Summary
Haemophilus influenzae induceert ontsteking in de luchtwegen. Dit artikel zal zich richten op het gebruik van flowcytometrie en confocale microscopie om immuunresponsen door fagocyten en lymfocyten als reactie op deze bacterie te definiëren.
Abstract
Haemophilus influenzae (Hi) is een veel voorkomende bacterie die voorkomt in een reeks ademhalingsaandoeningen. Een verscheidenheid aan verschillende testen / technieken kan worden gebruikt om de respiratoire immuun / ontstekingsreactie op deze bacterie te beoordelen. Flowcytometrie en confocale microscopie zijn op fluorescentie gebaseerde technologieën die gedetailleerde karakterisering van biologische reacties mogelijk maken. Verschillende vormen van Hi-antigeen kunnen worden gebruikt, waaronder celwandcomponenten, gedode / geïnactiveerde preparaten en levende bacteriën. Hi is een kieskeurige bacterie die verrijkte media vereist, maar over het algemeen gemakkelijk te kweken is in standaard laboratoriumomgevingen. Weefselmonsters voor stimulatie met Hi kunnen worden verkregen uit perifeer bloed, bronchoscopie of gereseceerde long (bijvoorbeeld bij patiënten die een operatie ondergaan voor de behandeling van longkanker). Macrofaag en neutrofiele functie kunnen uitgebreid worden beoordeeld met behulp van flowcytometrie met een verscheidenheid aan gemeten parameters, waaronder fagocytose, reactieve zuurstofsoorten en intracellulaire cytokineproductie. De lymfocytenfunctie (bijv. T-cel- en NK-celfunctie) kan specifiek worden beoordeeld met behulp van flowcytometrie, voornamelijk voor intracellulaire cytokineproductie. Hi-infectie is een krachtige inductor van extracellulaire valproductie, zowel door neutrofielen (NET's) als macrofagen (METs). Confocale microscopie is misschien wel de meest optimale manier om NET- en MET-expressie te beoordelen, die ook kan worden gebruikt om protease-activiteit te beoordelen. De longimmuniteit tegen Haemophilus influenzae kan worden beoordeeld met behulp van flowcytometrie en confocale microscopie.
Introduction
Haemophilus influenzae (Hi) is een normale commensale bacterie die aanwezig is in de keelholte van de meeste gezonde volwassenen. Hi kan een polysaccharidecapsule hebben (types A-F, bijvoorbeeld type B of HiB) of geen capsule hebben en niet-typebaar zijn (NTHi)1. Kolonisatie van het slijmvlies met deze bacterie begint in de vroege kindertijd en er is een omzet van verschillende koloniserende stammen2. Deze bacterie is ook in staat tot invasie van zowel de bovenste als de onderste luchtwegen; in deze context kan het activering van de immuunrespons en ontsteking induceren 3,4. Deze ontstekingsreactie kan klinische ziekten veroorzaken en bijdragen aan een verscheidenheid aan belangrijke ademhalingsaandoeningen, waaronder sinusitis, otitis media, bronchitis, cystische fibrose, longontsteking en chronische obstructieve longziekte (COPD). De meeste van deze aandoeningen zijn te wijten aan NTHi-stammen2. Dit artikel beschrijft methoden om respiratoire immuunresponsen op Hi te beoordelen met behulp van flowcytometrie en confocale microscopie.
De hieronder beschreven methoden zijn aangepast aan gevestigde technieken die zijn aangepast om de ontstekingsreactie op Hi te beoordelen. De selectie van een geschikte antigene vorm van Hi is een belangrijk onderdeel van deze beoordeling. Antigene preparaten variëren van celwandcomponenten tot levende bacteriën. Om assays vast te stellen en te standaardiseren, kan het gebruik van perifere bloedmonsters in eerste instantie zeer nuttig zijn.
Flowcytometrie maakt het mogelijk om een verscheidenheid aan parameters en functionele testen van één monster op cellulair niveau te meten. Deze techniek heeft het voordeel dat specifieke cellulaire responsen (bijv. productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) of intracellulaire cytokineproductie) kunnen worden beoordeeld in vergelijking met andere meer algemene methoden zoals enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of ELISspot.
