Summary
Her præsenterer vi en protokol til den optimerede FlashPack kapillær kolonne pakning procedure. Anvendelse af en optimeret protokol til en fælles 100-bar trykbombe setup giver mulighed for 10 gange hurtigere pakning og fremstilling af lange ultra-højtydende kapillær kolonner.
Abstract
Kapillær ultrahøjtydende flydende kromatografi (UHPLC) er i øjeblikket en valgfri metode til prøveadskillelsestrinnet i LC-MS-baserede proteomics. Kapillær kolonner er dog langt mindre robuste i forhold til deres højere flowtællertyper. På grund af nem forurening og blokering har de ofte brug for udskiftning. Det gør dem til en markant dyr del af de samlede LC-MS-analyseomkostninger. Intern pakning af UHPLC kapillær kolonner sparer en masse penge og giver mulighed for tilpasning. Standardpakningsproceduren i trykbomben på 100 bar fungerer dog kun godt for HPLC-kolonner, men er for langsom til UHPLC-sorbenter. Her giver vi en beskrivelse af en optimeret FlashPack-protokol, der anvendes på den samme 100-bar trykbombeopsætning. Metoden er baseret på pakning fra ultrahøj sorbentkoncentrationsstør og er udviklet til intern fremstilling af UHPLC kapillærsøjler af ubegrænset længde i rimelig tid.
Introduction
Moderne proteomics er baseret på flydende kromatografi-koblet massespektrometri med den ultrahøjtydende nanostrømskromatografi (50-150 μm kolonne intern diameter (ID)) adskillelse, der giver den bedste analysehastighed og følsomhed1. Mens mange kommercielle UHPLC kapillær kolonner er tilgængelige, deres pris udgør en stor del af forbrugsstoffer omkostninger, især når flere forskellige projekter køres i laboratoriet og projekt-specifikke kolonne forurening er et hyppigt problem. Desuden giver pakning af kolonner internt mulighed for brug af brugerdefinerede eksperimentspecifikke sorbenter (f.eks. polyCAT-A sorbent2) og kolonneegenskaber, der ikke er tilgængelige til køb som en færdig kolonne.
For at klare det pakker mange laboratorier kapillærsøjler internt. Den almindelige pakningsprocedure med en trykbombe på 100 bar (trykindsprøjtningscelle)3 er imidlertid uegnet til UHPLC-kolonnepakningen på grund af højt rygtryk på sub-2 μm UHPLC-sorbenter, hvilket resulterer i en dramatisk pakningssatsreduktion sammenlignet med større HPLC-sorbenter. Mens korte UHPLC kolonner stadig kan være meget langsomt pakket, fremstilling af lange UHPLC kolonner er fysisk umuligt4.
Standard kapillær kolonne pakning sker ved relativt lavt tryk-op til 100 barer, og med en meget lav sorbent gylle koncentration. Derfor er to mulige retninger for fremskyndelse af processen tilgængelige. Det er muligt at øge pakningstrykket5. Dette kræver dog specielt udstyr og praktisk talt installation af en ny metode i laboratoriet. En anden måde er at øge sorbent gyllekoncentrationen6. Høj sorbent gyllekoncentrationspakning er beskrevet i kombination med ultrahøjt emballagetryk i en tidligere publikation7. Men ved 100 bartryk, som bruges i de fleste af de eksisterende pakkebomber, resulterer højere sorbentkoncentration i enten pakningshastighed langsommere eller direkte pakningsstop. Effekten blev for nylig vist sig at skyldes sorbent klyngedannelse ved kolonneindgangen, og et simpelt trick af sorbent kuppel destabilisering ved at hamre kolonneindgangen med en magnetbjælke inde i et sorbent hætteglas blev foreslået4. Den resulterende metode, der hedder FlashPack, bruger den samme 100-bar trykbombe pakning setup. Samtidig tillader mindre, men kritiske ændringer i pakningsproceduren pakning fra meget høj sorbent gyllekoncentration og produktion af meget lange UHPLC-kolonner (50 til 70 cm og længere) på mindre end en time, mens en kort kolonne kan produceres på få minutter med separationskvaliteten svarende til kommercielle kolonner af samme parametre4. FlashPack-tilgangen blev allerede anvendt med succes i flere proteomics-projekter til udarbejdelse af både omvendt fase (RP)8,9,10,11,12,13,14 og hydrofil interaktion (HILIC)2 kapillærkolonner.
Her beskriver vi i detaljer de ændringer, der er nødvendige for tilpasning af FlashPack-tilgangen til standard 100-bar trykbombepakningsproceduren.
