Summary
In vivo högupplösta imaging av bukspottkörteln underlättades med bukspottskörteln intravital imaging fönster.
Abstract
Direkt in vivo cellulär upplösning av bukspottkörteln i en levande liten djurmodell har varit tekniskt utmanande. En nyligen intravital imaging studie, med en buken imaging fönster, möjliggjorde visualisering av cellulära dynamiken i buken organ in vivo. Men på grund av den mjuka arkliknande arkitekturen hos mus bukspottkörteln som lätt kan påverkas av fysiologisk rörelse (t.ex. peristalsis och andning), var det svårt att utföra stabiliserad longitudinell in vivo imaging under flera veckor på cellulär nivå för att identifiera, spåra och kvantifiera holmar eller cancerceller i mus bukspottkörteln. Häri beskriver vi en metod för att implantera en ny stödjande bas, ett integrerat intravitalt avbildningsfönster i bukspottskörteln, som rumsligt kan separera bukspottkörteln från tarmen för longitudinell tidsfördröjning intravital avbildning av bukspottkörtelmikrostrukturen. Longitudinell in vivo imaging med bildframställning fönstret möjliggör stabil visualisering, vilket möjliggör spårning av holmar under en period av 3 veckor och högupplöst tredimensionell avbildning av mikrostrukturen, vilket framgår här i en ortopisk bukspottskörtelcancer modell. Med vår metod kan ytterligare intravitala avbildningsstudier belysa patofysiologin hos olika sjukdomar som involverar bukspottkörteln på cellnivå.
Introduction
Bukspottkörteln är ett bukorgan med exokrin funktion i mag-tarmkanalen och en endokrin funktion av att utsöndra hormoner i blodomloppet. Högupplöst cellulär avbildning av bukspottkörteln kan avslöja patofysiologi av olika sjukdomar som omfattar bukspottkörteln, inklusive bukspottkörtelinflammation, bukspottskörtelcancer och diabetes mellitus1. Konventionella diagnostiska bildverktyg som datortomografi, magnetisk upplösning imaging och ultrasonography är allmänt tillgängliga inom det kliniska området1,2. Dessa bildframställningsmetoder är dock begränsade till att visualisera endast strukturella eller anatomiska förändringar, medan förändringar på cellulär eller molekylär nivå inte kan bestämmas. Med tanke på att molekylära förändringar i diabetes mellitus eller bukspottskörtelcancer hos människor kan initiera mer än 10 år före diagnosen3,4, har upptäckten av bukspottskörtelsjukdomar från deras molekylära övergång under den latenta perioden potential att ge en tidig diagnos och en snabb intervention. Således kommer avbildning som kommer att övervinna upplösningsbegränsningarna och ge värdefulla insikter i funktionen anmärkningsvärt få uppmärksamhet genom att ge tidig diagnos av bukspottskörtelcancer eller avancerad identifiering av förändringen av holmarna under utvecklingen av diabetes mellitus5.
Särskilt med holmar, kärnavbildning, bioluminescens imaging och optisk koherens tomografi har föreslagits som icke-invasiva holme imaging tekniker6. Upplösningen av dessa metoder är dock betydligt låg, med typiska värden som sträcker sig från flera tiotals till hundratals mikrometer, vilket ger en begränsad förmåga att upptäcka förändringar på cellnivå på holmarna. Å andra sidan utfördes tidigare högupplösta studier av holmar under ex vivo7,8 (t.ex. skivning eller matsmältning av bukspottkörteln), icke-fysiologiska9 (t.ex. utmattning av bukspottkörteln) och heterotopiskatillstånd 10,11,12 (t.ex. implantation under njurkapseln, inuti levern och i ögats främre kammare), vilket begränsar deras tolkning och kliniska konsekvenser. Om in vivo,fysiologisk och ortopisk modell av högupplöst bildbehandling kan fastställas, kommer det att vara en kritisk plattform för undersökning av bukspottskörtel holmar.
