Summary
Nevronal dendritisk morfologi ligger ofte til grunn for funksjon. Faktisk manifesterer mange sykdomsprosesser som påvirker utviklingen av nevroner med en morfologisk fenotype. Denne protokollen beskriver en enkel og kraftig metode for å analysere intakte dendritiske arbors og deres tilhørende spines.
Abstract
Hjerneaktivitet, de elektrokjemiske signalene som sendes mellom nevroner, bestemmes av tilkoblingsmønstrene til nevronnettverk, og fra morfologien til prosesser og understrukturer i disse nevronene. Som sådan har mye av det som er kjent om hjernefunksjon oppstått sammen med utviklingen i bildeteknologier som gir ytterligere innsikt i hvordan nevroner er organisert og forbundet i hjernen. Forbedringer i vevsrydding har gjort det mulig å avbilde tykke hjerneskiver med høy oppløsning, noe som letter morfologisk rekonstruksjon og analyser av nevronale understrukturer, som dendritiske arbors og spines. I tandem gir fremskritt innen bildebehandlingsprogramvare metoder for raskt å analysere store bildedatasett. Dette arbeidet presenterer en relativt rask metode for behandling, visualisering og analyse av tykke skiver av merket nevralt vev ved høy oppløsning ved hjelp av CLARITY vevsrydding, konfokal mikroskopi og bildeanalyse. Denne protokollen vil lette arbeidet med å forstå tilkoblingsmønstrene og nevronale morfologier som karakteriserer sunne hjerner, og endringene i disse egenskapene som oppstår i syke hjernetilstander.
Introduction
Forståelse av romlig organisering, tilkoblingsmønstre og morfologi av komplekse tredimensjonale biologiske strukturer er avgjørende for å avgrense funksjonene til bestemte celler og vev. Dette gjelder spesielt i nevrovitenskap, der enorm innsats har vært dedikert til å bygge høyoppløselige nevroanatomiske kart over sentralnervesystemet1,2. Nær undersøkelse av nevronene som består av disse kartene gir varierte morfologier, med forbindelser og steder som gjenspeiler funksjonen til disse forskjellige settene av nevroner3,4. Videre kan undersøkelse av subcellulære strukturer, spesielt dendritiske spines, informere modenheten til synapser, og dermed reflektere utviklingsprosesser og nevrologiske sykdomstilstander5,6,7. Dermed er tilnærminger som forbedrer avbildningsoppløsning og gjennomstrømning avgjørende for å bedre forstå hjernefunksjonen i alle skalaer.
Nylige fremskritt har utvidet det molekylære og genetiske verktøysettet for merking og manipulering av populasjoner av nevroner. Utviklingen av nye fluorescerende markører, kombinert med nye metoder for å introdusere disse markørene i nevroner, muliggjør differensialmerking av populasjoner av interagerende nevroner innenfor samme dyre- eller hjerneprøve8,9,10,11. Fordi lys er spredt av ugjennomsiktige lipider, og gitt det høye lipidinnholdet i hjernevev, har avbildning av nevronpopulasjoner primært vært begrenset til tynne seksjoner eller har stolt på avanserte mikrocropy teknikker (f.eks. konfidensere, multi-foton og lysarkmikrokopier) til bilde dype strukturer. Imidlertid har disse anstrengelsene blitt sterkt styrket av fremskritt innen vevsryddingsteknikker. Klar Lipid-byttet akrylamid-hybridisert Stiv imaging / immunostaining /in situ hybridisering-kompatibel Tissue-hYdrogel (CLARITY) er en slik teknikk, der vev av interesse er infundert med hydrogelmonomerer (akrylamid og bis-akrylamid) og deretter vasket med vaskemidler12. Hydrogelmonokromerene hybridiserer for å skape et stabilt 3D hydrogel stillas som er optisk gjennomsiktig og gjennomtrengelig for makromolekyletiketter. Nukleinsyrer og proteiner opprettholdes i den hybridiserte matrisen, mens lipider fjernes av vaskemiddelvaskene (figur 1). Dette resulterer i et stabilt vev som er stivt nok til å opprettholde den opprinnelige formen og orienteringen av celler og ikke-lipidmolekyler, mens optisk gjennomsiktig nok til å enkelt bilde dype strukturer ved høy oppløsning. Dette vedlikeholdet av vevsstruktur og orientering gjør det mulig å forestille seg tykke skiver, og dermed bevare celle-til-celle-forbindelser og romlige forhold. Videre, fordi plasseringen og tilgjengeligheten av proteiner og nukleinsyrer opprettholdes under ryddingsprosessen, er ryddet vev i stand til å holde uttrykksbaserte markører, samt eksogene etiketter. Dermed gir CLARITY seg som en potent metode for å forestille seg store mengder dype hjernestrukturer og forbindelsene mellom disse strukturene ved høy oppløsning.
