Summary
여기에서 최적화된 FlashPack 모세관 열 포장 절차에 대한 프로토콜을 제시합니다. 일반적인 100bar 압력 폭탄 설정에 최적화된 프로토콜을 적용하면 긴 초고성능 모세관 기둥의 10배 더 빠른 패킹 및 제조가 가능합니다.
Abstract
모세관 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC)는 현재 LC-MS 계프로테오믹스에서 시료 분리 단계를 선택하는 방법이다. 그러나 모세관 기둥은 더 높은 유동 카운터타입에 비해 훨씬 덜 견고합니다. 쉽게 오염과 차단으로 인해 종종 교체가 필요합니다. 따라서 총 LC-MS 분석 비용의 현저히 비용이 많이 듭니다. UHPLC 모세관 기둥의 사내 포장은 많은 돈을 절약하고 사용자 정의 할 수 있습니다. 그러나 100bar 압력 폭탄의 표준 포장 절차는 HPLC 열에만 적합하지만 UHPLC 소광에는 너무 느립니다. 여기에서 동일한 100bar 압력 폭탄 설정에 적용되는 최적화된 FlashPack 프로토콜에 대한 설명을 제공합니다. 이 방법은 초고강도 중고 슬러리로부터의 포장을 기반으로 하며, UHPLC 모세관 기둥의 사내 제조를 위해 합리적인 시간에 개발된다.
Introduction
현대 프로테오믹스는 액체 크로마토그래피 결합 질량 분석법과 초고성능 나노 유류 크로마토그래피(50-150 μm 컬럼 내부 직경(ID)) 분리를 기반으로 최고의 분석 속도와 감도1을제공한다. 수많은 상업용 UHPLC 모세관 기둥을 사용할 수 있지만, 가격은 소모품 비용의 주요 부분을 차지하며, 특히 실험실에서 여러 개의 다양한 프로젝트가 실행되고 프로젝트별 열 오염이 빈번한 문제입니다. 게다가, 사내에서 기둥을 포장하면 맞춤형 실험 별 소벤트(예: polyCAT-A sorbent2)와기성열로 구매할 수 없는 기둥 특성을 사용할 수 있습니다.
이에 대처하기 위해 많은 실험실에서는 모세관 기둥을 사내에서 포장합니다. 그러나, 100바 압력폭탄(압력 주입 셀)3을 가진 일반적인 포장 절차는 2μm UHPLC 소박의 높은 배압으로 인해 UHPLC 열 포장에 적합하지 않아 대형 HPLC 소벤트에 비해 급격한 포장속도 감소가 초래된다. 짧은 UHPLC 열은 여전히 매우 느리게 포장 할 수 있지만 긴 UHPLC 열의 제조는 물리적으로 불가능4.
표준 모세관 기둥 포장은 상대적으로 낮은 압력에서 최대 100 바, 매우 낮은 흡착 슬러리 농도로 수행됩니다. 따라서 프로세스속도를 높이는 두 가지 가능한 방향을 사용할 수 있습니다. 패킹 압력5를증가시킬 수 있다. 그러나, 이것은 특별한 장비가 필요하고, 실질적으로, 실험실에 새로운 방법의 설치. 또 다른 방법은 흡착 슬러리농도를증가시키는 것입니다 6. 고주판 슬러리 농도 포장은 이전 간행물7에서초고포장 압력과 함께 기술된다. 그러나, 기존 포장 폭탄의 대부분에 사용되는 100 바 압력에서, 높은 흡입 농도는 포장 속도 속도가 느려지거나 완전히 포장 중단을 초래한다. 이 효과는 최근에 기둥 입구에 있는 소벤트 클러스터링으로 인해 입증되었으며, 흡기 유리병 내부에 자석 막대로 기둥 입구를 망치로 하여 소벤트 쿠폴라 불안정의 간단한 트릭이 제안되었다4. FlashPack이라는 이름의 결과 방법은 동일한 100bar 압력 폭탄 패킹 설정을 사용합니다. 동시에, 포장 절차의 사소한 그러나 중요한 변화는 매우 높은 슬러리 농도 및 매우 긴 UHPLC 컬럼 (50 ~ 70cm 이상) 생산에서 포장을 허용하고, 짧은 컬럼은 동일한 매개 변수4의상업 열과 동일한 분리 품질로 분에서 생성 될 수 있습니다. FlashPack 접근법은 이미 두역상(RP)8,9,10,11,12,13및 친수성 상호작용(HILIC)2 모세관 컬럼의 제조를 위한 다중 프로테오믹스 프로젝트에 성공적으로 사용되었다.
여기에서는 표준 100 bar 압력 폭탄 패킹 절차에 대한 FlashPack 접근 방식을 조정하는 데 필요한 수정 사항을 자세히 설명합니다.
