Summary
Pankreasın in vivo yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi pankreas intravital görüntüleme penceresi ile kolaylaştırıldı.
Abstract
Pankreasın canlı bir küçük hayvan modelinde doğrudan in vivo hücresel çözünürlüklü görüntülenmesi teknik olarak zorlayıcı olmuştur. Yeni bir intravital görüntüleme çalışması, bir abdominal görüntüleme penceresi ile, karın organlarındaki hücresel dinamiklerin in vivoolarak görselleştirilmesini sağladı. Bununla birlikte, fare pankreasının fizyolojik hareketten (örneğin peristalsis ve solunum) kolayca etkilenebilen yumuşak tabaka benzeri mimarisi nedeniyle, fare pankreasındaki adacıkları veya kanser hücrelerini tanımlamak, izlemek ve ölçmek için hücresel düzeyde birkaç hafta boyunca stabilize uzunlamasına in vivo görüntüleme yapmak zordu. Burada, pankreasın mikro yapısının boyuna zaman atlamalı intravital görüntülemesi için pankreası bağırsaktan mekansal olarak ayırabilen yeni bir destek tabanı, entegre bir pankreas intravital görüntüleme penceresi yerleştirme yöntemini açıklıyoruz. Görüntüleme penceresi ile uzunlamasına in vivo görüntüleme, kararlı görselleştirme sağlar, 3 haftalık bir süre boyunca adacıkların izlenmesine ve burada bir ortopedik pankreas kanseri modelinde kanıt olduğu gibi mikroyapının yüksek çözünürlüklü üç boyutlu görüntülenmesine izin verir. Yöntemimizle, daha fazla intravital görüntüleme çalışması, pankreası içeren çeşitli hastalıkların patofizyolojisini hücresel düzeyde aydınlatabilir.
Introduction
Pankreas, sindirim sisteminde ekzokrin bir işleve ve kan dolaşımına hormon salgılamanın endokrin işlevine sahip bir karın organıdır. Pankreasın yüksek çözünürlüklü hücresel görüntülemesi, pankreatit, pankreas kanseri ve diabetes mellitus1dahil olmak üzere pankreası içeren çeşitli hastalıkların patofizyolojisini ortaya çıkarabilir. Bilgisayarlı tomografi, manyetik çözünürlüklü görüntüleme ve ultrasonografi gibi geleneksel tanısal görüntüleme araçları klinik alanda yaygın olarak mevcuttur1,2. Bununla birlikte, bu görüntüleme yöntemleri sadece yapısal veya anatomik değişiklikleri görselleştirmekle sınırlıdır, hücresel veya moleküler düzeydeki değişiklikler belirlenemez. İnsanlarda diabetes mellitus veya pankreas kanserindeki moleküler değişikliklerin tanıdan 10 yıldan daha önce başlatabileceği göz önüne alındığında3,4, pankreas hastalıklarının gizli dönemde moleküler geçişlerinden tespit edilmesi erken tanı ve zamanında müdahale sağlama potansiyeline sahiptir. Bu nedenle, çözünürlük sınırlamalarını aşacak ve işlev hakkında değerli içgörüler sağlayacak görüntüleme, pankreas kanserinin erken teşhisini veya diabetes mellitus5'inilerlemesi sırasında adacıkların değiştirilmesinin ileri düzeyde tanımlanmasını sağlayarak dikkat çekici bir şekilde dikkat kazanacaktır.
Özellikle adacıklarda nükleer görüntüleme, biyolüminesans görüntüleme ve optik koherens tomografi invaziv olmayan adacık görüntüleme teknikleri olarak öne sürlenmiştir6. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çözünürlüğü, birkaç on ila yüzlerce mikrometre arasında değişen tipik değerlerle önemli ölçüde düşüktür ve adacıklardaki hücresel düzeydeki değişiklikleri tespit etmek için sınırlı bir yetenek sunar. Öte yandan, daha önce ex vivo7,8 (örneğin, pankreasın dilimlenmesi veya sindirimi), fizyolojik olmayan9 (örneğin, pankreasın dışsallaştırılması) ve heterotopik durumlar10,11,12 (örneğin, böbrek kapsülü altında, karaciğerin içinde ve gözün ön odasında implantasyon), bu da yorumlarını ve klinik etkilerini kısıtlar. Yüksek çözünürlüklü görüntülemenin in vivo,fizyolojik ve ortotopik modeli kurulabilirse, pankreas adacıklarının araştırılması için kritik bir platform olacaktır.
