Summary
Neuronal dendritisk morfologi ligger ofta bakom funktion. Faktum är att många sjukdomsprocesser som påverkar utvecklingen av nervceller manifesterar sig med en morfologisk fenotyp. Detta protokoll beskriver en enkel och kraftfull metod för att analysera intakt dendritiska arbors och deras tillhörande ryggrader.
Abstract
Hjärnaktivitet, de elektrokemiska signalerna som överförs mellan nervceller, bestäms av anslutningsmönstren för neuronala nätverk och från morfologin av processer och understrukturer inom dessa nervceller. Som sådan har mycket av det som är känt om hjärnans funktion uppstått tillsammans med utvecklingen av bildteknik som möjliggör ytterligare insikt i hur nervceller är organiserade och anslutna i hjärnan. Förbättringar i vävnad clearing har möjliggjort högupplöst bildframställning av tjocka hjärnskivor, underlätta morfologiska återuppbyggnad och analyser av neuronal understrukturer, såsom dendritiska arbors och spines. Tillsammans ger framsteg inom bildbehandlingsprogram metoder för att snabbt analysera stora bilddatauppsättningar. Detta arbete presenterar en relativt snabb metod för bearbetning, visualisering och analys av tjocka skivor av märkta neurala vävnad vid hög upplösning med CLARITY vävnad clearing, konfokal mikroskopi och bild analys. Detta protokoll kommer att underlätta ansträngningar för att förstå anslutningsmönster och neuronala morfologier som kännetecknar friska hjärnor, och de förändringar i dessa egenskaper som uppstår i sjuka hjärntillstånd.
Introduction
Att förstå rumslig organisation, anslutningsmönster och morfologi av komplexa tredimensionella biologiska strukturer är avgörande för att avgränsa funktionerna hos specifika celler och vävnader. Detta gäller särskilt inom neurovetenskap, där enorma ansträngningar har ägnats åt att bygga högupplösta neuroanatomiska kartor över centrala nervsystemet1,2. Noggrann undersökning av nervcellerna som utgör dessa kartor ger olika morfologier, med anslutningar och platser som återspeglar funktionen hos dessa olika uppsättningar neuroner3,4. Dessutom kan undersökning av subcellulära strukturer, särskilt dendritiska ryggrader, informera synapsernas mognad och därmed återspegla utvecklingsprocesser och neurologiska sjukdomstillstånd5,6,7. Således är metoder som förbättrar bildupplösning och genomströmning avgörande för att bättre förstå hjärnans funktion på alla skalor.
De senaste framstegen har utökat den molekylära och genetiska verktygslådan för att markera och manipulera populationer av nervceller. Utvecklingen av nya fluorescerande markörer, i kombination med nya metoder för att införa dessa markörer i nervceller, möjliggör differentiell märkning av populationer av interagerande nervceller inom samma djur- eller hjärnprov8,9,10,11. Eftersom ljus sprids av ogenomskinliga lipider, och med tanke på det höga lipidinnehållet i hjärnvävnad, har bildåtergivningsneurokala populationer främst begränsats till tunna sektioner eller har förlitat sig på avancerade mikroscropy tekniker (t.ex. konfokal, multifoton och ljusplåt mikroskopi) för att avbilda djupa strukturer. Dessa ansträngningar har dock kraftigt stärkts av framsteg inom vävnadsrensning tekniker. Clear Lipid-exchanged Akrylamid-hybridiserad Rigid Imaging/immunostaining/in situ hybridiseringskompatibel Tissue-hYdrogel (CLARITY) är en sådan teknik, där vävnader av intresse infunderas med hydrogelmonomerer (akrylamid och bis akrylamid) och sedan tvättas med tvättmedel12. Hydrogelmonomererna hybridiserar för att skapa en stabil 3D-hydrogelställning som är optiskt transparent och genomsläpplig för makromolekylära etiketter. Nukleinsyror och proteiner hålls kvar i den hybridiserade matrisen, medan lipider avlägsnas med tvättmedlet(figur 1). Detta resulterar i en stabil vävnad som är tillräckligt styv för att bibehålla den ursprungliga formen och orienteringen av celler och icke-lipidmolekyler, medan optiskt transparent nog för att enkelt avbilda djupa strukturer med hög upplösning. Detta underhåll av vävnadsstruktur och orientering möjliggör avbildning av tjocka skivor, vilket bevarar cell-till-cell-anslutningar och rumsliga relationer. Eftersom placeringen och tillgängligheten av proteiner och nukleinsyror upprätthålls under clearingprocessen kan rensade vävnader dessutom hålla uttrycksbaserade markörer, liksom exogena etiketter. Clarity lämpar sig således som en potent metod för att avbilda stora mängder djupa hjärnstrukturer och kopplingarna mellan dessa strukturer med hög upplösning.