Intravital imaging, som avslöjar patofysiologin på mikroskopisk upplösningsnivå i ett levande djur, har nyligen fått stor uppmärksamhet13. Av in vivo-avbildningsmetoderna har utvecklingen av ett bukavbildningsfönster14, som implanterar ett fönster i musens buk, tillåtit upptäckten av nya fynd (dvs. ett pre-mikrometastasstadium av tidig levermetastas15 och mekanism för stamcellsunderhåll i tarmepiteel16). Även om buken imaging fönstret ger värdefulla resultat, har tillämpningarna av detta fönster för bukspottkörteln och den resulterande intravital imaging forskning baserat på sjukdomar som omfattar bukspottkörtel, inte undersökts i stor utsträckning.
Till skillnad från de väldefinierade fasta organegenskaperna hos den mänskliga bukspottkörteln är en mus bukspottkörtel en diffust fördelad mjukvävnadsliknande struktur17. Därför påverkas det oupphörligt av fysiologiska rörelser inklusive peristalsis och andning. En tidigare studie om tillämpningen av ett buken imaging fönster för bukspottkörteln visat att vandring inträffade på grund av rörelse-artefakter framkallas av tarm rörelser18. Allvarlig suddighet observerades i den resulterande genomsnittliga bilden, vilket hindrade visualisering och identifiering av mikroskala strukturer.
Häri beskriver vi användningen av en ny stödjande bas integrerad bukspottskörtel intravital bildframställning fönster kombinerat med intravital mikroskopi19,20 att undersöka longitudinella cellulära nivå händelser i sjukdomar som omfattar bukspottkörteln. Förutom en detaljerad beskrivning av metoden i den tidigare studien18kommer den utökade tillämpningen av avbildningsfönstret för bukspottskörteln för olika sjukdomar i bukspottkörteln att behandlas i detta dokument. I detta protokoll användes ett specialbyggt videohastighetslaserskanning confocal mikroskopi system som ett intravitalt mikroskopi system. Fyra lasermoduler (våglängder vid 405, 488, 561 och 640 nm) användes som excitationskälla, och fyra kanaler med emissionssignaler upptäcktes av fotomultiplierrör (PMT) genom bandpassfilter (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Laserskanning bestod av en roterande polygonspegel (X-axel) och en galvanometerskanningsspegel (Y-axel) som aktiverade videohastighetsskanningen (30 bilder per sekund). Detaljerad information om intravital mikroskopi har beskrivits i de tidigarestudierna 10,18,19,20,21,22,23.
I vår tidigare holmestudie18,vi framgångsrikt och stabilt avbildade holmarna i levande möss med hjälp av en transgen musmodell (MIP-GFP)24 där holmarna taggades med GFP. Metoden möjliggjorde högupplöst visualisering av förändringarna i holmarna under en period av 1 vecka. Det underlättade också avbildning av samma holmar i upp till 3 veckor, vilket tyder på genomförbarheten av långsiktiga studier av bukspottskörteln holmar för funktionell spårning eller övervakning under patogenesen vid diabetes mellitus18. Dessutom utvecklade vi en ortopisk bukspottskörtelcancer modell där fluorescerande bukspottskörteln cancerceller (PANC-1 NucLight Red)25 implanterades direkt i bukspottkörteln av musen. Med tillämpningen av bukspottskörteln intravital imaging fönster, denna modell kan användas som en plattform för att undersöka cellulära och molekylära patofysiologi i tumör microenvironment av bukspottskörteln cancer och för terapeutisk övervakning av nya läkemedelskandidater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som beskrivs i detta dokument utfördes i enlighetmed den åttonde utgåvan av Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (2011)26 och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) och Seoul National University Bundang Hospital (SNUBH).
1. Förberedelse av fönstret och andra material
- Specialdesigna bukspottskörteln intravital imaging fönster för att avskild bukspottkörteln från tarmen i bukhålan18 (Figur 1A,B). En detaljerad ritning av fönstret beskrivs i en kompletterande figur i en tidigare studie18.
- Använd C57BL/6N möss, 8-12 veckor gamla hanar, för intravital bukspottskörtelavbildning. Injicera anti-CD31-antikropp konjugerad med en Alexa 647 fluorofor, 2 timmar före avbildningen, för kärlmärkning18.