Canlı bir hayvanda patofizyolojiyi mikroskobik çözünürlük seviyesinde ortaya çıkaran intravital görüntüleme, son zamanlarda büyük ilgi gördü13. In vivo görüntüleme yöntemlerinden, bir farenin karnına bir pencere yerleştiren bir abdominal görüntülemepenceresinin geliştirilmesi 14, yeni bulguların keşfine izin sağlamıştır (yani, erken karaciğer metastazının mikrometaz öncesi aşaması15 ve bağırsak epitelinde kök hücre bakım mekanizması16). Abdominal görüntüleme penceresi değerli sonuçlar sağlasa da bu pencerenin pankreas için uygulamaları ve pankreas içeren hastalıklara dayalı sonuçlanan intravital görüntüleme araştırmaları kapsamlı bir şekilde araştırılmamıştır.
İnsan pankreasının iyi tanımlanmış katı organ özelliklerinin aksine, bir farenin pankreası yaygın olarak dağılmış yumuşak doku benzeri bir yapıdır17. Bu nedenle peristalsis ve solunum gibi fizyolojik hareketlerden sürekli etkilenir. Pankreas için abdominal görüntüleme penceresinin uygulanması üzerine daha önce yapılan bir çalışma, dolaşmanın bağırsak hareketlerinin neden olduğu hareket eserleri nedeniyle meydana geldiğinigöstermiştir 18. Elde edilen ortalama görüntüde, mikro ölçekli yapıların görselleştirilmesine ve tanımlanmasına engel olan ciddi bulanıklık gözlendi.
Burada, pankreası içeren hastalıklarda boyuna hücresel düzeydeki olayları araştırmak için intravital mikroskopi19,20 ile birlikte yeni bir destekleyici baz entegre pankreas intravital görüntüleme penceresinin kullanımını anlatıyoruz. Önceki çalışmada metodolojinin ayrıntılı bir açıklamasına ek olarak18Pankreası içeren çeşitli hastalıklar için pankreas görüntüleme penceresinin genişletilmiş uygulaması bu makalede ele alınacaktır. Bu protokolde intravital mikroskopi sistemi olarak özel yapım video-oranlı lazer taramalı konfokal mikroskopi sistemi kullanılmıştır. Dört lazer modülü (405, 488, 561 ve 640 nm'deki dalga boyları) bir heyecan kaynağı olarak kullanılmıştır ve fotomultiplier tüpler (PMT) tarafından bant geçiş filtreleri (BPF1: FF01-442/46) aracılığıyla dört kanal emisyon sinyali tespit edilmiştir; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Lazer tarama, dönen çokgen ayna (X ekseni) ve video hızı taramasını (saniyede 30 kare) sağlayan bir galvanometre tarama aynası (Y ekseni) oluşuyordu. İntravital mikroskopi hakkında detaylı bilgi önceki çalışmalardaaçıklanmıştır 10,18,19,20,21,22,23.
Önceki adacık çalışmamızda18, adacıkların GFP ile etiketlendiğini transgenik bir fare modeli (MIP-GFP)24 kullanarak canlı farelerdeki adacıkları başarıyla ve kararlılıkla görüntüledik. Yöntem, adacıklardaki değişikliklerin 1 haftalık bir süre içinde yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesini sağladı. Ayrıca aynı adacıkların 3 haftaya kadar görüntülenmesini kolaylaştırdı, bu da diyabet mellitus patogenez sırasında fonksiyonel izleme veya izleme için pankreas adacıklarının uzun süreli çalışmalarının fizibilitesini düşündürmektedir18. Ayrıca, floresan pankreas kanseri hücrelerinin (PANC-1 NucLight Red)25'in doğrudan farenin pankreasına yerleştirildiği bir ortotopik pankreas kanseri modeli geliştirdik. Pankreas intravital görüntüleme penceresinin uygulanması ile bu model, pankreas kanserinin tümör mikroçevreslerindeki hücresel ve moleküler patofizyolojinin araştırılması ve yeni ilaç adaylarının terapötik takibi için bir platform olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu makalede açıklanan tüm prosedürler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve KullanımıKılavuzu'nun 8.baskısına (2011)26 uyarınca yapılmış ve Kore İleri Bilim ve Teknoloji Enstitüsü (KAIST) ve Seul Ulusal Üniversitesi Bundang Hastanesi'ndeki (SNUBH) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Pencerenin ve diğer malzemelerin hazırlanması
- Pankreası karın boşluğundaki bağırsaktan inzivaya çekmek için pankreas intravital görüntüleme penceresini özel olarak tasarlayın18 (Şekil 1A,B). Pencerenin ayrıntılı bir planı, önceki bir çalışmanın ek bir figüründe açıklanmıştır18.
