Summary
In vivo høyoppløselig bildebehandling av bukspyttkjertelen ble tilrettelagt med bukspyttkjertelen intravital bildebehandling vinduet.
Abstract
Direkte in vivo cellulær oppløsningsavbildning av bukspyttkjertelen i en levende liten dyremodell har vært teknisk utfordrende. En nylig intravital avbildningsstudie, med et abdominal bildevindu, aktivert visualisering av cellulær dynamikk i bukorganer in vivo. På grunn av den myke arklignende arkitekturen til musens bukspyttkjertel som lett kan påvirkes av fysiologisk bevegelse (f.eks. peristaltikk og åndedrett), var det vanskelig å utføre stabiliserte langsgående in vivo-avbildning over flere uker på cellenivå for å identifisere, spore og kvantifisere holmer eller kreftceller i bukspyttkjertelen. Her beskriver vi en metode for implantering av en ny støttebase, et integrert intravitalt bildevindu i bukspyttkjertelen, som kan skille bukspyttkjertelen fra tarmen for langsgående tidsforløp intravital avbildning av bukspyttkjertelens mikrostruktur. Langsgående in vivo-avbildning med bildevinduet muliggjør stabil visualisering, noe som muliggjør sporing av holmer over en periode på 3 uker og høyoppløselig tredimensjonal bildebehandling av mikrostrukturen, som det fremgår her i en ortotopisk kreftmodell i bukspyttkjertelen. Med vår metode kan ytterligere intravitale avbildningsstudier belyse patofysiologien til ulike sykdommer som involverer bukspyttkjertelen på cellenivå.
Introduction
Bukspyttkjertelen er et bukorgan med eksokrine funksjon i fordøyelseskanalen og en endokrine funksjon av utskillende hormoner i blodet. Høyoppløselig cellulær avbildning av bukspyttkjertelen kan avsløre patofysiologien til ulike sykdommer som involverer bukspyttkjertelen, inkludert pankreatitt, kreft i bukspyttkjertelen og diabetes mellitus1. Konvensjonelle diagnostiske bildebehandlingsverktøy som beregnet tomografi, magnetisk oppløsningsavbildning og ultrasonografi er allment tilgjengelig i det kliniske feltet1,2. Imidlertid er disse bildemodalitetene begrenset til å visualisere bare strukturelle eller anatomiske endringer, mens endringer på cellulært eller molekylært nivå ikke kan bestemmes. Gitt at molekylære endringer i diabetes mellitus eller bukspyttkjertelkreft hos mennesker kan initiere mer enn 10 år før diagnosen3,4, har påvisning av bukspyttkjertelsykdommer fra deres molekylære overgang i latent periode potensial til å gi en tidlig diagnose og en rettidig intervensjon. Dermed vil avbildning som vil overvinne oppløsningsbegrensningene og gi verdifull innsikt i funksjonen bemerkelsesverdig få oppmerksomhet ved å gi tidlig diagnose av bukspyttkjertelkreft eller avansert identifisering av endringen av holmene under progresjonen av diabetes mellitus5.
Spesielt med holmer, kjernefysisk avbildning, bioluminescensavbildning og optisk koherenstomografi har blitt foreslått som ikke-invasive holmeavbildningsteknikker6. Imidlertid er oppløsningen av disse metodene betydelig lav, med typiske verdier som spenner fra flere titalls til hundrevis av mikrometer, og tilbyr en begrenset evne til å oppdage endringer på mobilnivå i holmene. På den annen side ble tidligere høyoppløselige studier av holmer utført under ex vivo7,8 (f.eks. kutting eller fordøyelse av bukspyttkjertelen), ikke-fysiologisk9 (f.eks. eksteriørisering av bukspyttkjertelen) og heterotopiske forhold10,11,12 (f.eks. implantasjon under nyrekapselen, inne i leveren og i øyets fremre kammer), som begrenser deres tolkning og kliniske implikasjoner. Hvis in vivo, fysiologiske og ortotopiske modeller av høyoppløselig avbildning kan etableres, vil det være en kritisk plattform for undersøkelse av bukspyttkjertel holmer.