Extracellulaire vallen worden tot expressie gebracht door neutrofielen (NET's)5,6,7 en door andere cellen zoals macrofagen (METs)8. Ze worden steeds meer erkend als een belangrijke ontstekingsreactie, met name bij infectie in de long9. Ze kunnen worden beoordeeld met confocale fluorescentiemicroscopie. Deze techniek maakt definitieve identificatie van NET's/METs mogelijk en onderscheidt hun expressie van andere vormen van celdood6.
Zowel flowcytometrie als confocale microscopie zijn op fluorescentie gebaseerde assays. Hun succes is afhankelijk van optimale overbelastingsprotocollen van biologische monsters. Deze methoden hebben enige tijd nodig om te leren en vereisen de juiste toezichthoudende expertise. De betrokken instrumenten zijn ook duur, zowel in aanschaf als in gebruik. De optimale setting voor hun gebruik omvat grote universiteiten en tertiaire verwijzingsziekenhuizen.
De methoden die in dit protocol worden gebruikt, zijn overdraagbaar voor de studie van andere vergelijkbare organismen die betrokken zijn bij luchtwegaandoeningen (bijv. Moxarella catarrhalis en Streptococcus pneumoniae). NTHi interageert ook met andere veel voorkomende respiratoire bacteriën10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit werk werd goedgekeurd door de ethische commissie voor menselijk onderzoek van Monash Health. Het protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek.
1. Antigeen preparaat
OPMERKING: Drie verschillende antigene preparaten kunnen worden gebruikt om de immuunrespons op Hi te beoordelen. Dit zijn 1) een subcellulaire component (meestal van de bacteriële celwand); 2) gedode en geïnactiveerde bacteriën; en 3) levende bacteriën. Bepaal het gebruik van elk antigeen preparaat voorafgaand aan de start van experimenten.
- Subcellulaire componenten
- Verkrijg subcellulaire componenten uit bronnen, waaronder commerciële preparaten, in eigen huis ontwikkelde componenten en/of van andere onderzoekers.
OPMERKING: Subcellulaire componenten meestal uit de bacteriële celwand kunnen worden gebruikt en omvatten buitenmembraaneiwitten zoals P6 en lipooligosaccharide (LOS)11,12. Deze subcellulaire componenten worden meestal afgeleid in gespecialiseerde centra. De beschrijving van hoe ze worden gemaakt valt buiten het bestek van dit artikel. Direct contact met experts op dit gebied wordt aanbevolen om deze componenten te verkrijgen.
- Verkrijg subcellulaire componenten uit bronnen, waaronder commerciële preparaten, in eigen huis ontwikkelde componenten en/of van andere onderzoekers.
- Gedode/geïnactiveerde bacteriën
- Verkrijg de bacteriën uit het juiste monster (bijv. sputum of bronchoscopie). Bevestig de stam als H. influenzae met behulp van een geschikt microbiologisch laboratorium. Voer typering van de H. influenzae-monsters uit om te bevestigen dat ze niet-typeerbaar zijn (door een gespecialiseerd microbiologisch laboratorium).
- Om een representatief antigeen te verkrijgen, gebruikt u meerdere NTHi-stammen (ten minste 5, elk van ongeveer dezelfde hoeveelheid) om een gepoold antigeen te maken. Bewaar de stammen bij -70 °C in glycerolbouillon in microcentrifugebuizen.
OPMERKING: In dit experiment werden tien verschillende stammen gebruikt. - Ontdooi de stammen (één microcentrifugebuis per keer) op chocolade-agarplaten en groei 's nachts in een incubator van 37 °C met 5% CO2. Voeg de bacteriën toe aan 500 μL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en was ze twee keer (draai op 300 x g gedurende 5 minuten). Gebruik een MacFarland standaard10 of een spectrofotometer13 om NTHi te aliquoteren tot een concentratie van 108 ml (met behulp van een 5 ml container of gelijkwaardig).
- Warmte inactiveer de bacteriën door ze gedurende 10 minuten in een waterbad bij een temperatuur van 56 °C te plaatsen.