- Intravital pankreas görüntüleme için 8-12 haftalık erkekler olan C57BL/6N fareleri kullanın. Damar etiketlemesi amacıyla görüntülemeden 2 saat önce alexa 647 floroforu ile konjuge edilen anti-CD31 antikoru enjekte edin.
- Adacıklar çalışması için, adacıkların floresan bir muhabir proteini ile etiketlendiğini transgenik bir fare modeli hazırlayın. Burada, yeşil floresan proteinin fare insülin 1 gen promotörünün kontrolü altında ifade edildiği MIP-GFP'yi kullandık, faredeki tüm adacıkların beta hücrelerinde aktifolan 24.
- Pankreas kanseri çalışması için floresan muhabir proteini ve BALB/C çıplak fareleri ile etiketlenmiş transgenik kanser hücreleri hazırlayın. Bu çalışmada PANC-1 NucLight Red hücreleri kullanılmıştır. PANC-1 kanser hücreleri25, NucLight Red floresan probu ile etiketlendi.
- Tüm cerrahi aletleri sterilize edin, camı örtün (PEG ile veya değil) ve bir otoklav kullanarak pencereleri görüntüleme.
- Enflamatuar yanıtı önlemek ve uzun süreli görüntüleme için uygun olan biyouyumluluğu artırmak için kapak camına PEG kaplama uygulayın.
2. Cerrahi
- Steril bir cerrahi platform hazırlayın ve yüzeyleri% 70 etanol ile sterilize edin.
NOT: Boyuna görüntüleme seansları için aseptik teknik gereklidir. - Fareleri tiletamin / zolazepam (30 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) karışımı ile uyuşturun.
NOT: Hipergliseminin olumsuz etkisi nedeniyle ketamin yerine tiletamin/zolazepam kullanılması önerilir. Deney amacıyla optimal anestezi seçilmelidir9,27. - Homeotermik kontrollü ısıtma yastığı ile rektal prob kullanarak vücut sıcaklığını izleyin.
- Farenin sol kanadını tıraş edin ve üç tur alternatif alkol ve iyot bazlı ovma uygulayın.
NOT: Depilatör krem kullanılıyorsa, kimyasal yanığı önlemek için 1 dakikadan fazla bırakmayın. - Farenin sol kanadında 1,5 cm'lik bir kesi yapın ve cildi ve kası parçalara ayrılın.
- Kesi kenar boşluğunda siyah veya naylon 4-0 dikişli bir çanta-string dikiş gerçekleştirin.
- Kesi üzerinde bir mikro retraktör kullanın ve dalağını hafifçe açığa çıkarın.
- Dalağını halka kanatları ile dikkatlice bir araya getirin ve pankreası tanımlayın.
- Pencereyi farenin kanadına yerleştirin ve dalak ve pankreası pencerenin açık alanından geçirin. Pankreasın manipülasyonu, kanamaya veya pankreatite neden olabileceği için çok yumuşak olmalıdır.
- Pankreası görüntüleme penceresinin plakasına hafifçe yerleştirin; dalak pencerenin açık alanına yerleştirilecektir.
- Kanser hücresi çalışması için PANC-1 NucLight Red 'i (1.0 x 106 hücre) doğrudan pankreasa enjekte edin.