Protocol
패킹 프로토콜은 5단계(도1):1) 패킹 스테이션 준비, 2) 모세관 제제, 3) 흡기 폭탄에 모세관 패킹, 5) 열 패킹업으로 구성되어 있으며, HPLC 시스템에서는 크기 및 UHPLC 연결 설치까지 절단한다. FlashPack 최적화는 공통 프로토콜과 비교하여 섹션 3과 4에서 조정해야 합니다.
1. 패킹 스테이션 어셈블리
- 질소, 헬륨 또는 아르곤으로 채워진 가스 탱크를 배출하는 가스 탱크를 배출하는 가스 > 50 바의 출구 압력으로 준비합니다. 최대 압력은 압력 폭탄 호환성에 의해 제한됩니다.
- 압력 폭탄의 통풍구 밸브에 레귤레이터를 연결합니다.
- 압력 폭탄이 통합 된 자기 교반기가 장착되어 있지 않은 경우 폭탄을 자기 교반기위에 놓습니다.
- 좁은 ID 플라스틱 튜브(예: 0.13 mm)를 압력 폭탄의 통풍구에 연결하고 물이 있는 용기에 넣습니다.
2. 모세관 준비
- 카실과 포르마이드 15 또는 레이저풀러(16)에 의해 제조된 당겨진 방출기 모세관으로 프릿드 모세관을 준비한다. 모세관은 의도된 컬럼 길이보다 10-15cm 더 길게 만들어집니다.
참고: 다른 모세관 크기 및 frit 유형과 관련된 가능한 문제에 대한 논의는 표 1을 참조하십시오. 표 2에는 뽑은 방출기 모세 혈관을 만들기 위한 P2000 레이저 풀러 프로그램의 예가 포함되어 있습니다. - 절단 된 젤 로딩 파이펫 팁으로 당겨진 방출기 끝을 보호하십시오.
- 360 μm OD 모세관 주위에 단단히 맞도록 팁을 잘라냅니다 (모세관을 따라 이동할 수 있지만 그렇게하기 위해 약간의 노력이 필요합니다).
- 절단 파이펫 끝을 모세관 앞단 방향에서 모세관에 밀어 넣고 방사체 끝으로 이동합니다.
- 열이 분사될 때 보호 팁을 다시 밀어 넣습니다. 열을 분사하지 않을 때 팁 안쪽에 방사체 가 끝나도록 팁을 앞으로 밀어 넣습니다(열이 흐름 아래에 있지만 여전히 분무되지 않은 경우에도).
3. 소벤트 슬러리 준비
- 스톡 스벤트 바이알 준비: 1.5mL 원심분리기 튜브에 마른 소광의 ~50 mg을 놓습니다. 여기서, Reprosil Pur C18은 예로 사용된다.
- 소벤트 튜브에 메탄올 1mL를 추가합니다.
- 완전히 혼합하려면 소용돌이 믹서를 사용하여 튜브를 10 초 동안 소용돌이시십시오.
- 10 초 동안 초음파 욕조에서 초음파 처리하십시오.
- 20-30분 동안 소광을 철저히 담가 두십시오. 그런 다음, 소용돌이와 다시 한 번 초음파 처리.
- 작동 하는 sorbent 유리병을 준비 합니다. 폭탄에 맞는 원물 바닥 유리병을 사용하십시오.
참고: 특정 압력 폭탄 설계에 따라 또 다른 1.5mL 원심분리기 튜브 또는 기타 바이알일 수 있습니다. 이 실험을 위해 압력 폭탄의 높이로 절단된 원내 바닥 나사 캡 튜브가 사용됩니다. - 스톡 스벤트 바이알의 소벤트를 다시 중단하고 500 μL을 2 x 3mm 크기의 자석 막대로 작업 중인 스소벤트 바이알로 옮킨다.
- 작업 바이알에 최대 ~1mL까지 메탄올을 추가합니다.
- 작업 바이알이 중력에 의해 정착하기 위해 10 분 동안 테이블에 서보자.
- 침전 후, 소광 층이 4mm 미만인 경우, 스톡 스벤트 슬러리를 더 추가하고 스벤트가 10 분 동안 정착 할 때까지 기다립니다.
참고: 준비된 작동 병은 수개월에 걸쳐 여러 열을 준비하기 위한 것입니다. 작동 하는 sorbent 유리병 2 시간 이상 교반 하지 않고 유지 하는 경우, 그것은 10 s에 대 한 소용돌이 해야 합니다., 10 s에 대 한 초음파 및 중력에 의해 정착. 일상적으로, 소벤트는 포장하기 전에 아침에 다시 중단됩니다. 그런 다음 순차적 열 포장 사이에 긴 일시 정지가없는 경우 하루 종일 포장하는 데 적합합니다. 작동 중인 바이알의 소벤트가 건조하면 메탄올을 추가하고 스톡 스벤트 바이알(3.2-3.5 단계)에 관해서는 전체 소벤트 준비 절차를 실행합니다.