Intravital avbildning, som avslører patofysiologien på et mikroskopisk oppløsningsnivå i et levende dyr, har nylig fått stor oppmerksomhet13. Av in vivo-avbildningsmetodene har utviklingen av et abdominal bildevindu14, som implanterer et vindu inn i magen til en mus, tillatt oppdagelsen av nye funn (dvs. et pre-mikrometastasis stadium av tidlig levermetastase15 og mekanisme for stamcellevedlikehold i tarmepitelet16). Selv om abdominal avbildningsvinduet gir verdifulle resultater, har applikasjonene til dette vinduet for bukspyttkjertelen og den resulterende intravitale bildeforskningen basert på sykdommer som involverer bukspyttkjertelen, ikke blitt grundig undersøkt.
I motsetning til de veldefinerte faste organegenskapene til den menneskelige bukspyttkjertelen, er bukspyttkjertelen til en mus en diffust fordelt bløtvevslignende struktur17. Derfor påvirkes det uopphørlig av fysiologiske bevegelser, inkludert peristaltikk og åndedrett. En tidligere studie om anvendelsen av et abdominal bildevindu for bukspyttkjertelen viste at vandring skjedde på grunn av bevegelsesartefakter indusert av avføring18. Alvorlig uskarphet ble observert i det resulterende gjennomsnittlige bildet, noe som hindret visualisering og identifisering av mikroskalastrukturene.
Her beskriver vi bruken av en ny støttebase integrert bukspyttkjertel intravital bildebehandlingsvindu kombinert med intravital mikroskopi19,20 for å undersøke langsgående cellulære nivå hendelser i sykdommer som involverer bukspyttkjertelen. I tillegg til en detaljert beskrivelse av metodikken i forrige studie18, vil den utvidede anvendelsen av bukspyttkjertelavbildningsvindu for ulike sykdommer som involverer bukspyttkjertelen bli adressert i dette dokumentet. I denne protokollen ble et spesialbygd laserskanningssystem for videohastighet brukt som et intravitalt mikroskopisystem. Fire lasermoduler (bølgelengder ved 405, 488, 561 og 640 nm) ble brukt som eksitasjonskilde, og fire kanaler med utslippssignaler ble oppdaget av fotomultiplierrør (PMT) gjennom bandpassfiltre (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). Laserskanning besto av et roterende polygonalt speil (X-akse) og et galvanometerskanningsspeil (Y-akse) som aktiverte videohastighetsskanning (30 bilder per sekund). Detaljert informasjon om intravital mikroskopi er beskrevet i de tidligere studiene10,18,19,20,21,22,23.
I vår forrige holmestudie18, vi vellykket og stabilt avbildet holmene i levende mus ved hjelp av en transgen musemodell (MIP-GFP)24 der holmene ble merket med GFP. Metoden aktiverte høyoppløselig visualisering av endringene i holmene over en periode på 1 uke. Det forenklet også avbildning av de samme holmene i opptil 3 uker, noe som antyder muligheten for langsiktige studier av bukspyttkjertel holmer for funksjonell sporing eller overvåking under patogenesen av diabetes mellitus18. Videre utviklet vi en ortotopisk kreftmodell i bukspyttkjertelen der fluorescerende kreftceller i bukspyttkjertelen (PANC-1 NucLight Red)25 ble direkte implantert i musens bukspyttkjertel. Med anvendelsen av bukspyttkjertelen intravital avbildningsvindu, kan denne modellen brukes som en plattform for å undersøke cellulær og molekylær patofysiologi i tumormikromiljøet av bukspyttkjertelkreft og for terapeutisk overvåking av nye legemiddelkandidater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer beskrevet i dette dokumentet ble utført i samsvar med den8. utgaven av Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (2011)26 og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST) og Seoul National University Bundang Hospital (SNUBH).
1. Forberedelse av vinduet og andre materialer
- Tilpasset design av vinduet for intravital bildebehandling i bukspyttkjertelen for å skille bukspyttkjertelen fra tarmen i bukhulen18 (Figur 1A, B). En detaljert blåkopi av vinduet er beskrevet i en supplerende figur av en tidligere studie18.
