Summary
यहां हम अनुकूलित फ्लैशपैक केशिका कॉलम पैकिंग प्रक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एक आम 100-बार दबाव बम सेटअप के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का आवेदन 10 गुना तेजी से पैकिंग और लंबे अल्ट्रा-उच्च प्रदर्शन केशिका स्तंभों के निर्माण की अनुमति देता है।
Abstract
केशिलरी अल्ट्रा-हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (यूएचपीएलसी) वर्तमान में एलसी-एमएस-आधारित प्रोटेओमिक्स में नमूना पृथक्करण चरण के लिए पसंद की एक विधि है। हालांकि, उनके उच्च प्रवाह काउंटरटाइप की तुलना में केशिका कॉलम बहुत कम मजबूत होते हैं। आसान प्रदूषण और अवरुद्ध होने के कारण, उन्हें अक्सर प्रतिस्थापन की आवश्यकता होती है। कि उन्हें कुल एलसी एमएस विश्लेषण लागत का एक स्पष्ट रूप से महंगा हिस्सा बनाता है। यूएचपीएलसी केशिका स्तंभों की इन-हाउस पैकिंग बहुत पैसा बचाती है और अनुकूलन की अनुमति देती है। हालांकि, 100-बार प्रेशर बम में मानक पैकिंग प्रक्रिया केवल एचपीएलसी कॉलम के लिए अच्छी तरह से काम करती है लेकिन यूएचपीएलसी शर्बत के लिए बहुत धीमी है। यहां हम एक ही 100-बार प्रेशर बम सेटअप पर लागू एक अनुकूलित फ्लैशपैक प्रोटोकॉल का विवरण प्रदान करते हैं। विधि अल्ट्रा उच्च शर्बत एकाग्रता घोल से पैकिंग पर आधारित है और उचित समय में असीमित लंबाई के UHPLC केशिका स्तंभों के इन-हाउस विनिर्माण के लिए विकसित की गई है।
Introduction
आधुनिक प्रोटेओमिक्स तरल क्रोमेटोग्राफी-युग्मित मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर आधारित है जिसमें अल्ट्रा-हाई-हाई परफॉर्मेंस नैनो-फ्लो क्रोमेटोग्राफी (50-150 माइक्रोन कॉलम आंतरिक व्यास (आईडी)) जुदाई सबसे अच्छा विश्लेषण गति और संवेदनशीलता प्रदान करता है1। जबकि कई वाणिज्यिक UHPLC केशिका कॉलम उपलब्ध हैं, उनकी कीमत उपभोग्य लागत का एक प्रमुख हिस्सा बनाती है, खासकर जब प्रयोगशाला में कई विविध परियोजनाएं चलाई जाती हैं और परियोजना-विशिष्ट कॉलम संदूषण एक लगातार मुद्दा है। इसके अलावा, घर में कॉलम की पैकिंग कस्टम प्रयोग-विशिष्ट शर्बत (जैसे, पॉलीकैट-ए शर्बत2)और कॉलम विशेषताओं के उपयोग की अनुमति देता है जो तैयार कॉलम के रूप में खरीदने के लिए उपलब्ध नहीं है।
इससे निपटने के लिए, कई प्रयोगशालाएं घर में केशिका स्तंभों को पैक करती हैं। हालांकि, 100 बार प्रेशर बम (प्रेशर इंजेक्शन सेल) 3 के साथ सामान्य पैकिंग प्रक्रिया यूएचपीएलसी कॉलमपैकिंग के लिए उपयुक्त है, क्योंकि उप-2 माइक्रोन यूएचपीएलसी शर्बंट्स के उच्च बैकप्रेशर के कारण बड़े आकार के एचपीएलसी शर्बंट्स की तुलना में नाटकीय पैकिंग दर में कमी आती है। जबकि छोटे यूएचपीएलसी कॉलम अभी भी बहुत धीरे-धीरे पैक किए जा सकते हैं, लंबे यूएचपीएलसी कॉलम का निर्माण शारीरिक रूप से असंभव है4।
मानक केशिका स्तंभ पैकिंग अपेक्षाकृत कम दबाव-अप 100 बार, और बहुत कम शर्बत घोल एकाग्रता के साथ किया जाता है। इसलिए, प्रक्रिया को तेज करने के दो संभावित निर्देश उपलब्ध हैं। पैकिंग दबाव5को बढ़ाना संभव है। हालांकि, इसके लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है और व्यावहारिक रूप से प्रयोगशाला में एक नई विधि की स्थापना की आवश्यकता होती है। दूसरा तरीका यह है कि शर्बत घोल एकाग्रता6को बढ़ाया जाए । उच्च शर्बत घोल एकाग्रता पैकिंग पिछले प्रकाशन7में अल्ट्रा-हाई पैकिंग दबाव के साथ संयोजन में वर्णित है। हालांकि, १०० बार दबाव है, जो मौजूदा पैकिंग बम के अधिकांश में प्रयोग किया जाता है पर, उच्च शर्बत एकाग्रता या तो पैकिंग दर धीमी गति से नीचे या एकमुश्त पैकिंग समाप्ति में परिणाम । प्रभाव हाल ही में कॉलम प्रवेश द्वार पर शर्बत क्लस्टरिंग के कारण होने का प्रदर्शन किया गया था, और एक शर्बत शीशी के अंदर एक चुंबक पट्टी के साथ कॉलम प्रवेश द्वार अंकित द्वारा शर्बत कपोल अस्थिरता की एक सरल चाल4का सुझाव दिया गया था । फ्लैशपैक नाम की परिणामी विधि, एक ही 100-बार प्रेशर बम पैकिंग सेटअप का उपयोग करती है। इसके साथ ही, पैकिंग प्रक्रिया में मामूली लेकिन महत्वपूर्ण परिवर्तन बहुत अधिक शर्बत घोल एकाग्रता और बहुत लंबे यूएचपीएलसी कॉलम (50 से 70 सेमी, और लंबे समय तक) के उत्पादन से एक घंटे से भी कम समय में पैकिंग की अनुमति देते हैं, जबकि एक छोटे कॉलम को समान मापदंडों के वाणिज्यिक स्तंभों के बराबर पृथक्करण गुणवत्ता के साथ मिनटों में उत्पादित किया जा सकता है4। फ्लैशपैक दृष्टिकोण का पहले से ही रिवर्स चरण(आरपी)8, 9,10, 11, 12,13,14और हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन (एचआईएलआईसी)2केशिलरी कॉलम दोनों की तैयारी के लिए कई प्रोटेओमिक्स परियोजनाओं में सफलतापूर्वक उपयोग कियागया था।