4. 압력 폭탄에 모세관 포장
주의: 압력 폭탄으로 작업할 때항상 보호 안경을 착용하십시오. 장갑을 착용하지 마십시오. 이들은 심하게 작은 직경 모세 혈관의 적절한 처리에 필요한 터치 감각을 줄이고 실수로 이어질.
- 압력 폭탄에 흡기 유리병을 넣고 모든 견과류를 단단히 고정합니다.
- 60-100 rpm에서 회전을 시작합니다.
- 프릿티 또는 당겨진 방출기 모세관을 폭탄에 삽입합니다: 유리병의 맨 아래로 밀어 넣은 다음 2-3mm를 들어 올려 너트를 고정합니다.
참고: 모세관 및 페룰 손상을 피하기 위해 모세관을 고치기 위해 최소한의 필요한 힘을 적용하십시오. 가장 좋은 것은 손 조이기입니다. 육사 렌치를 사용하는 경우, 조임에 대한 최소한의 충분한 노력을 적용하십시오. - 모세관이 제대로 고정되어 있는지 확인하십시오 - 손으로 모세관을 당기는 것은 불가능해야합니다.
- 모세관의 열린 끝을 얼굴에서 멀리 가리키는 유지하면서 압력 폭탄 밸브를 매우 천천히 엽니다.
- 포장 프로세스의 초기 단계를 보십시오.
참고: 가압 시, 소버벤트는 모세관을 채우고 전체 길이에 대해 불투명해집니다. 소광이 변압이 증가하고, 흐름이 느려지고, 모세관 개혁 내부의 심지어 는 등받이 없는 틈으로 분리된 여러 개의 소광 패킷으로 재구부비로 포장되기 시작하자마자. 이미 포장 된 소광은 조밀하게 착색 된 지속적으로 성장하는 지역으로 볼 수 있습니다. - 소경구가 채워진 부위를 모세관 길이의 70% 이상이어야 하며, 포장 공정의 전체 기간 동안 작은 소경프리 갭을 유지한다.
- 모세관에 효율적인 소벤트 배달을 유지하기 위해 기내 설정 조정이 필요한 포장 과정에서 주의해야 할 몇 가지 일반적인 문제가 있습니다.
참고: 소벤트 전달 효율 조정에 대한 자세한 내용은 표 3에설명되어 있습니다.- 문제 1: 새 소벤트가 모세관에 들어가지 않는 동안 이미 내부에 있는 소벤트가 계속 움직이면 아래 단계를 따르십시오.
참고: 가장 빈번한 문제입니다. 대부분의 경우 모세관 입구는 자체 집계 된 소경모 클러스터에 의해 차단됩니다. sorbent 흐름이 복원될 때까지 다음 단계를 하나씩 적용한 다음 나머지 문제 관련 단계를 건너뜁니다.- 회전 속도를 500rpm으로 늘리고 즉시 60-100 rpm으로 다시 줄입니다. 일반적으로, 그것은 소벤트 흐름을 복원합니다. 나머지 포장 공정에 대해 회전 속도가 60rpm 이상이어야 한다고 확인합니다.
- 도움이 되지 않으면 포장 폭탄을 잠시 배출하고 즉시 다시 가압하십시오.
- 도움이 되지 않거나 차단이 다시 발생하면 소경층 내부의 모세관을 재배치합니다. 소경구의 부재는 모세관 오픈 엔드가 자석 막대 위에 너무 높기 때문에 컬럼 끝이 닿지 않거나 모세관이 유리병 바닥에 붙어 있기 때문일 수 있습니다. 먼저 폭탄을 완전히 배출하고 너트를 풀고 모세관을 바닥으로 밀어 넣은 다음 2mm 뒤로 당깁니다. 너트를 수정합니다.
- 차단이 지속되면 시스템을 환기시키고, 흡착 유리병과 소용돌이를 꺼내 다시 한 번 초음파 처리합니다. 모세관 정면 끝을 현미경으로 손상시 확인하고 필요한 경우 프런트 엔드의 ~5mm를 잘라냅니다.
- 문제 2: 소경구가 모세관의 작은 부분만 긴 빈 영역으로 채울 때 아래 단계를 따릅니다.
- 회전 속도를 확인합니다. 회전속도가 너무 느리면 쿠폴라 파손이 충분하지 않습니다. 회전 속도를 ~150 rpm으로 늘립니다.
- 회전이 너무 빠르면, 소벤트는 더 큰 바이알 볼륨으로 다시 매달려지고 기둥 입구 주위의 로컬 소버벤트 농도가 낮습니다. 회전 속도를 60-100 RPM으로 느리게 합니다.
- 소벤트 레벨을 확인합니다. 모세관 내부에 약간의 흡착이 있는 동일한 문제는 유리병에 충분한 소벤트가 없을 때 관찰됩니다. 소벤트가 소진되면, 중력유발 침전 후 4mm 이하의 높은 흡착층을 유지하기 위해 새 소벤트로 바이알을 채우십시오.
