Summary
न्यूरोनल डेंड्रिटिक आकृतिविज्ञान अक्सर कार्य को रेखांकित करता है। दरअसल, कई रोग प्रक्रियाएं जो न्यूरॉन्स के विकास को प्रभावित करती हैं, एक रूपात्मक फेनोटाइप के साथ प्रकट होती हैं। यह प्रोटोकॉल बरकरार डेंड्रिटिक आर्बर और उनके संबद्ध कताई का विश्लेषण करने के लिए एक सरल और शक्तिशाली विधि का वर्णन करता है।
Abstract
मस्तिष्क गतिविधि, न्यूरॉन्स के बीच पारित इलेक्ट्रोकेमिकल संकेतों, न्यूरोनल नेटवर्क के कनेक्टिविटी पैटर्न द्वारा निर्धारित किया जाता है, और इन न्यूरॉन्स के भीतर प्रक्रियाओं और उपसंरचनाओं की आकृति विज्ञान से। जैसे, मस्तिष्क समारोह के बारे में क्या जाना जाता है की बहुत इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में विकास के साथ पैदा हुआ है कि कैसे न्यूरॉन्स का आयोजन कर रहे है और मस्तिष्क में जुड़े में आगे अंतर्दृष्टि की अनुमति देते हैं । ऊतक समाशोधन में सुधार ने मोटी मस्तिष्क स्लाइस के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए अनुमति दी है, जो रूपात्मक पुनर्निर्माण और न्यूरोनल सबस्ट्रक्चर के विश्लेषण को सुविधाजनक बनाता है, जैसे कि डेंड्रिटिक आर्बर और कताई। मिलकर, छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में प्रगति बड़े इमेजिंग डेटासेट का जल्दी विश्लेषण करने के तरीके प्रदान करती है। यह काम स्पष्टता ऊतक समाशोधन, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन पर लेबल किए गए तंत्रिका ऊतकों के मोटे स्लाइस को संसाधित करने, कल्पना करने और विश्लेषण करने की अपेक्षाकृत तेजी से विधि प्रस्तुत करता है। यह प्रोटोकॉल कनेक्टिविटी पैटर्न और न्यूरोनल मॉर्फोलोजी को समझने की दिशा में प्रयासों को सुविधाजनक करेगा जो स्वस्थ दिमाग की विशेषता है, और रोगग्रस्त मस्तिष्क राज्यों में उत्पन्न होने वाली इन विशेषताओं में परिवर्तन।
Introduction
विशिष्ट कोशिकाओं और ऊतकों के कार्यों को चित्रित करने के लिए स्थानिक संगठन, कनेक्टिविटी के पैटर्न और जटिल त्रि-आयामी जैविक संरचनाओं की आकृति विज्ञान को समझना आवश्यक है। यह न्यूरोसाइंस में विशेष रूप से सच है, जिसमें केंद्रीय तंत्रिका तंत्र1,2के उच्च-संकल्प न्यूरोएनाटॉमिकल मानचित्रों के निर्माण के लिए जबरदस्त प्रयास समर्पित किया गया है। इन मानचित्रों में शामिल न्यूरॉन्स की बारीकी से जांच से कनेक्शन और स्थानों के साथ विभिन्न मॉर्फोलोजी पैदा होते हैं जो न्यूरॉन्स3,4के इन विविध सेटों के कार्य को दर्शाते हैं। इसके अलावा, उपकोशिकीय संरचनाओं, विशेष रूप से डेंड्रिटिक कताई की जांच, सिनेप्स की परिपक्वता को सूचित कर सकती है, जिससे विकासात्मक प्रक्रियाओं और न्यूरोलॉजिकल रोग राज्यों को प्रतिबिंबित करता है5,6,7। इस प्रकार, सभी पैमानों पर मस्तिष्क समारोह को बेहतर ी समझने की दिशा में इमेजिंग संकल्प और थ्रूपुट में सुधार करने वाले दृष्टिकोण आवश्यक हैं।
हाल के अग्रिमों अंकन और न्यूरॉन्स की आबादी में हेरफेर के लिए आणविक और आनुवंशिक टूलकिट का विस्तार किया है । नए फ्लोरोसेंट मार्कर का विकास, इन मार्कर को न्यूरॉन्स में पेश करने के नए तरीकों के साथ संयुक्त, एक ही जानवरया मस्तिष्क के नमूने8, 9,10, 11के भीतर बातचीत न्यूरॉन्स की आबादी के अंतर लेबलिंग के लिए अनुमतिदेताहै। क्योंकि प्रकाश अपारदर्शी लिपिड द्वारा बिखरे हुए है, और मस्तिष्क के ऊतकों की उच्च लिपिड सामग्री को देखते हुए, इमेजिंग न्यूरोनल आबादी मुख्य रूप से पतली वर्गों तक सीमित रही है या उन्नत सूक्ष्म वर्गों (जैसे, कॉन्फोकल, मल्टी-फोटॉन और लाइट-शीट माइक्रोस्कोपी) पर गहरी संरचनाओं की छवि के लिए भरोसा किया गया है। हालांकि, इन प्रयासों को ऊतक समाशोधन तकनीकों में प्रगति से काफी मजबूत किया गया है । स्पष्ट लिपिड-एक्सचेंज्ड एक्रिलामाइड-हाइब्रिड कठोर इमेजिंग/इम्यूनोस्टेपिंग/सीटू संकरणमें-संगत ऊतक-hYdrogel (स्पष्टता) एक ऐसी तकनीक है, जिसमें ब्याज के ऊतकों को हाइड्रोजेल मोनोमर (एक्रिलामाइड और बिस-एक्रिलैमाइड) के साथ संचार किया जाता है और फिर डिटर्जेंट12 से धोया जाताहै । हाइड्रोगेल मोनोमर एक स्थिर 3 डी हाइड्रोजेल पाड़ बनाने के लिए संकरित होते हैं जो ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी और मैक्रोमॉल्यूल लेबल के पारगम्य