यहां हम विस्तार से वर्णन करते हैं, मानक 100-बार दबाव बम पैकिंग प्रक्रिया के लिए फ्लैशपैक दृष्टिकोण के अनुकूलन के लिए आवश्यक संशोधन।
Protocol
पैकिंग प्रोटोकॉल में पांच चरण(चित्रा 1: 1)पैकिंग स्टेशन की तैयारी, 2) केशिका तैयारी, 3) शर्बत घोल तैयार करना, 4) प्रेशर बम में केशिका पैकिंग, और 5) एचपीएलसी सिस्टम में कॉलम पैकिंग-अप, आकार और यूएचपीएलसी कनेक्शन इंस्टॉलेशन तक काटना शामिल है। फ्लैशपैक ऑप्टिमाइजेशन के लिए कॉमन प्रोटोकॉल की तुलना में सेक्शन 3 और 4 में एडजस्टमेंट की जरूरत होती है ।
1. पैकिंग स्टेशन विधानसभा
- आउटलेट दबाव > 50 बार के साथ एक चरण गैस नियामक के साथ सुसज्जित नाइट्रोजन, हीलियम या आर्गन से भरा एक गैस टैंक तैयार करें। अधिकतम दबाव दबाव बम अनुकूलता से सीमित है।
- प्रेशर बम के वेंट वाल्व से रेगुलेटर को कनेक्ट करें।
- यदि प्रेशर बम एक एकीकृत चुंबकीय उभारक से लैस नहीं है, तो बम को चुंबकीय उभारक पर रखें।
- एक संकीर्ण आईडी प्लास्टिक ट्यूबिंग (जैसे, 0.13 मिमी) को प्रेशर बम के वेंट आउटलेट से कनेक्ट करें और इसे पानी के साथ एक बर्तन में डाल दें।
2. केशिका तैयारी
- कसिल और फॉर्ममाइड15 या लेजर पुलर16द्वारा तैयार एक खींचा हुआ उत्सर्जक केशिका से बनने वाले एक एकीकृत ग्लास फ्रिट के साथ एक फ्रिटेड केशिका तैयार करें । केशिका को इच्छित स्तंभ लंबाई की तुलना में 10-15 सेमी लंबा बनाया जाता है।
नोट: विभिन्न केशिका आकार और फ्रिट प्रकारों से जुड़े संभावित मुद्दों की चर्चा के लिए तालिका 1 देखें। तालिका 2 में खींचा-उत्सर्जक केशिकाओं बनाने के लिए P2000 लेजर पुलर कार्यक्रम का एक उदाहरण शामिल है। - एक कट जेल-लोडिंग पिपेट टिप के साथ एक खींचा उत्सर्जक अंत की रक्षा करें।
- टिप काट तो यह ३६० μm आयुधी के आसपास कसकर फिट बैठता है (यह केशिका के साथ ले जाया जा सकता है, लेकिन ऐसा करने के लिए कुछ प्रयास की आवश्यकता है) ।
- केशिका सामने के अंत की दिशा से केशिका पर कट पिपेट टिप स्लाइड करें और इसे उत्सर्जक छोर तक ले जाएं।
- कॉलम छिड़काव होने पर सुरक्षा टिप को वापस स्लाइड करें। जब कॉलम छिड़काव नहीं हो रहा है (यहां तक कि जब कॉलम प्रवाह के नीचे है, लेकिन अभी भी छिड़काव नहीं है) टिप के अंदर उत्सर्जक अंत करने के लिए टिप आगे स्लाइड करें।
3. शर्बत घोल की तैयारी
- एक शेयर शर्बत शीशी तैयार करें: ~ 50 मिलीग्राम सूखी शर्बत को 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें। यहां, रिप्रॉसिल पुर सी 18 का उपयोग उदाहरण के रूप में किया जाता है।
- शर्बत ट्यूब में मेथनॉल की 1 एमसीएल डालें।
- इसे पूरी तरह से मिलाने के लिए, भंवर मिक्सर का उपयोग करके 10 एस के लिए ट्यूब को भंवर।
- 10 एस के लिए एक सोनीकेशन स्नान में Sonicate ।
- शर्बत को 20-30 मिनट तक अच्छी तरह से भिगोने दें। इसके बाद भंवर और उसे एक बार और सोनिकेट करें।
- एक कामकाजी शर्बत शीशी तैयार करें। एक शंकु नीचे शीशी जो बम में फिट बैठता है का प्रयोग करें।
नोट: यह या तो एक और 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब या किसी भी अन्य शीशी विशेष दबाव बम डिजाइन के आधार पर हो सकता है। इस प्रयोग के लिए, प्रेशर बम की ऊंचाई तक शंकु नीचे स्क्रू कैप ट्यूब कट का उपयोग किया जाता है। - स्टॉक शर्बत शीशी में शर्बत को फिर से खर्च करें और 2 x 3 मिमी आकार के चुंबक बार के साथ काम कर रहे शर्बत शीशी में 500 μL स्थानांतरित करें।
- काम शीशी के लिए ~ 1 एमएल तक मेथनॉल जोड़ें।
- काम शीशी को गुरुत्वाकर्षण द्वारा व्यवस्थित करने के लिए शर्बत के लिए 10 मिनट के लिए मेज पर खड़े होने दें।
- यदि, बसने के बाद, शर्बत परत 4 मिमी से नीचे है, तो स्टॉक शर्बत घोल के अधिक जोड़ें और शर्बत के लिए एक और 10 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए प्रतीक्षा करें ।
