Summary
L'imaging ad alta risoluzione in vivo del pancreas è stato facilitato con la finestra di imaging intravitale pancreatico.
Abstract
L'imaging diretto in vivo a risoluzione cellulare del pancreas in un modello di piccolo animale vivo è stato tecnicamente impegnativo. Un recente studio di imaging intravitale, con una finestra di imaging addominale, ha permesso la visualizzazione delle dinamiche cellulari negli organi addominali in vivo. Tuttavia, a causa dell'architettura morbida del pancreas del topo che può essere facilmente influenzata dal movimento fisiologico (ad esempio, peristalsi e respirazione), è stato difficile eseguire l'imaging longitudinale in vivo stabilizzato per diverse settimane a livello cellulare per identificare, tracciare e quantificare isole o cellule tumorali nel pancreas del topo. Qui, descriviamo un metodo per impiantare una nuova base di supporto, una finestra di imaging intravitale pancreatica integrata, che può separare spazialmente il pancreas dall'intestino per l'imaging intravitale longitudinale time-lapse della microstruttura del pancreas. L'imaging longitudinale in vivo con la finestra di imaging consente una visualizzazione stabile, consentendo il tracciamento delle isole per un periodo di 3 settimane e l'imaging tridimensionale ad alta risoluzione della microstruttura, come evidenziato qui in un modello di cancro del pancreas ortotopico. Con il nostro metodo, ulteriori studi di imaging intravitale possono chiarire la fisiopatologia di varie malattie che coinvolgono il pancreas a livello cellulare.
Introduction
Il pancreas è un organo addominale con una funzione esocrina nel tratto digestivo e una funzione endocrina di secernere ormoni nel flusso sanguigno. L'imaging cellulare ad alta risoluzione del pancreas potrebbe rivelare la fisiopatologia di varie malattie che coinvolgono il pancreas, tra cui pancreatite, cancro del pancreas e diabete mellito1. Gli strumenti di diagnostica per immagini convenzionali come la tomografia computerizzata, l'imaging a risoluzione magnetica e l'ecografia sono ampiamente disponibili nel campo clinico1,2. Tuttavia, queste modalità di imaging sono limitate alla visualizzazione solo di cambiamenti strutturali o anatomici, mentre le alterazioni a livello cellulare o molecolare non possono essere determinate. Dato che i cambiamenti molecolari nel diabete mellito o nel cancro del pancreas nell'uomo possono iniziare più di 10 anni prima della diagnosi3,4, l'individuazione delle malattie pancreatiche dalla loro transizione molecolare durante il periodo latente ha il potenziale per fornire una diagnosi precoce e un intervento tempestivo. Pertanto, l'imaging che supererà i limiti della risoluzione e fornirà preziose informazioni sulla funzione guadagnerà notevolmente l'attenzione fornendo una diagnosi precoce del cancro del pancreas o l'identificazione avanzata dell'alterazione delle isole durante la progressione del diabete mellito5.
In particolare con le isole, l'imaging nucleare, l'imaging a bioluminescenza e la tomografia a coerenza ottica sono stati suggeriti come tecniche di imaging delle isole non invasive6. Tuttavia, la risoluzione di questi metodi è sostanzialmente bassa, con valori tipici che vanno da diverse decine a centinaia di micrometri, offrendo una capacità limitata di rilevare cambiamenti a livello cellulare negli isolotti. D'altra parte, precedenti studi ad alta risoluzione sulle isole sono stati eseguiti in condizioni ex vivo7,8 (ad esempio, affettamento o digestione del pancreas),9 non fisiologico (ad esempio, esteriorizzazione del pancreas) e condizioni eterotopiche10,11,12 (ad esempio, impianto sotto la capsula renale, all'interno del fegato e nella camera anteriore dell'occhio), che limita la loro interpretazione e le implicazioni cliniche. Se è possibile stabilire un modello in vivo,fisiologico e ortotopico di imaging ad alta risoluzione, sarà una piattaforma critica per lo studio delle isole pancreatiche.