- 문제 1: 새 소벤트가 모세관에 들어가지 않는 동안 이미 내부에 있는 소벤트가 계속 움직이면 아래 단계를 따르십시오.
- 대상 컬럼 길이와 5-7cm가 달성될 때까지 열을 포장하십시오.
- 회전을 중지하고 매우 천천히 폭탄을 우울.
- 폭탄 밸브를 조금 열고 물병 내부에 거품이 터질 때까지 기다립니다. 그런 다음 밸브를 조금 더 넓게 열고 거품이 느려질 때까지 기다립니다.
- 밸브에서 가스가 나오지 때까지 압력을 증분으로 방출합니다.
참고 : 한 번에 밸브를 열지 마십시오 - 그것은 모세관 내부의 버블링과 유리병으로 다시 가는 소경구로 이어질 것입니다. 이 경우 폭탄을 다시 가압하고 열이 다시 포장될 때까지 기다립니다.
- 가스가 통풍구 밸브에서 나오는 것을 멈추면 포장 된 모세관을 압력 폭탄에서 꺼내십시오.
참고: 열이 마르지 않도록 하십시오. 추가 포장을 위해 HPLC 시스템에 즉시 연결되지 않은 경우, 전체 10% EtOH 솔루션으로 완전히 잠급하여 포장된 모세관을 저장에 넣습니다. 액체가 단단한 폴리 프로필렌 식품 저장 용기는 모세관 저장에 사용할 수 있습니다. 연결이 끊어진 HPLC 열은 동일한 방식으로 저장됩니다. - 더 이상 포장이 계획되지 않은 경우, 폭탄에서 흡인 유리병을 꺼내 단단히 닫습니다. 추가 열 포장을 위해 보관하십시오.
5. HPLC 열에 패킹
- HPLC 연결을 통해 포장된 모세관을 HPLC 시스템에 연결합니다.
- 250-300 바 압력을 대상으로 95% 용매 B(80 또는 100% 아세토나이트, 0.1% 포믹산(FA)로 흐름을 시작합니다. 40cm포장 모세관의 경우 200-300 nL/분의 유량을 사용하십시오.
참고: 포장 유량은 40-50cm 열의 경우 200nL/min이며 100 μm ID는 2 μm 소벤트로 포장되어 있습니다. 일부 다른 열 크기는 표 4에나열됩니다. 다른 열 길이 및 ID의 유량은 역압과 열 길이 및 단면 사이의 직접적인 비례성에서 추정됩니다. 정확한 유량은 실제 포장된 길이로 조정되며, 이는 기본적으로 대상 열 길이보다 깁니다. 또한 300 바 압력은 HPLC 연결의 물리적 압력 제한을 대상으로 합니다. 고압 연결의 경우 연결 압력 제한까지 의 높은 유량속도를 더 빠른 포장에 사용해야 합니다. - 모세관 내부의 느슨한 소경이 포장되고 전체 포장 길이에 추가되는 것을 지켜보십시오.
- 흐름을 멈추지 않고 컬럼 본체를 초음파 욕조에 두 번 찍어 넣습니다.
참고: 열 끝과 모세관 연결만 열 본문부분만 침지 마십시오. 초음파 처리 단계는 특히 매우 긴 열 >50cm 길이(게시되지 않은 데이터)의 경우 열 재현성을 개선하는 데 도움이 됩니다. 그러나, 그것은 뽑아 낸 방출기 모세관의 방출자 끝 안쪽에 자기 조립 소벤트 frit을 깨고 컬럼을 완전히 차단하는 임의의 기회를 추가합니다. 초음파 처리는 유리 프릿 컬럼에 보편적으로 적용 할 수 있지만, 우리는 50cm > 열 길이에 대해서만 뽑아 낸 방출기 열을 초음파 처리하는 것이 좋습니다. - 흡착침대가 수축을 멈추면 컬럼 본체를 초음파 욕조에 두 번 더 찍어 흐름을 멈추지 않고 두 번 더 찍어 넣습니다.
- 300 바에서 10분 동안 열을 실행합니다.
- 흐름을 중지하고 압력이 세 막대 아래로 떨어질 때까지 기다렸다가 열을 분리합니다.
- 간격과 변색이 없는 경우 컬럼을 시각적으로 검사합니다. 발견되면 흐름 하에서 초음파 처리가 반복될 수 있습니다. 중요한 실험의 경우 새 열을 만드는 것이 좋습니다.
- 열을 원하는 길이로 잘라냅니다.
참고: 제대로 수행된 절단은 컬럼 효율성을 위한 전제 조건입니다. 서기와 폴리이미드 코팅에 노치를 만들고, 부분적으로 모세관을 부수고 두 조각을 분리합니다. - 세라믹 웨이퍼 또는 랩핑 필름으로 기둥 프런트 엔드를 연마합니다.