नोट: तैयार काम शीशी महीनों में कई स्तंभों की तैयारी के लिए करना है । यदि काम करने वाले शर्बत शीशी 2 घंटे से अधिक के लिए सरगर्मी के बिना रहता है, यह 10 एस के लिए भंवर होना चाहिए, 10 एस के लिए ध्वनिक और गुरुत्वाकर्षण द्वारा बसे । नियमित रूप से, शर्बत पैकिंग से पहले सुबह में फिर से निलंबित कर दिया है । फिर, यह पूरे दिन के लिए पैकिंग के लिए अच्छा है अगर अनुक्रमिक कॉलम पैकिंग के बीच कोई लंबा ठहराव नहीं है। यदि काम शीशी में शर्बत सूख जाता है, मेथनॉल जोड़ें, और स्टॉक शर्बत शीशी (चरण 3.2-3.5) के लिए पूर्ण शर्बत तैयारी प्रक्रिया चलाएं।
4. एक दबाव बम में केशिका पैकिंग
सावधानी: प्रेशर बम के साथ काम करते समय हमेशा सुरक्षात्मक चश्मा पहनें। दस्ताने न पहनें। ये छोटे व्यास केशिकाओं की उचित हैंडलिंग के लिए आवश्यक स्पर्श की भावना को गंभीर रूप से कम करते हैं और गलतियों का कारण बनते हैं।
- शर्बत शीशी को प्रेशर बम में रखें और सभी मेवे को कसकर ठीक करें।
- 60-100 आरपीएम पर रोटेशन शुरू करें।
- बम में फ्रिटेड या खींचा हुआ उत्सर्जक केशिका डालें: इसे शीशी के बहुत नीचे तक धकेलें, और फिर इसे 2-3 मिमी तक उठाएं और अखरोट को ठीक करें।
नोट: केशिका और फेरुल क्षति से बचने के लिए केशिका को ठीक करने के लिए न्यूनतम आवश्यक बल लागू करें। सबसे अच्छा हाथ कस रहा है । यदि हेक्स-रिंच का उपयोग किया जाता है, तो कसने के लिए न्यूनतम पर्याप्त प्रयास लागू करें। - जांच करें कि क्या केशिका ठीक से तय है-इसे हाथ से खींचकर केशिका को स्थानांतरित करना असंभव होना चाहिए ।
- बहुत धीरे-धीरे दबाव बम वाल्व खोलने के लिए, जबकि केशिका के खुले अंत रखते हुए अपने चेहरे से दूर बताया।
- पैकिंग प्रक्रिया के प्रारंभिक चरण देखें।
नोट: दबाव पर तुरंत, शर्बत केशिका भरता है और यह पूरी लंबाई के लिए गैर पारदर्शी हो जाता है । जैसे ही शर्बत डिस्टल एंड के अंदर पैक करना शुरू करता है, बैकप्रेशर बढ़ जाता है, प्रवाह धीमा हो जाता है और शर्बत मुक्त अंतराल से अलग किए गए कई शर्बत पैकेटों में केशिका सुधारों के अंदर भी शर्बत घोल होता है। पहले से ही पैक शर्बत एक घनी रंग लगातार बढ़ते क्षेत्र के रूप में दिखाई दे रहा है। - शर्बत भरे क्षेत्रों को पैकिंग प्रक्रिया की पूरी अवधि के लिए छोटे शर्बत मुक्त अंतराल के साथ कम से कम 70% केशिका लंबाई के रूप में रखें।
- पैकिंग प्रक्रिया के दौरान देखने के लिए कई सामान्य मुद्दे हैं, जिन्हें केशिका में कुशल शर्बत वितरण रखने के लिए ऑन-द-फ्लाइट सेटअप समायोजन की आवश्यकता होती है।
नोट: शर्बत-वितरण दक्षता समायोजन पर अधिक जानकारी तालिका 3में वर्णित हैं ।- मुद्दा 1: जब नए शर्बत केशिका में प्रवेश करना बंद कर देता है, जबकि पहले से ही अंदर शर्बत चलता रहता है, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें ।
नोट: यह सबसे लगातार मुद्दा है । ज्यादातर मामलों में केशिका प्रवेश द्वार स्वयं-एकत्रित शर्बत समूहों द्वारा अवरुद्ध हो जाता है। जब तक शर्बत प्रवाह बहाल न हो जाए, तब तक निम्नलिखित चरणों को एक-एक करके लागू करें, और फिर समस्या से संबंधित चरणों के बाकी चरणों को छोड़ दें।- रोटेशन स्पीड को 500 आरपीएम तक बढ़ाएं और तुरंत इसे वापस 60-100 आरपीएम तक कम कर दें। आमतौर पर, यह शर्बत प्रवाह को पुनर्स्थापित करता है। बाकी पैकिंग प्रक्रिया के लिए कम से कम 60 आरपीएम होने की रोटेशन स्पीड चेक करें।
- यदि यह मदद नहीं करता है, तो पैकिंग बम को संक्षेप में वेंट करें और तुरंत इसे वापस दबाव दें।
- यदि यह मदद नहीं करता है या अवरुद्ध फिर से होता है, शर्बत परत के अंदर केशिका को फिर से स्थान दें। शर्बत की अनुपस्थिति केशिका खुले अंत के कारण हो सकती है जो चुंबक पट्टी के ऊपर बहुत अधिक है, इसलिए कॉलम का अंत इसे छू नहीं जाता है, या केशिका शीशी के नीचे चिपके हुए हैं। सबसे पहले, बम को पूरी तरह से वेंट करें, अखरोट को ढीला करें, केशिका को नीचे की ओर धकेलें, और फिर इसे 2 मिमी वापस खींचें। अखरोट को ठीक करें।
- यदि अवरुद्ध बना रहता है, तो सिस्टम को वेंट करें, शर्बत शीशी और भंवर निकालें और इसे एक बार फिर से सोनिकेट करें। माइक्रोस्कोप के नीचे नुकसान के लिए केशिका ललाट अंत की जांच करें और जरूरत पड़ने पर ~ 5 मिमी सामने के अंत में कटौती करें।
- अंक 2: जब शर्बत लंबे खाली क्षेत्रों के साथ केशिका का केवल एक छोटा सा हिस्सा भरता है, तो नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।
- रोटेशन गति की जांच करें। यदि रोटेशन बहुत धीमा है, तो कपोल तोड़ना पर्याप्त कुशल नहीं है। रोटेशन की गति को ~150 आरपीएम तक बढ़ाएं।
- यदि रोटेशन बहुत तेज है, तो शर्बत बड़ी शीशी की मात्रा में फिर से निलंबित हो जाता है और कॉलम प्रवेश द्वार के आसपास स्थानीय शर्बत एकाग्रता कम है। रोटेशन की गति को 60-100 आरपीएम तक धीमा करें।