- Soniceer de bacteriën met behulp van een continue ultrasoonapparaatinstelling op een lage tot gemiddelde snelheid gedurende 30 s.
- Voer het juiste volume monsters uit in microcentrifugebuizen. Gebruik voor een monster van 108 ml aliquots van 50 μL (d.w.z. 20 monsters per ml), vries ze in bij -70 °C totdat ze nodigzijn 14.
- Levende bacteriën
- Karakteriseer eerst levende bacteriën zoals vermeld in stap 1.2.1. Gebruik één goed gekarakteriseerde stam. Zorg ervoor dat de stam ook als reserve wordt bewaard in glycerolbouillon bij -70 °C.
- Kweek de bacteriën op verrijkte media zoals chocolade agar borden of in bouillon.
- Om chocolade agar borden te gebruiken, verspreid de bacteriën minimaal elke 3-4 dagen met steriele spreaders.
- Als alternatief, gebruik Brain Heart Infusion (BHI) bouillon verrijkt met de factoren X (hemine) en V (β-nicotinamide adenine dinucleotide) om de bacteriën te laten groeien. Ent NTHi van nachtplaten in 5-10 ml BHI-bouillon aangevuld met zowel hemine als β-nicotinamide adenine dinucleotide (beide 10 μg / ml) en kweek 's nachts bij 37 ° C in een 5% CO2-incubator .
OPMERKING: Dit heeft het voordeel van reproduceerbaarheid, hogere kolonievormende eenheden (CFU) tellingen en alle bacteriën bevinden zich in een vergelijkbare fase van loggroei (op platen kan de bacteriële levensvatbaarheid groter zijn, afhankelijk van de positie in de cultuur)13,15.
- Gebruik een veelvoud aan infecties (MOI) van 100 bacteriën naar één cel om een sterke immuunrespons op te wekken met behoud van cellulaire levensvatbaarheid. Gebruik MacFarland Standard10 of spectrofotometer13 om het aantal bacteriën te beoordelen.
- Zorg ervoor dat de media die worden gebruikt voor levende NTHi-testen vrij zijn van menselijk serum, omdat dit de bacteriën zal doden16. Dierlijke serummonsters (bijv. Foetaal kalfsserum) veroorzaken over het algemeen geen problemen.
OPMERKING: Gebruik de hieronder beschreven methoden om standaard weefselmonsters te analyseren, zoals perifeer bloed, bronchoscopiemonsters (met name bronchoalveolaire lavage (BAL)) en gereseceerd longweefsel. Incubeer de monsters met Hi-antigeen van 10 min tot 24 uur of meer.
2. Beoordeling van de fagocytische functie door middel van flowcytometrie
OPMERKING: Deze test vereist cellen in oplossing en wordt meestal gedaan in volbloed of met BAL-vloeistof. Deze test is aangepast op basis van een eerder gepubliceerd protocol op basis van het gebruik van geïnactiveerd Staphylococcus aureus-preparaat en Pansorbine17. Geïnactiveerd volbloed en gefixeerd H. influenzae wordt vervangen door pansorbine17.
- Meng gedode, geïnactiveerde NTHi (1,2) met propidiumjodide (PI) bij 100 μg/ml in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) in een verhouding van 1:1 gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer bij 450 x g gedurende 5 minuten en was vervolgens in 500 μL PBS. Draai gedurende 5 minuten bij 450 x g en resuspenseer de pellet in 500 μL PBS.
- Incubeer 450 μL perifeer bloed (uit venepunctuur van een menselijke proefpersoon) met 50 μL geïnactiveerde PI met het label H. influenzae gedurende 20 minuten in een waterbad bij 37 °C in een buis van 5 ml.
- Verwijder de monsters uit het waterbad en voeg 5 μL dihydrorhodamine-1,2,3 (DHR) toe. Vortex gedurende 10 s en plaats het vervolgens terug in het waterbad voor nog eens 10 minuten.
- Verwijder de monsters uit het waterbad en laat de erytrocyten (500 μL volume zoals hierboven vermeld in stap 2.2) lyseren met 10:1 (d.w.z. 5 ml) ammoniumchloride (150 mM NH4Cl, 1 mM NaHCO3 en 0,1 mM EDTA) oplossing.