- UHPLC 연결을 사용하여 열을 LC 시스템에 다시 연결합니다.
- 표 4에따라 열 ID에 따라 작업 흐름 속도를 2% B로 시작합니다. 압력이 평형화되고 열 재압을 확인할 때까지 기다립니다.
참고: 작업 흐름 속도는 열 매개 변수에 따라 조정됩니다. 예를 들어, 30cm 길이 100 μm ID 열은 500nL/min에서 실행됩니다. - 재압이 예상 값의 5% 이내인지 확인합니다(표 5참조), 열이 제대로 포장되어 사용할 준비가 되었는지 확인합니다.
참고: 열 배압은 열 앞 모세혈관의 배압을 뺀 열이 연결된 HPLC 시스템의 그라데이션 채널의 총 압력입니다. 동시에 표 5의 값은 임의적입니다(예상할 내용의 임의 척도를 제공합니다). 열에서 열에 대한 배압의 실험실 내 유사성은 모든 것이 제대로 작동하는 더 중요한 지표입니다. 실제 절대 배압은 흡착 크기 및 특성, 모세관 ID, 제조 및 배치, 뽑아낸 방출기 끝의 형상 또는 유리 프릿의 밀도 및 길이, 용매 특성 및 실내의 주변 온도 등과 같은 많은 파라미터에 따라 달라집니다. 역압이 너무 높으면 가능한 문제에 대해 표 1을 참조하십시오.
Representative Results
FlashPack 접근 방식은 표준 패킹 설정을 기반으로 하며 동일한 패킹 파이프라인을 따릅니다. 포장은 표준 프릿또는 당겨진 방출기 모세 혈관으로 수행됩니다. 주요 최적화는 흡착 슬러리 농도에 있습니다 : 표준 방법은 FlashPack에 사용되는 고농축 흡착 현탁액과 호환되지 않습니다. 그 결과 긴 UHPLC 컬럼에 대한 빠른 생산 방법이 있으며, 예를 들어, 1.9 μm 미만의 1.9 μm 의 흡착으로 50cm 길이로 포장된 컬럼(그림2).
FlashPack 접근법의 적용을 입증하기 위해 30cm 100 μm ID 모세관열(표 6)을준비하였다. ReprosilPur C18 1.9 μm 소광의 포장은 P2000 레이저 풀러에 의해 제조 된 50cm 길이 100 μm ID 에미터 모세관을 당긴 60 바에서 수행되었다. 모세관은 40분 만에 ~40cm로 포장되었고, 모세관 내부에는 좀 더 느슨한 소광이 남았습니다. 포장 된 모세관은 HPLC 시스템에 연결되어 용매 B (80 % 아세토나이트, 0.1 % FA)와 함께 300 nL / min에서 실행되었습니다. 5초 의 두 라운드 후, 최종 포장 길이는 43cm이었다. 열의 연결이 끊어지고 30cm로 절단되었으며 UHPLC 연결을 사용하여 HPLC 시스템에 연결되었습니다. 우리는 일상적으로 360 μm 민소매 PEEK 너트 페룰과 360 μm 스테인레스 스틸 조합을 사용합니다. 이 조합은 강하게 조여경우 적어도 700 개의 막대를 보유합니다. 제조된 컬럼은 500 nL/min에서 2% 용매 B에서 520바의 역압을 가지며, 이는 예상 값범위(표 5)와일치합니다.
컬럼 효율의 데모로서, 제조된 30cm 컬럼을 사용하여 시토크롬 C 단백질의 트립틱 다이제스트 50fmol을 2%에서 50%B로 15분 그라데이션으로 분리했습니다. 평균 FWHM은 약 3s(그림3)이었다.
표 1: 열의 높은 작업 역압에 대한 문제 해결. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2 : P2000 / F 레이저 풀러 프로그램. P2000/F 레이저 풀러 프로그램은 실내 온도 23-25°C에서 내부 코팅없이 360 μm OD 100 μm ID 융합 실리카 폴리이미드 코팅 모세혈관으로부터 당겨진 방출기 모세혈관의 제조를 위한 프로그램을 이 쪽을 클릭하여 다운로드해 주세요.
표 3: 플래시팩별 패킹 문제 및 체크포인트가 포장 과정에서 제어할 수 있습니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4: 다양한 열 아이디 및 길이에 대한 예시적인 패킹 및 작업 흐름 속도입니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 5: 2 μ m 구형 구취가 포장된 열에 대한 예상 역압은RT의 RP 용매 시스템에서 작동 유량(열 ID에 따라)으로 실행됩니다.
표 6: 30cm UHPLC 열의 예시포장. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1: 모세관 열 포장 방식. 1~3단계는 준비, 압력 폭탄 패킹, HPLC 패킹업으로 마무리됩니다. 단계 3과 4초 효율플래시팩 프로토콜에 맞게 수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 레프로실푸르 C18 AQ 1.9 μm을 메탄올의 100바에서 프릿모필러 100 μm ID의 포장속도.