Protocol
Pakkeprotokollen består af fem trin (figur 1):1) Pakningsstationsforberedelse, 2) kapillærforberedelse, 3) sorbent gylleforberedelse, 4) kapillærpakning i trykbomben og 5) kolonnepakning i HPLC-systemet, opskæring op til størrelse og UHPLC-forbindelsesinstallation. FlashPack-optimeringen kræver, at der foretages justeringer i afsnit 3 og 4 sammenlignet med den fælles protokol.
1. Pakning station samling
- Forbered en gastank fyldt med enten nitrogen, helium eller argon møbleret med en enkelt fase gas regulator med udløbstrykket > 50 barer. Maksimalt tryk er begrænset af trykbombekompatibiliteten.
- Tilslut regulatoren til trykbombens udluftningsventil.
- Hvis trykbomben ikke er udstyret med en integreret magnetisk omrører, skal bomben placeres på en magnetisk omrører.
- Tilslut en smal ID plastrør (f.eks. 0,13 mm) til trykbombens udluftningsudtag, og læg den i et fartøj med vand.
2. Kapillær forberedelse
- Forbered en fritted kapillær med en integreret glas frit dannet af Kasil og formamid15 eller en trukket emitter kapillær udarbejdet af en laser puller16. Kapillæren er lavet 10-15 cm længere end den tilsigtede kolonnelængde.
BEMÆRK: Se tabel 1 for at drøfte mulige spørgsmål i forbindelse med forskellige kapillærstørrelser og frit typer. Tabel 2 indeholder et eksempel på et P2000 lasertræksprogram til fremstilling af kapillærer til pull-emitter. - Beskyt en trukket emitter ende med en skåret gel-loading pipette spids.
- Skær spidsen, så den passer tæt omkring 360 μm OD kapillær (det kan flyttes langs kapillær, men kræver en vis indsats for at gøre det).
- Skub den afskårne pipettespids på kapillæren fra kapillærens retning forende, og flyt den op til udlederenden.
- Skub beskyttelsesspidsen tilbage, når kolonnen sprøjter. Skub spidsen fremad for at få emitteren ende inde i spidsen, når kolonnen ikke sprøjter (selv når kolonnen er under strømmen, men stadig ikke sprøjtning).
3. Sorbent gylle forberedelse
- Forbered en bestand sorbent hætteglas: Placer ~ 50 mg tør sorbent i en 1,5 mL centrifuge rør. Her bruges Reprosil Pur C18 som eksempel.
- Tilsæt 1 mL methanol til sorbentrøret.
- For at blande det helt, vortex røret i 10 s ved hjælp af en vortex mixer.
- Sonikere i et sonikeringsbad i 10 s.
- Lad sorbent få gennemblødt grundigt i 20-30 min. Derefter hvirvle og sonikere det igen.
- Forbered et fungerende sorbent hætteglas. Brug et konisk bundglas, der passer ind i bomben.
BEMÆRK: Det kan enten være et andet 1,5 mL centrifugerør eller ethvert andet hætteglas afhængigt af det særlige trykbombedesign. Til dette eksperiment anvendes koniske nederste skruehætterør, der skæres til trykbombens højde. - Resuspend sorbent i bestanden sorbent hætteglas og overføre 500 μL i fungerende sorbent hætteglas med en magnet bar på 2 x 3 mm størrelse.
- Tilsæt methanol op til ~ 1 mL til det arbejdende hætteglas.
- Lad arbejdsglaset stå på bordet i 10 minutter, så sorbenet kan afregne ved tyngdekraften.
- Hvis sorbentlaget efter afregning er under 4 mm, tilsæt mere af bestanden sorbent gylle og vent på, at sorbenten afregner i yderligere 10 minutter.
BEMÆRK: Det forberedte arbejdsglas er beregnet til udarbejdelse af flere kolonner over måneder. Hvis det arbejdende sorbent hætteglas forbliver uden omrøring i mere end 2 timer, skal det hvirvles i 10 s, sonikeres i 10 s og afregnes ved tyngdekraften. Rutinemæssigt suspenderes sorbent om morgenen før pakning. Derefter er det godt til pakning for hele dagen, hvis der ikke er lange pauser mellem sekventiel kolonnepakning. Hvis sorbentet i arbejdsglasset tørrer ud, tilsættes methanol og kører den fulde sorbentforberedelse som for bestandens sorbent-hætteglas (trin 3.2-3.5).