हैं। न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन संकरित मैट्रिक्स के भीतर बनाए रखा जाता है, जबकि लिपिड डिटर्जेंट वॉश(चित्रा 1)द्वारा हटा दिए जाते हैं । यह एक स्थिर ऊतक है कि कोशिकाओं और गैर लिपिड अणुओं के मूल आकार और अभिविन्यास को बनाए रखने के लिए पर्याप्त कठोर है में परिणाम है, जबकि ऑप्टिकली काफी पारदर्शी आसानी से उच्च संकल्प पर गहरी संरचनाओं छवि के लिए । ऊतक संरचना और अभिविन्यास का यह रखरखाव मोटी स्लाइस की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, जिससे सेल-टू-सेल कनेक्शन और स्थानिक संबंधों को संरक्षित किया जाता है। इसके अलावा, क्योंकि समाशोधन प्रक्रिया के दौरान प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड का स्थान और उपलब्धता बनाए रखी जाती है, इसलिए स्वीकृत ऊतक अभिव्यक्ति-आधारित मार्कर, साथ ही बहिर्जात लेबल धारण करने में सक्षम होते हैं। इस प्रकार, स्पष्टता खुद को गहरी मस्तिष्क संरचनाओं की बड़ी मात्रा में इमेजिंग और उच्च संकल्प पर इन संरचनाओं के बीच कनेक्शन के लिए एक शक्तिशाली विधि के रूप में उधार देता है ।
स्पष्टता का उपयोग न्यूरोनल आबादी इमेजिंग के दृष्टिकोण में काफी सुधार करता है। यह तकनीक विशेष रूप से बड़ी मात्रा में इमेजिंग डेटा उत्पन्न करने में माहिर है। स्पष्टता प्रोटीन आधारित फ्लोरेसेंस के कई रूपों के साथ अच्छी तरह से काम करती है। यह प्रोटोकॉल ईजीएफपी और टीडीटोमाटो के साथ विरल लेबल कोशिकाओं के लिए एक लेंटीवायरल-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करता है; हालांकि, पुनर्निर्माण के लिए कोशिकाओं को लेबल करने के लिए tdTomato या EGFP व्यक्त ट्रांसजेनिक रिपोर्टर alleles नियमित रूप से इस्तेमाल किया गया है । फ्लोरोफोर चुनना महत्वपूर्ण है जो फोटो-स्थिर और उज्ज्वल (जैसे, ईजीएफपी या टीडीटोमा) दोनों है। इसके अतिरिक्त, फ्लोरोफोर को व्यक्त करने के लिए एक मजबूत प्रमोटर का उपयोग बेहतर विपरीत और छवि गुणवत्ता प्रदान करता है। इस तकनीक की कमियां इस बड़ी मात्रा में डेटा का ठीक से विश्लेषण करने के रूप में उत्पन्न होती हैं, श्रम और समय-प्रधान दोनों हो सकती हैं। विशेष माइक्रोस्कोप थ्रूपुट को बेहतर बनाने और कार्यभार को कम करने में मदद कर सकते हैं। हालांकि, निर्माण, मालिक, और/या ऑपरेटिंग उन्नत माइक्रोस्कोप अक्सर कई प्रयोगशालाओं के लिए लागत निषेधात्मक हैं । यह काम मानक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त रूप से बड़े वर्गों के स्पष्ट ऊतक समाशोधन का उपयोग करके उच्च-संकल्प पर बड़ी मात्रा में तंत्रिका ऊतकों की कल्पना करने की एक उच्च थ्रूपुट, अपेक्षाकृत तेजी से, और सरल विधि प्रस्तुत करता है। यह प्रोटोकॉल निम्नलिखित चरणों के माध्यम से इस दृष्टिकोण का वर्णन करता है: 1) तंत्रिका ऊतक को विच्छेदन और तैयार करना, 2) ऊतक को साफ करना, 3) ऊतक को बढ़ता, 4) तैयार स्लाइस इमेजिंग, और 5) माइक्रोस्कोपी विज़ुअलाइज़ेशन सॉफ्टवेयर पुनर्निर्माण और विश्लेषण(चित्रा 2)का उपयोग करके पूर्ण स्लाइस छवियों को संसाधित करना। इन प्रयासों के परिणामस्वरूप उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां होती हैं जिनका उपयोग न्यूरॉन्स, न्यूरोनल कनेक्शन पैटर्न, 3 डी डेंड्रिटिक आकृति विज्ञान, डेंड्रिटिक स्पाइन बहुतायत और आकृति विज्ञान, और अक्षुण्ण मस्तिष्क ऊतक के भीतर आणविक अभिव्यक्ति पैटर्न की आबादी का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।
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Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल बायलोर कॉलेज ऑफ मेडिसिन के लिए सभी पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करता है।
1. विच्छेदन और ऊतक की तैयारी
- आइसोफ्लुन में भिगोए गए तौलिया (या अन्य आईयूसीएसी अनुमोदित साधनों द्वारा) के साथ एक बंद कंटेनर में माउस रखकर आइसोफ्लुनान की ओवरडोज के साथ माउस को इच्छामृत्यु दें।
- बर्फ ठंड पीबीएस के 10 एमएल के साथ एक 25 जी सुई का उपयोग कर पशु को प्रेरित करता है, इसके बाद 4% पीएफए के 10 एमएल होते हैं।
- ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र (या ऊतक) को विच्छेदन करें।