- शर्बत स्तर की जांच करें। केशिका के अंदर थोड़ा शर्बत के साथ एक ही मुद्दा मनाया जाता है जब शीशी में पर्याप्त शर्बत नहीं होता है। जब शर्बत का उपयोग किया जाता है, तो गुरुत्वाकर्षण-प्रेरित बसने के बाद शर्बत परत को 4 मिमी से कम नहीं रखने के लिए नए शर्बत के साथ शीशी भरें।
- मुद्दा 1: जब नए शर्बत केशिका में प्रवेश करना बंद कर देता है, जबकि पहले से ही अंदर शर्बत चलता रहता है, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें ।
- लक्ष्य कॉलम लंबाई प्लस 5-7 सेमी प्राप्त होने तक कॉलम की पैकिंग करते रहें।
- रोटेशन बंद करो और बहुत धीरे-धीरे बम दबाव।
- बम वाल्व थोड़ा खोलें और पानी की बोतल के अंदर बुलबुला फटने के लिए इंतजार कम करने के लिए। फिर, वाल्व को थोड़ा चौड़ा खोलें और फिर से बुलबुला फटने की प्रतीक्षा करें।
- वेतन वृद्धि में दबाव जारी जब तक कोई गैस वाल्व से बाहर आता है ।
नोट: एक बार में सभी तरह से वाल्व न खोलें - यह केशिका के अंदर बुदबुदाती और शर्बत को शीशी में वापस जाने के लिए नेतृत्व करेगा। अगर ऐसा होता है तो बम को वापस दबाव दें और कॉलम को फिर से पैक होने का इंतजार करें ।
- जब गैस वेंट वाल्व से बाहर आना बंद हो जाता है, तो खचाखच भरे केशिका को प्रेशर बम से बाहर निकाल लें।
नोट: कॉलम को सूखने न दें। यदि आगे की पैकिंग के लिए एचपीएलसी प्रणाली से तुरंत कनेक्ट नहीं किया जाता है, तो पैक किए गए केशिका को 10% एटोह समाधान में पूरी तरह से जलमग्न करके भंडारण में डाल दें। एक तरल-तंग पॉलीप्रोपाइलीन खाद्य भंडारण कंटेनर का उपयोग केशिका भंडारण के लिए किया जा सकता है। काटे गए एचपीएलसी कॉलम एक ही तरीके से संग्रहीत किए जाते हैं। - यदि आगे कोई पैकिंग की योजना नहीं है, तो बम से शर्बत शीशी निकालें और इसे कसकर बंद करें। इसे आगे कॉलम पैकिंग के लिए रखें।
5. एचपीएलसी कॉलम में पैकिंग
- एचपीएलसी कनेक्शन के माध्यम से पैक किए गए केशिका को एचपीएलसी सिस्टम से कनेक्ट करें।
- 250-300 बार दबाव को लक्षित करते हुए 95% सॉल्वेंट बी (80 या 100% एसीटोनिट्रिल, 0.1% फॉरमिक एसिड (एफए)) पर प्रवाह शुरू करें। 40 सेमी पैक्ड केशिका के लिए, 200-300 nL/min की प्रवाह दर का उपयोग करें।
नोट: पैकिंग प्रवाह दर 2 माइक्रोन शर्बत के साथ पैक 100 माइक्रोन आईडी के साथ 40-50 सेमी कॉलम के लिए 200 nL/मिनट है। कुछ अन्य कॉलम आकार तालिका 4में सूचीबद्ध हैं। अन्य कॉलम लंबाई और टीडीएस के लिए प्रवाह दरों का अनुमान बैकप्रेशर और कॉलम लंबाई और क्रॉस-सेक्शन के बीच प्रत्यक्ष समानता से किया जाता है। सटीक प्रवाह-दर वास्तविक पैक की गई लंबाई में समायोजित की जाती है, जो लक्षित कॉलम लंबाई से अधिक समय तक होती है। यह भी ध्यान दें, कि 300 बार दबाव एचपीएलसी कनेक्शन की भौतिक दबाव सीमा को लक्षित करता है। उच्च दबाव कनेक्शन के लिए, कनेक्शन दबाव सीमा तक उच्च प्रवाह दरों का उपयोग तेजी से पैकिंग के लिए किया जाना है। - केशिका के अंदर ढीले शर्बत के लिए देखें पैक हो रही है और कुल पैक लंबाई में जोड़ा जा रहा है ।
- प्रवाह को रोके बिना, स्तंभ शरीर को दो बार सोनिकेशन स्नान में डुबोएं।
नोट: कॉलम सिरों और केशिका कनेक्शन को विसर्जित न करें- कॉलम शरीर का केवल एक हिस्सा। सोनीशन स्टेप कॉलम प्रजनन क्षमता में सुधार करने में मदद करता है, विशेष रूप से बेहद लंबे कॉलम >50 सेमी लंबा (अप्रकाशित डेटा); हालांकि, यह खींचे गए उत्सर्जक केशिका के उत्सर्जक छोर के अंदर आत्म-कोडांतरण शर्बत फ्रिट को तोड़ने और कॉलम को पूरी तरह से अवरुद्ध करने का एक यादृच्छिक मौका जोड़ता है। जबकि सोनीशन को सार्वभौमिक रूप से किसी भी ग्लास-फ्रिट कॉलम पर लागू किया जा सकता है, हम केवल कॉलम की लंबाई > 50 सेमी के लिए सोनिकेट खींचे गए उत्सर्जक कॉलम का सुझाव देते हैं। - जब शर्बत बिस्तर सिकुड़ना बंद हो जाता है, तो प्रवाह को रोके बिना कॉलम शरीर को दो गुना अधिक सोनिकेशन स्नान में डुबोएं।
- 300 बार में एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए कॉलम चलाएं।
- प्रवाह को रोकें, दबाव को तीन सलाखों से नीचे छोड़ने की प्रतीक्षा करें, और कॉलम को डिस्कनेक्ट करें।
- नेत्रहीन अंतराल और मलिनकिरण की कमी के लिए कॉलम का निरीक्षण करें। यदि कोई पाया जाता है, तो प्रवाह के तहत सोनीशन दोहराया जा सकता है। महत्वपूर्ण प्रयोगों के लिए, एक नया कॉलम बनाने पर विचार करें।