- Bruk C57BL/6N mus, 8-12 uker gamle hanner, til intravital pankreasavbildning. Injiser anti-CD31 antistoff konjugert med en Alexa 647 fluorofor, 2 timer før avbildningen, med det formål å merke kar18.
- For holmestudien, lag en transgen musemodell der holmene er merket med et fluorescerende reporterprotein. Her brukte vi MIP-GFP, hvor grønt fluorescerende protein ble uttrykt under kontroll av musen insulin 1 genpromotor, som er aktiv i betacellene til alle holmer i musen24.
- For kreftstudien i bukspyttkjertelen, lag transgene kreftceller merket med et fluorescerende reporterprotein og BALB / C nakenmus. I denne studien ble PANC-1 NucLight Red-cellene brukt. PANC-1 kreftceller25 ble merket med NucLight Red fluorescerende sonde.
- Steriliser alle kirurgiske verktøy, dekk glass (med PEG eller ikke), og bildevinduer ved hjelp av en autoklave.
- Påfør PEG-belegg på dekkglasset for å forhindre inflammatorisk respons og øke biokompatibiliteten, som er egnet for langvarig avbildning.
2. Kirurgi
- Forbered en steril kirurgisk plattform og steriliser overflatene med 70% etanol.
MERK: For langsgående bildebehandlingsøkter er aseptisk teknikk viktig. - Bedøv mus med en blanding av tiletamin/zolazepam (30 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg).
MERK: Bruk av tiletamin/zolazepam anbefales i stedet for ketamin på grunn av dens negative effekt av hyperglykemi. Optimal anestesi bør velges med det formål å eksperimentere9,27. - Overvåk kroppstemperaturen ved hjelp av en rektal sonde med en homeothermic kontrollert varmepute.
- Barber venstre flanke av musen og påfør tre runder med vekslende alkohol og jodbasert skrubb.
MERK: Hvis depilatorisk krem brukes, må du ikke la det stå lenger enn 1 minutt for å unngå kjemisk brenning. - Lag et snitt på 1,5 cm på venstre flanke av musen og disseker huden og muskelen.
- Utfør en veskestreng sutur med en svart eller nylon 4-0 sutur i snittmarginen.
- Bruk en mikroretraktor på snittet og utsett milten forsiktig.
- Legg forsiktig milten med ring tang og identifiser bukspyttkjertelen.
- Plasser vinduet på flanken av musen og passere milten og bukspyttkjertelen gjennom det åpne rommet i vinduet. Manipulering av bukspyttkjertelen må være veldig hedning, da det kan forårsake blødning eller pankreatitt
- Plasser bukspyttkjertelen forsiktig på platen på bildevinduet; milten vil bli plassert på det åpne rommet i vinduet.
- For kreftcellestudien injiserer du PANC-1 NucLight Red (1,0 x 106 celler) direkte i bukspyttkjertelen.
MERK: For avbildning av de ortotopiske humane bukspyttkjertelen kreft xenografts, direkte implantasjon av kreftcelle som PANC-1 eller andre humane bukspyttkjertel kreftcelle kan lettes28. For å visualisere med intravital fluorescensmikroskopi ble PANC-1-celler transdusert med rødt fluorescerende protein ved hjelp av NucLight Red lentiviral reagens som merker kjernen29. Selv om maksimalt injeksjonsvolum er usikkert, kan du redusere volumet som mulig for å unngå trykkeffekten i bukspyttkjertelen. - Påfør dråper N-butyl cyanoacrylat lim på margen i bildevinduet.
- For å minimere mengden av påført lim, bruk en 31 G kateternål for påføring. Hvis mengden av dråpen er stor, vil vevet utilsiktet holde seg til vinduet eller dekkglasset.
- Påfør forsiktig et 12 mm rundt dekselglass på kanten av bildevinduet.
- Trekk suturløkken for å passe inn i vinduets sidespor og bind den tre ganger.
- Klipp det maksimale proksimale stedet i knuten for å forhindre avbrudd av stramme masker når disse musene er våken.