Bruken av CLARITY forbedrer i stor grad tilnærminger til avbildning av nevronpopulasjoner. Denne teknikken er spesielt dyktig til å generere store mengder bildedata. CLARITY fungerer bra med flere former for proteinbasert fluorescens. Denne protokollen benytter en lentiviral-basert tilnærming til sparsomt etikettceller med EGFP og tdTomato; Imidlertid har transgene reporter alleler som uttrykker tdTomato eller EGFP for å merke celler for rekonstruksjon rutinemessig blitt brukt. Det er viktig å velge en fluorofor som er både fotostabil og lys (f.eks. EGFP eller tdTomato). I tillegg gir bruk av en sterk promotor for å uttrykke fluorofor overlegen kontrast og bildekvalitet. Ulempene med denne teknikken oppstår da riktig analyse av denne store mengden data kan være både arbeids- og tidkrevende. Spesialiserte mikroskoper kan bidra til å forbedre gjennomstrømningen og redusere arbeidsmengden. Imidlertid er bygging, eie og / eller drift av avanserte mikroskoper ofte kostnadsforbudende for mange laboratorier. Dette arbeidet presenterer en høy gjennomstrømning, relativt rask og enkel metode for å visualisere store mengder nevralt vev ved høyoppløselig ved hjelp av CLARITY vevsrydding av store seksjoner, kombinert med standard konfokal mikroskopi. Denne protokollen beskriver denne tilnærmingen gjennom følgende trinn: 1) dissekering og klargjøring av nevralvevet, 2) rydding av vevet, 3) montering av vevet, 4) avbildning av de forberedte skiver og 5) behandling av fullskivebilder ved hjelp av mikroskopi visualisering programvare rekonstruksjon og analyse (Figur 2). Disse anstrengelsene resulterer i høyoppløselige bilder som kan brukes til å analysere populasjoner av nevroner, nevronale tilkoblingsmønstre, 3D dendritisk morfologi, dendritisk ryggradsoverflod og morfologi, og molekylære uttrykksmønstre i intakt hjernevev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoll følger alle retningslinjer for dyrepleie for Baylor College of Medicine.
1. Disseksjon og vevspreparat
- Avlive musen med en overdose isofluran ved å plassere musen i en lukket beholder med et håndkle gjennomvåt i isofluran (eller på andre IUCAC-godkjente midler).
- Perfuse dyret transkardielt ved hjelp av en 25 G nål med 10 ml iskald PBS, etterfulgt av 10 ml 4% PFA.
- Dissekere hjerneregionen (eller vevet) av interesse.
- Plasser det dissekerte vevet i 4 % PFA over natten ved 4 °C. Riktig fiksering er nøkkelen for denne protokollen. Ikke hopp over eller forkort dette trinnet.
- Etter fiksering i 4% PFA i minst 12 timer, overfør vevet til en 4% akrylamidhydrgelblanding i 24 timer ved 4 °C.