- कॉलम को मनचाद लंबाई में काट लें।
नोट: ठीक से किया काटने कॉलम दक्षता के लिए एक शर्त है । मुंशी के साथ पॉलीमाइड कोटिंग में एक पायदान बनाएं, आंशिक रूप से केशिका को क्रैक करें और दो टुकड़ों को अलग करें। - एक सिरेमिक वेफर पर या लैपिंग फिल्म के साथ कॉलम फ्रंट एंड पॉलिश करें।
- यूएचपीएलसी कनेक्शन का उपयोग करके कॉलम को एलसी सिस्टम से फिर से कनेक्ट करें।
- टेबल 4के अनुसार कॉलम आईडी के आधार पर 2% बी पर काम प्रवाह दर शुरू करें । दबाव को बराबर करने और कॉलम बैकप्रेशर की जांच करने के लिए प्रतीक्षा करें।
नोट: कार्य प्रवाह दर कॉलम मापदंडों के अनुसार समायोजित की जाती है। उदाहरण के लिए, 500 एनएल/मिनट पर 30 सेमी लंबा 100 माइक्रोन आईडी कॉलम चलाया जाता है। - सुनिश्चित करें कि बैकप्रेशर अपेक्षित मूल्य के 5% के भीतर है (तालिका 5देखें), यह पुष्टि करता है कि कॉलम ठीक से पैक किया गया है और उपयोग करने के लिए तैयार है।
नोट: कॉलम बैकप्रेशर एचपीएलसी सिस्टम के ढाल चैनल में कुल दबाव है जिसमें कॉलम से पहले केशिकाओं के बैकप्रेशर को शून्य से जोड़ा गया है। साथ ही, तालिका 5 में मान मनमाने ढंग से हैं (वे मनमाने पैमाने पर क्या उम्मीद करते हैं)। कॉलम से कॉलम तक बैकप्रेशर की अंतर-प्रयोगशाला समानता एक अधिक महत्वपूर्ण संकेतक है कि सब कुछ ठीक से काम करता है। वास्तविक निरपेक्ष बैकप्रेशर कई मापदंडों पर निर्भर करता है, जैसे शर्बत आकार और विशेषताएं, केशिका आईडी, निर्माता और बैच, खींचा उत्सर्जक अंत के आकार या कांच फ्रिट के घनत्व और लंबाई, विलायक विशेषताओं और कमरे में परिवेश का तापमान आदि। यदि बैकप्रेशर बहुत अधिक है, तो संभावित मुद्दों के लिए तालिका 1 देखें।
Representative Results
फ्लैशपैक दृष्टिकोण मानक पैकिंग सेटअप पर आधारित है और एक ही पैकिंग पाइपलाइन का पालन करता है। पैकिंग मानक फ्रिटेड या खींचे गए उत्सर्जक केशिकाओं में किया जाता है। प्रमुख अनुकूलन शर्बत घोल एकाग्रता में निहित है: मानक विधि फ्लैशपैक में उपयोग किए जाने वाले उच्च केंद्रित शर्बत निलंबन के साथ असंगत है। परिणाम लंबे यूएचपीएलसी कॉलम के लिए एक तेज़ उत्पादन विधि है, उदाहरण के लिए, 1 घंटे(चित्रा 2)से कम में 1.9 मीटर सोर्बेंट के साथ 50 सेमी लंबाई के लिए पैक किया गया एक कॉलम।
फ्लैशपैक दृष्टिकोण के आवेदन को प्रदर्शित करने के लिए, 30 सेमी 100 माइक्रोन आईडी केशिका कॉलम(तालिका 6)तैयार किया गया था। ReprosilPur C18 1.9 माइक्रोन शर्बंट की पैकिंग 60 सलाखों में 50 सेमी लंबी 100 माइक्रोन आईडी खींच ली गई उत्सर्जक केशिका में की गई थी, जिसे पी 2000 लेजर पुलर द्वारा तैयार किया गया था। केशिका को 40 मिनट में ~ 40 सेमी तक पैक किया गया था जिसमें केशिका के अंदर कुछ और ढीले शर्बत छोड़ दिए गए थे। पैक्ड केशिका को एचपीएलसी सिस्टम से जोड़ा गया था और सॉल्वेंट बी (80% एसीटोनिट्रिल, 0.1% एफए) के साथ 300 एनएल/मिन पर चलाया जाता था। 5 एस सोनीसिएशन के दो राउंड के बाद फाइनल पैक्ड लेंथ ४३ सेमी थी । कॉलम काट दिया गया था, 30 सेमी तक काट दिया और एक UHPLC कनेक्शन का उपयोग कर HPLC प्रणाली से जुड़ा हुआ है । हम नियमित रूप से 360 μm स्लीवलेस तिरछी नट-फेरुल और 360 माइक्रोन स्टेनलेस स्टील यूनियन का उपयोग करते हैं। इस संयोजन को कम से कम 700 सलाखों के लिए रखती है अगर दृढ़ता से कड़ा किया। निर्मित कॉलम में 500 एनएल/मिनट पर 2% सॉल्वेंट बी पर 520 बार का बैकप्रेशर है, जो अपेक्षित मूल्य सीमा(तालिका 5)के अनुरूप है।
कॉलम दक्षता के प्रदर्शन के रूप में, हमने निर्मित 30 सेमी कॉलम का उपयोग 15 मिनट ग्रेडिएंट में साइटोक्रोम सी प्रोटीन के ट्राइप्टिक डाइजेस्ट के 50 एफएमओएल को अलग करने के लिए किया। औसत FWHM 3 एस(चित्रा 3)के आसपास था ।
तालिका 1: कॉलम के उच्च कार्य बैकप्रेशर के लिए समस्या निवारण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
तालिका 2: P2000/F लेजर पुलर कार्यक्रम। P2000/F लेजर पुलर कार्यक्रम 360 माइक्रोन ओडी 100 माइक्रोन आईडी से खींचा उत्सर्जक केशिकाओं की तैयारी के लिए कमरे के तापमान 23-25 डिग्री सेल्सियस पर आंतरिक कोटिंग के बिना केशिकाएं । कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
तालिका 3: पैकिंग प्रक्रिया के दौरान नियंत्रित करने के लिए फ्लैशपैक-विशिष्ट पैकिंग मुद्दे और चौकियां। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