Användningen av CLARITY förbättrar kraftigt metoder för att imaging neuronal populationer. Denna teknik är särskilt skicklig på att generera stora mängder bilddata. CLARITY fungerar bra med flera former av proteinbaserad fluorescens. Detta protokoll använder en lentiviral-baserad metod för glest etikett celler med EGFP och tdTomato; Transgena reporter alleler som uttrycker tdTomato eller EGFP för att märka celler för återuppbyggnad har dock använts rutinmässigt. Det är viktigt att välja en fluorofor som är både fotostabil och ljus (t.ex. EGFP eller tdTomato). Dessutom ger användning av en stark promotor för att uttrycka fluorofor överlägsen kontrast och bildkvalitet. Nackdelarna med denna teknik uppstår som korrekt analysera denna stora mängd data kan vara både arbets- och tidsintensiv. Specialiserade mikroskop kan hjälpa till att förbättra data flödet och minska arbetsbelastningen. Att bygga, äga och/eller driva avancerade mikroskop är dock ofta kostnadsöverkomligt för många laboratorier. Detta arbete presenterar en hög genomströmning, relativt snabb och enkel metod för att visualisera stora mängder neural vävnad vid hög upplösning med CLARITY vävnad clearing av stora sektioner, kombinerat med standard confocal mikroskopi. Detta protokoll beskriver detta tillvägagångssätt genom följande steg: 1) dissekera och förbereda neural vävnaden, 2) rensa vävnaden, 3) montera vävnaden, 4) avbilda de beredda skivorna och 5) bearbeta fullständiga segmentbilder med hjälp av mikroskopi visualisering programvara återuppbyggnad och analys(figur 2). Dessa ansträngningar resulterar i högupplösta bilder som kan användas för att analysera populationer av nervceller, neuronala anslutningsmönster, 3D dendritisk morfologi, dendritisk ryggrad överflöd och morfologi, och molekylära uttryck mönster inom intakt hjärnvävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll följer alla djurvårdsriktlinjer för Baylor College of Medicine.
1. Dissekering och vävnadsberedning
- Avliva musen med en överdos av isofluran genom att placera musen i en sluten behållare med en handduk indränkt i isofluran (eller på annat IUCAC-godkänt sätt).
- Perfusera djuret transkardiiellt med en 25 G nål med 10 ml iskall PBS, följt av 10 ml 4% PFA.
- Dissekera hjärnregionen (eller vävnaden) av intresse.
- Placera den dissekerade vävnaden i 4% PFA över natten vid 4 °C. Korrekt fixering är nyckeln till det här protokollet. Hoppa inte över eller förkorta det här steget.
- Efter fixering i 4% PFA i minst 12 timmar, överför vävnaden till en 4% akrylamidhydrogelblandning för 24 h vid 4 °C.
OBS: När du tinar hydrogelen, se till att den inte har polymeriserats, detta kan hända om hydrogelen blir för varm. Tina på is för att förhindra för tidig polymerisation.
2. Vävnadsrensning
- Placera hjärnvävnaden (fortfarande nedsänkt i hydrogel) i en vakuuminkubator i 3 h vid 37 °C med ett -90 kPa vakuum. Låt rörskivan skruvas av så att vakuumet kan bildas ordentligt.
- Tvätta vävnaden med PBS i 10 min vid rumstemperatur (25 °C) med mild skakning.
- Placera det polymeriserade vävnadsprovet i elektroforeskammaren och notera vävnadens orientering i kammaren.
- Fyll kammaren och behållaren med den medföljande elektrofores SDS-bufferten.