4. Kapillær pakning i en trykbombe
FORSIGTIG: Brug altid beskyttelsesbriller, når du arbejder med trykbomben. Brug ikke handsker. Disse reducerer alvorligt den følesans, der kræves for korrekt håndtering af kapillærer med lille diameter og fører til fejl.
- Placer sorbent hætteglasset i trykbomben og fastgør alle nødderne tæt.
- Start rotationen ved 60-100 omdrejninger.
- Indsæt den fritted eller trukket emitter kapillær i bomben: skubbe den til bunden af hætteglasset, og løft den derefter op 2-3 mm og fastgør møtrikken.
BEMÆRK: Påfør en minimal kraft for at fastgøre kapillæren for at undgå kapillær- og ferruleskader. Det bedste er håndstramning. Hvis der anvendes en hex-skruenøgle, skal du anvende en tilstrækkelig minimal indsats for at stramme. - Kontroller, om kapillæren er korrekt fastgjort - det må være umuligt at flytte kapillæren ved at trække den ud i hånden.
- Meget langsomt åbne trykbombe ventilen samtidig holde den åbne ende af kapillær pegede væk fra dit ansigt.
- Se de første trin i pakkeprocessen.
BEMÆRK: Umiddelbart efter tryk fylder sorbenten kapillæren, og den bliver uigennemsigtig for hele længden. Så snart sorbent begynder at pakke inde i den distale ende, stiger backpressuret, strømmen sænkes, og den selv sorbent gylle inde i kapillærreformen i flere sorbentpakker adskilt af sorbentfrie huller. Allerede pakket sorbent er synlig som en tæt farvet kontinuerligt voksende region. - Hold de sorbentfyldte områder mindst 70% af kapillærlængden med små sorbentfrie huller i hele pakningsprocessens varighed.
- Der er flere almindelige problemer at se under pakningsprocessen, der kræver justering af opsætningen på flyvningen for at holde effektiv sorbentlevering ind i kapillæren.
BEMÆRK: Flere oplysninger om effektivisering af sorbentlevering er beskrevet i tabel 3.- Problem 1: Når ny sorbent holder op med at komme ind i kapillæren, mens sorbent allerede inde holder sig i bevægelse, skal du følge nedenstående trin.
BEMÆRK: Dette er det hyppigste problem. I de fleste tilfælde bliver kapillærindgangen blokeret af selvsammensvækkende sorbentklynger. Anvend følgende trin en efter en, indtil sorbentflowet er genoprettet, og spring derefter resten af de problemrelaterede trin over.- Forøg rotationshastigheden til 500 omdr./min. og reducer den straks tilbage til 60-100 omdr./min. Normalt genopretter det sorbent-flowet. Kontroller, at rotationshastigheden er mindst 60 omdr./min. for resten af pakkeprocessen.
- Hvis det ikke hjælper, skal du kortvarigt lufte pakningsbomben og straks trykke den tilbage.
- Hvis det ikke hjælper, eller blokeringen sker igen, skal kapillæren flyttes inde i sorbentlaget. Fraværet af sorbenten kan skyldes, at den kapillær åbne ende enten er for højt over magnetbjælken, så kolonneafslutningen ikke rører den, eller kapillæren klæber ind i hætteglasbunden. Først skal du lufte bomben helt, løsne møtrikken, skubbe kapillæren til bunden og derefter trække den 2 mm tilbage. Fix møtrikken.
- Hvis blokeringen fortsætter, udluft systemet, tage sorbent hætteglas og vortex og sonikere det igen. Kontroller kapillær frontalden for skader under mikroskopet, og skær ~ 5 mm af forenden, hvis det er nødvendigt.
- Spørgsmål 2: Når sorbenten kun fylder en lille del af kapillæren med lange tomme områder, skal du følge nedenstående trin.
- Kontroller rotationshastigheden. Hvis rotationen er for langsom, er kuppelbrud ikke effektiv nok. Forøg rotationshastigheden til ~150 omdr./min.
- Hvis rotationen er for hurtig, bliver sorbenten suspenderet i det større hætteglasvolumen, og den lokale sorbentkoncentration omkring kolonneindgangen er lav. Sænk rotationshastigheden ned til 60-100 omdr./min.
- Tjek sorbentniveauet. Det samme problem med lidt sorbent inde i kapillæren observeres, når der ikke er nok sorbent i hætteglasset. Når sorbenten bliver brugt op, fylde hætteglasset med den nye sorbent for at holde sorbentlaget ikke mindre end 4 mm højt efter tyngdekraftsfremkaldt afregning.
- Problem 1: Når ny sorbent holder op med at komme ind i kapillæren, mens sorbent allerede inde holder sig i bevægelse, skal du følge nedenstående trin.