NOT: Ortotopik insan pankreas kanseri ksinograftlarının görüntülenmesi için PANC-1 veya diğer insan pankreas kanseri hücresi gibi kanser hücresinin doğrudan implantasyonu kolaylaştırılabilir28. İntravital floresan mikroskopi ile görselleştirmek için PANC-1 hücreleri, çekirdeği etiketleyen NucLight Red lentiviral reaktif kullanılarak kırmızı floresan protein ile transdüklenmiştir29. Maksimal enjeksiyon hacmi belirsiz olsa da, pankreastaki basınç etkisini önlemek için hacmi mümkün olduğunca azaltın. - Görüntüleme penceresinin kenar boşluğuna N-butil siyanoakrilat tutkal damlaları uygulayın.
- Uygulanan tutkal miktarını en aza indirmek için uygulama için 31 G kateter iğnesi kullanın. Damla miktarı büyükse, doku istemeden pencereye veya kapak camına yapışır.
- Görüntüleme penceresinin kenar boşluğuna hafifçe 12 mm yuvarlak bir kapak camı uygulayın.
- Dikiş halkasını pencerenin yanal oluğuna sığacak şekilde çekin ve üç kez bağlayın.
- Bu fareler uyanıkken sıkı dikişlerin kesilmesini önlemek için düğümün maksimum proksimal bölgesini kesin.
- Farelerin anesteziden (2-3 saat) iyileşmesine izin verin ve ağrı kesici için ketoprofen (5 mg / kg, hayvanın boyun veya kalça tabanındaki gevşek ciltte deri altı) enjekte edin. Her 12 saatte bir ağrı belirtileri için yeniden değerlendirme ve ketoprofen 1-3 gün boyunca her 24 saatte bir düşünülmelidir.
NOT: Analjezi glikoz9'ayanıt olarak insülin salgısını etkiler. Analjezi seçimi ve zamanlaması deneysel amaç için bireyselleştirilmelidir. - Pencerenin kafese temasını önlemek için fareyi kafeste yeterli yatak takımı ile birikin. Pencere ameliyatı olmadan evi farelerle barındırmaktan kaçının.
3. İntravital görüntüleme
- Lazer gücü de dahil olmak üzere intravital mikroskobu açın.
- Isıtma yastığını açın ve homeotermik regülasyonu 37 °C olarak ayarlayın.
NOT: Alternatif olarak, homeotermik bir düzenleme yoksa sık kontrole sahip pasif bir ısıtma yastığı veya lamba kullanın. - Tiletamin/zolazepam (30 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) karışımı ile göz içi anestezi gerçekleştirin.
NOT: Hipergliseminin olumsuz etkisi nedeniyle ketamin yerine tiletamin/zolazepam kullanılması önerilir. Deneylerin amacı için optimal anestezi seçilmelidir9,27. - Enjeksiyon için bir vasküler kateter yerleştirin.
- Turnike uygulamasına alternatif olarak kuyruğun proksimal tarafına indeks ve üçüncü parmakla basınç uygulayın. Gerekirse kuyruğu bir lamba ile ısıtın.
- Kuyruk damarını% 70 etanol spreyi ile sterilize edin.
- Yanal kuyruk damarına 30 G kateter yerleştirin. Pe10 tüpünde kanın kusmuması görselleştirilecektir.
- Stabilize etmek için katetere ipek bir bant uygulayın.
- Floresan probların kombinasyonuna göre FITC / TMR dektran veya diğer floresan probları (Alexa 647 ile eşleştirilmiş 25 μg anti-CD31) enjekte edin18.
NOT: Floresan konjuge antikor probları için görüntüleme seansından önce 2 saat enjekte edin.
- Fareyi cerrahi platformdan görüntüleme aşamasına aktarın.
- Homeotermik ısıtma yastığı sistemi ile vücut sıcaklığını otomatik olarak kontrol etmek için bir rektal prob takın.
- Pankreas görüntüleme penceresini intravital mikroskopi kurulumu sırasında hazırlanan pencere tutucusuna yerleştirin (Şekil 2). Ters mikroskop için pencere tutucusu gerekmeyebilir.
- İntravital görüntüleme gerçekleştirin.
- Pankreası görüntülemek için, pankreasın pankreas görüntüleme penceresindeki tüm görünümünü taramak için düşük büyütme objektif lensi (örneğin, 4x) ile başlayın (önerilen görüş alanı: 2500 x 2500 μm).