- Kör provet vid 70 V, 1 A och 35 C, med konstant ström i ca 2 h/mm vävnad.
- Kontrollera exemplet regelbundet. det kan ta längre tid i kammaren att rensa ordentligt. En bra utgångspunkt för clearing är 1-2 h per mm hjärnvävnad. En hel mushjärna kräver 8-10 h för tillräcklig clearing. Kom ihåg provets orientering innan du tar ut det från kammaren och var noga med att byta ut det tillbaka i kammaren i samma riktning.
OBS: Figur 3A visar hur en helt rensad hjärna kommer att se ut. Hjärnan kommer att se ogenomskinlig och inte klar i detta skede på grund av närvaron av upplöst SDS, men det bör finnas liten eller ingen gul vävnadsfärgad nyans efter lipidextraktion.
- Kontrollera exemplet regelbundet. det kan ta längre tid i kammaren att rensa ordentligt. En bra utgångspunkt för clearing är 1-2 h per mm hjärnvävnad. En hel mushjärna kräver 8-10 h för tillräcklig clearing. Kom ihåg provets orientering innan du tar ut det från kammaren och var noga med att byta ut det tillbaka i kammaren i samma riktning.
3. Förbereda och montera den rensade vävnaden
- När provet är klart och ser tillräckligt klart ut, tvätta i PBS över natten vid rumstemperatur. Byt ut PBS med färsk PBS så ofta som möjligt. Det här steget är viktigt för att ta bort rest SDS som kan bilda fällningar i senare steg.
- Efter den slutliga tvätten i PBS, tvätta vävnaden i 5 min i avjoniserat vatten vid rumstemperatur tre gånger. Vävnaden blir ogenomskinlig i detta steg och kan expandera.
- Inkubera vävnaden i matchningslösningen för brytningsindex (se tabell 1) i minst 4 timmar vid rumstemperatur. Figur 3B visar en bit rensad vävnad efter inkubation i brytningsindexmatchningslösning.
- Under inkubationen av vävnad i brytningsindexmatchningslösning, konstruera en lämplig huskammare för att avbilda provet om det behövs.
- Konstruera en bildkammare för små vävnadsprover/skivor
- Använd en glasrutschbana som bas för montering, lägg ner antingen gummi- eller plastutrymmen och säkra med superlim. Om färdiga distanser inte finns tillgängliga, använd plastringar gjorda av koniska rör tvärsnitt.
- Se till att dessa bitar fästs på glasrutschbanan utan hål (figur 3C).
- Placera den rensade vävnaden i monteringskammaren förfylld med brytningsindexmatchningslösning.
- Montera vävnaden ordentligt genom att placera ett glasöverdrag ovanpå och försegla den med nagellack.
- Föreställ dig denna vävnad genom att lägga till en droppe brytningsindexmatchande monteringslösning direkt ovanpå glaset.
- Stor avbildningskammare för vävnad
- Konstruera denna kammare om vävnaden är större än 5 mm tjock (lämplig för hela hjärnor eller halvklot).
- Använd en 10 cm glasfat med en hög vägg, placera ett 50 ml koniskt rör i mitten och se till att konisk diameter är tillräckligt stor för att acceptera pipan på den objektiva linsen som används.
- Gör 3% agaros i vatten och häll det i utrymmet mellan glasfatet och koniskt rör, låt svalna i 1 h (figur 3D). Detta kommer att bilda en ring av solid agaros (figur 3E).
- Fäst vävnaden ordentligt på botten av kammaren med superlim och fyll kammaren med brytningsindexmatchningslösning. Applicera lim för att fästa vävnaden på en region som inte kommer att avbildas för att tillåta återvinning av vävnaden från skålen utan att skada de områden som är av intresse.
OBS: Detta preparat är tidskänsligt, eftersom brytningsindexmediet kan börja polymeriseras om det inte bevaras från luft och lagras vid 4 °C.
4. Avbildning rensade vävnadsprover
- Skaffa bilden med ett konfokalt mikroskop som passar med ett 25x/0,95 NA-mål med ett arbetsavstånd på 4 mm.