MERK: Når du tiner hydrogelen, må du sørge for at den ikke har polymerisert seg, dette kan skje hvis hydrogelen blir for varm. Tine på is for å forhindre for tidlig polymerisering.
2. Vevsrydding
- Plasser hjernevevet (fortsatt nedsenket i hydrogel) i en vakuuminkubator i 3 timer ved 37 °C med et -90 kPa-vakuum. La rørtoppen stå skrudd av slik at vakuumet kan dannes riktig.
- Vask vevet med PBS i 10 min ved romtemperatur (25 °C) med skånsom risting.
- Plasser den polymeriserte vevsprøven i elektroforesekammeret, og legg merke til vevets orientering i kammeret.
- Fyll kammeret og reservoaret med den medfølgende elektroforese SDS-bufferen.
- Kjør prøven ved 70 V, 1 A og 35 C, med konstant strøm i ca. 2 t/mm vev.
- Kontroller prøven med jevne mellomrom; det kan ta mer tid i kammeret å fjerne riktig. Et godt utgangspunkt for rydding er 1-2 t per mm hjernevev. En hel musehjerne krever 8-10 timer for tilstrekkelig rydding. Husk retningen på prøven før du fjerner den fra kammeret og pass på å bytte den tilbake i kammeret i samme retning.
MERK: Figur 3A viser hvordan en fullstendig ryddet hjerne vil se ut. Hjernen vil se ugjennomsiktig ut og ikke klart på dette stadiet på grunn av tilstedeværelsen av oppløst SDS, men det skal være lite eller ingen gult vev farget nyanse etter lipidekstraksjon.
- Kontroller prøven med jevne mellomrom; det kan ta mer tid i kammeret å fjerne riktig. Et godt utgangspunkt for rydding er 1-2 t per mm hjernevev. En hel musehjerne krever 8-10 timer for tilstrekkelig rydding. Husk retningen på prøven før du fjerner den fra kammeret og pass på å bytte den tilbake i kammeret i samme retning.
3. Klargjøring og montering av det ryddede vevet
- Etter at prøven er ferdig klar og ser tilstrekkelig klar ut, vask i PBS over natten ved romtemperatur. Skift ut PBS med fersk PBS så ofte som mulig. Dette trinnet er avgjørende for å fjerne gjenværende SDS som kan danne utfellinger i senere trinn.
- Etter den endelige vasken i PBS, vask vevet i 5 min i deionisert vann ved romtemperatur tre ganger. Vevet blir ugjennomsiktig på dette trinnet og kan utvide seg.
- Inkuber vevet i refraktiv indeksmatchingsløsning (se tabell 1) i minst 4 timer ved romtemperatur. Figur 3B viser et stykke ryddet vev etter inkubasjon i brytningsindeksmatchingsløsning.
- Under inkubasjon av vev i brytningsindeks matchende løsning, konstruere et passende huskammer for å avbilde prøven om nødvendig.
- Konstruere et bildekammer for små vevsprøver/skiver
- Bruk en glasssklie som base for montering, legg ned enten gummi- eller plastavstandsstykker og fest med superlim. Hvis forhåndslagde avstandsstykker ikke er tilgjengelige, bruk plastringer laget av koniske rørtrsnitt.
- Pass på at du fester disse delene til glassskuffen uten hull (Figur 3C).
- Plasser det ryddede vevet i monteringskammeret forhåndsfylt med brytningsindekstilpasningsløsning.
- Monter vevet sikkert ved å plassere et glassdeksler på toppen og forsegle det med neglelakk.
- Bilde dette vevet ved å legge til en dråpe brytningsindeks matchende monteringsløsning direkte på toppen av glasset.
- Stort vevsavbildningskammer
- Konstruer dette kammeret hvis vevet er større enn 5 mm tykt (egnet for hele hjerner eller halvkule).
- Bruk en 10 cm glassfat med høy vegg, plasser et 50 ml konisk rør i midten, og sørg for at diameteren på konisk er stor nok til å akseptere fatet til objektivlinsen som brukes.