- İlgi çekici bölgenin belirlenmesinden sonra, hücresel düzeyde görüntülemeyi gerçekleştirmek için daha yüksek büyütme objektif lensine (20x veya 40x) geçin (önerilen görüş alanı: 500 x 500 μm veya 250 x 250 μm). Bu deneyde yanal ve eksenel çözünürlük sırasıyla yaklaşık 0,5 μm ve 3 μm idi.
- 3D yapıyı veya hücre geçişi gibi hücre düzeyindeki dinamikleri gözlemlemek için z yığını veya hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin.
NOT: Transgenik hayvanların (MIP-GFP) floresan protein ifade hücrelerini görüntülemek için, 0,43 mW'a kadar güçle 30 s aralıklı 488 nm lazer maruziyeti gözle görülür fotobleaching veya doku hasarı olmadan tolere edilebilirdi. Alexa 647 ile etiketlenmiş floresan proteinleri görüntülemek için, 0,17 mW'a kadar 640 nm lazer gücü gözle görülür fotobleaching veya doku hasarı olmadan tolere edilebilirdi. Bu ayarın üzerinde bir güçle uzun süreli heyecan lazer maruziyeti fototoksiklik ile fotobleaching veya doku hasarına yol açabilir. İlgi alanına uygun şekilde görüntü vermek için yeterli kazancı ve gücü ayarlayın. Enstitüde hazırlanan her intravital mikroskopi için intravital mikroskopideki parametrelerin ayrıntılı ayarı bireyselleştirilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İntravital mikroskopi, destekleyici taban entegre pankreas intravital görüntüleme penceresi ile birlikte, pankreasın farede boyuna hücresel düzeyde görüntülenmesini sağlar. Pankreas intravital görüntüleme penceresi ile yapılan bu protokol, tek tek adacıkları 3 haftaya kadar izlemek için yüksek çözünürlüklü görüntülemenin edinimine olanak sağlayan uzun süreli doku stabilitesi sağlar. Sonuç olarak, genişletilmiş bir görüş alanı için mozaik görüntüleme, z-stack görüntülemenin üç boyutlu (3D) yeniden yapılandırılması ve aynı pozisyonun boyuna izlenmesi sağlanabilir. Buna ek olarak, intravital mikroskopimiz dört kanal (405, 488, 561 ve 647 nm) kazanım sağlar ve bu da etkileşimleriyle eşzamanlı çoklu hücre görselleştirmesini sağlar.
Ön görüntüleme için, pencere bir C57BL/6N fareye, alexa 647 floroforu ile konjuge edilmiş intravenöz enjekte edilmiş anti-CD31 antikoru ile yerleştirildi. Bu sistemle pankreasın geniş alan görüntülemesi (Şekil 3A) ve büyütülmüş3Dgörüntüleme ( Şekil3B -D, Ek Video 1) kolaylaştırılmıştır. Pankreas dokusu otofluoresans ile görselleştirildi ve anti-CD31 antikoru ile etiketlenmiş bitişik vaskülat tespit edildi. Peristalsis veya solunuma bağlı salınım tanımlanmamıştır, bu da yüksek sinyal-gürültü oranına sahip ortalama görüntüleme ile sonuçlanır (Şekil 4). Pankreastaki mikro ölçekli çözünürlükte görselleştirme gerektiren acınar hücreler, ortalama görüntülerde açıkça görselleştirildi.
Adacıkların görüntülenmesi için bir MIP-GFP faresi kullanılmıştır. Mozaik görüntüleme yöntemini kullanarak, yüksek çözünürlüklü görüntülemeye sahip geniş alan görünümü, adacıkların bitişik vaskülatla görselleştirilmesini sağladı (Şekil 5). Geniş alan görünümünde yaklaşık 40-50 adacık tespit edilmiştir. Bu kararlı görüntüleme yöntemi, önceki bir çalışmada gösterildiği gibi adacıkların 3 haftaya kadar izlenmesini daha da kolaylaştırabilir (Şekil 6)18.
Kanser hücre görüntüleme için PANC-1 NucLight Kırmızı hücreleri ameliyat sırasında doğrudan fare pankreasına yerleştirildi (Şekil 7). PANC-1 NucLight Kırmızı hücrelerinden ve Alexa 647 ile eşleştirilmiş anti-CD31 ile boyanmış yakındaki damarlardan oluşan çift etiketleme stratejisi kullanıldı. Protokolümüzle, tümörün marjını saptayan pankreas kanserinin geniş alan görüntülemesi (Şekil 7A) ve tek hücreli düzeyde yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme elde edildi (Şekil 7B-D, Tamamlayıcı Video 2).