- Fortsæt med at pakke kolonnen, indtil målkolonnens længde plus 5-7 cm er opnået.
- Stop rotationen og tryk langsomt bomben ned.
- Åbn bombeventilen lidt og vent på boblen brast inde i vandflasken til at stilne af. Åbn derefter ventilen lidt bredere og vent igen på, at boblen brister for at bremse.
- Slip trykket i trin, indtil der ikke kommer gas ud af ventilen.
BEMÆRK: Åbn ikke ventilen hele vejen på én gang - det vil føre til boblende inde i kapillæren og sorbenten går tilbage i hætteglasset. Hvis det sker, skal du trykke på bomben tilbage og vente på, at kolonnen pakkes igen.
- Når gassen holder op med at komme ud af udluftningsventilen, skal du tage den pakkede kapillær ud af trykbomben.
BEMÆRK: Lad ikke kolonnen tørre ud. Hvis den ikke er tilsluttet HPLC-systemet med det samme til yderligere pakning, skal du lægge den pakkede kapillær på lager ved at nedsænke den hele i 10% EtOH-opløsning. En væsketæt polypropylen fødevareopbevaringsbeholder kan bruges til kapillær opbevaring. Frakoblede HPLC-kolonner gemmes på samme måde. - Hvis der ikke er planlagt yderligere pakning, skal du tage sorbentglastet ud af bomben og lukke det tæt. Hold det til yderligere kolonne pakning.
5. Pakning i HPLC-kolonnen
- Tilslut den pakkede kapillær til HPLC-systemet via en HPLC-forbindelse.
- Start flowet ved 95% opløsningsmiddel B (80 eller 100% acetonitril, 0,1% myresyre (FA)) rettet mod 250-300 bartryk. For 40 cm pakket kapillær, bruge strømningshastighed på 200-300 nL/min.
BEMÆRK: Pakningsflowhastigheden er 200 nL/min for 40-50 cm kolonne med 100 μm ID pakket med 2 μm sorbent. Nogle andre kolonnestørrelser er angivet i tabel 4. Flowhastigheder for andre kolonnelængder og id'er estimeres ud fra den direkte proportionalitet mellem rygtrykket og kolonnelængden og tværsnit. Den nøjagtige strømningshastighed justeres til den faktiske pakkelængde, som som standard er længere end den målrettede kolonnelængde. Bemærk også, at 300 bar trykket er rettet mod den fysiske trykgrænse for HPLC-forbindelsen. Ved forbindelser med højere tryk skal der bruges højere flowhastigheder op til tilslutningstryksgrænsen til hurtigere pakning. - Hold øje med den løse sorbent inde i kapillæren, der bliver pakket og bliver tilføjet til den samlede pakkede længde.
- Uden at stoppe strømmen, dyppe kolonne kroppen to gange i sonikering bad.
BEMÆRK: Du må ikke nedsænke kolonneende og kapillærforbindelser kun en del af kolonnekroppen. Sonikeringstrin hjælper med at forbedre kolonne reproducerbarheden, især for ekstremt lange kolonner >50 cm lange (ikke-offentliggjorte data); det tilføjer dog en tilfældig chance for at bryde den selvmontering sorbent frit inde i emitter slutningen af trukket emitter kapillær og blokere kolonnen helt. Mens sonikering kan anvendes universelt på enhver glas-fritted kolonner, foreslår vi sonikering trukket emitter kolonner kun for kolonne længde > 50 cm. - Når sorbent sengen holder op med at krympe, dyppe kolonnekroppen i sonikeringsbadet to gange mere uden at stoppe strømmen.
- Kør kolonnen i yderligere 10 min på 300 barer.
- Stop flowet, vent på, at trykket falder til under tre søjler, og afbryd kolonnen.
- Undersøg visuelt kolonnen for manglen på huller og misfarvninger. Hvis der findes nogen, kan sonikering under strømmen gentages. For kritiske eksperimenter, overveje at lave en ny kolonne.
- Skær kolonnen til den ønskede længde.
BEMÆRK: Korrekt udført skæring er en forudsætning for kolonneeffektivitet. Lav et hak i polyimidbelægning med skriveren, knæk delvist kapillæren og træk to stykker fra hinanden. - Polere søjlen forende på en keramisk wafer eller med lapping film.
- Tilslut kolonnen igen til remburs-systemet ved hjælp af en UHPLC-forbindelse.
- Start arbejdsflowhastigheden ved 2 % B afhængigt af kolonne-id'et i henhold til tabel 4. Vent på, at trykket ekvilibrerer og kontroller kolonnepresset.