- Lag 3% agarose i vann og hell det i rommet mellom glassfatet og konisk rør, la det avkjøles i 1 time (Figur 3D). Dette vil danne en ring av fast agarose (Figur 3E).
- Fest vevet sikkert til bunnen av kammeret ved hjelp av superlim og fyll kammeret med brytningsindeksmatchingsløsning. Påfør lim for å feste vevet på en region som ikke vil bli avbildet for å tillate gjenvinning av vevet fra parabolen uten å skade regionene av interesse.
MERK: Dette preparatet er tidssensitivt, da brytningsindeksmediet kan begynne å polymerisere med mindre det er bevart fra luft og lagret ved 4 °C.
4. Imaging ryddet vev prøver
- Skaff deg bildet ved hjelp av et konfokalt mikroskop som passer med et 25x/0,95 NA-mål med en 4 mm arbeidsavstand.
- Slå på alt relevant bildeutstyr. Plasser prøven på scenen og plasser en dråpe brytningsindekstilpasningsløsning på toppen av monteringskammeret.
- Gå forsiktig til nedsenkningsmediene med målet og danner en kontinuerlig kolonne med medier.
- Bruk epifluorescence, finn et passende bildefelt.
- Start prosedyren for bildeanskaffelse ved å teste de riktige innstillingene.
- Begynn med å stille inn innstillingene for oppløsning og skannehastighet ved hjelp av figur 4A som en veiledning. Hvis du ser på bildet ved hjelp av et konfokalt mikroskop, lukker du pinholeet helt for å oppnå den minste optiske delen og dermed beste z-oppløsning.
- Øk laserkraften/sensorforsterkningen gradvis til et passende bilde oppnås med et høyt signal-til-støy-forhold.
- Hvis du bruker standard EGFP/tdTomato tofarget avbildning, stiller du inn innstillingene for lyssamling ved hjelp av figur 4B som en veiledning.
- Angi z-stack-parametrene basert på de observerte start- og sluttpunktene i vevet. Angi trinnstørrelsen basert på ønsket z-oppløsning ved hjelp av figur 4C som en veiledning.
MERK: Mindre trinnstørrelser vil gi større z-oppløsning, men vil også introdusere mer laserboetid, noe som potensielt kan føre til prøvebleking. - Når du er fornøyd med innstillingene for bildeanskaffelse, må du skaffe deg bildet.
- Kontroller at bildet har et høyt signal-til-støy-forhold og viser tydelige grenser for strukturer (Figur 4D).
5. Bildebehandling og 3D-kvantifisering ved hjelp av programvare for mikroskopianalyse
MERK: Mikroskopiske programvarepakker for bildeanalyse er kraftige verktøy for tredimensjonal bildevisualisering og -behandling. Mange av disse programmene er perfekt egnet for håndtering av store datasett som genereres fra avbildningsklarerte vevsprøver. Følgende trinn og tilknyttede figurer tilsvarer arbeidsflyten for Imaris-programvare.
- Åpne bildestakken og importer den til den valgte analyseprogramvaren.
- Vis bildet i tredimensjonalt rom, og gjør ønskede endringer i oppslagstabellene ved hjelp av visningsjusteringen for bedre å visualisere bildet.
MERK: Figur 5A viser den mulige ekstreme bildedybden som er tilgjengelig gjennom 2-fotonmikroskopi sammen med CLARITY-vevsrydding. Figur 5B viser distinkte dendrittprosesser samt tydelig synlige ryggmorfologier fra z-stabelen som presenteres i figur 5A. - Hvis du vil filtrere ut konsekvent bakgrunn, klikker du bildebehandlingsknappen og velger bakgrunnsdeltraksjonsfilteret.
MERK: Figur 5C viser bildet med et konsekvent disig bakgrunnssignal før behandling. Figur 5D viser bildet etter at bakgrunnsdeltraksjonsfilteret er brukt. - Vær oppmerksom på 3D-bildet og bli kjent med det ved å se på det fra flere vinkler og zoomnivåer.