- विच्छेदित ऊतक को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 4% पीएफए में रखें। उचित निर्धारण इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है। इस कदम को छोड़ या छोटा न करें।
- कम से कम 12 घंटे के लिए 4% पीएफए में निर्धारण के बाद, ऊतक को 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 4% एक्रिलैमाइड हाइड्रोगेल मिश्रण में स्थानांतरित करें।
नोट: हाइड्रोगेल को विगल करते समय, यह सुनिश्चित करें कि यह बहुलक नहीं है, यह तब हो सकता है जब हाइड्रोगेल बहुत गर्म हो जाता है। समय से पहले बहुलीकरण को रोकने के लिए बर्फ पर गल।
2. ऊतक समाशोधन
- मस्तिष्क के ऊतकों (अभी भी हाइड्रोगेल में डूबे हुए) को -90 केपीए वैक्यूम के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए वैक्यूम इनक्यूबेटर में रखें। वैक्यूम को ठीक से बनाने की अनुमति देने के लिए ट्यूब टॉप को अनस्क्रूड छोड़ दें।
- कोमल मिलाते हुए कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ ऊतक धोएं।
- कक्ष के भीतर ऊतक के अभिविन्यास का ध्यान रखते हुए, इलेक्ट्रोफोरेसिस कक्ष में पॉलीमराइज्ड ऊतक नमूना रखें।
- आपूर्ति किए गए इलेक्ट्रोफोरेसिस एसडीएस बफर के साथ चैंबर और जलाशय भरें।
- 70 वी, 1 ए और 35 सी पर नमूना चलाएं, जिसमें लगभग 2 एच/मिमी ऊतक के लिए निरंतर धारा है।
- समय-समय पर नमूने की जांच करें; इसे ठीक से स्पष्ट करने के लिए कक्ष में अधिक समय की आवश्यकता हो सकती है। समाशोधन के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु मस्तिष्क के ऊतकों के प्रति मिमी 1-2 घंटे है। एक पूरे माउस मस्तिष्क पर्याप्त समाशोधन के लिए 8-10 घंटे की आवश्यकता है। इसे कक्ष से हटाने से पहले नमूने के अभिविन्यास को याद रखें और इसे वापस एक ही अभिविन्यास में कक्ष में बदलना सुनिश्चित करें।
नोट: चित्रा 3A से पता चलता है कि एक पूरी तरह से मंजूरी दे दी मस्तिष्क की तरह दिखेगा । मस्तिष्क अपारदर्शी दिखेगा और भंग एसडीएस की उपस्थिति के कारण इस स्तर पर स्पष्ट नहीं होगा, लेकिन लिपिड निष्कर्षण के बाद पीले ऊतक रंग का रंग नहीं होना चाहिए।
- समय-समय पर नमूने की जांच करें; इसे ठीक से स्पष्ट करने के लिए कक्ष में अधिक समय की आवश्यकता हो सकती है। समाशोधन के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु मस्तिष्क के ऊतकों के प्रति मिमी 1-2 घंटे है। एक पूरे माउस मस्तिष्क पर्याप्त समाशोधन के लिए 8-10 घंटे की आवश्यकता है। इसे कक्ष से हटाने से पहले नमूने के अभिविन्यास को याद रखें और इसे वापस एक ही अभिविन्यास में कक्ष में बदलना सुनिश्चित करें।
3. तैयारी और मंजूरी दे दी ऊतक बढ़ते
- नमूना समाशोधन समाप्त हो गया है और पर्याप्त रूप से स्पष्ट लग रहा है के बाद, कमरे के तापमान पर रात भर PBS में धो । जितनी बार हो सके ताजा पीबीएस के साथ पीबीएस की जगह लें। यह कदम अवशिष्ट एसडीएस को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है जो बाद के चरणों में उपजी बना सकते हैं।
- पीबीएस में अंतिम धोने के बाद, कमरे के तापमान पर तीन बार deionized पानी में 5 मिनट के लिए ऊतक धोएं । ऊतक इस कदम पर अपारदर्शी हो जाएगा और विस्तार हो सकता है ।
- अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान में ऊतक को इनक्यूबेट करें (टेबल 1देखें) कमरे के तापमान पर कम से कम 4 घंटे के लिए। चित्रा 3B अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान में इनक्यूबेशन के बाद मंजूरी दे दी ऊतक का एक टुकड़ा दिखाता है ।
- अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान में ऊतक की इनक्यूबेशन के दौरान, यदि आवश्यक हो तो नमूना छवि के लिए एक उपयुक्त आवास कक्ष का निर्माण करें।
- छोटे ऊतक नमूनों/स्लाइस के लिए एक इमेजिंग चैंबर का निर्माण
- बढ़ते के लिए एक आधार के रूप में एक गिलास स्लाइड का उपयोग करना, या तो रबर या प्लास्टिक स्पेसर नीचे रखना और सुपर गोंद के साथ सुरक्षित । यदि प्रीमेड स्पेसर उपलब्ध नहीं हैं, तो शंकु नली क्रॉस सेक्शन से बने प्लास्टिक के छल्ले का उपयोग करें।
- किसी भी छेद(चित्रा 3C)के बिना कांच स्लाइड करने के लिए इन टुकड़ों को सुरक्षित करने के लिए सुनिश्चित करें ।
- रिफ्रएक्टिव इंडेक्स मिलान समाधान के साथ पूर्व भरा बढ़ते कक्ष में मंजूरी दे दी ऊतक रखें।
- सुरक्षित रूप से शीर्ष पर एक ग्लास कवरलिप रखकर और नेल पॉलिश के साथ इसे सील करके ऊतक को माउंट करें।