L'imaging intravitale, che rivela la fisiopatologia a livello di risoluzione microscopica in un animale vivo, ha recentemente ricevuto grande attenzione13. Tra i metodi di imaging in vivo, lo sviluppo di una finestra di imaging addominale14, che impianta una finestra nell'addome di un topo, ha permesso la scoperta di nuovi risultati (cioè uno stadio di pre-micrometastasi delle metastasi epatiche precoci15 e meccanismo di mantenimento delle cellule staminali nell'epitelio intestinale16). Sebbene la finestra di imaging addominale fornisca risultati preziosi, le applicazioni di questa finestra per il pancreas e la conseguente ricerca di imaging intravitale basata su malattie che coinvolgono il pancreas, non sono state ampiamente studiate.
A differenza delle caratteristiche ben definite degli organi solidi del pancreas umano, il pancreas di un topo è una struttura simile ai tessuti molli diffusamente distribuita17. Pertanto, è incessantemente influenzato da movimenti fisiologici tra cui peristalsi e respirazione. Un precedente studio sull'applicazione di una finestra di imaging addominale per il pancreas ha dimostrato che il vagabondaggio si è verificato a causa di artefatti di movimento indotti da movimenti intestinali18. È stata osservata una grave sfocatura nell'immagine mediata risultante, che ha impedito la visualizzazione e l'identificazione delle strutture su microscala.
Qui, descriviamo l'uso di una nuova finestra di imaging intravitale pancreatico integrata di base di supporto combinata con la microscopia intravitale19,20 per indagare gli eventi di livello cellulare longitudinale nelle malattie che coinvolgono il pancreas. Oltre a una descrizione dettagliata della metodologia nel precedente studio18, l'applicazione estesa della finestra di imaging pancreatico per varie malattie che coinvolgono il pancreas sarà affrontata in questo documento. In questo protocollo, un sistema di microscopia confocale a scansione laser a velocità video personalizzato è stato utilizzato come sistema di microscopia intravitale. Quattro moduli laser (lunghezze d'onda a 405, 488, 561 e 640 nm) sono stati utilizzati come sorgente di eccitazione e quattro canali di segnali di emissione sono stati rilevati da tubi fotomoltiplicatori (PMT) attraverso filtri passa-banda (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). La scansione laser consisteva in uno specchio poligonale rotante (asse X) e uno specchio di scansione galvanometro (asse Y) che consentivano la scansione della velocità video (30 fotogrammi al secondo). Informazioni dettagliate sulla microscopia intravitale sono state descritte negli studi precedenti10,18,19,20,21,22,23.
Nel nostro precedente studio sulle isole18,abbiamo ripreso con successo e stabilmente le isole in topi vivi utilizzando un modello murino transgenico (MIP-GFP)24 in cui le isole sono state etichettate con GFP. Il metodo ha consentito la visualizzazione ad alta risoluzione dei cambiamenti negli isolotti per un periodo di 1 settimana. Ha anche facilitato l'imaging delle stesse isole per un massimo di 3 settimane, il che suggerisce la fattibilità di studi a lungo termine delle isole pancreatiche per il monitoraggio funzionale o il monitoraggio durante la patogenesi del diabete mellito18. Inoltre, abbiamo sviluppato un modello di carcinoma pancreatico ortotopico in cui le cellule tumorali pancreatiche fluorescenti (PANC-1 NucLight Red)25 sono state impiantate direttamente nel pancreas del topo. Con l'applicazione della finestra di imaging intravitale pancreatico, questo modello potrebbe essere utilizzato come piattaforma per studiare la fisiopatologia cellulare e molecolare nel microambiente tumorale del cancro del pancreas e per il monitoraggio terapeutico di nuovi farmaci candidati.
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Protocol
Tutte le procedure descritte in questo documento sono state condotte in conformità conl'8a edizione della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (2011)26 e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) e il Seoul National University Bundang Hospital (SNUBH).
1. Preparazione della finestra e di altri materiali
- Progettazione personalizzata della finestra di imaging intravitale pancreatico per isolare il pancreas dall'intestino nella cavità addominale18 (Figura 1A, B). Un progetto dettagliato della finestra è descritto in una figura supplementare di uno studio precedente18.
- Utilizzare topi C57BL / 6N, maschi di 8-12 settimane, per l'imaging pancreatico intravitale. Iniettare l'anticorpo anti-CD31 coniugato con un fluoroforo Alexa 647, 2 ore prima dell'imaging, ai fini dell'etichettatura dei vasi18.
- Per lo studio delle isole, preparare un modello murino transgenico in cui le isole sono etichettate con una proteina reporter fluorescente. Qui, abbiamo utilizzato MIP-GFP, dove la proteina fluorescente verde è stata espressa sotto il controllo del promotore del gene insulina 1 del topo, che è attivo nelle cellule beta di tutte le isole del topo24.