Şekil 1: Pankreas intravital görüntüleme penceresinin tasarımı ve fotoğrafı. (A) Pankreas intravital görüntüleme penceresinin 3D ve kesitsel görünümü. Boyut ve çapın ayrıntılı bir planı önceki makalede açıklanmıştır18. (B) Pankreas görüntüleme penceresinin ön ve arka fotoğrafı. Telif Hakkı 2020 Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198 Kore Diyabet Derneği. Kore Diyabet Derneği'nin izniyle yeniden basıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Pankreas intravital görüntüleme penceresinin uygulanmasının fotoğrafı. XYZ çeviri aşamasında fareye pankreas intravital görüntüleme penceresi yerleştirilir ve eğilme yuvasına bağlı görüntüleme odası tutucusu pankreas görüntüleme penceresine bağlanır. Telif Hakkı 2020 Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198 Kore Diyabet Derneği. Kore Diyabet Derneği'nin izniyle yeniden basıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: C57BL/6N farede temsili intravital pankreas görüntüleme. (A) Geniş alan görüntüsü ve (B) C57BL / 6N faredeki pankreasın (yeşil) ve mikrovaskülasyonunun (kırmızı) büyütülmüş 3D görüntüsü. Damarlar Alexa 647 floroforu ile eşleştirilmiş bir anti-CD31 antikoru ile etiketlenmiştir. (C) 3D yeniden yapılandırılmış görüntü ve (D) fare pankreasının yüzey işleme görüntüsü. Ölçek çubuğu: 200 μm (A) ve 50 μm (B-D). Ayrıca bkz: Ek Video 1. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Acınar hücre ve bitişik vaskülatın intravital görüntülemesi. C57BL/6N farede Acinar hücreleri (yeşil) ve bitişik vaskülat (kırmızı). Damarlar Alexa 647 floroforu ile konjuge edilmiş Anti-CD31 antikoru ile etiketlenmiştir. Pankreas görüntüleme penceresi ile gerçekleştirilen doku stabilitesi, yüksek sinyal-gürültü oranı görüntüsü sağlar. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: MIP-GFP faresinde pankreas adacıklarının temsili intravital görüntülemesi. MIP-GFP farenin pankreasında maksimum yoğunlukta projeksiyon yöntemiyle işlenen adacıkların (yeşil) ve bitişik vaskülatın (kırmızı) geniş alan mozaiği ve büyütülmüş görüntüsü. Damarlar Alexa 647 floroforu ile eşleştirilmiş bir anti-CD31 antikoru ile etiketlenmiştir. Ölçek çubuğu: 500 μm (geniş alan) ve 50 μm (büyütülmüş). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: MIP-GFP faresinin pankreasındaki adacıkların uzunlamasına intravital görüntülemesi. MIP-GFP faresinde pankreasta 3 haftaya kadar adacıkların boyuna görüntüsü. Farklı renklere sahip her ok ucu aynı adacıkları gösterir. Ölçek çubuğu: 100 μm. Telif Hakkı 2020 Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198 Kore Diyabet Derneği. Kore Diyabet Derneği'nin izniyle yeniden basıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Pankreas kanseri modelinin temsili intravital görüntülemesi. (A) Geniş alan görüntüsü ve (B) BALB / c Çıplak farede implante panc-1 NucLight Kırmızı hücrelerinin (kırmızı) 3D görüntüsünü büyütülmüştür. Gemiler (mavi), Alexa 647 floroforu ile eşleştirilmiş bir anti-CD31 antikoru ile etiketlenmiştir. (C) 3D yeniden yapılandırılmış görüntü ve (D) fare modelinde pankreas kanserinin yüzey işleme görüntüsü. Ölçek çubuğu: 500 μm (A) ve 50 μm (B-D). Ayrıca bkz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek video 1: C57BL / 6N farede in vivo 3D pankreas görüntüleme. C57BL/6N farenin pankreasının (yeşil) in vivo 3D görüntülemesi, Alexa 647 floroforu (kırmızı) ile konjuge edilmiş bir anti-CD31 antikoru ile intravenöz olarak enjekte edilir. Ölçek çubuğu videoda tasvir edilir. Bu video Şekil 3C,D 'yekarşılık gelir. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek video 2: BALB / C Çıplak farede in vivo 3D pankreas kanseri (PANC-1 NucLight Red) görüntüleme. BALB/C Nude fareye yerleştirilen pankreas kanserinin (kırmızı) in vivo 3D görüntülemesi, Alexa 647 floroforu (mavi) ile konjuge edilmiş bir anti-CD31 antikoru ile intravenöz olarak enjekte edilir. Ölçek çubuğu videoda tasvir edilir. Bu video Şekil 7C,D 'yekarşılık gelir. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol, karın görüntüleme penceresinden modifiye edilmiş yeni bir destekleyici taban entegre pankreas intravital görüntüleme penceresi kullanılarak pankreasın intravital görüntülemesinden oluşur. Yukarıda açıklanan protokoller arasında ilk kritik adım fareye intravital pankreas görüntüleme penceresinin yerleştirilmesidir. Tutkalın pencerede uygulanması için, tutkalın pencerenin kenar boşluğu ile kapak camı arasına uygulanması önemlidir, ancak pankreas dokusuna uygulanmaz, çünkü intravital görüntülemeyi önemli ölçüde kesintiye uğratabilir. Sadece tutkalın kendisini cam ve doku arasında değil, aynı zamanda tutkal doğrudan dokuya uygulanırsa, ek toz parçacıkları görüntüleme sırasında ışık saçılımlarına neden olabilir. Ek olarak, yapıştırıcının uygulanması pankreas üzerinde toksik ve fizyolojik olmayan etkilere sahip olabilir.
İkinci adım, metal destekleyen taban plakasına yerleştirilen pankreas dokusu miktarıdır. Pankreas dokusu tabaka benzeri bir yapı olduğu için plaka üzerindeki pankreas dokusunun hacminin kontrol edilmesi gerekir. Plakaya çok büyük bir hacim yerleştirilirse, halkanın kenar boşluğuna uygulanan tutkal dokuya yapışabilir ve kütle etkisi pankreasın perfüzyonunu engelleyebilir. Öte yandan, oraya çok küçük bir birim yerleştirilirse, görselleştirilebilen görüş alanı sınırlı olabilir. Penceredeki bu ameliyat protokolü, tutarlı bir standardı karşılamak için birkaç deneme gerektirebilir.
3 haftalık bir süre boyunca uzun süreli görüntüleme için, en endişe verici konu pankreas görüntüleme penceresinde potansiyel hasardı. Pankreas görüntüleme penceresindeki kapak camının istenmeyen tahribatı uzun süreli gözlem süresi boyunca ortaya çıkabilir. Bunu önlemek için, pencereli fare ayrı ayrı yerleştirilecek ve keskin kenarlı sert nesneler kafesten çıkarılmalıdır. Pencerenin yakınında şiddetli iltihap belirtileri varsa veya hayvan zor durumda görünüyorsa, kapak camı kırılırsa farelerin ötenazisi göz önünde bulundurulmalıdır. Deneyimlerimize göre, pankreas görüntüleme penceresine sahip fareler, ameliyat sonrası iyileşme uygun olduğunda ve başka bir komplikasyon gelişmediğinde normal beslenebildi ve egzersiz yapabildi.
Abdominal görüntüleme penceresi ile ilgili önceki deneyimimizde, aynı noktaların uzunlamasına takibinin yanı sıra yüksek kaliteli hücresel düzeyde görüntülemeyi birden fazla gün boyunca elde edemedik. Çeşitli karın organları için çeşitli bir platform sağlayan abdominal görüntüleme penceresi ile karşılaştırıldığında, pankreasın yanı sıra yumuşak ve mezen, dalak ve ince bağırsak gibi hareketlerden kolayca etkilenen diğer organların görüntülenmesi için pankreas görüntüleme penceresi daha da belirtilmiştir. Bununla birlikte, karaciğer ve böbrek, alanın sınırlı olması nedeniyle pankreas görüntüleme penceresinde mümkün olmayabilir.