- Start dendritsporingen ved først å velge Filament tracer-verktøyet.
- Klikk Rediger filamentet manuelt, hopp over automatisk oppretting.
- Sett modusen til automatisk bane, og kontroller korrigeringer av automatisk midtstilt og automatisk diameter.
- Skift + høyreklikk på cellekroppen for å angi et utgangspunkt.
- Spor nevronen langs hele lengden av dendritten; venstreklikk på slutten av dendritten for å angi termineringspunktet slik at programvaren automatisk kan beregne banen mellom start- og sluttpunktene.
- Gjenta dette trinnet for alle dendrittene, og spor ut cellestrukturen fullstendig.
- Visualiser den sporede cellen og bekreft nøyaktigheten. Foreta manuelle justeringer etter behov.
- Velg kategorien Opprettelse .
- Velg alternativet Beregn dendritdiameter på nytt.
- Følg veiviseren til fullføring for en mer nøyaktig sporet dendrit.
- Velg Tegne-fanen.
- Klikk på alternativknappen Ryggrad for å begynne å tegne ryggrader.
- Still inn den omtrentlige ryggdiameteren etter behov, og bruk måleverktøyet for å få en nøyaktig representasjon av ryggdiametre.
- Klikk på midten av rygghodene for å legge til en ny ryggrad.
- Gjenta dette for alle spines på dendritten.
MERK: Det er viktig å observere dendritten fra alle mulige vinkler når du legger til spines manuelt. - Kontroller de nylig tillagte ryggradene for nøyaktighet og gjør endringer etter behov.
- Velg kategorien Opprettelse .
- Velg alternativet Recompute Spine Diameter for å la programvaren bestemme riktig hode- og nakkediameter, noe som er avgjørende for nedstrømsdataanalyse.
- Følg veiviseren for oppretting av ryggdiameter til den er fullført.
- Vær oppmerksom på resultatet av beregningen og foreta eventuelle manuelle justeringer etter behov. Figur 5E viser en fullstendig sporet nevron komplett med spines.
- Hvis du vil opprette en klassifisert liste over ryggrader, velger du kategorien Verktøy .
MERK: MATLAB-utvidelsen må være installert for at dette skal fungere.- Åpne innstillingsvinduet for å installere MATLAB-utvidelsen.
- Velg alternativet Egendefinerte verktøy .
- Legg til riktig MCR for MATLAB-kjøretid.
- Klikk på Klådd på Ryggrader.
- Rediger de ønskede parameterne for ryggklassifisering.
- Klikk på Classify Spines på MATLAB-utvidelsen. Figur 5F viser dendritten overlagt med fargekodede klassifiserte spines.
- Velg kategorien Statistikk .
- Konfigurer ønsket statistikk for å kvantifisere dataene ved å klikke på Konfigurer-knappen nederst til venstre i denne kategorien.
- Når metoden for statistikkrepresentasjon er valgt, eksporterer du dataene ved hjelp av knappen Eksporter statistikk på fanevisning til fil nederst til høyre i dette vinduet.
- Lag en grafisk fremstilling av statistikken ved hjelp av en foretrukket grafmetode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter bildeinnhenting ble den representative cellemorfologien analysert ved hjelp av innebygd statistikk og klassifisering av skript i analyseprogramvaren. De innsamlede dataene (figur 6A) gjenspeiler at neuron 2 har en større dendrittisk struktur med høyere tetthet av ryggrader. Som helhet antyder dataene at neuron 2 har en mer kompleks dendrittisk struktur sammenlignet med nevron 1. For å sannsynliggjøre dette resultatet ble det utført standard Sholl-analyse, som bekrefter at neuron 2 er mer dendritisk kompleks enn nevron 1 som betegnet av det økte antallet Sholl-kryss ved 50-100 μm fra soma (Figur 6B). Til slutt ble dendrittiske spines av de to avbildede nevronene klassifisert i fire hovedkategorier basert på deres samlede former og størrelser. Spines som viser flere filopodia-lignende former er sannsynligvis mer umodne ryggradsundertyper. Spines med definerte hoder, kalt soppspinner, inneholder sannsynligvis mer utviklede og modne synapser7. Analysen som presenteres her viser at neuron 1 inneholder en større andel filopodia-lignende spines sammenlignet med neuron 2 (Figur 6C). Således, basert på morfologi, er neuron 2 mer utviklingsmessig moden da den er større, mer forgrenet og inneholder en høyere tetthet av modne spines.