- La mus komme seg fra anestesi (2-3 timer) og injiser ketoprofen (5 mg / kg, subkutan i løs hud ved foten av nakken eller hoften av dyret) for smertelindring. Revurdering for tegn på smerte hver 12 timer og ketoprofen bør vurderes hver 24 timer i 1-3 dager.
MERK: Analgesi påvirker insulinsekresjon som respons på glukose9. Valget og tidspunktet for analgesi må individualiseres for det eksperimentelle formålet. - Accomodate musen i buret med tilstrekkelig sengetøy for å unngå kontakt av vinduet til buret. Unngå å huse huset med musene uten vinduskirurgi.
3. Intravital avbildning
- Slå på det intravitale mikroskopet, inkludert lasereffekten.
- Slå på varmeputen og sett den homeothermic reguleringen til 37 °C.
MERK: Alternativt kan du bruke en passiv varmepute eller lampe med hyppig kontroll hvis det ikke er noen homeothermic regulering. - Utfør intramuskulær anestesi med en blanding av tiletamin/zolazepam (30 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg).
MERK: Bruk av tiletamin/zolazepam anbefales i stedet for ketamin på grunn av dens negative effekt av hyperglykemi. Optimal anestesi bør velges med det formål å eksperimentere9,27. - Sett inn et vaskulært kateter til injeksjonen.
- Påfør trykk på den proksimale siden av halen med indeksen og tredje finger som et alternativ til en tourniquet-applikasjon. Varm halen med en lampe om nødvendig.
- Steriliser halevenen med en 70% etanolspray.
- Sett inn et 30 G kateter i sidehalevenen. Oppblåsthet av blod vil bli visualisert i PE10-røret.
- Påfør et silkebånd på kateteret for å stabilisere det.
- Injiser FITC/TMR dextran eller andre fluorescerende sonder (25 μg anti-CD31 konjugert med Alexa 647), etter behov, i henhold til kombinasjonen av fluorescerende sonder18.
MERK: For fluorescerende konjugerte antistoffprober, injiser 2 timer før bildebehandlingsøkten.
- Overfør musen fra den kirurgiske plattformen til bildestadiet.
- Sett inn en rektal sonde for automatisk å kontrollere kroppstemperaturen med det homeothermic varmeputesystemet.
- Sett vinduet for bukspyttkjertelavbildning inn i vindusholderen som ble klargjort under det intravitale mikroskopioppsettet (Figur 2). For et invertert mikroskop kan det hende at det ikke er nødvendig med en vindusholder.
- Utfør intravital avbildning.
- For avbildning av bukspyttkjertelen, start med en objektiv linse med lav forstørrelse (f.eks. 4x) for skanning av hele visningen av bukspyttkjertelen i vinduet for bukspyttkjertelavbildning (anbefalt synsfelt: 2500 x 2500 μm).
- Etter fastsettelse av interesseområdet, bytt til objektiv linse med høyere forstørrelse (20x eller 40x) for å utføre bildebehandling på cellenivå (anbefalt synsfelt: 500 x 500 μm eller 250 x 250 μm). I dette eksperimentet var den laterale og aksiale oppløsningen henholdsvis ca. 0,5 μm og 3 μm.
- Utfør z-stack- eller tidsforløpavbildning for å observere 3D-strukturen eller dynamikken på cellenivå, for eksempel cellemigrering.