- छवि इस ऊतक अपवर्तक सूचकांक की एक बूंद जोड़कर सीधे कांच के शीर्ष पर बढ़ते समाधान मिलान ।
- बड़े ऊतक इमेजिंग कक्ष
- ऊतक 5 मिमी मोटी (पूरे दिमाग या गोलार्द्धों के लिए उपयुक्त) से बड़ा है, तो इस कक्ष का निर्माण करें।
- एक ऊंची दीवार के साथ 10 सेमी ग्लास डिश का उपयोग करके, केंद्र में 50 एमएल शंकु नली रखें, जिससे यह सुनिश्चित किया जा सके कि शंकु का व्यास उपयोग किए गए उद्देश्य लेंस की बैरल को स्वीकार करने के लिए काफी बड़ा है।
- पानी में 3% agarose बनाओ और कांच पकवान और शंकु नली के बीच अंतरिक्ष में डालना, 1 घंटे(चित्रा 3 डी)के लिए ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं । यह ठोस agarose(चित्रा 3E)की एक अंगूठी बनेगी ।
- सुपर गोंद का उपयोग करके कक्ष के नीचे ऊतक का सुरक्षित रूप से पालन करें और चैंबर को अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान के साथ भरें। एक क्षेत्र है कि ब्याज के क्षेत्रों को नुकसान पहुंचाए बिना पकवान से ऊतक के उद्धार की अनुमति के लिए छवि नहीं किया जाएगा पर ऊतक का पालन करने के लिए गोंद लागू करें ।
नोट: यह तैयारी समय संवेदनशील है, क्योंकि अपवर्तक सूचकांक मीडिया तब तक बहुलक होना शुरू हो सकता है जब तक कि हवा से संरक्षित न हो और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत न हो।
4. इमेजिंग ऊतक नमूनों को मंजूरी दे दी
- 4 मिमी काम करने की दूरी के साथ 25x/0.95 NA उद्देश्य के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप फिट का उपयोग करके छवि प्राप्त करें।
- सभी प्रासंगिक इमेजिंग उपकरण चालू करें। नमूना को चरण पर रखें और बढ़ते कक्ष के शीर्ष पर अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान की एक बूंद रखें।
- ध्यान से उद्देश्य के साथ विसर्जन मीडिया दृष्टिकोण और मीडिया का एक सतत स्तंभ के रूप में।
- एपिफ्लोरेसेंस का उपयोग करके, एक उपयुक्त इमेजिंग फ़ील्ड ढूंढें।
- उपयुक्त सेटिंग्स का परीक्षण करके छवि अधिग्रहण प्रक्रिया शुरू करें।
- एक गाइड के रूप में चित्रा 4A का उपयोग करके रिज़ॉल्यूशन सेट करके और गति सेटिंग्स को स्कैन करके शुरू करें। यदि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इमेजिंग, तो सबसे छोटे ऑप्टिकल सेक्शन को प्राप्त करने के लिए पिनहोल को पूरी तरह से बंद करें और इस प्रकार सबसे अच्छा जेड-रिज़ॉल्यूशन।
- धीरे-धीरे लेजर पावर/सेंसर लाभ को तब तक बढ़ाएं जब तक कि एक उपयुक्त छवि उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ प्राप्त न हो जाए।
- यदि मानक EGFP/tdTomato दो रंग इमेजिंग का उपयोग कर, एक गाइड के रूप में चित्रा 4B का उपयोग कर प्रकाश संग्रह सेटिंग्स सेट ।
- ऊतक के अवलोकन शुरू और अंत बिंदुओं के आधार पर जेड-स्टैक पैरामीटर सेट करें। गाइड के रूप में चित्रा 4सी का उपयोग करके वांछित जेड-रिज़ॉल्यूशन के आधार पर चरण आकार निर्धारित करें।
नोट: छोटे कदम आकार एक बड़ा जेड संकल्प निकलेगा, लेकिन यह भी अधिक लेजर निवास समय शुरू होगा, संभावित नमूना विरंजन के लिए अग्रणी । - छवि अधिग्रहण सेटिंग्स से संतुष्ट होने पर, छवि प्राप्त करें।
- सुनिश्चित करें कि छवि में उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात है और संरचनाओं की अलग-अलग सीमाएं दिखातीहै (चित्रा 4D)।
5. माइक्रोस्कोपी विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवि प्रसंस्करण और 3डी क्वांटिफिकेशन
नोट: सूक्ष्म छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज त्रि-आयामी छवि दृश्य और प्रसंस्करण के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं। इनमें से कई कार्यक्रम बड़े डेटासेट की हैंडलिंग के लिए पूरी तरह से अनुकूल हैं जो इमेजिंग क्लीयर किए गए ऊतक नमूनों से उत्पन्न होते हैं। निम्नलिखित चरण और संबंधित आंकड़े Imaris सॉफ्टवेयर वर्कफ्लो के अनुरूप हैं।
- छवि स्टैक खोलें और इसे चयनित विश्लेषण सॉफ्टवेयर में आयात करें।
- छवि को त्रि-आयामी स्थान में देखें और छवि को बेहतर तरह से कल्पना करने के लिए डिस्प्ले एडजस्टर का उपयोग करके लुकअप टेबल में कोई वांछित परिवर्तन करें।