그림 3: 사이토크롬 C의 트립틱 펩타이드의 이온 크로마토그램 추출. 30cm 길이 100mm ID로 50fmol을 분리한 후 시토크롬 C의 트립틱 펩타이드의 추출된 이온 크로마토그램은 완충 B(80% 아세토니톨)의 그라데이션에서 ReprosilPur C18 AQ 1.9 μm으로 포장된 방출기 모세관 기둥을 뽑아, 0.1% FA) 및 완충A(2% 아세토니틀, 0.1% FA)에서 15분 에서 2%에서 40%로 15분 만에 RT.Detection는 질량 분광계를 사용하여 수행하였다. 각 펩티드에 대한 절대 강도 및 추출된 m/z 범위는 스펙트럼의 오른쪽에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
사내 모세관 기둥 포장은 여러 독립 프로젝트에서 일하는 대형 실험실에서 매우 인기가 있습니다. 그러나, 저농도 흡기 서스펜션에서 일반적인 포장 방법은 속도에 큰 한계를 가지며 긴 UHPLC 열을 생성할 수 없다.
FlashPack은 매우 높은 흡기 농도에서 포장을 가능하게 하는 표준 포장 절차를 수정한 것입니다. 이 방법의 이론적 기초는 전체 포장 기간 동안 기둥 입구의 연속 적인 소벤트 쿠폴라 불안정에 있습니다. 후자는 기술적으로 지속적으로 자석 막대에 맞은 열 입구에 의해 달성된다. 쿠폴라 불안정화 방법은 의도적으로 포장 설정을 일반적인 포장 공정과 완전히 유사하게 개발하지만, FlashPack의 트릭은 포장 과정에서 셔벤트 슬러리 준비, 모세관 위치 및 자석 바 사용의 세부 사항에 있다.
소벤트 슬러리는 큰 용매 부피의 퇴적물 소벤트 층으로 제조된다. 압력 폭탄 기반 포장은 열에 대한 동일한 포장 조건을 필요로하지 않는다는 것이 흥미롭습니다. FlashPack에서는 기둥 입구 주변의 정확한 슬러리 농도를 알지 못했습니다. 포장 과정에서도 변경되기 때문에 정확하게 측정하고 제어하는 것은 불가능합니다. 그러나 최종 열은 포장이 어떻게 이루어졌는지에 관계없이 여전히 매우 재현 가능한4개입니다.
빠른 포장의 기초는 효율적인 소벤트 쿠폴라 불안정에 있습니다. 이러한 이유로, 모세관에 들어가는 소벤트를 제어하고 전체 포장 기간 동안 최적의 쿠폴라 불안정 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 효율적인 소벤트 배달을 방지할 수 있는 몇 가지 가능한 문제가 있습니다. 이들 중 몇 가지 예는 빠른 자기 바 회전에 의해 셔벤트 층 재서스펜션, 자석 바 위치 또는 너무 느린 자석 막대 회전에 잘못된 상대 모세관으로 인한 비효율적인 큐폴라 불안정성입니다. 문제 자체와 해결 방법은 프로토콜 섹션에서 자세히 설명합니다.
열을 포장한 후 확인할 주요 열 매개 변수는 열 재압입니다. 표 5에 나열된 압력 값은 인기 있는 서브 2 μm 비드 크기 중 하나에 대해 예상되는 기준점을 제공하며, 이는 소벤트-ReproSil PUR C18 AQ(1.9 μm)이다. 동시에, 추가 역압은 frit 또는 너무 좁게 당겨진 방출기에 의해 추가될 수 있고 하나는 끊임없이 그것을 감시해야 합니다. 포장이 당겨진 방출기로 수행되는 경우, 우리는 여전히 먼저 fritted 모세 혈관을 포장하여 사용 중인 특정 소험에 대한 예상 컬럼 배압을 측정한 다음 자체 조립 프리가 너무 많이 추가되는지 확인하는 것이 좋습니다. 고압 문제의 경우 표 1에 제공된 지침을 사용하여 문제를 정확히 찾아보십시오.
우리의 경험에서, 변색, 간격, 적절한 배압이없는 포장 된 컬럼은 케이스의 100 %에서 작동하고 컬럼 길이와 소경 특성에서 기대할 수있는 것에 가까운 분리 품질을 제공합니다. 변색이 있는 컬럼이 제대로 작동하도록 보장되지는 않지만 만족스러운 결과를 제공할 수 있습니다.
대부분의 경우 분리 품질에 문제가 있는 경우 컬럼 자체에서 온 것이 아니라 분리 시스템, 즉 펌프, 용매 또는 연결의 다른 부분에서 나옵니다. 특히 잠재적으로 유해한 것은 열 후 연결입니다. 방출기와 프릿 기둥 사이의 막다른 부피와의 연결은 모세관 크로마토그래피의 유량이 매우 낮기 때문에 주요 피크 확대 및 꼬리를 유발합니다.