OPMERKING: Als alternatief kan een geautomatiseerd systeem zoals Q-prep worden gebruikt. - Analyseer de monsters binnen een uur op een flowcytometer. Analyseer minimaal 3.000-5.000 cellen (uit elke subset van belang) uit elk monster om representatieve resultaten te verkrijgen (figuur 1).
- Om de monsters op fagocytose te analyseren, bepaalt u het aandeel cellen dat gelabelde bacteriën heeft ingenomen (meet het aandeel cellen met de fluorescerende kleuring).
- Kwantificeer de ROS door de oxidatie van DHR, wat resulteert in een fluorescerend signaal (de verschuiving in mediane fluorescentie wordt vergeleken tussen baseline en gestimuleerde monsters).
OPMERKING: Neutrofielen zijn meer korrelig en hebben meer zijverstrooiing, terwijl macrofagen groter zijn en meer voorwaartse verstrooiing hebben. - Onderscheid de neutrofielen en macrofagen morfologisch van elkaar door hun grootte (macrofagen zijn groter) en granulariteit (neutrofielen zijn meer granulair).
OPMERKING: Specifieke markers voor neutrofielen en macrofagen worden over het algemeen niet gebruikt, hoewel CD14 kan worden gebruikt om bloedmonocyten te labelen. Flowcytometrie kan mogelijk worden gebruikt om onderscheid te maken tussen verschillende functionele vormen van monocyten en macrofagen (bv. M1- en M2-subgroepen)18.
- Pas de test indien nodig aan (gebruik bijvoorbeeld levende niet-gelabelde NTHi om fagocyten te stimuleren en meet de ROS-expressie door DHR-splitsing).
- Isoleer perifere bloedmononucleaire cellen door dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Leg het bloed over het aangewezen polymeer voor dichtheidsgradiëntcentrifugatie en draai gedurende 30 minuten op 2300 x g . Verwijder de mononucleaire laag met een pipet, was deze tweemaal met PBS en resuspendeer de cellen in PBS met 106 cellen per ml.
- Als alternatief kunt u BAL-macrofagen gebruiken.
- Suspensie van de monocyten/macrofagen in een concentratie van 106 cellen/ml in het kweekmedium (RPMI). Infecteer ze met levende NTHi bij een MOI van 100:1 gedurende 1 uur zoals beschreven in stap 1.3.
- Voeg DHR toe aan de suspensie zoals beschreven in stap 2.3 gedurende 10 minuten. Voer de analyse voor ROS uit met behulp van flowcytometrie.
3. Beoordeling van de lymfocytenfunctie in perifeer bloed
- Gebruik volbloed- of mononucleaire celpreparaten voor flowcytometrietests14.
- Verkrijg monsters van elk onderwerp door venepunctie. Verzamel 4 ml bloed uit een perifere ader in een lithiumheparinebuis en verdeel de monsters in aliquots voor controle en antigeenstimulatie.
- Voeg costimulatoire antilichamen (anti-CD28 en CD49d, 1 μL/ml) toe aan beide monsters. Voeg NTHi toe aan het antigeenmonster en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2 . Voeg voor het gedode NTHi-preparaat 200 μL van het antigeen toe aan 2 ml bloed. Voeg voor levende NTHi levende NTHi-cellen met een MOI van 100:1 toe aan de witte bloedcellen (zoals gemeten door de hemocytometer).
- Voeg het Golgi-blokkerende middel Brefeldin A (10 μL/ml) toe aan de monsters en incubeer ze nog eens 5 uur.
OPMERKING: Het blokkeren van het Golgi-apparaat voorkomt dat de cytokines buiten de cel worden geëxporteerd. - Als volbloed wordt gebruikt, lyseer de erytrocyten met 0,8% ammoniumchloride (stap 2.4) om alleen leukocyten in oplossing achter te laten. Fixeer de leukocyten met 500 μL 1% -2% paraformaldehyde gedurende 1 uur.
- Tel de cellen met hemocytometer, permeabiliseer 106 cellen met 100 μL 0,1% saponine gedurende 15 minuten en incubeer de cellen met fluorescerend gelabelde antilichamen. Was de cellen en analyseer ze met behulp van een flowcytometer.