नोट: चित्रा 5A स्पष्टता ऊतक समाशोधन के साथ बनती 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से सुलभ संभव चरम इमेजिंग गहराई को दर्शाता है । चित्रा 5B चित्रा 5Aमें प्रस्तुत जेड-स्टैक से अलग डेंड्राइट प्रक्रियाओं के साथ-साथ स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली रीढ़ की मॉर्फोलोजी दिखाता है। - किसी भी सुसंगत पृष्ठभूमि को फ़िल्टर करने के लिए, इमेज प्रोसेसिंग बटन पर क्लिक करें और पृष्ठभूमि घटाव फ़िल्टर का चयन करें।
नोट: चित्रा 5C प्रसंस्करण से पहले एक सुसंगत धुंधला पृष्ठभूमि संकेत के साथ छवि से पता चलता है । चित्रा 5D पृष्ठभूमि घटाव फ़िल्टर लागू होने के बाद छवि दिखाता है। - 3 डी छवि का निरीक्षण करें और इसे कई कोणों और ज़ूम स्तर से देखकर परिचित हो जाएं।
- पहले फिलामेंट ट्रेसर टूल का चयन करके डेंड्राइट ट्रेसिंग शुरू करें।
- फिलामेंट मैन्युअल रूप से संपादित करें, स्वचालित निर्माण छोड़ें।
- ऑटो पथ के लिए मोड सेट करें और ऑटो-सेंटर और ऑटो-व्यास सुधार की जांच करें।
- एक प्रारंभिक बिंदु सेट करने के लिए सेल बॉडी पर शिफ्ट + सही क्लिक करें।
- डेनड्राइट की पूरी लंबाई के साथ न्यूरॉन का पता लगाइँक; सॉफ़्टवेयर को शुरू और अंत बिंदुओं के बीच में पथ की गणना करने की अनुमति देने के लिए समाप्ति बिंदु निर्धारित करने के लिए डेंड्राइट के अंत पर बाएं क्लिक करें।
- सभी dendrites के लिए इस कदम को दोहराएं, और पूरी तरह से सेल संरचना का पता लगाएं।
- पता लगाया सेल कल्पना और इसकी सटीकता की पुष्टि करें। आवश्यकतानुसार मैन्युअल समायोजन करें।
- क्रिएशन टैब चुनें।
- रीकॉम्प्यूट डेंड्राइट व्यास विकल्प चुनें।
- एक और अधिक सही पता लगाया dendrite के लिए पूरा करने के लिए जादूगर का पालन करें ।
- ड्रा टैब का चयन करें।
- स्पाइन ड्राइंग शुरू करने के लिए स्पाइन रेडियो बटन पर क्लिक करें।
- आवश्यकतानुसार अनुमानित रीढ़ व्यास सेट करें, और रीढ़ के व्यास का सटीक प्रतिनिधित्व प्राप्त करने के लिए माप उपकरण का उपयोग करें।
- एक नई रीढ़ जोड़ने के लिए रीढ़ सिर के केंद्र पर क्लिक करें।
- डेंड्राइट पर सभी कताई के लिए इसे दोहराएं।
नोट: मैन्युअल रूप से कताई जोड़ते समय सभी संभावित कोणों से डेंड्राइट का निरीक्षण करना महत्वपूर्ण है। - सटीकता के लिए नए जोड़े गए कताई की जांच करें और आवश्यकतानुसार परिवर्तन करें।
- क्रिएशन टैब चुनें।
- सॉफ्टवेयर को उचित सिर और गर्दन व्यास निर्धारित करने की अनुमति देने के लिए पुनर्संरक्षित रीढ़ व्यास विकल्प का चयन करें, जो डाउनस्ट्रीम डेटा विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण हैं।
- पूरा करने के लिए रीढ़ व्यास निर्माण जादूगर का पालन करें।
- गणना के परिणाम का निरीक्षण करें और आवश्यकतानुसार कोई भी मैनुअल समायोजन करें। चित्रा 5E एक पूरी तरह से पता लगाया न्यूरॉन कताई के साथ पूरा दिखाता है।
- कताई की एक वर्गीकृत सूची बनाने के लिए, टूल टैब का चयन करें।
नोट: काम करने के लिए इसके लिए मैटलैब एक्सटेंशन स्थापित किया जाना चाहिए।- मैटलैब एक्सटेंशन स्थापित करने के लिए, वरीयताओं की खिड़की खोलें।
- कस्टम टूल्स विकल्प चुनें।
- उपयुक्त मैटलैब रनटाइम एमसीआर जोड़ें।
- क्लासिफाई कताईपर क्लिक करें ।
- रीढ़ वर्गीकरण के लिए वांछित मापदंडों को संपादित करें।
- MATLAB एक्सटेंशन पर क्लासिफाई कताई पर क्लिक करें। चित्रा 5F रंग-कोडित वर्गीकृत कताई के साथ मढ़ा dendrite से पता चलता है ।
- सांख्यिकी टैब का चयन करें।
- इस टैब के नीचे-बाएं कोने में कॉन्फ़िगर बटन पर क्लिक करके डेटा की मात्रा निर्धारित करने के लिए वांछित आंकड़ों को कॉन्फ़िगर करें।
- एक बार सांख्यिकी प्रतिनिधित्व की विधि चुनी जाने के बाद, टैब डिस्प्ले पर निर्यात सांख्यिकी का उपयोग करके डेटा को इस विंडो के नीचे दाईं ओर स्थित फ़ाइल बटन पर निर्यात करें।
- पसंदीदा रेखांकन विधि का उपयोग करके आंकड़ों को ग्राफ करें।
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Representative Results