- För holmestudien, förbered en transgen musmodell där holmarna är märkta med ett fluorescerande reporterprotein. Här använde vi MIP-GFP, där grönt fluorescerande protein uttrycktes under kontroll av musinsulin 1 genpromotor, som är aktiv i betacellerna på alla holmar imusen 24.
- För cancerstudien i bukspottskörteln, förbered transgena cancerceller märkta med ett fluorescerande reporterprotein och BALB/C-nakna möss. I denna studie användes PANC-1 NucLight Röda blodkroppar. PANC-1 cancerceller25 var märkta med NucLight Red fluorescerande sond.
- Sterilisera alla kirurgiska verktyg, täckglas (med PEG eller inte) och avbildningsfönster med hjälp av en autoklav.
- Applicera PEG-beläggning på täckglaset för att förhindra inflammatorisk respons och öka biokompatibiliteten, som är lämplig för långsiktig avbildning.
2. Kirurgi
- Förbered en steril kirurgisk plattform och sterilisera ytorna med 70% etanol.
OBS: För longitudinella bildbehandlingssessioner är aseptisk teknik nödvändig. - Söva möss med en blandning av tiletamine/zolazepam (30 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg).
OBS: Användning av tiletamine/zolazepam rekommenderas istället för ketamin på grund av dess negativa effekt av hyperglykemi. Optimal anestesi bör väljas för experimentet9,27. - Övervaka kroppstemperaturen med hjälp av en rektal sond med en homeotermstyrd värmedyna.
- Raka musens vänstra flank och applicera tre rundor alternerande alkohol och jodbaserad skrubb.
OBS: Om depilatorisk grädde används ska du inte lämna längre än 1 minut för att undvika kemisk brännskada. - Gör ett snitt på 1,5 cm på musens vänstra flank och dissekera huden och muskeln.
- Utför en handväska-sträng sutur med en svart eller nylon 4-0 sutur i snitt marginalen.
- Använd ett mikroupprullningsdon på snittet och exponera försiktigt mjälten.
- Slå försiktigt mjälten med ring tång och identifiera bukspottkörteln.
- Placera fönstret på musens flank och passera mjälten och bukspottkörteln genom fönstrets öppna utrymme. Manipulering av bukspottkörteln måste vara mycket hedniska eftersom det kan orsaka blödning eller pankreatit
- Placera försiktigt bukspottkörteln på bildfönstrets platta; mjälten placeras på fönstrets öppna utrymme.
- För cancercellsstudien, injicera PANC-1 NucLight Red (1,0 x 106 celler) direkt i bukspottkörteln.
OBS: För avbildning av ortopisk human bukspottskörtelcancer xenografts, direkt implantation av cancer cell såsom PANC-1 eller andra mänskliga bukspottskörteln cancer cell kan underlättas28. För att visualisera med intravital fluorescensmikroskopi transducerades PANC-1-celler med rött fluorescerande protein med nuclight röd lentiviral reagens som märker kärnan29. Även om maximal injektionsvolym är osäker, minska volymen som möjligt för att undvika tryckeffekten i bukspottkörteln. - Applicera droppar N-butylcyanoakrylatlim på bildfönstrets marginal.
- För att minimera mängden applicerat lim, använd en 31 G kateternål för applikationen. Om mängden droppe är stor, kommer vävnaden oavsiktligt att fästa på fönstret eller täckglaset.
- Applicera försiktigt ett 12 mm runt täckglas på bildfönstrets marginal.
- Dra suturslingan för att passa in i fönstrets sidospår och bind den tre gånger.
- Skär den maximala proximala platsen för knuten för att förhindra avbrott i snäva stygn när dessa möss är vakna.
- Låt möss återhämta sig från anestesi (2-3 timmar) och injicera ketoprofen (5 mg/kg, subkutan i den lösa huden vid djurets nacke eller höft) för smärtlindring. Omvärdera för tecken på smärta var 12: e timme och ketoprofen bör övervägas var 24: e timme i 1-3 dagar.
OBS: Analgesi påverkar insulinsekretion som svar på glukos9. Valet och tidpunkten för analgesi måste individualiseras för det experimentella ändamålet. - Accomodate musen i buret med tillräckligt med sängkläder för att undvika kontakten med fönstret till buret. Undvik att hysa huset med mössen utan fönsteroperationen.