FlashPack 접근 방식에 특정 한 가지 더 중요한 문제는 작동 하는 sorbent 슬러리 유리병에 비싼 sorbents많이 사용 하는 것입니다. FlashPack의 셔벤트 슬러리는 여러 번 사용하기 위한 것입니다. 소벤트를 돌봐. 포장이 끝나자마자 회전을 멈추는 것을 기억하십시오. 그리고 흡기 폭탄에 열린 소릭 바이알을 두지 말고, 흡사건조를 피하십시오. 비록 그 후 여전히 사용할 수 있습니다., 그것은 sorbent 슬러리를 리메이크 하는 데 시간이 걸립니다.
이 방법은 프릿모세혈관과 당겨진 방출기 모세혈관 모두에 똑같이 효과적입니다. FlashPack 원리는 모세관 ID의 포장 속도를 20에서 250 μm로 증가시킵니다(더 작고 더 큰 것은 테스트되지 않았습니다). 그것은 또한 모든 ororbents에 적용, 완전 하 고 피상적으로 다공성, 우리는 테스트 할 수 있습니다 (높은 흡착 슬러리 농도의 흡인 큐폴라 형성은 RP 소광에 특별히 제한 되지 않습니다 반영). 게다가, 용매 파라미터는 그들의 물리적 및 화학적 특성에 따라 포장에 명확하게 영향을 미칩니다. 예를 들어 점성이 적은 아세톤은 동일한 포장 압력에서 메탄올보다 더 높은 포장 속도를 제공합니다. 그러나, 메탄올보다 극성도 적고 서로 달라붙는 흡착 입자를 감소시킨다. 그 자체로 는 유량이 여전히 높을 때 포장의 시작 부분에서 흡기 쿠폴라 형성을 방지합니다. 그러나, 흡착 입자 상호 작용의 감소는 또한 포장 도중 보다 적게 믿을 수 있는 자기 조립 frit 형성 및 더 빈번한 당김 끝 차단으로 이끌어 냅니다. 따라서 아세톤은 프릿모세혈관을 포장하는 것이 좋지만, 메탄올을 슬러리 용매로 사용하는 것은 당겨진 모세혈관에 적합하지 않지만 두 가지 유형의 결말에 적합합니다. 헥산 또는 디클로로메탄(DCM)에서 포장하는 것은 메탄올에서 아세톤으로 전환하는 극단적인 경우입니다: 극성이 적기 때문에 흡기 쿠폴라 형성을 완전히 방지하지만 끌어당기는 방사체 포장에는 전혀 적합하지 않습니다. 게다가, 매우 낮은 DCM 극성은 내부 모세관 벽에 붙어 그것에 두꺼운 층을 만드는 흡착입자로 이끌어 내는 것을 주의했습니다. 레이어 두께가 점차 증가하고 임의의 로컬 블록이 형성되어 기둥이 소벤트가 없는 영역으로 구분된 여러 부분으로 압축됩니다. 이러한 효과는 C18 펩타이드 에리스 소벤트에 대해 관찰되었다.
또 다른 관찰 된 문제는 YMC Triart C18 소벤트가 메탄올에서 제대로 중단되지 않고 일종의 플레이크를 형성하는 것이었습니다. 그러나 FlashPack으로 포장되어 매우 괜찮은 분리 효율 (게시되지 않은 데이터)을 제공하는 것을 막지는 못합니다. 따라서, 어떤 경우에는 최적이지는 않지만, 메탄올은 모든 테스트 된 흡착제 및 기둥에 대해 작동하는 가장 보편적 인 용매였다. 우리는 아직 다른 슬러리 용매가 열 분리 효율에 미치는 영향을 분석하지 않은 것을 언급 할 필요가있다. 동시에 메탄올에서 포장된 컬럼의 효율은 이미 동일한 소벤트4의상업용 열과 완전히 동일합니다.
FlashPack은 UHPLC 열의 포장 속도를 개선하는 유일한 기존 접근 방식이 아닙니다. 초고압 패킹7을사용하면 고압 슬러리 농도로부터 빠른 포장이 가능합니다. FlashPack의 장점은 특수 초고압 펌프와 스모펜션 연결에 대한 압력 폭탄을 필요로하지 않기 때문에 훨씬 간단하다는 것입니다. 동시에 극한의 압력으로 포장된 컬럼은 저압 포장컬럼(17)보다분리 효율이 높을 수 있음을 입증했다. FlashPack은 포장 방법을 모르는 비교4에사용되는 상용 열과 동일한 열을 생성하지만 플래시 팩 열이 초고압 포장 열에 어떻게 대항하는지 아직 테스트하지 않았습니다.