Floresan fare, hücreler ve antikor problarının kombinasyonu endotel hücreleri ile adacıklar veya kanser hücreleri arasındaki dinamik etkileşimlerin görselleştirilmesini sağlarken, burada açıklanan protokol floresan etiketli hücrelerin veya her duruma uygun moleküler probların diğer bileşimleriyle çoğaltılabilir. Ayrıca, yöntemimizle entegre geniş uygulamalar, insülin salgısı9,30,reaktif oksijen türlerini hedefleyen AAV8 aracılı gen iletimi (ROS)31veya ortotopik tümör modeli32 , 33,34 ile cpepSfGFP muhabir faresi gibi, in situ tümörün tümör mikroçevresini tam olarak uyarabileceği, tümörigenezi, gelişimi ve metastazı35. Ayrıca, hasta kaynaklı ksinograft modelleri de platformumuz kullanılarak incelenebilir36.
Bu çalışmada ele alınması gereken birkaç sınırlama vardır. İlk olarak, stabilizasyon için metal tabanı kullandığımız zaman bile, doku üzerinde indüklenen mekanik stresi baz ve kapak camı tarafından belirleyemedik, bu da kan akışını etkileyebilir. Bununla birlikte, yukarıdaki rakamlarda gösterildiği gibi, floresan konjuge antikorun (CD31) veya dektranın intravenöz enjeksiyonu, damarı ayırt edilebilir perfüzyonsuz bir alana sahip olmayan yeterince etiketlemiş, bu da mekanik stresin pankreas dokusunun içindeki normal kan akışı üzerinde minimum bir etkisi olduğunu göstermektedir. İkincisi, yapıştırıcıya bağlı advers reaksiyonlar pankreas dokusunda değerlendirilemedi. Bununla birlikte, ek etkilerden kaçınmak için pankreasa yapıştırıcılarla mümkün olduğunca dikkatli bir şekilde dokunmaktan kaçınmaya çalıştık. Üçüncüsü, yukarıda tartışıldığı gibi, anestezik ajanların istenmeyen etkisi, önceki çalışmada açıklandığı gibi insülin duyarlılığını ve salgısını etkileyebilir9,27. Deneyimlerimize göre, karotamin, zolazepam ve ksilazinin karışımına kıyasla ketamin ve ksilazine indüklenmiş hiperglisemi karışımı. Anestezinin insülin salgısı üzerindeki etkisini araştıran başka bir çalışma yapılmalı ve her deneye göre minimum yan etkiye sahip uygun anestezi seçilmelidir. Dördüncü olarak, pankreasın görüntülemesi kuyruk kısmına odaklanmıştır ve pankreasın baş kısmının görüntülenmesi penceremizle sınırlı olabilir.
Özetle, pankreasın hücresel düzeyde birkaç haftaya kadar stabilize uzunlamasına görüntülenmesi, in vivo pankreas görüntüleme için optimize edilmiş pankreas intravital görüntüleme penceresi ile entegre görüntüleme sistemimiz tarafından kolaylaştırıldı. İntravital görüntüleme hücre biyolojisi, immünoloji ve tümör biyolojisi hakkında dinamik içgörüler sağladığından, bu protokol pankreası içeren çeşitli hastalıkların patofizyolojisini araştırmak için yararlı bir yöntem olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, SNUBH Araştırma Fonu'ndan (14-2020-002) ve Kore hükümeti (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window - custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder - custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
References
- Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. Imaging in pancreatic disease. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).
- Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. Technologies for imaging the normal and diseased pancreas. Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed. Diabetes Care. 31, Suppl 2 165-169 (2008).
- Baetens, D., et al. Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice. Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Ravier, M. A., Rutter, G. A. Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes. Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).
- Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose. Science Reports. 11 (1), 603 (2021).
- Lee, E. M., et al. Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice. Islets. 10 (1), 25-39 (2018).
- Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. In vivo imaging of islet transplantation. Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).
- Mojibian, M., et al. Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147 (5), 983-991 (2011).
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), 1024405 (2015).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Park, I., et al. Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model. Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).
- Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Hwang, Y., et al. In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver. Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas. International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).
- National Institutes of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).
- Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice. Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Cichocki, F., et al. GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity. Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
- Reissaus, C. A., et al. A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).
- Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).
- Bisht, S., Feldmann, G. Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).
- Feig, C., et al. The pancreas cancer microenvironment. Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).
- Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models. Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).