3. Intravital avbildning
- Slå på det intravitala mikroskopet inklusive lasereffekten.
- Slå på värmedynan och ställ in den homeothermic regleringen på 37 °C.
OBS: Alternativt kan du använda en passiv värmedyna eller lampa med frekvent kontroll om det inte finns någon homeotermisk reglering. - Utför intramuskulär anestesi med en blandning av tiletamine/zolazepam (30 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg).
OBS: Användning av tiletamine/zolazepam rekommenderas istället för ketamin på grund av dess negativa effekt av hyperglykemi. Optimal anestesi bör väljas för experimenten9,27. - Sätt in en kärlkateter för injektionen.
- Applicera tryck på svansens proximala sida med indexet och tredje fingret som ett alternativ till en stassapplikation. Värm svansen med en lampa om det behövs.
- Sterilisera svans venen med en 70% etanolspray.
- Sätt in en 30 G kateter i den laterala svansvenen. Uppstötning av blod kommer att visualiseras i PE10-röret.
- Applicera en silketjp på katetern för att stabilisera den.
- Injicera FITC/TMR dextran eller andra fluorescerande sonder (25 μg anti-CD31 konjugerade med Alexa 647), beroende på kombinationen av fluorescerande sonder18.
OBS: För fluorescerande konjugerade antikroppssonder, injicera 2 timmar före avbildningssessionen.
- Överför musen från den kirurgiska plattformen till bildfasen.
- Sätt i en rektal sond för att automatiskt styra kroppstemperaturen med det hematermiska värmedynan.
- Sätt in fönstret för bukspottskörtelavbildning i fönsterhållaren som förberetts under den intravitala mikroskopiinställningen (figur 2). För ett inverterat mikroskop kanske en fönsterhållare inte behövs.
- Utför intravital avbildning.
- För avbildning av bukspottkörteln, börja med en objektivlins med låg förstoring (t.ex. 4x) för skanning av hela vyn av bukspottkörteln i fönstret för bukspottskörtelavbildning (rekommenderat synfält: 2500 x 2500 μm).
- Efter bestämning av intresseområdet, byt till objektiv för högre förstoringsmål (20x eller 40x) för att utföra cellnivåavbildningen (rekommenderat synfält: 500 x 500 μm eller 250 x 250 μm). I detta experiment var den laterala och axiella upplösningen cirka 0, 5 μm respektive 3 μm.
- Utför z-stack- eller timelapse-avbildning för att observera 3D-strukturen eller dynamiken på cellnivå, till exempel cellmigrering.
OBS: För avbildning av fluorescerande protein som uttrycker celler hos transgena djur (MIP-GFP), var 30 s intermittent 488 nm laserexponering med effekt upp till 0, 43 mW tolerabel utan märkbar fotoblekning eller vävnadsskador. För avbildning av fluorescerande proteiner märkta med Alexa 647 var lasereffekten på 640 nm upp till 0,17 mW acceptabel utan märkbar fotoblekning eller vävnadsskador. Långvarig excitation laser exponering med en effekt över denna inställning kan leda till fotobleaching eller vävnad skador genom fototoxicitet. Justera tillräcklig förstärkning och kraft för att på lämpligt sätt avbilda intresseområdet. Detaljerad inställning av parametrar i intravital mikroskopi måste individualiseras för varje intravital mikroskopi som utarbetas i institutet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intravital mikroskopi i kombination med den stödjande basen integrerad bukspottskörteln intravital imaging fönster möjliggör längsgående cellulär nivå imaging av bukspottkörteln i en mus. Detta protokoll med bukspottskörteln intravital imaging fönster ger långsiktiga vävnad stabilitet som gör det möjligt att förvärva högupplösta imaging för att spåra enskilda holmar i upp till 3 veckor. Som ett resultat kan mosaik imaging för ett utökat synfält, tredimensionell (3D) återuppbyggnad av z-stack imaging och longitudinell spårning av samma position uppnås. Dessutom ger vår intravitala mikroskopi fyra kanaler (405, 488, 561 och 647 nm) förvärv, vilket möjliggör samtidig multipelcellsvisualisering med deras interaktioner.