BEMÆRK: Arbejdsflowhastigheden justeres i henhold til kolonneparametre. For eksempel køres en 30 cm lang 100 μm ID kolonne ved 500 nL/min. - Sørg for, at tilbagetrykket ligger inden for 5 % af den forventede værdi (se tabel 5) Dette bekræfter, at kolonnen er pakket korrekt og er klar til brug.
BEMÆRK: Kolonneryggetrykket er det samlede tryk i gradientkanalen på HPLC-systemet med kolonnen tilsluttet minus kapillærernes rygtryk før kolonnen. Samtidig er værdierne i tabel 5 vilkårlige (de giver en vilkårlig skala over, hvad de kan forvente). Backpressurets intralaboratorielighed fra kolonne til kolonne er en vigtigere indikator for, at alt fungerer korrekt. Det faktiske absolutte tilbagetryk afhænger af mange parametre, såsom sorbent størrelse og egenskaber, kapillær ID, producent og batch, formen af den trak emitter ende eller tætheden og længden af glasset frit, opløsningsmiddel egenskaber og omgivelsestemperaturen i rummet, osv. Hvis rygtrykket er for højt, skal du se tabel 1 for mulige problemer.
Representative Results
FlashPack-tilgangen er baseret på standardpakkeopsætningen og følger den samme pakkepipeline. Pakning sker i standard fritted eller trukket emitter kapillærer. Hovedoptimeringen ligger i sorbent gyllekoncentrationen: Standardmetoden er uforenelig med en højkoncentreret sorbentaffjedring, der anvendes i FlashPack. Resultatet er en hurtig produktionsmetode for lange UHPLC-kolonner, f.eks. en kolonne, der er pakket i 50 cm længde med 1,9 μm sorbent på mindre end 1 h (Figur 2).
For at demonstrere anvendelsen af FlashPack-tilgangen blev der udarbejdet en 30 cm 100 μm ID kapillær kolonne (tabel 6). Pakning af ReprosilPur C18 1,9 μm sorbent blev udført på 60 barer i en 50 cm lang 100 μm ID trukket emitter kapillær, udarbejdet af en P2000 laser puller. Kapillæren var pakket til ~ 40 cm i 40 minutter med nogle mere løs sorbent tilbage inde i kapillæren. Den pakkede kapillær blev tilsluttet et HPLC-system og kørte ved 300 nL/min med opløsningsmiddel B (80% acetonitril, 0,1% FA). Efter to runder af 5 s sonikering, den endelige pakket længde var 43 cm. Kolonnen blev afbrudt, skåret til 30 cm og tilsluttet HPLC-systemet ved hjælp af en UHPLC-forbindelse. Vi bruger rutinemæssigt 360 μm ærmeløs PEEK nut-ferrule og 360 μm rustfrit stål union. Denne kombination rummer mindst op til 700 stænger, hvis den strammes kraftigt. Den fremstillede kolonne har et tilbagetryk på 520 stænger ved 2% opløsningsmiddel B ved 500 nL/min, hvilket er i overensstemmelse med det forventede værdiinterval (tabel 5).
Som en demonstration af søjleeffektiviteten brugte vi den fremstillede 30 cm kolonne til at adskille 50 fmol af en tryptisk fordøje af cytochrom C-protein i en 15 min gradient fra 2% til 50% B. Udvundne ionkromamatrammer viste toppe at være meget symmetriske med minimal tailing. Gennemsnitlig FWHM var omkring 3 s(Figur 3).
Tabel 1: Fejlfinding i forbindelse med højtryk af kolonnen. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2: P2000/F lasertræk program. P2000/F laser puller program til fremstilling af trukket emitter kapillærer fra 360 μm OD 100 μm ID smeltet silica polyimid belagt kapillærer uden intern belægning ved stuetemperaturer 23-25 °C. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3: FlashPack-specifikke pakkeproblemer og checkpoints, der skal kontrolleres under pakningsprocessen. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 4: Eksemplarisk pakning og arbejdsflowhastigheder for forskellige kolonne-id'er og længde. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 5: Forventet tilbagetryk for en kolonne fyldt med 2 μm sfæriske sorbenter og køre ved arbejdsflowhastighed (i henhold til kolonne-id) i RP opløsningsmiddel system på RT. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 6: Eksemplarisk pakning af 30 cm UHPLC kolonne. Klik her for at downloade denne tabel.