MERK: For avbildning av det fluorescerende proteinet som uttrykker celler av transgene dyr (MIP-GFP), var 30 s periodisk 488 nm lasereksponering med effekt opptil 0,43 mW tolererbar uten merkbar fotobleking eller vevsskade. For avbildning av fluorescerende proteiner merket med Alexa 647, var 640 nm laserkraft opp til 0,17 mW tolererbar uten merkbar fotobleking eller vevsskade. Langvarig eksitasjonslasereksponering med en effekt over denne innstillingen kan føre til fotobleaching eller vevsskade ved fototoksisitet. Juster tilstrekkelig forsterkning og kraft for å avbilde interesseområdet på riktig måte. Detaljert innstilling av parametere i intravital mikroskopi må individualiseres for hver intravital mikroskopi utarbeidet i instituttet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intravital mikroskopi kombinert med støttebasen integrert pankreas intravital bildebehandling vindu muliggjør langsgående cellulær nivå bildebehandling av bukspyttkjertelen i en mus. Denne protokollen med pankreas intravital bildebehandlingsvindu gir langsiktig vevsstabilitet som gjør det mulig å anskaffe høyoppløselig avbildning for å spore individuelle holmer i opptil 3 uker. Som et resultat kan mosaikkavbildning for et utvidet synsfelt, tredimensjonal (3D) rekonstruksjon av z-stack-avbildning og langsgående sporing av samme posisjon oppnås. I tillegg gir vår intravitale mikroskopi fire kanaler (405, 488, 561 og 647 nm) oppkjøp, noe som muliggjør samtidig multippel cellevisualisering med deres interaksjoner.
For den foreløpige avbildningen ble vinduet implantert i en C57BL/6N-mus med intravenøst injisert anti-CD31 antistoff konjugert med en Alexa 647 fluorofor. Bredbilde (figur 3A) og forstørret 3D-bildebehandling (Figur 3B-D, Tilleggsvideo 1) i bukspyttkjertelen ble tilrettelagt med dette systemet. Bukspyttkjertelvev ble visualisert med autofluorescence, og den tilstøtende vaskulaturen merket med anti-CD31 antistoffet ble identifisert. Oscillasjon på grunn av enten peristaltikk eller åndedrett ble ikke identifisert, noe som resulterte i gjennomsnittlig avbildning med høyt signal-til-støy-forhold (figur 4). Acinarceller, som krever visualisering med mikroskalaoppløsning i bukspyttkjertelen, ble tydelig visualisert i de gjennomsnittlige bildene.
For avbildning av holmene ble det brukt en MIP-GFP-mus. Ved hjelp av mosaikkavbildningsmetoden aktiverte en bredfeltvisning med høyoppløselig bildebehandling visualiseringen av holmene med den tilstøtende vaskulaturen (figur 5). Omtrent 40-50 holmer ble identifisert i vidfeltvisningen. Denne stabile bildemetoden kan ytterligere lette sporingen av holmene i opptil 3 uker, som vist i en tidligere studie (figur 6)18.
For kreftcelleavbildningen ble PANC-1 NucLight Red-celler direkte implantert i bukspyttkjertelen under operasjonen (figur 7). En strategi for dobbeltmerking ble brukt, bestående av PANC-1 NucLight Red-celler og nærliggende fartøy farget med anti-CD31 konjugert med Alexa 647. Med vår protokoll ble det oppnådd bredfeltavbildning av kreft i bukspyttkjertelen (figur 7A), som avgrenser tumormarginen og høyoppløselig 3D-avbildning på enkeltcellenivå (Figur 7B-D, Tilleggsvideo 2).
Figur 1: Design og fotografi av vinduet for intravital bildebehandling i bukspyttkjertelen. (A) En 3D- og tverrsnittsvisning av vinduet for intravital bildebehandling i bukspyttkjertelen. En detaljert blåkopi av størrelse og diameter er beskrevet i forrige papir18. (B) Fremre og bakre fotografi av bildevinduet i bukspyttkjertelen. Copyright 2020 Koreansk Diabetes Association fra Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Gjengitt med tillatelse fra The Korean Diabetes Association. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fotografi av implementeringen av vinduet for intravital bildebehandling i bukspyttkjertelen. Et intravitalt bildevindu i bukspyttkjertelen implanteres i musen i XYZ-translasjonsfasen, og bildekammerholderen som er festet til vippebraketten, er koblet til vinduet for pankreasavbildning. Copyright 2020 Koreansk Diabetes Association fra Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Gjengitt med tillatelse fra The Korean Diabetes Association. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representativ intravital bukspyttkjertelavbildning i C57BL/6N-mus. (A) Bilde i bredt område og (B) forstørret 3D-bilde av bukspyttkjertelen (grønn) og mikrovaskulaturen (rød) i C57BL/6N-musen. Fartøy er merket med et anti-CD31 antistoff konjugert med Alexa 647 fluorofor. (C) 3D rekonstruert bilde og (D) overflategjengivelsesbilde av musepankreasen. Skalastang: 200 μm (A) og 50 μm (B-D). Se også Tilleggsvideo 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Intravital avbildning av acinarcelle og tilstøtende vaskulatur. Acinarceller (grønn) og tilstøtende vaskulatur (rød) i C57BL/6N-musen. Fartøy er merket med Anti-CD31 antistoff konjugert med Alexa 647 fluorofor. Vevsstabilitet oppnådd med bildevinduet i bukspyttkjertelen gir et bilde med høyt signal-til-støy-forhold. Skalalinje: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representativ intravital avbildning av bukspyttkjertel holmer i MIP-GFP-musen. Bred mosaikk og forstørret bilde av holmene (grønn) og tilstøtende vaskulatur (rød) behandlet med maksimal intensitet projeksjonsmetode i bukspyttkjertelen til MIP-GFP-musen. Fartøy er merket med et anti-CD31 antistoff konjugert med Alexa 647 fluorofor. Skalastang: 500 μm (bredt område) og 50 μm (forstørret). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Langsgående intravital avbildning av holmer i bukspyttkjertelen til MIP-GFP-musen. Langsgående bilde av holmene i opptil 3 uker i bukspyttkjertelen i MIP-GFP-musen. Hver pilspiss med forskjellige farger angir de samme holmene. Skala bar: 100 μm. Copyright 2020 Koreansk Diabetes Association fra Diabetes Metab J. 2020 44:1:193-198. Gjengitt med tillatelse fra The Korean Diabetes Association. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Representativ intravital avbildning av kreftmodellen i bukspyttkjertelen. (A) Bilde i bredt område og (B) forstørret 3D-bilde av de implanterte PANC-1 NucLight Røde cellene (rød) i BALB/c Nakenmusen. Kar (blå) er merket med et anti-CD31 antistoff konjugert med Alexa 647 fluorofor. (C) 3D rekonstruert bilde og (D) overflategjengivelse bilde av bukspyttkjertelen kreft i musemodellen. Skalastang: 500 μm (A) og 50 μm (B-D). Se også Tilleggsvideo 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsvideo 1: In vivo 3D pankreasavbildning i C57BL/6N-mus. In vivo 3D-avbildning av bukspyttkjertelen (grønn) av C57BL/6N-mus intravenøst injisert med et anti-CD31 antistoff konjugert med Alexa 647 fluorofor (rød). Skalalinjen er avbildet i videoen. Denne videoen tilsvarer figur 3C,D. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Supplerende video 2: In vivo 3D kreft i bukspyttkjertelen (PANC-1 NucLight Red) bildebehandling i BALB / C Naken mus. In vivo 3D-avbildning av kreft i bukspyttkjertelen (rød) implantert i BALB/C Naken mus intravenøst injisert med et anti-CD31 antistoff konjugert med Alexa 647 fluorofor (blå). Skalalinjen er avbildet i videoen. Denne videoen tilsvarer figur 7C,D. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som er beskrevet her består av intravital avbildning av bukspyttkjertelen ved hjelp av en ny støttebase integrert bukspyttkjertel intravital bildebehandling vindu modifisert fra et abdominal bildevindu. Blant protokollene beskrevet ovenfor er det første kritiske trinnet implantasjonen av det intravitale bukspyttkjertelavbildningsvinduet i musen. For påføring av limet i vinduet er det viktig å bruke limet mellom vinduets margin og dekkglasset, men ikke på bukspyttkjertelen vev, da det kan forstyrre intravital avbildning betydelig. Ikke bare limet selv mellom glass og vev, men også adjunkt støvpartikler kan indusere lysspredning under avbildning hvis limet påføres direkte på vevet. I tillegg kan påføringen av limet ha giftige og ikke-fysiologiske effekter på bukspyttkjertelen.