요약하자면, 설명된 FlashPack 메서드는 프로토콜에 대한 몇 가지 조정을 통해 실험실의 기존 패킹 프로토콜에 쉽게 적응할 수 있으며 설정은 완전히 동일하게 유지됩니다. HPLC 모세관 기둥포장속도를 분으로 조정하고 표준 포장 절차로는 명백히 불가능한 긴 UHP 모세관 기둥을 생산할 수 있습니다. FlashPack 접근 방식을 적용하여 실험실의 시간과 비용을 연간 수만 유로로 계산할 수 있습니다. 또한 UHP 모세관 열을 로컬로 생성하는 기능은 사용 가능한 상용 제품으로는 실험 사용자 지정이 불가능할 수 있습니다.
Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 RSF 보조금 20-14-00121에 의해 지원되었다. 저자는 유익한 토론을 위해 P. V. Shliaha (기념 슬로안 케터링 암 센터)에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59002 | |
| centrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | ||
| Ceramic Scoring Wafer | Restek | 20116 | any ceramic wafer is suitable for capillary polishing |
| Diamond-chip bladed scribe | NewObjective | Diamond-chip bladed scribe | recommended for capillary cutting |
| fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD | CM Scientific | TSP100375 | |
| GELoader tips | Eppendorf | 30001222 | |
| HPLC system | ThermoScientific | Ultimate3000 RSLCnano | |
| laser puller | Sutter | P2000/F | |
| magnet bar 2x5 mm | Merck | Z283819 | |
| MeOH | Merck | 1.06018 | |
| microspatula | Merck | Z193216 | |
| PEEK ferrule 360 mm | VICI | JR-C360NFPK | use to connect the column to UPLC union |
| pipette tip, 1000 uL | Merck | Z740095 | |
| pipette, 1000 uL | Gilson | Pipetman L P1000L | |
| pressure bomb | NextAdvance | PC-77 MAG | |
| regulator | GCE | Jetcontrol 600 200/103 | |
| Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm | Dr. Maisch | r13.aq.0001 | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL | Merck | AXYST050SS | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL | Merck | AXYST150SS | |
| Screw caps with O-rings | Merck | AXYSCOC | |
| sonication bath | Elma | Elmasonic S30 H | |
| union HPLC | VICI | JR-C360RU1PK6 | HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| union UPLC | VICI | JR-C360RU1FS6 | UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| vortex | BioSan | V-1plus | |
| Water with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59013 |
References
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Now Coon, J. J. Now, more than ever, proteomics needs better chromatography. Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).
- Shliaha, P. V., et al. Middle-down proteomic analyses with ion mobility separations of endogenous isomeric proteoforms. Analytical Chemistry. 92 (3), 2364-2368 (2020).
- Pressure injection cells - next advance - laboratory instruments. , Available from: https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview (2021).
- Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. FlashPack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (2), 383-390 (2019).
- MacNair, J. E., Lewis, K. C., Jorgenson, J. W. Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns. Analytical Chemistry. 69 (6), 983-989 (1997).
- Bruns, S., et al. Slurry concentration effects on the bed morphology and separation efficiency of capillaries packed with sub-2 µm particles. Journal of Chromatography. A. 1318, 189-197 (2013).
- Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. Implementation of high slurry concentration and sonication to pack high-efficiency, meter-long capillary ultrahigh pressure liquid chromatography columns. Journal of Chromatography. A. 1462, 165-169 (2016).
- Andrzejczak, O. A. The effect of phytoglobin overexpression on the plant proteome during nonhost response of barley (Hordeum vulgare) to wheat powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici). Scientific Reports. 10 (1), 9192 (2020).
- Elchaninov, A., et al. Comparative analysis of the transcriptome, proteome, and miRNA profile of kupffer cells and monocytes. Biomedicines. 8 (12), 627 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches. BMC Genomics. 21 (1), 331 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Identification of unusual peptides with new Cys frameworks in the venom of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus. Scientific Reports. 7 (1), 14534 (2017).
- Loughran, G., et al. Unusually efficient CUG initiation of an overlapping reading frame in POLG mRNA yields novel protein POLGARF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (40), 24936-24946 (2020).
- Radzisheuskaya, A., et al. PRMT5 methylome profiling uncovers a direct link to splicing regulation in acute myeloid leukemia. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 999-1012 (2019).
- Rubtsova, M., et al. Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways. Nucleic Acids Research. 46 (17), 8966-8977 (2018).
- Maiolica, A., Borsotti, D., Rappsilber, J. Self-made frits for nanoscale columns in proteomics. PROTEOMICS. 5 (15), 3847-3850 (2005).
- Ishihama, Y., Rappsilber, J., Andersen, J. S., Mann, M. Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics. Journal of Chromatography. A. 979 (1-2), 233-239 (2002).
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. Ultra-high pressure (>30,000 psi) packing of capillary columns enhancing depth of shotgun proteomic analyses. Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).