छवि अधिग्रहण के बाद, प्रतिनिधि सेल आकृति विज्ञान एम्बेडेड आंकड़ों का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के भीतर लिपियों को वर्गीकृत किया गया था। एकत्र किए गए डेटा(चित्रा 6A) दर्शाताहै कि न्यूरॉन 2 में कताई के उच्च घनत्व के साथ एक बड़ी डेंड्रिटिक संरचना है। एक पूरे के रूप में, डेटा से पता चलता है कि न्यूरॉन 2 न्यूरॉन 1 की तुलना में एक अधिक जटिल dendritic संरचना है । इस परिणाम को पुख्ता करने के लिए, मानक शोल विश्लेषण किया गया था, जो इस बात की पुष्टि करता है कि न्यूरॉन 2 न्यूरॉन 1 की तुलना में अधिक डेंजरटिक रूप से जटिल है जैसा कि सोमा(चित्रा 6B)से 50-100 माइक्रोन पर शोल चौराहों की बढ़ी हुई संख्या से दर्शाया गया है। अंत में, दो इमेज्ड न्यूरॉन्स के डेंड्रिटिक कताई को उनके समग्र आकार और आकारों के आधार पर चार मुख्य श्रेणियों में वर्गीकृत किया गया था। अधिक फिलोडोडिया जैसी आकृतियां प्रदर्शित करने वाली कताई अधिक अपरिपक्व रीढ़ के उपप्रकार हैं। परिभाषित सिर के साथ कताई, मशरूम कताई कहा जाता है, संभावना अधिक विकसित और परिपक्व synapses7होते हैं । यहां प्रस्तुत विश्लेषण से पता चलता है कि न्यूरॉन 1 में न्यूरॉन 2(चित्रा 6C)की तुलना में फिलोडोडिया जैसी कताई का एक बड़ा हिस्सा होता है। इस प्रकार, आकृति विज्ञान के आधार पर, न्यूरॉन 2 अधिक विकासात्मक रूप से परिपक्व होता है क्योंकि यह बड़ा, अधिक उच्च शाखाकृत होता है, और इसमें परिपक्व कताई का घनत्व अधिक होता है।
चित्र 1:स्पष्टता प्रोटोकॉल अंतर्निहित संरचना और अणु-अणु स्थानिक संबंधों को बनाए रखते हुए ऊतकों को पारदर्शी बनाता है। (ए)समाशोधन से पहले न्यूरोनल ऊतक और अंतरकोशिकीय घटकों का मूल अभिविन्यास। (ख)हाइड्रोगेल मोनोमर (बैंगनी रेखाएं) ऊतक में संचार और एक हाइड्रोजेल जाल में बहुलक हैं । ऊतक और हाइड्रोजेल जाल फॉर्मलडिहाइड निर्धारण के माध्यम से क्रॉसलिंक किए जाते हैं। (ग)इसके बाद टिश्यू को इलेक्ट्रिक फील्ड्स के संपर्क में रहते हुए आयनिक डिटर्जेंट सॉल्यूशंस से धोया जाता है । इस प्रक्रिया के दौरान, डिटर्जेंट मिसेल्स ऊतक से लिपिड अणुओं को हटा देते हैं, पारदर्शी हाइड्रोगेल और बायोमॉलिक्यूल्स के क्रॉसलिंक्ड नेटवर्क को पीछे छोड़ते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2:प्रोटोकॉल का फ्लो चार्ट, टिश्यू तैयार करने, क्लीयरिंग, बढ़ते, इमेजिंग और इमेज प्रोसेसिंग को आरेखन करना। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3-साफ किए गए टिश्यू नमूनों के लिए बढ़ते कक्षों का निर्माण। (ए)अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान में विसर्जन से पहले पीबीएस में पूरे मस्तिष्क को मंजूरी दे दी। (ख)अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान में मस्तिष्क टुकड़ा। (ग)बड़े और छोटे साफ ऊतक नमूनों के लिए इमेजिंग चैंबर । कक्षों सहित सामग्री की एक किस्म का उपयोग कर बनाया जा सकता है, लेकिन 3 डी मुद्रित प्लास्टिक और कट शंकु ट्यूबों तक ही सीमित नहीं है । (घ)पूरे मस्तिष्क या गोलार्द्ध इमेजिंग के लिए इमेजिंग चैंबर, एक राहत के रूप में 50 एमएल शंकु नली का उपयोग करने से पहले एक डालने का कार्य डालने से पहले। (ई)पूरे मस्तिष्क या गोलार्द्ध इमेजिंग चैंबर के साथ agarose पूरी तरह से सेट; यह सेटअप बड़े बैरल विसर्जन उद्देश्यों के लिए इष्टतम है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4:साफ ऊतक नमूनों से उच्च गुणवत्ता वाले बड़े डेटासेट प्राप्त करें। (A)इमेज एक्विजिशन सेटिंग्स का इस्तेमाल पूरे सेल हाई-रेजोल्यूशन इमेजिंग के लिए किया जाता है । फाइन ऑप्टिकल सेक्शन को सक्षम करने के लिए पिनहोल को पूरी तरह से बंद कर दिया गया था। स्कैन गति अनुभवजन्य इष्टतम पिक्सेल निवास समय के आधार पर निर्धारित किया गया था । (ख)लाइट पाथ सेटिंग्स- ये फ्लोरोफोर और इस्तेमाल किए जाने वाले उपकरणों पर निर्भर करेंगे। (C)जेड-स्टैक सेटिंग्स; जेड-दिशा में यथासंभव अधिक से अधिक जानकारी को कैप्चर करने के लिए एक बढ़िया जेड-स्टेप का उपयोग किया गया था। (घ)प्रतिनिधि अधिकतम प्रक्षेपण; स्केल बार 25 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 5:विश्लेषण सॉफ्टवेयर में dendrites के 3 डी विश्लेषण। (A) एकदो फोटॉन के साइड-व्यू ने tdTomato को व्यक्त करते हुए 1 मिमी मोटी ऊतक से प्राप्त 600 माइक्रोन जेड-स्टैक का अधिग्रहण किया; स्केल बार पैनल ए में अधिग्रहीत एक ही जेड-स्टैक के 100μm(B)टॉप-व्यू का प्रतिनिधित्व करता है; स्केल बार 100μm का प्रतिनिधित्व करता है।