Det andre trinnet er mengden bukspyttkjertelvev plassert på metallstøttende baseplate. Fordi bukspyttkjertelvevet er en arklignende struktur, må volumet av bukspyttkjertelvev på platen kontrolleres. Hvis for stort volum er plassert på platen, kan limet som påføres ringens margin holde seg til vevet, og masseeffekten kan hemme perfusjonen av bukspyttkjertelen. På den annen side, hvis for lite et volum er plassert der, kan synsfeltet som kan visualiseres være begrenset. Denne operasjonsprotokollen på vinduet kan kreve flere forsøk for å oppfylle en konsekvent standard.
For langtidsavbildning over en periode på 3 uker var det mest bekymringsfulle problemet potensiell skade på vinduet for bukspyttkjertelavbildning. Utilsiktet ødeleggelse av dekkglasset i bukspyttkjertelens bildevindu kan oppstå i løpet av den langsiktige observasjonsperioden. For å forhindre dette må musen med vinduet plasseres separat, og harde gjenstander med skarpe kanter skal fjernes fra buret. Musens eutanasi bør vurderes hvis dekselglasset bryter, hvis det er de alvorlige tegn på betennelse nær vinduet, eller hvis dyret ser ut til å være i nød. Etter vår erfaring var mus med bukspyttkjertelavbildningsvinduet i stand til å spise og trene normalt når utvinningen etter operasjonen var hensiktsmessig og ingen annen komplikasjon ble utviklet.
I vår tidligere erfaring med abdominal bildebehandling vinduet, klarte vi ikke å skaffe seg høy kvalitet cellulær nivå bildebehandling samt langsgående sporing av de samme stedene over flere dager. Sammenlignet med abdominal avbildningsvinduet, som gir en mangfoldig plattform for ulike bukorganer, er bukspyttkjertelavbildningsvinduet ytterligere spesifisert for avbildning av bukspyttkjertelen så vel som andre organer som er myke og lett påvirket av bevegelser som mesenteri, milt og liten tarm. Leveren og nyrene kan imidlertid være umulige i vinduet for bukspyttkjertelavbildning på grunn av den begrensede plassen.
Mens kombinasjonen av en fluorescerende mus,celler og antistoff sonder muliggjør visualisering av dynamiske interaksjoner mellom endotelceller og enten holmer eller kreftceller, protokollen beskrevet her kan reproduseres med andre sammensetninger av fluorescerende merkede celler eller molekylære sonder egnet for hver respektive tilstand. Videre forventes ekspansive applikasjoner integrert med vår metode, for eksempel CpepSfGFP reportermus med insulinsekresjon9,30, AAV8-mediert genlevering rettet mot reaktive oksygenarter (ROS)31, eller ortotopisk tumormodell32,33,34 der svulsten in situ fullt ut kan stimulere tumormikromiljøet, inkludert tumorigenesis, utvikling og metastase3. Videre kan pasientavledede xenograftmodeller også studeres ved hjelp av vår plattform36.
Det er noen begrensninger som må tas opp i denne studien. For det første, selv når vi brukte metallbasen til stabilisering, klarte vi ikke å bestemme det mekaniske stresset som ble indusert på vevet av basen og dekkglasset, noe som kunne påvirke blodstrømmen. Men som avbildet i figurene ovenfor, intravenøs injeksjon av et fluorescenskonjugert antistoff (CD31) eller dextran tilstrekkelig merket fartøyet uten skille ikke-perfundert område, noe som tyder på en minimal innvirkning av mekanisk stress på den normale blodstrømmen inne i bukspyttkjertelen vev. For det andre kunne bivirkninger på grunn av limet ikke vurderes i bukspyttkjertelen. Likevel forsøkte vi å unngå å berøre bukspyttkjertelen med lim så nøye som mulig for å unngå ytterligere effekter. For det tredje, som beskrevet ovenfor, kan den utilsiktede effekten av bedøvelsesmidler påvirke insulinfølsomhet og sekresjon, som beskrevet i forrige studie9,27. Vår erfaring er at en blanding av ketamin og xylazin indusert hyperglykemi sammenlignet med blandingen av tiletamin, zolazepam og xylazin. En videre studie som undersøker effekten av anestesi på insulinsekresjon bør utføres, og riktig anestesi med minimale bivirkninger bør velges i henhold til hvert eksperiment. For det fjerde er bildebehandling av bukspyttkjertelen fokusert på haledelen, og bildebehandling av hodedelen av bukspyttkjertelen kan begrenses med vinduet vårt.