För den preliminära avbildningen implanterades fönstret i en C57BL/6N mus med intravenöst injiceras anti-CD31 antikroppar konjugeras med en Alexa 647 fluorophore. Avbildning med stort område (figur 3A) och förstorad 3D-avbildning (figur 3B-D, kompletterande video 1) i bukspottkörteln underlättades med detta system. Bukspottskörteln vävnad visualiserades med autofluorescens, och intilliggande vasculature märkt med anti-CD31 antikroppar identifierades. Oscillation på grund av antingen peristalsis eller andning identifierades inte, vilket resulterade i genomsnittlig avbildning med ett högt signal-till-brusförhållande (figur 4). Acinarceller, som kräver visualisering med mikroskalaupplösning i bukspottkörteln, visualiserades tydligt i de genomsnittliga bilderna.
För avbildning av holmarna användes en MIP-GFP-mus. Med hjälp av mosaikavbildningsmetoden möjliggjorde en bredfältsvy med högupplöst avbildning visualiseringen av holmarna med den intilliggande vaskulaturen (figur 5). Cirka 40-50 holmar identifierades i vidvinkelvyn. Denna stabila avbildningsmetod skulle ytterligare kunna underlätta spårningen av holmarna i upp till 3 veckor, vilket framgår av en tidigare studie (figur 6)18.
För cancercellsavbildningen implanterades PANC-1 NucLight Red-celler direkt i mus bukspottkörteln under operationen (Figur 7). En strategi med dubbla etiketter användes, bestående av PANC-1 NucLight Red-celler och närliggande fartyg färgade med anti-CD31 konjugerade med Alexa 647. Med vårt protokoll uppnåddes bredfältsavbildning av bukspottskörtelcancer (figur 7A), som avgränsar tumörens marginal, och högupplöst 3D-avbildning på encellsnivå (Figur 7B-D, Kompletterande video 2).
Figur 1: Design och fotografi av det intravitala bildfönstret i bukspottskörteln. a)En 3D- och tvärsnittsvy av fönstret intravital avbildning i bukspottskörteln. En detaljerad ritning över storlek och diameter beskrivs i föregående dokument18. B)Främre och bakre fotografi av fönstret för bukspottskörtelavbildning. Copyright 2020 Korean Diabetes Association from Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Omtryckt med tillstånd från The Korean Diabetes Association. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Fotografi av genomförandet av det intravitala avbildningsfönstret i bukspottskörteln. Ett intravitalt avbildningsfönster i bukspottskörteln implanteras i musen i XYZ-översättningsstadiet och bildkammarkammarens hållare som är fäst vid tippningsfästet är ansluten till fönstret för bukspottskörtelavbildning. Copyright 2020 Korean Diabetes Association from Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Omtryckt med tillstånd från The Korean Diabetes Association. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativ intravital bukspottskörtelavbildning i C57BL/6N-mus. (A) Bred yta bild och (B) förstorad 3D-bild av bukspottkörteln (grön) och dess mikrovaskulatur (röd) i C57BL/6N musen. Kärlen är märkta med en anti-CD31-antikropp konjugerad med Alexa 647-fluorforen. (C) 3D rekonstruerad bild och ( D ) ytrenderingsbild av mus bukspottkörteln. Skalstång: 200 μm (A) och 50 μm (B-D). Se även Kompletterande video 1. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Intravital avbildning av acinarcell och intilliggande vaskulatur. Acinarceller (gröna) och intilliggande vaskulatur (röd) i C57BL/6N-musen. Fartyg är märkta med Anti-CD31 antikropp konjugerad med Alexa 647 fluorofor. Vävnadsstabilitet som uppnås med fönstret för bukspottskörtelavbildning ger en bild av förhållandet mellan signaler och brus. Skalbar: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Representativ intravital avbildning av bukspottskörtelöar i MIP-GFP-musen. Bred yta mosaik och förstorad bild av holmar (grön) och intilliggande vaskulatur (röd) bearbetas med maximal intensitet projektion metod i bukspottkörteln av MIP-GFP musen. Kärlen är märkta med en anti-CD31-antikropp konjugerad med Alexa 647-fluorforen. Skalstång: 500 μm (bred yta) och 50 μm (förstorad). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6:Longitudinell intravital avbildning av holmar i bukspottkörteln på MIP-GFP-musen. Längsgående bild av holmarna i upp till 3 veckor i bukspottkörteln i MIP-GFP-musen. Varje pilspets med olika färger anger samma holmar. Skalstång: 100 μm. Copyright 2020 Korean Diabetes Association from Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Omtryckt med tillstånd från The Korean Diabetes Association. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Representativ intravital avbildning av cancermodellen i bukspottskörteln. Kärl (blå) är märkta med en anti-CD31 antikropp konjugerad med Alexa 647 fluorofor. (C) 3D rekonstruerad bild och ( D ) ytrenderingsbild av bukspottskörtelcancer i musmodellen. Skalstång: 500 μm (A) och 50 μm (B-D). Se även Kompletterande video 2. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande video 1: In vivo 3D bukspottskörteltomografi i C57BL/6N mus. In vivo 3D-avbildning av bukspottkörtel (grön) av C57BL/6N-mus intravenöst injicerad med en anti-CD31-antikropp konjugerad med Alexa 647 fluorfor (röd). Skalbaren visas i videon. Den här videon motsvarar figur 3C, D. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande video 2: In vivo 3D bukspottskörtelcancer (PANC-1 NucLight Red) imaging i BALB/C Naken mus. In vivo 3D-avbildning av bukspottskörtelcancer (röd) implanterad i BALB/C Nakenmus intravenöst injicerad med en anti-CD31-antikropp konjugerad med Alexa 647 fluorfor (blå). Skalbaren visas i videon. Den här videon motsvarar figur 7C, D. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här består av intravital imaging av bukspottkörteln med hjälp av en ny stödjande bas integrerad bukspottskörteln intravital imaging fönster ändras från en buken imaging fönster. Bland de protokoll som beskrivs ovan är det första kritiska steget implantationen av det intravitala bukspottskörteln imaging fönstret i musen. För applicering av limet i fönstret är det viktigt att applicera limet mellan fönstrets marginal och täckglaset, men inte på bukspottskörtelvävnaden, eftersom det avsevärt kan avbryta intravital avbildning. Inte bara själva limmet mellan glaset och vävnaden utan även adjungerade dammpartiklar kan inducera ljusspridning under avbildning om limet appliceras direkt på vävnaden. Dessutom kan appliceringen av limet ha giftiga och icke-fysiologiska effekter på bukspottkörteln.
Det andra steget är mängden bukspottskörtelvävnad som placeras på den metallbärande bottenplattan. Eftersom bukspottskörteln vävnad är en arkliknande struktur, volymen av bukspottskörteln vävnad på plattan måste kontrolleras. Om en för stor volym placeras på plattan kan limet som appliceras på ringens marginal fastna på vävnaden, och masseffekten kan hämma bukspottkörtelns perfusion. Å andra sidan, om en för liten volym placeras där, kan synfältet som kan visualiseras vara begränsat. Detta protokoll för kirurgi på fönstret kan kräva flera prövningar för att uppfylla en konsekvent standard.
För långsiktig avbildning under en period av 3 veckor var den mest oroande frågan potentiella skador på bukspottskörteln imaging fönster. Oavsiktlig destruktion av täckglaset i bukspottskörteln imaging fönster kan uppstå under den långsiktiga observationsperioden. För att förhindra detta måste musen med fönstret hållas separat, och hårda föremål med skarpa kanter bör tas bort från buret. Dödshjälp av möss bör övervägas om täckglaset går sönder, om det finns allvarliga tecken på inflammation nära fönstret eller om djuret verkar vara i nöd. Enligt vår erfarenhet kunde möss med bukspottskörteln imaging fönster äta och träna normalt när återhämtningen efter operationen var lämplig och ingen annan komplikation utvecklades.
I vår tidigare erfarenhet av buken imaging fönster, vi misslyckades med att förvärva högkvalitativa cellulär nivå imaging samt longitudinell spårning av samma fläckar under flera dagar. Jämfört med buken imaging fönstret, som ger en varierad plattform för olika bukorgan, bukspottskörteln bildframställning fönstret specificeras ytterligare för avbildning bukspottkörteln samt andra organ som är mjuka och lätt påverkas av rörelser såsom mesenteri, mjälte och små tarm. Lever och njure kan dock vara ogenomförbara i bukspottskörteln imaging fönstret på grund av det begränsade utrymmet.