(C)कन्फोकल ने ईजीएफपी व्यक्त करते हुए ऊतक की छवि का अधिग्रहण किया। छवि फ़ाइलों को सीधे विश्लेषण सॉफ्टवेयर में आयात किया जा सकता है और अधिक छवि गुणवत्ता के लिए पूर्व-संसाधित किया जा सकता है; स्केल बार 25 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है।(D)थ्रेसहोल्ड घटाव का उपयोग सी(ई)फिलामेंट ट्रेसिंग और रीढ़ की पहचान में मौजूद लगातार पृष्ठभूमि संकेत को हटाने के लिए किया जाता है: यह प्रक्रिया सबसे अच्छी होती है जब ऑटो-गहराई सुविधा की जांच के साथ अर्ध-स्वचालित प्रदर्शन किया जाता है। कताई तो पूर्ण dendrite पुनर्निर्माण के बाद हाथ लेबल थे; स्केल बार बिल्ट-इन मैटलैब एक्सटेंशन का उपयोग करके 25 माइक्रोन(एफ)स्पाइन वर्गीकरण का प्रतिनिधित्व करता है। कताई को उनकी आकृति विज्ञान के आधार पर रंग कोडित किया गया है; ठूंठ की कताई लाल हैं; मशरूम कताई हरे रंग की हैं; लंबी पतली कताई नीली होती है; फिलोपोडिया बैंगनी हैं; स्केल बार 25 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 6:प्रतिनिधि परिणाम। (A)चयनित विश्लेषण कार्यक्रम द्वारा स्वचालित रूप से उत्पन्न सामान्य रूपात्मक मापों की तालिका। (ख)कार्यक्रम के आंकड़ों द्वारा उत्पन्न शोल चौराहों की संख्या । (ग)पाई चार्ट डेंड्रिटिक स्पाइन मॉर्फोलोजी के वितरण का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| घोल | संयोजन | नोट्स |
| अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान | हिस्टोडेन्ज़ के 80 ग्राम | पीएच को 7.5 NaOH के साथ |
| 0.02 एम फॉस्फेट बफर के 60 एमएल | 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें | |
| सोडियम एजाइड का 0.01% | मार्क्स, वी नेचर मेथड्स वॉल्यूम 11, पेज 1209-1214 (2014) से अनुकूलित | |
| हाइड्रोजेल | 30% एक्रिलैमाइड (नो-बीआईएस) का 13.33 एमएल | बर्फ पर एक साथ मिलाएं, अन्यथा समाधान बहुलक होना शुरू हो सकता है |
| 10x पीबीएस के 10 एमएल | Aliquot और स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर | |
| 250 मिलीग्राम वीए-044 | ||
| 76.66 एमएएल का डीएच2ओ |
तालिका 1: अपवर्तक छवि मिलान समाधान और हाइड्रोगेल समाधान के लिए व्यंजनों। अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान और हाइड्रोगेल की संरचना सूचीबद्ध है।
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Discussion
समकालीन ऊतक समाशोधन तकनीकों के आगमन से पहले, न्यूरोनल आकृति विज्ञान का अध्ययन करने में समय-गहन अनुभागिंग, इमेजिंग और आसन्न बहुत पतले वर्गों का पुनर्निर्माण शामिल था। कॉन्फोकल इमेजिंग के संयोजन में इलेक्ट्रोफोरेटिक ऊतक समाशोधन का उपयोग करना पूर्ण न्यूरोनल आकृति विज्ञान का एक अबाधित दृश्य प्रदान करता है। अक्षुण्ण डेंड्रिटिक पेड़ों से, सबसे छोटी सिनेप्टिक बोटन, इमेजिंग और मात्रात्मक न्यूरोनल आकृति विज्ञान कभी भी अधिक व्यवहार्य नहीं रही है।
मंजूरी दे दी मस्तिष्क ऊतक की तैयारी सीधी है और विशेष उपकरणों का केवल एक टुकड़ा की आवश्यकता है। ऊतक को मंजूरी दे दी और इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर छवि थकाऊ पतली अनुभागिंग, हैंडलिंग, और बढ़ते के लिए की जरूरत है, काफी प्रयोग से छवि अधिग्रहण के लिए समय कम । इसके अतिरिक्त, खंड के बिना चित्रित ऊतक मूल संरचनाओं के प्रति अधिक वफादार रहता है, क्योंकि नुकसान या आवश्यक पोस्ट-हॉक छवि पुनर्निर्माण का कोई स्रोत नहीं है। अंत में, यह प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर सुविधाओं जैसे कि छोटे पैमाने पर सबमिक्रॉन सुविधाओं जैसे स्पाइन जैसे डेंड्रिटिक पेड़ों की एक साथ इमेजिंग की अनुमति देकर समय बचाता है।
इस प्रोटोकॉल में चरणों का एक महत्वपूर्ण संग्रह धोने के कदम हैं जो समाशोधन प्रक्रिया का पालन करते हैं। ये कदम एसडीएस इलेक्ट्रोफोरेटिक समाशोधन बफर के सभी निशानों को हटाने के लिए महत्वपूर्ण हैं। यदि साफ ऊतक पर्याप्त रूप से धोया नहीं जाता है, तो बढ़ते कदम के दौरान वर्षा बनेगी। इन तेज़ों को कभी-कभी कम समय के लिए 37-55 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक को इनक्यूबेट करके पुनर्विकार किया जा सकता है। हालांकि, अगर वर्षा बनी रहती है, तो वे प्रकाश को तितर-बितर करेंगे, खराब इमेजिंग गहराई और गुणवत्ता पैदा करेंगे।