OPMERKING: De hoeveelheid fluorescerende antilichamen is specifiek voor elk cytokine. Volg de instructies van de fabrikant. Doorgaans worden 106 cellen in 100 μL oplossing gedurende 1 uur gekleurd. De meeste commercieel verkregen antilichamen zijn voldoende om 25-100 tests uit te voeren. - Bepaal het aandeel antigeenresponserende cellen door de relevante lymfocytenpopulatie te gaten (cellen worden afgesloten door CD45, vervolgens door CD3 en later door CD4- of CD8-expressie), zoals weergegeven in figuur 2. Voer achtergrondkleuring uit op niet-gestimuleerde cellen voor alle cytokines die moeten worden geanalyseerd. Screen 100.000 cellen om elk cytokine te analyseren op zowel gestimuleerde cellen als controle.
4. Beoordeling van de lymfocytenfunctie/ontstekingsmediatoren in longweefsel
- Het is meestal niet mogelijk om voldoende lymfocyten te verkrijgen van bronchoscopie; gebruik daarom het longweefsel van lobectomiemonsters. De optimalisatie van longweefselmonsters vereist nauwe samenwerking met de anatomische pathologiedienst. Zorg ervoor dat het weefsel een marge van ten minste 3 cm van de tumor heeft en het cellulaire weefsel is zonder significant emfyseem (zoals bepaald door de patholoog).
- Breek het longweefsel in een cellulaire suspensie voordat het kan worden gebruikt voor flowcytometrietests. Verteer het longweefsel chemisch (bijvoorbeeld met collagenase) of splits het mechanisch uit.
OPMERKING: De mechanische uitsplitsing van weefsel kan de voorkeur krijgen, omdat dit gepaard gaat met een betere oppervlaktekleuring van cellen (bijv. CD3/4-etikettering)19.- Verkrijg lobectomiemonsters van een patholoog (meestal verkregen van patiënten die een behandeling van longkanker ondergaan). Snijd ongeveer 20-40 g van het monster in 3-5 mm3 secties. Plaats ze in een steriele kamer van 50 μL voordat ze mechanisch worden gefragmenteerd met behulp van een geschikte desaggregator.
- Na weefseldisaggregatie, lyseer de rode bloedcellen met 0,8% NH4Cl zoals vermeld in stap 2.4.
- Resuspendeer de cellen in steriel RPMI (het volume is afhankelijk van de celaantallen en is over het algemeen 10-20 ml) en filter ze vervolgens door een steriel nylongaas van 100 μm. Tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van de trypan blue exclusion methode.
- NTHi infectie assay
- Resuspensie van de longcellen tot een uiteindelijke celconcentratie van 4 x 106 cellen/ml per buis (controle en gestimuleerde monsters).
- Gebruik een suspensie van 4 x 106-6 x 106 cellen in 1 ml RPMI voor de (negatieve) controlebuis. Gebruik dezelfde hoeveelheid voor de NTHi-buis (elk extra monster kan worden gebruikt als een positieve controle met SEB). Infecteer de cellen in de NTHi-buis bij een MOI van 100 bacteriën per cel. Maak de dop een halve rotatie los om gasoverdracht in de buizen mogelijk te maken.
- Plaats de cellen in een buisrotator en incubeer ze bij 37 °C terwijl ze draaien bij 12 rpm.
- Om de extracellulaire export van cytokines te voorkomen, voegt u een Golgi-blokker (Brefeldin A) toe aan de celsuspensies 1 uur na stimulatie tot een eindconcentratie van 10 μg/ml. Retourneer de celsuspensies gedurende nog eens 16-22 uur incubatie bij rotatie (stap 4.3.3).
- Was de celsuspensie met 500 μL PBS met 1% runderserumalbumine (BSA) en 0,01% NaN3. Fixeer en permeabiliseer de cellen zoals beschreven in respectievelijk stap 3.5 en stap 3.6.