Medan kombinationen av en fluorescerande mus, celler och antikroppssonder möjliggör visualisering av de dynamiska interaktionerna mellan endotelceller och antingen holmar eller cancerceller, kan protokollet som beskrivs här reproduceras med andra sammansättningar av fluorescerande märkta celler eller molekylära sonder som är lämpliga för varje respektive tillstånd. Dessutom förväntas expansiva applikationer integrerade med vår metod, såsom CpepSfGFP reporter mus med insulin utsöndring9,30,AAV8-medierad gen leverans som riktar sig till reaktiva syre arter (ROS)31, eller ortopisk tumörmodell 32,33,34 där tumör in situ kan helt stimulera tumör microenvironment, inklusive tumorigenesis, utveckling, och metas35. Dessutom kan patientbaserade xenograftmodeller också studeras med hjälp av vår plattform36.
Det finns några begränsningar att ta itu med i denna studie. Först, även när vi använde metallbasen för stabilisering, kunde vi inte bestämma den mekaniska stress som inducerades på vävnaden av basen och täckglaset, vilket kan påverka blodflödet. Såsom beskrivs i ovanstående siffror betecknades dock intravenös injektion av en fluorescenskonjugerad antikropp (CD31) eller dextran på ett tillfredsställande sätt kärlet utan något urskiljbart icke-perserat område, vilket tyder på en minimal inverkan av mekanisk stress på det normala blodflödet inuti bukspottkörtelvävnaden. För det andra kunde biverkningar på grund av limmet inte bedömas i bukspottskörtelvävnaden. Ändå försökte vi undvika att röra bukspottkörteln med lim så noggrant som möjligt för att undvika ytterligare effekter. För det tredje, som diskuterats ovan, kan den oavsiktliga effekten av bedövningsmedel påverka insulinkänsligheten och utsöndring, som beskrivs i den tidigarestudien 9,27. Enligt vår erfarenhet, en blandning av ketamin och xylazin inducerad hyperglykemi jämfört med blandningen av tiletamine, zolazepam och xylazin. En ytterligare studie som undersöker effekten av anestesi på insulinsekretion bör utföras och korrekt anestesi med minimala biverkningar bör väljas enligt varje experiment. För det fjärde är avbildningen av bukspottkörteln fokuserad på svansdelen, och avbildningen av huvuddelen av bukspottkörteln kan begränsas med vårt fönster.
Sammanfattningsvis underlättades en stabiliserad longitudinell avbildning av bukspottkörteln på cellnivå i upp till flera veckor av vårt bildsystem integrerat med bukspottskörteln intravital imaging fönster optimeras för in vivo bukspottkörtel imaging. Eftersom intravital imaging ger dynamiska insikter i cellbiologi, immunologi och tumörbiologi, kan detta protokoll vara en användbar metod för att undersöka patofysiologin hos olika sjukdomar som involverar bukspottkörteln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag nr 14–2020–002 från SNUBH:s forskningsfond och av det nationella forskningsstiftelse i Korea (NRF) som finansierades av Koreas regering (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window - custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder - custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
References
- Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A.
- Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. Technologies for imaging the normal and diseased pancreas. Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed. Diabetes Care. 31, Suppl 2 165-169 (2008).
- Baetens, D., et al. Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice. Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Ravier, M. A., Rutter, G. A. Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes. Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).
- Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose. Science Reports. 11 (1), 603 (2021).
- Lee, E. M., et al. Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice. Islets. 10 (1), 25-39 (2018).
- Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. In vivo imaging of islet transplantation. Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).
- Mojibian, M., et al. Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R.
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), 1024405 (2015).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Park, I., et al. Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model. Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).
- Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Hwang, Y., et al. In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver. Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas. International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).
- National Institutes of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).
- Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice. Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Cichocki, F., et al. GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity. Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
- Reissaus, C. A., et al. A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).
- Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).
- Bisht, S., Feldmann, G. Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Feig, C., et al.
- Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models. Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).