Oppsummert ble en stabilisert langsgående bildebehandling av bukspyttkjertelen på cellenivå i opptil flere uker tilrettelagt av bildesystemet vårt integrert med det pankreatiske intravitale bildevinduet optimalisert for in vivo bukspyttkjertelavbildning. Fordi intravital avbildning gir dynamisk innsikt i cellebiologi, immunologi og tumorbiologi, kan denne protokollen være en nyttig metode for å undersøke patofysiologien til ulike sykdommer som involverer bukspyttkjertelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av grant No. 14-2020-002 fra SNUBH Research Fund og av National Research Foundation of Korea (NRF) stipend finansiert av Korea regjeringen (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters) | Invitrogen | A20006 | Fluorescent probe for conjugate with antibody |
| BALB/C Nude | OrientBio | BALB/C Nude | BALB/C Nude |
| BD Intramedic polyethylene tubing | BD Biosciences | 427401 | PE10 catheter for connection with needle |
| C57BL/6N | OrientBio | C57BL/6N | C57BL/6N |
| Cover glasses circular | Marienfeld | 0111520 | Cover glass for pancreatic imaging window |
| FITC Dextran 2MDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | FD200S | For vessel identification |
| IMARIS 8.1 | Bitplane | IMARIS | Image processing |
| Intravital Microscopy | IVIM tech | IVM-C | Intravital Microscopy |
| IRIS Scissor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | S-1107-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Loctite 401 | Henkel | 401 | N-butyl cyanoacrylate glue |
| Micro Needle holder | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | H-1126-10 | This product can be replaced with the product from other company |
| Micro rectractor | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | 17004-03 | This product can be replaced with the product from other company |
| Microforceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1034 | This product can be replaced with the product from other company |
| MIP-GFP | The Jackson Laboratory | 006864 | B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J |
| Nylon 4-0 | AILEE | NB434 | Non-Absorbable Suture |
| Omnican N 100 30G | B BRAUN | FT9172220S | For Vascular Catheter, Use only Needle part |
| PANC-1 NucLightRed | Custom-made | Custom-made | Made in laboratory |
| Pancreatic imaging window | Geumto Engineering | Custom order | Pancreatic imaging window - custom order |
| Physiosuite | Kent Scientific | PS-02 | Homeothermic temperature controller |
| Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 553708 | Antibody for in vivo vessel labeling |
| Ring Forceps | JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD | F-1090-3 | This product can be replaced with the product from other company |
| Rompun | Bayer | Rompun | Anesthetic agent |
| TMR Dextran 65-85kDa | Merck (Former Sigma Aldrich) | T1162 | For vessel identification |
| Window holder | Geumto Engineering | Custom order | Window holder - custom order |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 100 | Anesthetic agent |
References
- Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A.
- Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. Technologies for imaging the normal and diseased pancreas. Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed. Diabetes Care. 31, Suppl 2 165-169 (2008).
- Baetens, D., et al. Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice. Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Ravier, M. A., Rutter, G. A. Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes. Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).
- Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose. Science Reports. 11 (1), 603 (2021).
- Lee, E. M., et al. Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice. Islets. 10 (1), 25-39 (2018).
- Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. In vivo imaging of islet transplantation. Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).
- Mojibian, M., et al. Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R.
- Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), 1024405 (2015).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Park, I., et al. Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury. The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786 (2019).
- Park, I., et al. Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model. Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).
- Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy. Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).
- Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
- Hwang, Y., et al. In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver. Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas. International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).
- National Institutes of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).
- Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice. Physiological Reports. 4 (11), 12824 (2016).
- Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).
- Cichocki, F., et al. GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity. Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).
- Zhu, S., et al. Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).
- Reissaus, C. A., et al. A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Science Reports. 9 (1), 8449 (2019).
- Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma. Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).
- Bisht, S., Feldmann, G. Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Feig, C., et al.
- Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models. Cancers (Basel). 12 (5), 1327 (2020).