तालिका 4: विभिन्न कॉलम टीडीएस और लंबाई के लिए अनुकरणीय पैकिंग और काम करने वाली प्रवाह दरें। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
तालिका 5: 2 μमीटर गोलाकार शर्बत के साथ पैक कॉलम के लिए अपेक्षित बैकप्रेशरऔर आरटी में आरपी सॉल्वेंट सिस्टम में वर्किंग फ्लो रेट (कॉलम आईडी के अनुसार) पर चलाएं । कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
तालिका 6: 30 सेमी यूएचपीएलसी कॉलम की अनुकरणीय पैकिंग। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 1:केशिका स्तंभ पैकिंग योजना। चरण 1 से 3 तैयारी कर रहे हैं, दबाव बम पैकिंग के बाद और HPLC पैकिंग द्वारा समाप्त अप । चरण 3 और 4 अल्ट्रा-कुशल फ्लैशपैक प्रोटोकॉल के लिए संशोधित किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2:मेथनॉल में 100 बार में रिप्रोसिलपुर सी18 एक्यू 1.9 माइक्रोन के साथ फ्रिटेड केशिका 100 माइक्रोन आईडी के लिए पैकिंग दर। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3:साइटोक्रोम सी के ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स के निकाले गए आयन क्रोमोग्राम। 30 सेमी लंबी 100 मिमी आईडी में 50 एफएमोल के अलग होने के बाद साइटोक्रोम सी के ट्राइप्टिक पेप्टाइड्स के आयन क्रोमेटोग्राम ने बफर बी (80% एसीटोनिट्रिल,) के एक ढाल में रिप्रसिलपुर सी18 एक्यू 1.9 माइक्रोन के साथ पैक उत्सर्जक केशिक कॉलम खींचा 0.1% एफए) और बफर ए (2% एसीटोनिट्रिल, 0.1% एफए) में 2% से 40% बी में 15 मिनट में 500 nL/min पर आरटी. डिटेक्शन एक मास-स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके किया गया था। प्रत्येक पेप्टाइड के लिए पूर्ण तीव्रता और निकाले गए मीटर/जेड पर्वतमाला को स्पेक्ट्रा के दाईं ओर दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
इन-हाउस केशिका कॉलम पैकिंग कई स्वतंत्र परियोजनाओं पर काम करने वाली बड़ी प्रयोगशालाओं में अत्यधिक लोकप्रिय है। हालांकि, कम एकाग्रता शर्बत निलंबन से एक आम पैकिंग विधि की गति में प्रमुख सीमाएं हैं और लंबे यूएचपीएलसी कॉलम का उत्पादन करने में असमर्थ है।
फ्लैशपैक मानक पैकिंग प्रक्रिया का एक संशोधन है जो बहुत अधिक शर्बत एकाग्रता से पैकिंग को संभव बनाता है। विधि का सैद्धांतिक आधार पूरी पैकिंग अवधि के लिए कॉलम प्रवेश द्वार पर निरंतर शर्बत कपोल अस्थिरता में निहित है। बाद तकनीकी रूप से कॉलम प्रवेश द्वार द्वारा प्राप्त किया जाता है लगातार एक चुंबक बार के साथ मारा जा रहा है । कपोल अस्थिरता की विधि जानबूझकर पैकिंग सेटअप पूरी तरह से आम पैकिंग प्रक्रिया के समान है विकसित की है, लेकिन फ्लैशपैक की चाल पैकिंग प्रक्रिया के दौरान शर्बत घोल तैयारी, केशिका स्थिति, और चुंबक बार उपयोग के विवरण में निहित है।
शर्बत घोल एक बड़े विलायक मात्रा में एक तलछट शर्बत परत के रूप में तैयार किया जाता है। यह दिलचस्प है कि दबाव बम आधारित पैकिंग कॉलम से कॉलम के लिए एक ही पैकिंग शर्तों की आवश्यकता नहीं है । फ्लैशपैक में, हम कॉलम प्रवेश द्वार के आसपास सटीक शर्बत घोल एकाग्रता को कभी नहीं जानते हैं। यह मापने और वास्तव में नियंत्रित करने के लिए असंभव है, क्योंकि यह भी पैकिंग प्रक्रिया के दौरान बदलता है । हालांकि, अंतिम कॉलम अभी भी बहुत प्रजनन योग्य4 हैं, भले ही पैकिंग कैसे हासिल की गई थी।
तेजी से पैकिंग के लिए आधार कुशल शर्बत कपोल अस्थिरता में निहित है । इस कारण से, केशिका में प्रवेश करने वाले शर्बत को नियंत्रित करना और पूरी पैकिंग अवधि में इष्टतम कपोल अस्थिरता की स्थिति को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। ऐसे कई संभावित मुद्दे हैं जो कुशल शर्बत वितरण को रोक सकते हैं। इनमें से कुछ उदाहरण तेजी से चुंबकीय बार रोटेशन द्वारा शर्बत परत पुनः प्राप्त कर रहे हैं, अक्षम कपोल चुंबक बार स्थिति या बहुत धीमी चुंबक बार रोटेशन के लिए या तो गलत रिश्तेदार केशिका के कारण अस्थिरता । मुद्दों को स्वयं और उनका समाधान कैसे किया जाना है, प्रोटोकॉल अनुभाग में विस्तार से चर्चा की जाती है ।