Figur 1: Kapillær kolonnepakningsordning. Fase 1 til 3 er forberedende, efterfulgt af trykbombepakning og færdig med HPLC-pakning. Fase 3 og 4 ændres til den ultraeffektive FlashPack-protokol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Pakkehastighed for en fritted kapillær 100 μm ID med ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm ved 100 barer i methanol.
Figur 3: Ekstraheret ionkromatogrammer af tryptiske peptider af cytochrom C. Ekstraheret ionkromamatrammer af tryptiske peptider af cytochrom C efter adskillelse af 50 fmol i 30 cm lang 100 mm ID trukket emitter kapillær kolonne pakket med ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm i en gradient af buffer B (80% acetonitrile, 0,1% FA) og i buffer A (2% acetonitril, 0,1% FA) fra 2% til 40% B i 15 min ved 500 nL/min på RT. Detektion blev udført ved hjælp af et massespektrometer. Absolutte intensiteter og udvundne m/z-intervaller for hvert peptid vises til højre for spektret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
In-house kapillær kolonne pakning er meget populær i store laboratorier, der arbejder på flere uafhængige projekter. En almindelig pakkemetode fra en lav koncentration sorbent suspension har store begrænsninger i hastigheden og er ude af stand til at producere lange UHPLC kolonner.
FlashPack er en ændring af standardpakningsproceduren, som gør pakning fra en meget høj sorbentkoncentration mulig. Det teoretiske grundlag for metoden ligger i den kontinuerlige sorbent kuppel destabilisering ved kolonneindgangen for hele pakningsvarigheden. Sidstnævnte opnås teknisk ved kolonneindgang, der kontinuerligt rammes med en magnetstang. Metoden til kup destabilisering er bevidst udviklet til at have pakning setup helt ligner den fælles pakning proces, men tricket med FlashPack ligger i detaljerne i sorbent gylle forberedelse, kapillær positionering, og magnet bar brug under pakningsprocessen.
Sorbent gyllen fremstilles som et sedimentsparnelag i et stort opløsningsmiddelvolumen. Det er interessant, at trykbombebaseret pakning ikke kræver de samme pakningsbetingelser for kolonne til kolonne. I FlashPack kender vi aldrig den nøjagtige sorbent gyllekoncentration omkring kolonneindgangen. Det er umuligt at måle og kontrollere nøjagtigt, da det også ændres under pakningsprocessen. De sidste kolonner er dog stadig meget reproducerbare4, uanset hvordan pakningen blev opnået.
Grundlaget for den hurtige pakning ligger i den effektive sorbent kuppel destabilisering. Af denne grund er det vigtigt at kontrollere sorbent ind i kapillæren og opretholde de optimale kuppel destabiliseringsforhold gennem hele pakningsvarigheden. Der er flere mulige problemer, der kan forhindre effektiv sorbent levering. Nogle eksempler på disse er sorbent lag resuspension ved hurtig magnetisk bar rotation, ineffektiv kup destabilisering på grund af enten forkert relativ kapillær til magnet bar positionering eller for langsom magnet bar rotation. Spørgsmålene selv, og hvordan de skal behandles, drøftes i detaljer i protokolafsnittet.
Når kolonnen er pakket, er den overordnede kolonneparameter, der skal kontrolleres, kolonneryggetrykket. Trykværdierne i tabel 5 er et referencepunkt for, hvad der forventes for en af de populære sub 2 μm perlestørrelse sorbent-ReproSil PUR C18 AQ (1,9 μm). Samtidig kan yderligere tilbagetryk tilføjes af frit eller en for snævert trukket udleder, og man bør konstant overvåge for det. Hvis pakning sker i en trukket udleder, foreslår vi stadig at måle det forventede kolonne backpressur for den særlige sorbent i brug ved at pakke fritted kapillærer først, og derefter for at se, om den selvmontering frit tilføjer for meget. I forbindelse med problemer med højtryk kan du bruge retningslinjerne i tabel 1 til at identificere problemet.
Det er vores erfaring, at en pakket kolonne uden misfarvninger, huller og med det rette rygtryk fungerer i 100% af tilfældene og giver adskillelseskvaliteten tæt på, hvad der kan forventes fra kolonnelængden og sorbentegenskaberne. En kolonne med misfarvninger er ikke garanteret at fungere korrekt, men kan stadig give tilfredsstillende resultater.
Det meste af tiden, hvis der er problemer med adskillelseskvaliteten, kommer de ikke fra kolonnen selv, men snarere fra andre dele af separationssystemet, nemlig pumper, opløsningsmidler eller forbindelser. Særligt potentielt skadeligt er eventuelle forbindelser efter kolonnen. Dårlig forbindelse med en død volumen mellem emitter og fritted kolonne fører til større peak udvidelse og tailing på grund af meget lave flowhastigheder i kapillær kromatografi.