ऊतक के बढ़ते बड़े टुकड़े पारंपरिक पतली टुकड़ा इमेजिंग की तुलना में एक चुनौती प्रस्तुत करता है । यहां हम बड़े ऊतकों को माउंट करने के लिए कई प्रक्रियाएं पेश करते हैं, जो इमेजिंग तकनीक, उद्देश्य लेंस गुणों और ऊतक नमूने के आकार पर निर्भर करते हैं। सबसे पहले, यह एक उद्देश्य लेंस है कि विशिष्ट अपवर्तक सूचकांक मिलान मीडिया में विसर्जन के लिए उपयुक्त है का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, और जो बड़े ऊतक नमूनों इमेजिंग के लिए पर्याप्त काम की दूरी है । यह प्रोटोकॉल काफी हद तक इमेजिंग प्लेटफॉर्म के ऑप्टिकल गुणों द्वारा सीमित है, विशेष रूप से उद्देश्यों की कार्य दूरी। गहराई पर इमेजिंग आसानी से इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर हासिल किया है। हालांकि, अगर पर्याप्त काम की दूरी के साथ एक उद्देश्य उपलब्ध नहीं है, ऊतक ही बड़ी छवियों को प्राप्त करने के लिए एक भौतिक बाधा पेश करेंगे । अगला महत्वपूर्ण निर्णय इमेजिंग तकनीक है। दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी आम तौर पर अपनी शानदार छवि की गुणवत्ता, इमेजिंग की गहराई, और अधिग्रहण की गति के लिए प्रयोग किया जाता है । दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी चित्र 5 ए,बीमें प्रदर्शित छवि की गुणवत्ता के नुकसान के बिना स्पष्टता को साफ ऊतक में 1 मिमी तक इमेजिंग सक्षम बनाता है। हालांकि, पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते समय बहुत ही परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं, हालांकि दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी(चित्रा 5 सी,डी)की तुलना में गहराई इमेजिंग के लिए बलिदान के साथ।
संक्षेप में, यह विधि बड़े और छोटे दोनों पैमानों पर न्यूरोनल आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए एक मजबूत और सुविधाजनक मंच प्रदान करती है। इसके अतिरिक्त, यह विधि काफी हद तक हैंडलिंग और प्रसंस्करण समय को कम करती है, जबकि अधिक सटीक और पूर्ण त्रि-आयामी छवियां भी प्रदान करती है। सेलुलर आकृति विज्ञान सर्किट कार्य और स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला प्रॉक्सी है जो कई बीमारियों और विकृतियों का अंतर्निहित है13,14,15. इमेजिंग न्यूरॉन आकृति विज्ञान शक्तिशाली, सीधा है, और अच्छी तरह से रोग मॉडल की एक भीड़ में परख के लिए अनुकूल है।
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Disclosures
लेखकों के पास इस समय खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम इन प्रयोगों में इस्तेमाल किए जाने वाले एएवी और लेंटीवायरस के उत्पादन के लिए जन और डैन डंकर न्यूरोलॉजिकल संस्थान में वायरल कोर एनआरडीडीसी का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इसके अतिरिक्त, हम माउस पालन और इस्तेमाल चूहों के सामान्य रखरखाव के लिए तुलनात्मक चिकित्सा के लिए बायलोर कॉलेज ऑफ मेडिसिन सेंटर का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। हम पुरस्कार संख्या 20PRE35040011 के तहत उनके समर्थन के लिए अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और पीतल: उनके समर्थन (PJH) के लिए छात्र वैज्ञानिकों के लिए Baylor अनुसंधान अधिवक्ताओं । अंत में, हम लोगो एक्स-स्पष्टता इलेक्ट्रोफोरेटिक ऊतक समाशोधन प्रणाली के साथ हमारी प्रयोगशाला प्रदान करने के लिए लोगो का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| 25 G x 1" Needle | BD | 305127 | |
| 30% Acrylamide (No-Bis) | National Diagnostics | EC-810 | |
| 50 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339653 | |
| Electrophoretic Tissue Clearing Solution | Logos | C13001 | |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | |
| Hydrogel Solution Kit | Logos | C1310X | |
| Imaris | Oxford Instruments | N/A | |
| Paraformaldehyde 16% | EMS | 15710 | |
| PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case | fisher | MT21040CV | |
| VA-044 | Wako | 925-41020 | |
| X-CLARITY Polymerization System | Logos | C20001 | |
| X-CLARITY Tissue Clearing System II | Logos | C30001 |
References
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