- Voeg de antilichamen toe voor intracellulaire cytokinekleuring (de keuze van antilichamen moet door de onderzoeker worden bepaald, zoals vermeld in de NOTITIE in stap 3.6). Kleur de celsuspensie voor specifieke menselijke lymfocytenceloppervlakmarkers (bijv. CD45, CD3, enz.) gedurende 1 uur. Was de cellen met PBS, fixeer en permeabiliseer ze zoals beschreven in stap 3.5-3.6.
- Incubeer de cellen met intracellulaire cytokinekleuringsantistoffen (bijv. IFN-γ en TNF-α of IL-13 en IL-17A) gedurende 1 uur.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om eerst oppervlaktemarkers te kleuren en vervolgens intracellulair, omdat fixatie conformatieveranderingen kan veroorzaken in de oppervlakte-eiwitten waaraan antilichamen binden. - Was de cellen met 500 μL PBS en resuspenseer in 100 μL PBS voordat gegevens worden verzameld op een flowcytometer.
- Een bead array assay kan in combinatie worden gebruikt om het supernatant beschreven in stap 3.2 (Voer dit uit zonder Brefeldin A) te analyseren. Dit maakt analyse mogelijk van een breed scala aan verschillende ontstekingsmediatoren (mogelijk tot 40-50 mediatoren). Verzamel het supernatant in aliquots van 100 μL en bewaar het bij -70 °C totdat het klaar is voor analyse. Als alternatief kan men multiplex chemiluminescent assaysgebruiken 20.
- Gebruik multiplex kralenarrays om de ontdooide monsters te analyseren. Gebruik het opgeslagen supernatant om de cytokineproductie te analyseren volgens de instructies van de fabrikant.
- Voer de acquisitie van de multiplex bead array uit op een flowcytometer. Gebruik relevante software om de downstream data-analyse uit te voeren.
OPMERKING: Deze bead array assay kan ook worden uitgevoerd op supernatant uit perifeer bloed en / of BAL-monsters.
5. Beoordeling van longproteolyse door confocale microscopie
OPMERKING: Fluorescerende confocale microscopie is complementair aan flowcytometrie en kan worden gebruikt om protease- en ROS-ontstekingsreacties te beoordelen. Extracellulaire vallen zoals NET's en MET's zijn samengesteld uit extracellulair chromatine (DNA) met andere ontstekingsmediatoren, met name proteasen zoals neutrofiel elastase (NE) en matrix metalloproteinasen (MMP). Ze kunnen worden beoordeeld in BAL en longweefsel met behulp van confocale microscopie, en dit is eerder beschreven door Sharma, R. et al.21.
- Beoordeel de directe protease-expressie in longweefsel (zoals beschreven in stap 4.2.1) met behulp van confocale microscopie en in situ zymografie15,17.
- Gebruik vers of bevroren niet-vastgeroest longweefsel. Monteer de gesneden secties tot een dikte van 4 μm op superfrost/ adhesieglaasjes. Verwarm de secties in 1x reactiebuffer gedurende 5 min.
- Voeg gefluoresceïne-gelabeld gelatinesubstraat (30 μg / ml per sectie) rechtstreeks toe aan individuele dia's om proteolyse te meten via de werking van metalloproteinasen.
- Plaats de dia's in een horizontale positie en incubeer gedurende 1 uur in een lichtbeschermde, bevochtigde kamer bij 37 °C.
- Spoel de secties in 1x reactiebuffer voordat ze worden gemonteerd.
- Voeg als negatieve controle alleen de reactiebuffer zonder fluorescerende gelatine toe aan de secties.
- Gebruik een confocale microscoop om de lysis van het substraat door onderzoek te testen. Gebruik ImageJ om het gebied van de long te bepalen met aanwijzingen voor proteolyse. Meet hiervoor het longgebied met vlekken boven de achtergrond van het gebluste monster. Gebruik als andere controle het longweefsel zonder fluorescerende gelatine toegevoegd15.
OPMERKING: Voer dit uit op minimaal 10 high power view fields of view (FOV) voor elk monster.