Figur 1: CLARITY-protokollen gjør vev gjennomsiktig samtidig som iboende struktur og molekylmolekyl-molekyl romlige relasjoner opprettholdes. (A) Opprinnelig orientering av nevronvev og intercellulære komponenter før rydding. (B) Hydrogel monomerer (lilla linjer) infunderes i vevet og polymeriseres i et hydrogelnett. Vevet og hydrogelnettet er krysskoblet via formaldehydfiksering. (C) Vevet vaskes deretter med ioniske vaskemiddelløsninger mens det utsettes for elektriske felt. Under denne prosessen fjerner vaskemiddelet micelles lipidmolekyler fra vevet, og etterlater et krysskoblet nettverk av gjennomsiktig hydrogel og biomolekyler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Flytskjema over protokollen, diagramlegging av vevsforberedelse, rydding, montering, avbildning og bildebehandling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Konstruere monteringskamre for klarerte vevsprøver. (A) Ryddet hele hjernen i PBS før nedsenking i brytningsindeksmatchingsløsning. (B) Hjerneskive i brytningsindeksavstemmingsløsning. (C) Bildekammer for store og små klarerte vevsprøver. Kamrene kan lages ved hjelp av en rekke materialer, inkludert, men ikke begrenset til, 3D-trykt plast og kutte koniske rør. (D) Imaging kammer for hele hjernen eller halvkule bildebehandling, ved hjelp av 50 ml konisk rør som en lettelse før helling agarose. (E) Hele hjernen eller halvkule bildekammeret med agarose fullt satt; dette oppsettet er optimalt for store nedsenkningsmål for fat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Innhente store datasett av høy kvalitet fra klarerte vevsprøver. (A) Innstillinger for bildeanskaffelse som brukes for bilder med høy oppløsning i hele celler. Hullet var helt lukket for å muliggjøre fine optiske seksjoner. Skannehastigheten ble bestemt empirisk basert på optimale pikselboetider. (B) Innstillinger for lysbane: Disse vil avhenge av fluoroforen og utstyret som brukes. (C) Z-stack-innstillinger; et fint z-trinn ble brukt til å fange så mye informasjon i z-retning som mulig. (D) Representativ maks projeksjon; skala bar representerer 25 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: 3D-analyse av dendritter i analyseprogramvaren. (A) Sidevisning av en to-foton ervervet 600 μm z-stack anskaffet fra et 1 mm tykt vev som uttrykker tdTomato; skalalinjen representerer 100 μm. (B) Sett ovenfra for samme z-stakk som er anskaffet i panel A; skala bar representerer 100μm. (C) Confocal ervervet bilde av vev som uttrykker EGFP. Bildefiler kan importeres direkte til analyseprogramvaren og forhåndsbehandles for større bildekvalitet; skalalinjen representerer 25 μm. (D) Terskeldeldeksjon brukes til å fjerne det konsekvente bakgrunnssignalet som finnes i C. (E) Filamentsporing og ryggradsidentifikasjon: Denne prosessen er best når den utføres halvautomatisk med autodybdefunksjonen kontrollert. Spines ble deretter håndmerket etter full dendrit rekonstruksjon; skala bar representerer 25 μm. (F) Rygg klassifisering ved hjelp av en innebygd MATLAB forlengelse. Spines har blitt fargekodet basert på deres morfologi; stubby spines er røde; sopp spines er grønne; lange tynne spines er blå; filopodia er lilla; skala bar representerer 25 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Representative resultater. (A) Tabell over vanlige morfologiske målinger som genereres automatisk av det valgte analyseprogrammet. (B) Antall Sholl-skjæringspunkt generert av programstatistikk. (C) Sektordiagram som representerer fordelingen av dendrittiske ryggmorfologier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Løsning | Komposisjon | Notater |