- Per lo studio sul cancro del pancreas, preparare cellule tumorali transgeniche etichettate con una proteina reporter fluorescente e topi nudi BALB / C. In questo studio, sono stati utilizzati i globuli rossi PANC-1 NucLight. Le cellule tumorali PANC-125 sono state etichettate con la sonda fluorescente NucLight Red.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici, coprire il vetro (con PEG o meno) e le finestre di imaging utilizzando un'autoclave.
- Applicare il rivestimento PEG sul vetro di copertura per prevenire la risposta infiammatoria e aumentare la biocompatibilità, che è adatto per l'imaging a lungo termine.
2. Chirurgia
- Preparare una piattaforma chirurgica sterile e sterilizzare le superfici con il 70% di etanolo.
NOTA: per le sessioni di imaging longitudinale, la tecnica asettica è essenziale. - Anestetizzare i topi con una miscela di tiletamina/zolazepam (30 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
NOTA: L'uso di tiletamina / zolazepam è raccomandato al posto della ketamina a causa del suo effetto avverso di iperglicemia. L'anestesia ottimale dovrebbe essere selezionata ai fini dell'esperimento9,27. - Monitorare la temperatura corporea utilizzando una sonda rettale con una piastra riscaldante controllata omeotermica.
- Rasare il fianco sinistro del mouse e applicare tre cicli di alternanza di alcol e scrub a base di iodio.
NOTA: Se si utilizza una crema depilatoria, non lasciare più di 1 minuto per evitare ustioni chimiche. - Fai un'incisione di 1,5 cm sul fianco sinistro del topo e seziona la pelle e il muscolo.
- Eseguire una sutura a cordone di borsa con una sutura nera o nylon 4-0 nel margine dell'incisione.
- Utilizzare un micro riavvolgitore sull'incisione ed esporre delicatamente la milza.
- Mettere a bagno con cura la milza con una pinza ad anello e identificare il pancreas.
- Posizionare la finestra sul fianco del mouse e passare la milza e il pancreas attraverso lo spazio aperto della finestra. La manipolazione del pancreas deve essere molto gentile in quanto può causare sanguinamento o pancreatite
- Posizionare delicatamente il pancreas sulla piastra della finestra di imaging; la milza sarà posizionata sullo spazio aperto della finestra.
- Per lo studio sulle cellule tumorali, iniettare PANC-1 NucLight Red (1,0 x 106 cellule) direttamente nel pancreas.
NOTA: Per l'imaging degli xenotrapianti ortotopici del cancro pancreatico umano, l'impianto diretto di cellule tumorali come PANC-1 o altre cellule tumorali pancreatiche umane potrebbe essere facilitato28. Per visualizzare con microscopia a fluorescenza intravitale, le cellule PANC-1 sono state trasdotte con proteina fluorescente rossa utilizzando il reagente lentivirale NucLight Red che etichetta il nucleo29. Sebbene il volume massimo di iniezione sia incerto, diminuire il volume il più possibile per evitare l'effetto di pressione nel pancreas. - Applicare gocce di colla N-butil cianoacrilato sul margine della finestra di imaging.
- Per ridurre al minimo la quantità di colla applicata, utilizzare un ago catetere da 31 G per l'applicazione. Se la quantità della goccia è grande, il tessuto aderirà involontariamente alla finestra o al vetro di copertura.
- Applicare delicatamente un vetro di copertura rotondo da 12 mm sul margine della finestra di imaging.
- Tirare il cappio di sutura per adattarlo alla scanalatura laterale della finestra e legarlo tre volte.
- Tagliare il sito prossimale massimo del nodo per prevenire l'interruzione di punti stretti quando questi topi sono svegli.
- Lasciare che i topi si riprendano dall'anestesia (2-3 ore) e iniettare ketoprofene (5 mg / kg, sottocutaneo nella pelle sciolta alla base del collo o dell'anca dell'animale) per alleviare il dolore. Rivalutare i segni di dolore ogni 12 ore e il ketoprofene dovrebbe essere considerato ogni 24 ore per 1-3 giorni.