- Meet de extracellulaire ROS-expressie in longweefsel door immunoreactiviteit voor 3-nitrotyrosine (een toxisch oxidatief stressproduct)13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representatieve resultaten laten zien hoe inflammatoire immuunresponsen op NTHi kunnen worden beoordeeld/gekwantificeerd door flowcytometrie en confocale microscopie. Een belangrijk onderdeel van de interpretatie van de resultaten is de vergelijking in fluorescentie tussen controle- en gestimuleerde monsters. Een aantal voorbereidende experimenten zijn meestal nodig om de kleuring van monsters te optimaliseren. Hoeveel verschillende kleuren tegelijkertijd kunnen worden onderzocht, hangt af van het aantal kanalen dat beschikbaar is op de flowcytometer / confocale microscoop. Resultaten worden getoond voor de beoordeling van 1) ROS-productie, 2) intracellulaire cytokinekleuring van menselijk longweefsel en 3) in situ zymografie om longproteolyse te meten.
Figuur 1 toont de representatie van ROS-productie door monocyten. De meting van ROS gebeurt door de oxidatie van DHR123 om fluorescentie te produceren. Cellen worden afgesloten en hun mediane fluorescentie wordt beoordeeld door flowcytometrie. De mediane fluorescentie van het gestimuleerde monster wordt vergeleken met de controle.
Figuur 2 toont de intracellulaire productie van cytokines door lymfocyten afkomstig van menselijk longweefsel. Het longweefsel moet worden afgebroken tot eencellige suspensie voordat flowcytometrietests kunnen worden uitgevoerd om de productie van ontstekingsmediatoren te beoordelen, bijvoorbeeld cytokineproductie door lymfocyten. Longweefsel kan mechanisch worden afgebroken of chemisch worden verteerd, bijvoorbeeld door collagenase. De mechanische afbraakmethoden kunnen superieure resultaten opleveren, met name op het gebied van het vasthouden van celoppervlakkleuring (bijv. CD3 en CD4). Het filteren van de monsters is belangrijk om puin uit te sluiten dat de analyse kan verstoren.
Figuur 3 toont de expressie van protease-activiteit zoals gemeten door in situ zymografie. Niet-gefixeerd weefsel wordt gebruikt om de protease-activiteit te beoordelen. Deze monsters worden meestal ingevroren bij -70 °C tot de analyse. Het gebied van het weefsel met proteasefluorescentie wordt gemeten en de resultaten worden vergeleken tussen controle- en gestimuleerde monsters.
Figuur 1: ROS-productie door monocyten. (A) Het panel toont de gating-strategie voor perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC), waarbij voorwaartse spreiding en zijverstrooiing worden gebruikt om de fagocytenpopulatie te definiëren. In panel (B) wordt de fagocytenpopulatie verder gedefinieerd door CD14-expressie om de monocyten te labelen. Deze monocytenpopulatie wordt geanalyseerd op DHR-fluorescentie in controle (C) en gestimuleerde monsters (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Cytokineproductie in longweefsel. Cellen worden eerst geanalyseerd op hun expressie van de leukocytenmarker CD45 (A) met behulp van flowcytometrie. Deze populatie wordt vervolgens verder geanalyseerd op CD3-expressie (B) en CD4/CD8-expressie (C). CD3/CD4+ cellen worden beoordeeld op intracellulaire cytokineproductie in controle (D) en NTHi-gestimuleerde monsters (E). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Long in situ zymografie. Paneel (A) toont de expressie van chromatine/DAPI in delen van longweefsel. Paneel (B) toont fluorescerende kleuring, wat wijst op de aanwezigheid van MMP-activiteit. Paneel (C) toont de samengevoegde afbeelding die aangeeft dat de MMP-activiteit ook co-gelokaliseerd is met de expressie van chromatine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier genoemde methoden maken gebruik van op fluorescentie gebaseerde flowcytometrie en confocale microscopietechnieken die in combinatie kunnen worden gebruikt om gedetailleerde informatie te verkrijgen over de inflammatoire longrespons op Hi.