| Refraktiv indeksavstemmingsløsning | 80 g histodenz | pH til 7,5 med NaOH |
| 60 ml 0,02 M fosfatbuffer | Oppbevars ved 4 °C | |
| 0,01 % av natriumazid | Tilpasset fra Marx, V. Naturmetoder volum 11, side 1209–1214 (2014) | |
| Hydrogel | 13,33 ml 30 % akrylamid (no-bis) | Bland sammen på is, ellers kan løsningen begynne å polymerisere |
| 10 ml 10x PBS | Aliquot og oppbevar ved -20 °C | |
| 250 mg VA-044 | ||
| 76,66 ml ddH2O |
Tabell 1: Oppskrifter for brytning av bildematchingsløsning og hydrogelløsning. Sammensetningen av refraktiv indeksmatchingsløsning og hydrogel er oppført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Før fremkomsten av moderne vevsryddingsteknikker besto studier av nevronal morfologi av tidkrevende seksjonering, avbildning og rekonstruksjon av tilstøtende svært tynne seksjoner. Bruk av elektroforetisk vevsrydding i kombinasjon med konfokal avbildning gir en uhindret oversikt over fullstendig nevronal morfologi. Fra intakte dendrittiske trær, ned til den minste synaptiske bouton, har avbildning og kvantifisering av nevronal morfologi aldri vært mer gjennomførbar.
Utarbeidelsen av ryddet hjernevev er grei og krever bare ett stykke spesialisert utstyr. Vev ryddet og avbildet ved hjelp av denne protokollen undergraver behovet for kjedelig tynn seksjonering, håndtering og montering, og reduserer drastisk tiden fra eksperimentering til bildeanskaffelse. I tillegg forblir vev avbildet uten seksjonering mer trofast mot de opprinnelige strukturene, da det ikke er noen kilder til skade eller nødvendig post-hoc-bilderekonstruksjon. Til slutt sparer denne protokollen tid ved å tillate samtidig avbildning av store funksjoner som dendrittiske trær sammen med småskala submikronfunksjoner som spines.
En viktig samling trinn i denne protokollen er vasketrinnene som følger avregningsprosessen. Disse trinnene er avgjørende for å fjerne alle spor av SDS elektroforetisk clearingbuffer. Hvis det ryddede vevet ikke vaskes tilstrekkelig, vil det dannes utfellinger under monteringstrinnet. Disse utfellingene kan noen ganger løses ved å inkubere vevet ved 37-55 °C i en kort periode. Men hvis utfellingene vedvarer, vil de spre lys, noe som gir dårlig bildedybde og kvalitet.
Montering av store vevsstykker er en utfordring sammenlignet med tradisjonell tynnskiveavbildning. Her presenterer vi flere prosesser for å montere stort vev, som avhenger av bildeteknikken, objektive linseegenskaper og størrelsen på vevsprøven. For det første er det viktig å bruke en objektiv linse som er egnet for nedsenking i det spesifikke brytningsindekstilpasningsmediet som brukes, og som har tilstrekkelig arbeidsavstand for avbildning av store vevsprøver. Denne protokollen er i stor grad begrenset av de optiske egenskapene til bildeplattformen som brukes, spesielt arbeidsavstanden til mål. Avbildning i dybden oppnås lett ved hjelp av denne protokollen. Men hvis et mål med tilstrekkelig arbeidsavstand ikke er tilgjengelig, vil vevet selv presentere en fysisk barriere for å skaffe seg store bilder. Den neste viktige avgjørelsen er bildeteknikken. To-fotonmikroskopi brukes vanligvis til sin suverene bildekvalitet, dybde på bildebehandling og oppkjøpshastighet. To-fotonmikroskopi gjør det mulig å se opptil 1 mm inn i CLARITY-ryddet vev uten tap av bildekvalitet som vist i figur 5A,B. Imidlertid kan svært like resultater oppnås ved bruk av tradisjonell konfokal mikroskopi om enn med et offer til bildedybde sammenlignet med to-fotonmikroskopi (Figur 5C,D).