NOTA: L'analgesia influenza la secrezione di insulina in risposta al glucosio9. La scelta e la tempistica dell'analgesia devono essere individualizzate a scopo sperimentale. - Accogliere il topo nella gabbia con biancheria da letto sufficiente per evitare il contatto della finestra con la gabbia. Evitare di alloggiare la casa con i topi senza l'intervento chirurgico alla finestra.
3. Imaging intravitale
- Accendere il microscopio intravitale compresa la potenza laser.
- Accendere la piastra riscaldante e impostare la regolazione omeotermica a 37 °C.
NOTA: In alternativa, utilizzare una piastra riscaldante passiva o una lampada con controllo frequente se non vi è alcuna regolazione omeotermica. - Eseguire l'anestesia intramuscolare con una miscela di tiletamina/zolazepam (30 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
NOTA: L'uso di tiletamina / zolazepam è raccomandato al posto della ketamina a causa del suo effetto avverso di iperglicemia. L'anestesia ottimale dovrebbe essere selezionata ai fini degli esperimenti9,27. - Inserire un catetere vascolare per l'iniezione.
- Applicare una pressione sul lato prossimale della coda con l'indice e il terzo dito in alternativa all'applicazione del laccio emostatico. Riscaldare la coda con una lampada, se necessario.
- Sterilizzare la vena della coda con uno spray al 70% di etanolo.
- Inserire un catetere da 30 G nella vena laterale della coda. Il rigurgito di sangue sarà visualizzato nel tubo PE10.
- Applicare un nastro di seta sul catetere per stabilizzarlo.
- Iniettare IL DESTRANO FITC/TMR o altre sonde fluorescenti (25 μg di anti-CD31 coniugato con Alexa 647), a seconda dei casi, secondo la combinazione di sonde fluorescenti18.
NOTA: per le sonde fluorescenti a anticorpi coniugati, iniettare 2 ore prima della sessione di imaging.
- Trasferire il mouse dalla piattaforma chirurgica alla fase di imaging.
- Inserire una sonda rettale per controllare automaticamente la temperatura corporea con il sistema di termoforo omeotermico.
- Inserire la finestra di imaging pancreatico nel porta finestra preparato durante la configurazione della microscopia intravitale (Figura 2). Per un microscopio invertito, potrebbe non essere necessario un porta finestra.
- Eseguire l'imaging intravitale.
- Per l'imaging del pancreas, iniziare con una lente obiettiva a basso ingrandimento (ad esempio, 4x) per la scansione dell'intera vista del pancreas nella finestra di imaging pancreatico (campo visivo consigliato: 2500 x 2500 μm).
- Dopo aver segnato la regione di interesse, passare all'obiettivo con ingrandimento più elevato (20x o 40x) per eseguire l'imaging a livello cellulare (campo visivo consigliato: 500 x 500 μm o 250 x 250 μm). In questo esperimento, la risoluzione laterale e assiale era di circa 0,5 μm e 3 μm, rispettivamente.
- Esegui l'imaging z-stack o time-lapse per osservare la struttura 3D o le dinamiche a livello cellulare, come la migrazione cellulare.
NOTA: per l'imaging delle cellule fluorescenti che esprimono proteine di animali transgenici (MIP-GFP), 30 s di esposizione laser intermittente a 488 nm con potenza fino a 0,43 mW erano tollerabili senza fotosbiancamento evidente o danni ai tessuti. Per l'imaging delle proteine fluorescenti etichettate con Alexa 647, la potenza laser di 640 nm fino a 0,17 mW era tollerabile senza fotosbiancamenti evidenti o danni ai tessuti. L'esposizione laser ad eccitazione prolungata con una potenza superiore a questa impostazione può portare a fotosciviazione o danni ai tessuti per fototossicità. Regola il guadagno e la potenza adeguati per immaginare in modo appropriato la regione di interesse. L'impostazione dettagliata dei parametri nella microscopia intravitale deve essere individualizzata per ogni microscopia intravitale preparata nell'istituto.
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Representative Results
La microscopia intravitale combinata con la finestra di imaging intravitale pancreatico integrata nella base di supporto consente l'imaging longitudinale a livello cellulare del pancreas in un topo. Questo protocollo con la finestra di imaging intravitale pancreatico fornisce stabilità tissutale a lungo termine che consente l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione per tracciare le singole isole per un massimo di 3 settimane. Di conseguenza, è possibile ottenere l'imaging a mosaico per un campo visivo esteso, la ricostruzione tridimensionale (3D) dell'imaging z-stack e il tracciamento longitudinale della stessa posizione. Inoltre, la nostra microscopia intravitale fornisce quattro canali (405, 488, 561 e 647 nm) di acquisizione, che consente la visualizzazione simultanea di più cellule con le loro interazioni.