Het vaststellen van de juiste antigene formulering van Hi die moet worden gebruikt, is van cruciaal belang en het is raadzaam om in dit verband specifieke input van een microbioloog te hebben. Live Hi induceert een sterkere respons, terwijl gedode Hi-preparaten en Hi-componenten meer gestandaardiseerd zijn en gemakkelijker op te slaan zijn. PI labelt alleen dode bacteriën22; andere kleurstoffen zoals carboxyfluoresceïne succinimidylester (CVSE) kunnen worden gebruikt om levende bacteriën te labelen voor fagocytosetests23. Een reeks voorbereidende experimenten moet worden uitgevoerd om het juiste antigeen te optimaliseren. Voor het gebruik van live NTHi is een MOI van 100:1 optimaal; een lagere MOI kan geen duidelijke immuunrespons induceren, terwijl een hogere MOI toxisch kan zijn voor de cellen. Een dosis-responscurve kan echter nuttige informatie opleveren en kan zeer waardevol zijn, vooral met de initiële optimalisatie van de techniek24. Als positieve controle kan een commercieel verkregen vorm van geïnactiveerd Staphylococcus aureus-antigeen worden gebruikt, dat ook is gelabeld met PI zoals hierboven voor de ROS / fagocytose-test. Voor de T-celtests kan stimulatie met stafylokokken superantigeen E (SEB) worden gebruikt als een positieve controle19,25.
De protocollen voor het verkrijgen van BAL- en/of longweefselmonsters moeten duidelijk worden vastgesteld. De BAL-monsters kunnen behoorlijk variabel zijn tussen verschillende operators. Een handspuit voor de rechter middenkwab lavage levert goede resultaten op26. Het verkrijgen van het longweefselmonster uit lobectomiemonsters vereist de oprichting van een samenwerking met een patholoog. Het longweefselmonster moet enige marge van de tumor hebben (idealiter ten minste 3-4 cm). Grotere monsters (bijv. Ten minste 25-50 g) zullen meer cellen opleveren, evenals monsters die meer proximaal zijn zonder duidelijk emfyseem. De mechanische uitsplitsing van het longweefsel is tijdrovend en duurt over het algemeen ten minste 2-3 uur voor elk monster19,27.
Er moeten voorbereidende experimenten worden gedaan om de kleuring van verschillende fluoroforen te optimaliseren voor zowel flowcytometrie als confocale microscopie. Gebieden om op te concentreren zijn onder meer het identificeren van het beste kleuringspaneel, kleuring / concentratie en behandeling van cellen / weefsel om de levensvatbaarheid te maximaliseren28. Het gebruik van longweefsel kan worden geassocieerd met meer weefselresten dan andere vloeistofmonsters zoals bloed of BAL, en dit kan enig effect hebben op de differentiatie van verschillende cellulaire populaties door flowcytometrie. De juiste keuze van antilichamen moet worden bepaald en geoptimaliseerd in voorbereidende experimenten. Voor oppervlaktelabeling van lymfocyten kunnen anti-CD3 en CD4 worden gebruikt voor T-helpercellen, anti-CD3 en CD8 voor cytotoxische T-cellen en anti-CD3 en CD56 voor NK-cellen. De keuze van de te bestuderen intracellulaire cytokines hangt af van de mediatoren van belang en het aantal parameters/kleuren dat op de flowcytometer kan worden geanalyseerd29. Een specifieke uitdaging van het werken met macrofagen in longweefsel is hun hoge niveau van autofluorescentie30; dit probleem kan worden aangepakt door gestimuleerde cellen te vergelijken met achtergrondcontrole en de toevoeging van specifieke markers voor ontstekingen zoals proteasen en histonen.
Een beperking van deze technieken is de vereiste voor goed opgeleid en geschoold personeel om de experimenten uit te voeren. Goed gevestigde flowcytometrie en microscopiefaciliteiten zijn ook vereist. Het gebruik van menselijke weefselmonsters is geassocieerd met significante variabiliteit, met name bij het gebruik van longweefsel; dit kan een reeks voorbereidende experimenten vereisen om assays te optimaliseren (vooral met problemen met achtergrondkleuring).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de medewerkers van Clinical Immunology bij Monash Health bedanken voor hun hulp bij dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
- Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
- Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
- King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
- Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
- Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
- Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
- Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, Suppl 1 181-184 (1992).
- Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 6, Unit 6D (2010).
- King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
- Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
- King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
- Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
- King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
- Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
- Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
- Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
- Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
- Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
- Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).