कॉलम पैक होने के बाद, जांच करने के लिए प्रमुख कॉलम पैरामीटर कॉलम बैकप्रेशर है। तालिका 5 में सूचीबद्ध दबाव मान लोकप्रिय उप 2 माइक्रोन मनका आकार शर्बत-ReproSil PUR C18 AQ (1.9 माइक्रोन) में से एक के लिए उम्मीद है के लिए एक संदर्भ बिंदु प्रदान करता है। एक ही समय में, अतिरिक्त बैकप्रेशर फ्रिट या एक बहुत संकीर्ण खींच लिया उत्सर्जक द्वारा जोड़ा जा सकता है और एक लगातार उस के लिए निगरानी करनी चाहिए । यदि पैकिंग एक खींचा उत्सर्जक में किया जाता है, हम अभी भी पहले fritted केशिकाओं पैकिंग द्वारा उपयोग में विशेष रूप से शर्बत के लिए अपेक्षित कॉलम बैकप्रेशर को मापने का सुझाव है, और फिर देखने के लिए कि क्या स्वयं कोडांतरण फ्रिट बहुत ज्यादा कहते हैं । किसी भी उच्च दबाव के मुद्दों के लिए, समस्या को इंगित करने के लिए तालिका 1 में दिए गए दिशा-निर्देशों का उपयोग करें।
हमारे अनुभव में, मलिनकिरण, अंतराल के बिना एक पैक कॉलम, और उचित बैकप्रेशर के साथ 100% मामलों में काम करता है और कॉलम लंबाई और शर्बत विशेषताओं से उम्मीद की जा सकती है के करीब पृथक्करण गुणवत्ता देता है। मलिनकिरण के साथ एक कॉलम ठीक से काम करने की गारंटी नहीं है, लेकिन अभी भी संतोषजनक परिणाम दे सकते हैं ।
अधिकांश समय, यदि सेपरेशन गुणवत्ता के साथ कोई समस्या है, तो वे कॉलम से ही नहीं आते हैं, बल्कि सेपरेशन सिस्टम के अन्य हिस्सों, अर्थात् पंप, सॉल्वैंट्स या कनेक्शन से आते हैं। विशेष रूप से संभावित रूप से हानिकारक कोई भी पोस्ट-कॉलम कनेक्शन है। उत्सर्जक और फ्रिट कॉलम के बीच एक मृत मात्रा के साथ बुरा संबंध केशिका क्रोमेटोग्राफी में बहुत कम प्रवाह दरों के कारण प्रमुख चोटी को व्यापक और टेलिंग की ओर ले जाता है।
फ्लैशपैक दृष्टिकोण के लिए विशिष्ट एक और महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि यह एक काम करने वाले शर्बत घोल शीशी में बहुत सारे महंगे शर्बत का उपयोग करता है। कृपया याद रखें, कि फ्लैशपैक में शर्बत घोल कई उपयोग के लिए है। शर्बत का ध्यान रखें। शर्बत पीसने को कम करने के लिए अनावश्यक चुंबक बार सरगर्मी से बचें- पैकिंग समाप्त होते ही रोटेशन को रोकना याद रखें। और शर्बत सुखाने से बचने के लिए प्रेशर बम में खुली शर्बत शीशी न छोड़ें। हालांकि शर्बत अभी भी उसके बाद इस्तेमाल किया जा सकता है, यह शर्बत घोल रीमेक करने के लिए समय लगता है ।
विधि दोनों फ्रिटेड केशिकाओं और खींचे गए उत्सर्जक केशिकाओं के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम करती है। फ्लैशपैक सिद्धांत केशिका डिलरी डीएस के लिए पैकिंग दर को 20 से बढ़ाकर 250 माइक्रोन (छोटे और बड़े परीक्षण नहीं किया गया)। यह सभी शर्बतों पर भी लागू होता है, दोनों पूरी तरह से और सतही रूप से असुरक्षित, हम परीक्षण कर सकते हैं (यह दर्शाता है कि उच्च शर्बत घोल एकाग्रता में शर्बत कपोल गठन विशेष रूप से आरपी शर्बत तक सीमित नहीं है)। इसके अलावा, विलायक पैरामीटर स्पष्ट रूप से उनकी भौतिक और रासायनिक विशेषताओं के अनुसार पैकिंग को प्रभावित करते हैं। उदाहरण के लिए, कम चिपचिपा एसीटोन एक ही पैकिंग दबाव पर मेथनॉल की तुलना में भी अधिक पैकिंग दर देता है। हालांकि, यह मेथनॉल की तुलना में कम ध्रुवीय भी है और एक दूसरे से चिपके हुए शर्बत कणों को कम करता है। अपने आप में प्रभाव पैकिंग की शुरुआत में शर्बत कपोल गठन को रोकता है जब फ्लोरेट अभी भी अधिक है। हालांकि, शर्बत कण बातचीत में कमी भी कम विश्वसनीय आत्म कोडांतरण फ्रिट गठन और अधिक लगातार खींच लिया अंत पैकिंग के दौरान अवरुद्ध करने की ओर जाता है । इसलिए, जबकि एसीटोन फ्रिटेड केशिकाओं की पैकिंग के लिए बेहतर है, यह खींचे गए उत्सर्जक केशिकाओं के लिए कम उपयुक्त है, मेथनॉल के साथ एक घोल विलायक के रूप में धीमा है लेकिन दोनों प्रकार के समाप्त होने के लिए उपयुक्त है। हेक्सेन या डाइक्लोरोमेथेन (डीसीएम) से पैकिंग मेथनॉल से एसीटोन पर स्विच करने के चरम मामले हैं: वे और भी कम ध्रुवीय हैं, इसलिए वे शर्बत कपोल गठन को पूरी तरह से रोकते हैं, हालांकि वे खींचे गए उत्सर्जक पैकिंग के लिए बिल्कुल फिट नहीं हैं। इसके अलावा, यह ध्यान दिया गया था कि बेहद कम डीसीएम ध्रुवता आंतरिक केशिका की दीवार से चिपके हुए और उस पर एक मोटी परत बनाने वाले शर्बत कणों की ओर जाता है। परत की मोटाई धीरे-धीरे बढ़ती है और यादृच्छिक स्थानीय ब्लॉक बनते हैं जिसके परिणामस्वरूप बिना शर्बत के क्षेत्रों द्वारा अलग किए गए कई हिस्सों में कॉलम पैक होता है। इस तरह के प्रभाव C18 पेप्टाइड एरिस शर्बत के लिए मनाया गया था।