- Slå på all relevant bildutrustning. Placera provet på scenen och placera en droppe brytningsindexmatchningslösning på toppen av monteringskammaren.
- Närma dig noggrant nedsänkningsmediet med målet och bilda en kontinuerlig kolumn av media.
- Använd epifluorescens, hitta ett lämpligt bildfält.
- Påbörja avbildningsförvärvsproceduren genom att testa lämpliga inställningar.
- Börja med att ställa in upplösnings- och skanningshastighetsinställningarna med bild 4A som guide. Vid avbildning med hjälp av ett konfokalt mikroskop, stäng pinhålet helt för att få den minsta optiska sektionen och därmed bästa z-upplösningen.
- Öka gradvis lasereffekten/sensorvinsten tills en lämplig bild erhålls med högt signal-till-brus-förhållande.
- Om du använder standard EGFP/tdTomato tvåfärgsavbildning ställer du in ljussamlingsinställningarna med bild 4B som guide.
- Ställ in z-stackparametrarna baserat på vävnadens observerade start- och slutpunkter. Ställ in stegstorleken baserat på önskad z-upplösning med bild 4C som guide.
OBS: Mindre stegstorlekar ger en större z-upplösning men kommer också att introducera mer laserboendetid, vilket kan leda till provblekning. - När du är nöjd med bildförvärvsinställningarna, skaffa bilden.
- Se till att bilden har ett högt signal-till-brus-förhållande och visar tydliga gränser för strukturer(figur 4D).
5. Bildbehandling och 3D-kvantifiering med hjälp av programvara för mikroskopianalys
OBS: Mikroskopiska bildanalysprogrampaket är kraftfulla verktyg för tredimensionell bildvisualisering och bearbetning. Många av dessa program är perfekt lämpade för hantering av stora datamängder som genereras från avbildningsklarade vävnadsprover. Följande steg och associerade siffror motsvarar Imaris programvaruarbetsflöde.
- Öppna bildstacken och importera den till den valda analysprogramvaran.
- Visa bilden i tredimensionellt utrymme och gör önskade ändringar i uppslagstabellerna med hjälp av displayjusteraren för att bättre visualisera bilden.
OBS: Figur 5A visar det möjliga extrema bilddjupet som är tillgängligt genom 2-fotonmikroskopi i kombination med CLARITY vävnadsrensning. Figur 5B visar distinkta dendritprocesser samt tydligt synliga ryggradsmorfologier från z-stacken som presenteras i figur 5A. - Om du vill filtrera bort en konsekvent bakgrund klickar du på knappen Bildbehandling och väljer filtret för bakgrunds subtraktion.
OBS: Bild 5C visar bilden med en konsekvent dimmig bakgrundssignal före bearbetning. Bild 5D visar bilden efter att filtret för bakgrundsretraktion har tillämpats. - Observera 3D-bilden och bekanta dig med den genom att titta på den från flera vinklar och zoomnivåer.
- Starta dendritspårningen genom att först välja spårämnesverktyget För filament.
- Klicka på Redigera filamentet manuellt, Hoppa över automatisk skapande.
- Ställ in läget på automatisk bana och kontrollera korrigeringar med automatisk centrerad och automatisk diameter.
- Skift + högerklicka på cellkroppen för att ställa in en startpunkt.
- Spåra neuron längs hela dendritens längd; vänsterklicka i slutet av dendriten för att ställa in avslutningspunkten så att programvaran automatiskt kan beräkna sökvägen mellan start- och slutpunkterna.
- Upprepa det här steget för alla dendriter och spåra cellstrukturen helt.
- Visualisera den spårade cellen och bekräfta dess noggrannhet. Gör manuella justeringar efter behov.
- Välj fliken Skapa.
- Välj alternativet Omkompilerad dendritdiameter.
- Följ guiden för att slutföra för en mer exakt spårad dendrit.
- Välj fliken Rita.
- Klicka på alternativknappen Ryggrad för att börja rita ryggrader.
- Ställ in den ungefärliga ryggdiametern efter behov och använd mätverktyget för att få en korrekt representation av ryggradens diametrar.
- Klicka på mitten av ryggradshuvudena för att lägga till en ny ryggrad.
- Upprepa detta för alla ryggrader på dendriten.