Oppsummert gir denne metoden en robust og praktisk plattform for å analysere nevronal morfologi i både store og små skalaer. I tillegg minimerer denne metoden i stor grad håndterings- og behandlingstiden, samtidig som den gir mer nøyaktige og komplette tredimensjonale bilder. Cellulær morfologi er en vanlig brukt proxy for å vurdere kretsfunksjon og helse som ligger til grunn for mange sykdommer og patologier13,14,15. Imaging neuron morfologi er kraftig, grei og godt egnet til å analyse i en rekke sykdomsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre på dette tidspunktet.
Acknowledgments
Vi vil takke den virale kjernen NRDDC ved Jan og Dan Duncan Neurological Institute for å produsere AAVs og lentivirus som brukes i disse eksperimentene. I tillegg vil vi takke Baylor College of Medicine Center for Comparative Medicine for musehold og generelt vedlikehold av musene som brukes. Vi vil takke American Heart Association for deres støtte under prisnummer 20PRE35040011, og BRASS: Baylor Research Advocates for Student Scientists for deres støtte (PJH). Til slutt vil vi takke Logos for å gi laboratoriet vårt Logos X-Clarity elektroforetisk vevsryddingssystem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| 25 G x 1" Needle | BD | 305127 | |
| 30% Acrylamide (No-Bis) | National Diagnostics | EC-810 | |
| 50 mL Conical Tube | Thermo Scientific | 339653 | |
| Electrophoretic Tissue Clearing Solution | Logos | C13001 | |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | |
| Hydrogel Solution Kit | Logos | C1310X | |
| Imaris | Oxford Instruments | N/A | |
| Paraformaldehyde 16% | EMS | 15710 | |
| PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case | fisher | MT21040CV | |
| VA-044 | Wako | 925-41020 | |
| X-CLARITY Polymerization System | Logos | C20001 | |
| X-CLARITY Tissue Clearing System II | Logos | C30001 |
References
- Abbott, L. F., et al. The Mind of a mouse. Cell. 182 (6), 1372-1376 (2020).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), (2015).
- Winnubst, J., et al. Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain. Cell. 179 (1), 268-281 (2019).
- Araya, R., Vogels, T. P., Yuste, R. Activity-dependent dendritic spine neck changes are correlated with synaptic strength. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (28), (2014).
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
- Martínez-Cerdeño, V. Dendrite and spine modifications in autism and related neurodevelopmental disorders in patients and animal models. Developmental Neurobiology. 77 (4), 393-404 (2017).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetics and imaging technologies for circuit-based neuroanatomy. Nature. 461 (7266), 900-907 (2009).
- Kim, E. H., Chin, G., Rong, G., Poskanzer, K. E., Clark, H. A. Optical probes for neurobiological sensing and imaging. Accounts of Chemical Research. 51 (5), 1023-1032 (2018).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2014).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Ledda, F., Paratcha, G. Mechanisms regulating dendritic arbor patterning. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (24), 4511-4537 (2017).
- Falougy, H. E., Filova, B., Ostatnikova, D., Bacova, Z., Bakos, J. Neuronal morphology alterations in autism and possible role of oxytocin. Endocrine Regulations. 53 (1), 46-54 (2019).