Et mere vigtigt spørgsmål, der er specifikt for FlashPack-tilgangen, er, at den bruger mange dyre sorbenter i et fungerende sorbent gylleglas. Husk, at sorbent gyllen i FlashPack er beregnet til flere brug. Pas sorbent. Undgå unødvendig magnetstang omrøring for at reducere sorbent slibning-husk at stoppe rotationen, så snart pakningen er færdig. Og lad ikke det åbne sorbent hætteglas i trykbomben for at undgå sorbenttørring. Selvom sorbent stadig kan bruges efter det, tager det tid at genskabe sorbent gyllen.
Metoden fungerer lige så godt for både fritted kapillærer og pulled-emitter kapillærer. FlashPack-princippet øger pakkehastigheden for kapillær-id'er fra 20 til 250 μm (mindre og større blev ikke testet). Det gælder også for alle sorbenter, både fuldt og overfladisk porøs, vi kunne teste (hvilket afspejler, at sorbent cupola dannelse i høj sorbent gylle koncentration ikke er begrænset specifikt til RP sorbents). Desuden påvirker opløsningsmiddelparametrene tydeligt pakningen i henhold til deres fysiske og kemiske egenskaber. For eksempel giver mindre tyktflydende acetone endnu højere pakningshastighed end methanol ved samme pakningstryk. Men det er også mindre polar end methanol og reducerer sorbentpartikler, der klæber til hinanden. Effekten i sig selv forhindrer sorbent cupola dannelse i begyndelsen af pakningen, når flowrate er stadig høj. Reduktion i sorbent partikelinteraktion fører dog også til mindre pålidelig selvmontering af fritdannelse og hyppigere blokering af trukket ende under pakningen. Så mens acetone er bedre til pakning af fritted kapillærer, det er mindre egnet til pulled-emitter kapillærer, med methanol som en gylle opløsningsmiddel er langsommere, men velegnet til begge typer af slutter. Pakning fra hexan eller dichlormethan (DCM) er ekstreme tilfælde af at skifte til acetone fra methanol: de er endnu mindre polare, så de forhindrer sorbent kuppelformation helt, men de er slet ikke egnede til pulled-emitter pakning. Desuden blev det bemærket, at ekstremt lav DCM polaritet fører til sorbent partikler klæber til den interne kapillær væg og gøre et tykt lag på det. Lagtykkelsen vokser gradvist, og tilfældige lokale blokke dannes, hvilket resulterer i kolonnen pakket i flere dele adskilt af regioner uden sorbent. En sådan virkning blev observeret for C18 Peptid Aeris sorbent.
Et andet observeret problem var YMC Triart C18 sorbent ikke suspenderes i methanol ordentligt, men at danne en slags flager. Det forhindrer det dog ikke i at blive pakket med FlashPack og give meget anstændig separationseffektivitet (ikke-offentliggjorte data). Selvom methanol ikke var optimal i nogle tilfælde, var det det mest universelle opløsningsmiddel til at arbejde for alle de testede sorbenter og kolonner. Det er nødvendigt at nævne, at vi endnu ikke har analyseret, hvordan forskellige gylleopløsningsmidler påvirker kolonneseparationens effektivitet. Samtidig er effektiviteten af kolonner pakket fra methanol allerede helt lig med kommercielle kolonner for de samme sorbenter4.
FlashPack er ikke den eneste eksisterende tilgang til at forbedre pakningshastigheden for UHPLC-kolonner. Hurtig pakning fra høj sorbent gyllekoncentration er også mulig ved brug af ultrahøjtrykspakning7. Fordelen ved FlashPack er, at det er meget enklere, da det ikke kræver særlige ultra-højtrykspumper og trykbomber til sorbent levering og kapillærforbindelser. Samtidig blev det påvist, at kolonnerne pakket ved ekstreme tryk kan have adskillelse effektivitet højere end lavere tryk pakket kolonner17. Og mens FlashPack producerer kolonner, der er identiske med kommercielle, der bruges i sammenligningen4, for hvilke vi ikke kender pakkemetoden, blev det endnu ikke testet, hvordan FlashPack-kolonner står mod ultrahøjtrykspakkede kolonner.