OBS: Det är viktigt att observera dendriten från alla möjliga vinklar när du manuellt lägger till ryggraden. - Kontrollera de nytillkomna ryggraderna för noggrannhet och gör ändringar efter behov.
- Välj fliken Skapa.
- Välj alternativet Recompute Spine Diameter så att programvaran kan bestämma rätt huvud- och nackdiametrar, vilket är avgörande för dataanalys nedströms.
- Följ guiden skapa ryggradens diameter tills den är klar.
- Observera resultatet av beräkningen och gör eventuella manuella justeringar efter behov. Figur 5E visar en helt spårad neuron komplett med ryggrader.
- Om du vill skapa en klassificerad lista med taggar väljer du fliken Verktyg.
OBS: MATLAB-tillägget måste installeras för att detta ska fungera.- Om du vill installera MATLAB-tillägget öppnar du inställningsfönstret.
- Välj alternativet Anpassade verktyg.
- Lägg till lämplig MATLAB-mcr vid körning.
- Klicka på Klassificera ryggrader.
- Redigera önskade parametrar för ryggradsklassificering.
- Klicka på Klassificera spines på MATLAB-tillägget. Bild 5F visar dendriten överlagrad med färgkodade klassificerade taggar.
- Välj fliken Statistik.
- Konfigurera önskad statistik för att kvantifiera data genom att klicka på knappen Konfigurera längst ned till vänster på den här fliken.
- När metoden för statistikrepresentation har valts exporterar du data med knappen Exportera statistik på fliken Visa till arkiv längst ned till höger i det här fönstret.
- Rita upp statistiken med en önskad grafmetod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter bildförvärv analyserades den representativa cellmorfologin med hjälp av inbäddad statistik och klassificering av skript i analysprogramvaran. De insamlade uppgifterna (figur 6A) återspeglar att neuron 2 har en större dendritisk struktur med högre densitet av ryggraden. Som helhet tyder data på att neuron 2 har en mer komplex dendritisk struktur jämfört med neuron 1. För att underbygga detta resultat utfördes standard Sholl-analys, som bekräftar att neuron 2 är mer dendritiskt komplex än neuron 1 som betecknas av det ökade antalet Sholl-korsningar vid 50-100 μm från soma (Figur 6B). Slutligen klassificerades dendritiska ryggraden i de två avbildade nervcellerna i fyra huvudkategorier baserat på deras övergripande former och storlekar. Spines som uppvisar mer filopodia-liknande former är sannolikt mer omogna ryggradsundertyper. Spines med definierade huvuden, kallade svampryggar, innehåller sannolikt mer utvecklade och mogna synapser7. Analysen som presenteras här visar att neuron 1 innehåller en större andel filopodialiknande ryggrader jämfört med neuron 2 (figur 6C). Således, baserat på morfologi, neuron 2 är mer utvecklingsmässigt mogen eftersom den är större, mer förgrenad och innehåller en högre densitet av mogna ryggrader.