एक और मनाया मुद्दा YMC Triart C18 शर्बत मेथनॉल में ठीक से निलंबित नहीं किया जा रहा था, लेकिन गुच्छे के कुछ प्रकार के रूप में । हालांकि, यह फ्लैशपैक के साथ पैक होने और बहुत अच्छी पृथक्करण दक्षता (अप्रकाशित डेटा) देने से नहीं रोकता है। इस प्रकार, कुछ मामलों के लिए इष्टतम नहीं होने के दौरान, मेथनॉल सभी परीक्षण शर्बत और स्तंभों के लिए काम करने के लिए सबसे सार्वभौमिक विलायक था। यह उल्लेख करना आवश्यक है कि हमने अभी तक विश्लेषण नहीं किया कि विभिन्न घोल सॉल्वैंट्स कॉलम सेपरेशन दक्षता को कैसे प्रभावित करते हैं। साथ ही, मेथनॉल से पैक किए गए स्तंभों की दक्षता पहले से ही एक ही शर्बत4के लिए वाणिज्यिक स्तंभों के बराबर है।
फ्लैशपैक यूएचपीएलसी कॉलम की पैकिंग दर में सुधार करने के लिए एकमात्र मौजूदा दृष्टिकोण नहीं है। उच्च शर्बत घोल एकाग्रता से तेजी से पैकिंग भी अल्ट्रा उच्च दबावपैकिंग 7के उपयोग के साथ संभव है । फ्लैशपैक का लाभ यह है कि यह बहुत सरल है क्योंकि इसमें शर्बत वितरण और केशिका कनेक्शन के लिए विशेष अल्ट्रा-हाई प्रेशर पंप और प्रेशर बम की आवश्यकता नहीं होती है। साथ ही, यह प्रदर्शित किया गया था कि अत्यधिक दबावों पर पैक किए गए स्तंभों में कम दबाव पैक किए गए कॉलम17की तुलना में पृथक्करण दक्षता अधिक हो सकती है। और जब फ्लैशपैक तुलना 4 में उपयोग किए जाने वाले वाणिज्यिक लोगों के समान कॉलम का उत्पादन करता है, जिसके लिए हमपैकिंगविधि नहीं जानते हैं, तो अभी तक यह परीक्षण नहीं किया गया था कि फ्लैशपैक कॉलम अल्ट्रा-हाई प्रेशर पैक किए गए कॉलम के खिलाफ कैसे खड़े होते हैं।
संक्षेप में, वर्णित फ्लैशपैक विधि को प्रोटोकॉल में किए गए कुछ समायोजनों के साथ प्रयोगशाला में मौजूदा पैकिंग प्रोटोकॉल के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, जबकि सेटअप पूरी तरह से एक ही रहता है। यह एचपीएलसी केशिका कॉलम को मिनटों के समय तक पैकिंग करने की गति देता है और लंबे यूएचपी केशिका कॉलम के उत्पादन की अनुमति देता है, जो मानक पैकिंग प्रक्रिया के साथ स्पष्ट रूप से असंभव है। फ्लैशपैक दृष्टिकोण के आवेदन द्वारा प्रयोगशाला के लिए समय और पैसे में समग्र अर्थव्यवस्था को प्रति वर्ष हजारों यूरो में गिना जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यूएचपी केशिका स्तंभों का उत्पादन करने की क्षमता स्थानीय रूप से उपलब्ध वाणिज्यिक उत्पादों के साथ असंभव प्रयोग अनुकूलन के लिए संभावनाओं को खोलती है।
Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
इस काम को आरएसएफ ग्रांट 20-14-00121 से सपोर्ट मिला। लेखक उपयोगी चर्चाओं के लिए पी वी श्लियाहा (मेमोरियल स्लोन केटरिंग कैंसर सेंटर) का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59002 | |
| centrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | ||
| Ceramic Scoring Wafer | Restek | 20116 | any ceramic wafer is suitable for capillary polishing |
| Diamond-chip bladed scribe | NewObjective | Diamond-chip bladed scribe | recommended for capillary cutting |
| fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD | CM Scientific | TSP100375 | |
| GELoader tips | Eppendorf | 30001222 | |
| HPLC system | ThermoScientific | Ultimate3000 RSLCnano | |
| laser puller | Sutter | P2000/F | |
| magnet bar 2x5 mm | Merck | Z283819 | |
| MeOH | Merck | 1.06018 | |
| microspatula | Merck | Z193216 | |
| PEEK ferrule 360 mm | VICI | JR-C360NFPK | use to connect the column to UPLC union |
| pipette tip, 1000 uL | Merck | Z740095 | |
| pipette, 1000 uL | Gilson | Pipetman L P1000L | |
| pressure bomb | NextAdvance | PC-77 MAG | |
| regulator | GCE | Jetcontrol 600 200/103 | |
| Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm | Dr. Maisch | r13.aq.0001 | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL | Merck | AXYST050SS | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL | Merck | AXYST150SS | |
| Screw caps with O-rings | Merck | AXYSCOC | |
| sonication bath | Elma | Elmasonic S30 H | |
| union HPLC | VICI | JR-C360RU1PK6 | HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| union UPLC | VICI | JR-C360RU1FS6 | UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| vortex | BioSan | V-1plus | |
| Water with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59013 |
References
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