Sammenfattende kan den beskrevne FlashPack-metode nemt tilpasses den eksisterende pakkeprotokol i laboratoriet med nogle justeringer af protokollen, mens opsætningen forbliver helt den samme. Det fremskynder HPLC kapillær kolonne pakning til minutter tid og tillader produktion af lange UHP kapillær kolonner, hvilket er klart umuligt med standard pakning procedure. Den samlede økonomi i tid og penge til laboratoriet ved anvendelse af FlashPack-tilgangen kan tælles i titusindvis af euro om året. Derudover åbner muligheden for at producere UHP kapillær kolonner lokalt mulighederne for eksperiment tilpasning umuligt med de tilgængelige kommercielle produkter.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af RSF tilskud 20-14-00121. Forfatterne takker P. V. Shliaha (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) for frugtbare diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59002 | |
| centrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | ||
| Ceramic Scoring Wafer | Restek | 20116 | any ceramic wafer is suitable for capillary polishing |
| Diamond-chip bladed scribe | NewObjective | Diamond-chip bladed scribe | recommended for capillary cutting |
| fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD | CM Scientific | TSP100375 | |
| GELoader tips | Eppendorf | 30001222 | |
| HPLC system | ThermoScientific | Ultimate3000 RSLCnano | |
| laser puller | Sutter | P2000/F | |
| magnet bar 2x5 mm | Merck | Z283819 | |
| MeOH | Merck | 1.06018 | |
| microspatula | Merck | Z193216 | |
| PEEK ferrule 360 mm | VICI | JR-C360NFPK | use to connect the column to UPLC union |
| pipette tip, 1000 uL | Merck | Z740095 | |
| pipette, 1000 uL | Gilson | Pipetman L P1000L | |
| pressure bomb | NextAdvance | PC-77 MAG | |
| regulator | GCE | Jetcontrol 600 200/103 | |
| Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm | Dr. Maisch | r13.aq.0001 | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL | Merck | AXYST050SS | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL | Merck | AXYST150SS | |
| Screw caps with O-rings | Merck | AXYSCOC | |
| sonication bath | Elma | Elmasonic S30 H | |
| union HPLC | VICI | JR-C360RU1PK6 | HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| union UPLC | VICI | JR-C360RU1FS6 | UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| vortex | BioSan | V-1plus | |
| Water with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59013 |
References
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Now Coon, J. J. Now, more than ever, proteomics needs better chromatography. Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).
- Shliaha, P. V., et al. Middle-down proteomic analyses with ion mobility separations of endogenous isomeric proteoforms. Analytical Chemistry. 92 (3), 2364-2368 (2020).
- Pressure injection cells - next advance - laboratory instruments. , Available from: https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview (2021).
- Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. FlashPack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (2), 383-390 (2019).
- MacNair, J. E., Lewis, K. C., Jorgenson, J. W. Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns. Analytical Chemistry. 69 (6), 983-989 (1997).
- Bruns, S., et al. Slurry concentration effects on the bed morphology and separation efficiency of capillaries packed with sub-2 µm particles. Journal of Chromatography. A. 1318, 189-197 (2013).
- Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. Implementation of high slurry concentration and sonication to pack high-efficiency, meter-long capillary ultrahigh pressure liquid chromatography columns. Journal of Chromatography. A. 1462, 165-169 (2016).
- Andrzejczak, O. A. The effect of phytoglobin overexpression on the plant proteome during nonhost response of barley (Hordeum vulgare) to wheat powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici). Scientific Reports. 10 (1), 9192 (2020).
- Elchaninov, A., et al. Comparative analysis of the transcriptome, proteome, and miRNA profile of kupffer cells and monocytes. Biomedicines. 8 (12), 627 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches. BMC Genomics. 21 (1), 331 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Identification of unusual peptides with new Cys frameworks in the venom of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus. Scientific Reports. 7 (1), 14534 (2017).
- Loughran, G., et al. Unusually efficient CUG initiation of an overlapping reading frame in POLG mRNA yields novel protein POLGARF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (40), 24936-24946 (2020).
- Radzisheuskaya, A., et al. PRMT5 methylome profiling uncovers a direct link to splicing regulation in acute myeloid leukemia. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 999-1012 (2019).
- Rubtsova, M., et al. Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways. Nucleic Acids Research. 46 (17), 8966-8977 (2018).
- Maiolica, A., Borsotti, D., Rappsilber, J. Self-made frits for nanoscale columns in proteomics. PROTEOMICS. 5 (15), 3847-3850 (2005).
- Ishihama, Y., Rappsilber, J., Andersen, J. S., Mann, M. Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics. Journal of Chromatography. A. 979 (1-2), 233-239 (2002).
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. Ultra-high pressure (>30,000 psi) packing of capillary columns enhancing depth of shotgun proteomic analyses. Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).