Figur 1: CLARITY-protokollet gör vävnader transparenta samtidigt som inneboende struktur och rumsliga förhållanden mellan molekyler och molekyler bibehålls. (B) Hydrogelmonomerer (lila linjer) infunderas i vävnaden och polymeriseras till ett hydrogelnät. Vävnaden och hydrogelnätet korsas via formaldehydfixering. (C) Vävnaden tvättas sedan med joniska tvättmedelslösningar när den utsätts för elektriska fält. Under denna process tar tvättmedelsmössen bort lipidmolekyler från vävnaden och lämnar efter sig ett tvärlänkat nätverk av transparent hydrogel och biomolekyler. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Flödesschema över protokollet, diagram över vävnadsberedning, röjning, montering, bildbehandling och bildbehandling. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Konstruera monteringskammare för rensade vävnadsprover. (A) Rensad hel hjärna i PBS före nedsänkning i brytningsindexmatchningslösning. (B) Hjärnskiva i brytningsindexmatchningslösning. (C)Bildkammare för stora och små rensade vävnadsprover. Kamrarna kan tillverkas med en mängd olika material, inklusive men inte begränsat till 3D-tryckt plast och skurna koniska rör. (D) Bildkammare för hela hjärnan eller halvklotets avbildning, med 50 ml koniskt rör som en lättnad innan agaros hälls. e)Hela hjärnan eller halvklotets bildkammare med agaros helt inställd; denna inställning är optimal för stora fat nedsänkningsmål. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Skaffa stora datamängder av hög kvalitet från rensade vävnadsprover. (A) Inställningar för bildförvärv som används för högupplöst avbildning i hela celler. Pinhole var helt stängt för att möjliggöra fina optiska sektioner. Skanningshastigheten bestämdes empiriskt baserat på optimala pixelboendetider. (B) Ljusvägsinställningar: Dessa beror på fluoroforen och utrustningen som används. C)Z-stackinställningar; ett fint z-steg användes för att fånga så mycket information i z-riktningen som möjligt. ( D)Representativ maximal projektion. skalstapeln representerar 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: 3D-analys av dendriter i analysprogramvaran. (A) Sidovy av en tvåfoton förvärvad 600 μm z-stack förvärvad från en 1 mm tjock vävnad som uttrycker tdTomato; skalstången representerar 100 μm. (B) Topvy av samma z-stack som förvärvats på panel A; skalstången representerar 100 μm. (C) Konfokal förvärvad bild av vävnad som uttrycker EGFP. Bildfiler kan importeras direkt till analysprogramvaran och förbehandlas för högre bildkvalitet; skalstången representerar 25 μm. (D) Tröskel subtraktion används för att ta bort den konsekventa bakgrundssignalen som finns i C. (E) Filamentspårning och ryggradsidentifiering: denna process är bäst när den utförs halvautomatisk med den automatiska djupfunktionen kontrollerad. Spines var sedan handmärkta efter full dendrite återuppbyggnad; skalstången representerar 25 μm. (F) Ryggradsklassificering med hjälp av en inbyggd MATLAB-förlängning. Spines har färgkodats baserat på deras morfologi; stubbiga ryggrader är röda; svampryggar är gröna; långa tunna ryggrader är blå; filopodia är lila; skalstapeln representerar 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Representativa resultat. (A) Tabell över gemensamma morfologiska mätningar som automatiskt genereras av det valda analysprogrammet. (B) Antal Sholl-korsningar som genereras av programstatistik. C)Cirkeldiagram som representerar fördelningen av dendritiska ryggradsmorfologier. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Lösning | Sammansättning | Anteckningar |
| Matchningslösning för brytningsindex | 80 g histodenz | pH till 7,5 med NaOH |
| 60 ml fosfatbuffert på 0,02 M | Förvara vid 4 °C | |
| 0,01% natriumazid | Anpassad från Marx, V. Nature Methods volym 11, sidorna 1209–1214 (2014) | |
| Hydrogel | 13,33 ml 30 % akrylamid (no-bis) | Blanda på is, annars kan lösningen börja polymerisera |
| 10 ml 10x PBS | Aliquot och förvara vid -20 °C | |
| 250 mg VA-044 | ||
| 76,66 ml ddH2O |
Tabell 1: Recept för brytningslösning för bildmatchning och hydrogellösning. Sammansättningen av brytningsindexmatchningslösningen och hydrogelen listas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Före tillkomsten av samtida vävnad clearing tekniker bestod studier neuronal morfologi av tidsintensiva avsnitt, imaging och återuppbyggnad av intilliggande mycket tunna avsnitt. Användning av elektroforisk vävnad clearing i kombination med confocal imaging ger en fri bild av fullständig neuronal morfologi. Från intakt dendritiska träd, ner till den minsta synaptiska bouton, imaging och kvantifiering av neuronal morfologi har aldrig varit mer genomförbart.
Förberedelsen av rensad hjärnvävnad är enkel och kräver bara en specialutrustning. Vävnad rensas och avbildas med hjälp av detta protokoll undergräver behovet av tråkig tunn sektionering, hantering och montering, drastiskt minska tiden från experiment till bild förvärv. Dessutom förblir vävnad avbildad utan sektionering mer trogen de ursprungliga strukturerna, eftersom det inte finns några källor till skador eller nödvändiga post-hoc bildrekonstruktion. Slutligen sparar detta protokoll tid genom att tillåta samtidig avbildning av storskaliga funktioner som dendritiska träd tillsammans med småskaliga submicron-funktioner som ryggrader.