Per l'imaging preliminare, la finestra è stata impiantata in un topo C57BL/6N con anticorpo anti-CD31 iniettato per via endovenosa coniugato con un fluoroforo Alexa 647. L'imaging ad ampia area(Figura 3A)e l'imaging 3D ingrandito(Figura 3B-D, Video supplementare 1)del pancreas sono stati facilitati con questo sistema. Il tessuto pancreatico è stato visualizzato con autofluorescenza ed è stata identificata la vascolarizzazione adiacente etichettata con l'anticorpo anti-CD31. L'oscillazione dovuta alla peristalsi o alla respirazione non è stata identificata, con conseguente imaging medio con un elevato rapporto segnale-rumore (Figura 4). Le cellule acinari, che richiedono la visualizzazione a una risoluzione su microscala nel pancreas, sono state chiaramente visualizzate nelle immagini medie.
Per l'imaging delle isole, è stato utilizzato un mouse MIP-GFP. Utilizzando il metodo di imaging a mosaico, una vista ad ampio campo con imaging ad alta risoluzione ha permesso la visualizzazione delle isole con la vascolarizzazione adiacente (Figura 5). Circa 40-50 isole sono state identificate nella vista ad ampio campo. Questo metodo di imaging stabile potrebbe facilitare ulteriormente il tracciamento delle isole per un massimo di 3 settimane, come mostrato in uno studio precedente (Figura 6)18.
Per l'imaging delle cellule tumorali, i globuli rossi PANC-1 NucLight sono stati impiantati direttamente nel pancreas del topo durante l'intervento chirurgico (Figura 7). È stata utilizzata una strategia di doppia etichettatura, costituita da globuli rossi PANC-1 NucLight e vasi vicini colorati con anti-CD31 coniugato con Alexa 647. Con il nostro protocollo, è stata ottenuta l'imaging ad ampio campo del cancro del pancreas (Figura 7A), che delinea il margine del tumore e l'imaging 3D ad alta risoluzione a livello di singola cellula (Figura 7B-D, Video supplementare 2).
Figura 1: Progettazione e fotografia della finestra di imaging intravitale pancreatico. (A) Una vista 3D e della sezione trasversale della finestra di imaging intravitale pancreatico. Un progetto dettagliato delle dimensioni e del diametro è descritto nel precedente documento18. (B) Fotografia anteriore e posteriore della finestra di imaging pancreatico. Copyright 2020 Korean Diabetes Association di Diabetes Metab J. 2020 44: 1: 193-198. Ristampato con il permesso della Korean Diabetes Association. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Fotografia dell'implementazione della finestra di imaging intravitale pancreatico. Una finestra di imaging intravitale pancreatico viene impiantata nel topo nella fase traslazionale XYZ e il supporto della camera di imaging collegato al supporto inclinabile è collegato alla finestra di imaging pancreatico. Copyright 2020 Korean Diabetes Association di Diabetes Metab J. 2020 44: 1: 193-198. Ristampato con il permesso della Korean Diabetes Association. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Imaging pancreatico intravitale rappresentativo nel topo C57BL/6N. (A) Immagine ad ampia area e (B) immagine 3D ingrandita del pancreas (verde) e della sua microvascolarizzazione (rosso) nel mouse C57BL/6N. I vasi sono etichettati con un anticorpo anti-CD31 coniugato con il fluoroforo Alexa 647. (C) Immagine ricostruita 3D e (D) immagine di rendering superficiale del pancreas del topo. Barra di scala: 200 μm (A) e 50 μm (B-D). Vedere anche video supplementare 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Imaging intravitale delle cellule acinari e della vascolarizzazione adiacente. Cellule acinari (verdi) e vascolarizzazione adiacente (rosso) nel topo C57BL/6N. I vasi sono etichettati con anticorpi Anti-CD31 coniugati con il fluoroforo Alexa 647. La stabilità tissutale ottenuta con la finestra di imaging pancreatico fornisce un'immagine ad alto rapporto segnale-rumore. Barra della scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Imaging intravitale rappresentativo delle isole pancreatiche nel topo MIP-GFP. Mosaico ad ampia area e immagine ingrandita delle isole (verde) e della vascolarizzazione adiacente (rosso) elaborati con metodo di proiezione di massima intensità nel pancreas del topo MIP-GFP. I vasi sono etichettati con un anticorpo anti-CD31 coniugato con il fluoroforo Alexa 647. Barra di scala: 500 μm (ampia area) e 50 μm (ingrandita). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Imaging intravitale longitudinale delle isole nel pancreas del topo MIP-GFP. Immagine longitudinale delle isole per un massimo di 3 settimane nel pancreas nel topo MIP-GFP. Ogni punta di freccia con colori diversi indica gli stessi isolotti. Barra di scala: 100 μm. Copyright 2020 Korean Diabetes Association di Diabetes Metab J. 2020 44: 1: 193-198. Ristampato con il permesso della Korean Diabetes Association. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Imaging intravitale rappresentativo del modello di cancro del pancreas. (A) Immagine ad ampia area e (B) immagine 3D ingrandita dei globuli rossi PANC-1 NucLight impiantati (rosso) nel topo nudo BALB/c. I vasi (blu) sono etichettati con un anticorpo anti-CD31 coniugato con il fluoroforo Alexa 647. (C) Immagine ricostruita 3D e (D) immagine di rendering superficiale del cancro del pancreas nel modello murino. Barra di scala: 500 μm (A) e 50 μm (B-D). Vedere anche il video supplementare 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video supplementare 1: Imaging pancreatico 3D in vivo nel mouse C57BL/6N. Imaging 3D in vivo del pancreas (verde) di topo C57BL/6N iniettato per via endovenosa con un anticorpo anti-CD31 coniugato con il fluoroforo Alexa 647 (rosso). La barra della scala è raffigurata nel video. Questo video corrisponde alla Figura 3C,D. Clicca qui per scaricare questo video.
Video supplementare 2: Carcinoma pancreatico 3D in vivo (PANC-1 NucLight Red) imaging in topo nudo BALB/C. Imaging 3D in vivo del cancro del pancreas (rosso) impiantato in topo BALB/C Nude iniettato per via endovenosa con un anticorpo anti-CD31 coniugato con il fluoroforo Alexa 647 (blu). La barra della scala è raffigurata nel video. Questo video corrisponde alla Figura 7C,D. Clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
Il protocollo qui descritto consiste nell'imaging intravitale del pancreas utilizzando una nuova finestra di imaging intravitale pancreatico integrata nella base di supporto modificata da una finestra di imaging addominale. Tra i protocolli sopra descritti, il primo passo critico è l'impianto della finestra di imaging pancreatico intravitale nel topo. Per l'applicazione della colla nella finestra, è importante applicare la colla tra il margine della finestra e il vetro di copertura, ma non sul tessuto pancreatico, in quanto potrebbe interrompere significativamente l'imaging intravitale. Non solo la colla stessa tra il vetro e il tessuto, ma anche le particelle di polvere aggiuntive possono indurre la diffusione della luce durante l'imaging se la colla viene applicata direttamente al tessuto. Inoltre, l'applicazione dell'adesivo può avere effetti tossici e non fisiologici sul pancreas.
Il secondo passo è la quantità di tessuto pancreatico posto sulla piastra di base di supporto metallico. Poiché il tessuto pancreatico è una struttura simile a un foglio, il volume del tessuto pancreatico sulla piastra deve essere controllato. Se un volume troppo grande viene posizionato sulla piastra, la colla applicata al margine dell'anello potrebbe aderire al tessuto e l'effetto di massa potrebbe ostacolare la perfusione del pancreas. D'altra parte, se un volume troppo piccolo è posto lì, il campo visivo che può essere visualizzato potrebbe essere limitato. Questo protocollo di chirurgia sulla finestra può richiedere diversi studi per soddisfare uno standard coerente.