En viktig samling steg i det här protokollet är de tvättsteg som följer rensningsprocessen. Dessa steg är avgörande för att ta bort alla spår av SDS elektroforetiska clearingbuffert. Om den rensade vävnaden inte är tillräckligt tvättad kommer fällningar att bildas under monteringssteget. Dessa fällningar kan ibland omfördelas genom att inkubera vävnaden vid 37-55 °C under en kort tid. Men om fällarna kvarstår kommer de att sprida ljus, vilket ger dåligt bilddjup och kvalitet.
Montering av stora bitar av vävnad utgör en utmaning jämfört med traditionell tunn skiva imaging. Här presenterar vi flera processer för att montera stor vävnad, som beror på bildteknik, objektiva linsegenskaper och storleken på vävnadsprovet. För det första är det viktigt att använda en objektiv lins som är lämplig för nedsänkning i det specifika brytningsindexmatchningsmedium som används och som har tillräckligt arbetsavstånd för att avbilda stora vävnadsprover. Detta protokoll begränsas till stor del av de optiska egenskaperna hos den bildplattform som används, särskilt måls arbetsavstånd. Avbildning på djupet uppnås lätt med hjälp av detta protokoll. Men om ett mål med tillräckligt arbetsavstånd inte är tillgängligt, kommer vävnaden själv att utgöra ett fysiskt hinder för att förvärva stora bilder. Nästa viktiga beslut är bildtekniken. Tvåfotonmikroskopi används vanligtvis för sin fantastiska bildkvalitet, bilddjup och förvärvshastighet. Tvåfotonmikroskopi möjliggör avbildning av upp till 1 mm i CLARITY rensad vävnad utan förlust av bildkvalitet, vilket visas i figur 5A,B. Mycket liknande resultat kan dock uppnås vid användning av traditionell konfokal mikroskopi, om än med en uppoffring till bilddjup jämfört med två-fotonmikroskopi (figur 5C,D).
Sammanfattningsvis ger denna metod en robust och bekväm plattform för att analysera neuronal morfologi i både stora och små skalor. Dessutom minimerar denna metod till stor del hanterings- och bearbetningstiden, samtidigt som den ger mer exakta och kompletta tredimensionella bilder. Cellulär morfologi är en vanlig proxy för att bedöma kretsfunktion och hälsa bakom många sjukdomar och patologier13,14,15. Imaging neuron morfologi är kraftfull, okomplicerad och väl lämpad för analys i en mängd sjukdomsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja just nu.
Acknowledgments
Vi vill tacka den virala kärnan NRDDC vid Jan och Dan Duncan Neurological Institute för att ha producerat AAV och lentivirus som används i dessa experiment. Dessutom vill vi tacka Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine för mushållning och allmänt underhåll av de möss som används. Vi vill tacka American Heart Association för deras stöd under prisnummer 20PRE35040011 och BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists för deras stöd (PJH). Slutligen vill vi tacka Logos för att ha försett vårt labb med Logos X-Clarity elektroforetiska vävnadsrensningssystem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| 25 G x 1" Needle | BD | 305127 | |
| 30% Acrylamide (No-Bis) | National Diagnostics | EC-810 | |
| 50 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339653 | |
| Electrophoretic Tissue Clearing Solution | Logos | C13001 | |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | |
| Hydrogel Solution Kit | Logos | C1310X | |
| Imaris | Oxford Instruments | N/A | |
| Paraformaldehyde 16% | EMS | 15710 | |
| PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case | fisher | MT21040CV | |
| VA-044 | Wako | 925-41020 | |
| X-CLARITY Polymerization System | Logos | C20001 | |
| X-CLARITY Tissue Clearing System II | Logos | C30001 |
References
- Abbott, L. F., et al. The Mind of a mouse. Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), (2015).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
- Martínez-Cerdeño, V. Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models. Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy. Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).
- Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. Optical probes for neurobiological sensing and imaging. Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2014).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Ledda, F., Paratcha, G. Mechanisms regulating dendritic arbor patterning. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).
- Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin. Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).