Per l'imaging a lungo termine per un periodo di 3 settimane, il problema più preoccupante era il potenziale danno alla finestra di imaging pancreatico. La distruzione involontaria del vetro di copertura nella finestra di imaging pancreatico potrebbe verificarsi durante il periodo di osservazione a lungo termine. Per evitare ciò, il mouse con la finestra deve essere alloggiato separatamente e gli oggetti duri con spigoli vivi devono essere rimossi dalla gabbia. L'eutanasia dei topi dovrebbe essere presa in considerazione se il vetro di copertura si rompe, se ci sono gravi segni di infiammazione vicino alla finestra o se l'animale sembra essere in difficoltà. Nella nostra esperienza, i topi con la finestra di imaging pancreatico sono stati in grado di mangiare ed esercitare normalmente quando il recupero dopo l'intervento chirurgico è stato appropriato e non è stata sviluppata nessun'altra complicazione.
Nella nostra precedente esperienza con la finestra di imaging addominale, non siamo riusciti ad acquisire immagini a livello cellulare di alta qualità e il tracciamento longitudinale degli stessi punti per più giorni. Rispetto alla finestra di imaging addominale, che fornisce una piattaforma diversificata per vari organi addominali, la finestra di imaging pancreatico è ulteriormente specificata per l'imaging del pancreas e di altri organi che sono morbidi e facilmente influenzati da movimenti come mesentere, milza e intestino tenue. Tuttavia, il fegato e il rene potrebbero essere irrealizzabili nella finestra di imaging pancreatico a causa dello spazio limitato.
Mentre la combinazione di un topo fluorescente, cellule e sonde anticorpali consente la visualizzazione delle interazioni dinamiche tra le cellule endoteliali e le isole o le cellule tumorali, il protocollo qui descritto potrebbe essere riprodotto con altre composizioni di cellule fluorescenti o sonde molecolari adatte a ciascuna rispettiva condizione. Inoltre, sono attese applicazioni espansive integrate con il nostro metodo, come il topo reporter CpepSfGFP con secrezione di insulina9,30,AAV8-mediated gene delivery targeting reactive oxygen species (ROS)31,o il tumore ortotopico modello32,33,34 in cui il tumore in situ può stimolare completamente il microambiente tumorale, compresa la tumorigenesi, lo sviluppo e le metastasi35. Inoltre, i modelli di xenotrapianto derivati dal paziente possono anche essere studiati utilizzando la nostrapiattaforma 36.
Ci sono alcune limitazioni da affrontare in questo studio. In primo luogo, anche quando abbiamo utilizzato la base metallica per la stabilizzazione, non siamo stati in grado di determinare lo stress meccanico indotto sul tessuto dalla base e dal vetro di copertura, che potrebbe influenzare il flusso sanguigno. Tuttavia, come illustrato nelle figure precedenti, l'iniezione endovenosa di un anticorpo coniugato a fluorescenza (CD31) o destrano ha adeguatamente etichettato il vaso senza area non perfusa distinguibile, suggerendo un impatto minimo dello stress meccanico sul normale flusso sanguigno all'interno del tessuto pancreatico. In secondo luogo, le reazioni avverse dovute all'adesivo non possono essere valutate nel tessuto pancreatico. Tuttavia, abbiamo cercato di evitare di toccare il pancreas con adesivi il più attentamente possibile per evitare effetti aggiuntivi. In terzo luogo, come discusso sopra, l'impatto indesiderato degli agenti anestetici potrebbe influenzare la sensibilità all'insulina e la secrezione, come descritto nello studio precedente9,27. Nella nostra esperienza, una miscela di ketamina e xilazina ha indotto iperglicemia rispetto alla miscela di tiletamina, zolazepam e xilazina. Un ulteriore studio che studia l'effetto dell'anestesia sulla secrezione di insulina deve essere eseguito e deve essere selezionata un'anestesia adeguata con effetti avversi minimi in base a ciascun esperimento. In quarto luogo, l'imaging del pancreas è focalizzato sulla porzione di coda e l'imaging della porzione di testa del pancreas potrebbe essere limitato con la nostra finestra.
In sintesi, un'imaging longitudinale stabilizzato del pancreas a livello cellulare per un massimo di diverse settimane è stato facilitato dal nostro sistema di imaging integrato con la finestra di imaging intravitale pancreatico ottimizzata per l'imaging del pancreas in vivo. Poiché l'imaging intravitale fornisce approfondimenti dinamici sulla biologia cellulare, l'immunologia e la biologia dei tumori, questo protocollo potrebbe essere un metodo utile per studiare la fisiopatologia di varie malattie che coinvolgono il pancreas.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dalla sovvenzione n. 14-2020-002 del Fondo di ricerca SNUBH e dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window - custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder - custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
References
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