Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Évaluation des réponses immunitaires respiratoires à Haemophilus influenzae

Published: June 29, 2021 doi: 10.3791/62572
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 2,4, 5, 1,2
1Monash Lung and Sleep, Monash Medical Centre, 2Monash University Department of Medicine, Monash Medical Centre, 3Flow Cytometry Science Technology Platform, Francis Crick Institute, 4Clinical Immunology, Monash Medical Centre, 5Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University

Summary

Haemophilus influenzae induit une inflammation des voies respiratoires. Cet article portera sur l’utilisation de la cytométrie en flux et de la microscopie confocale pour définir les réponses immunitaires des phagocytes et des lymphocytes en réponse à cette bactérie.

Abstract

Haemophilus influenzae (Hi) est une bactérie répandue dans une gamme de conditions respiratoires. Une variété de dosages / techniques différents peuvent être utilisés pour évaluer la réponse immunitaire / inflammatoire respiratoire à cette bactérie. La cytométrie en flux et la microscopie confocale sont des technologies basées sur la fluorescence qui permettent une caractérisation détaillée des réponses biologiques. Différentes formes d’antigène Hi peuvent être utilisées, y compris les composants de la paroi cellulaire, les préparations tuées / inactivées et les bactéries vivantes. Hi est une bactérie fastidieuse qui nécessite un milieu enrichi, mais qui est généralement facile à cultiver dans des environnements de laboratoire standard. Les échantillons de tissus pour la stimulation par Hi peuvent être obtenus à partir de sang périphérique, de bronchoscopie ou de poumon réséqué (par exemple, chez les patients subissant une intervention chirurgicale pour le traitement du cancer du poumon). La fonction des macrophages et des neutrophiles peut être évaluée de manière exhaustive à l’aide de la cytométrie en flux avec une variété de paramètres mesurés, y compris la phagocytose, les espèces réactives de l’oxygène et la production intracellulaire de cytokines. La fonction lymphocytaire (p. ex. fonction des lymphocytes T et des cellules NK) peut être spécifiquement évaluée à l’aide de la cytométrie en flux, principalement pour la production intracellulaire de cytokines. L’infection à Hi est un puissant inducteur de la production de pièges extracellulaires, à la fois par les neutrophiles (TNE) et les macrophages (MET). La microscopie confocale est sans doute le moyen le plus optimal d’évaluer l’expression de la TNE et de la MET, qui peut également être utilisée pour évaluer l’activité de la protéase. L’immunité pulmonaire à Haemophilus influenzae peut être évaluée par cytométrie de flux et microscopie confocale.

Introduction

Haemophilus influenzae (Hi) est une bactérie commensale normale présente dans le pharynx de la plupart des adultes en bonne santé. Hi peut avoir une capsule de polysaccharide (types A-F, p. ex. type B ou HiB) ou ne pas avoir de capsule et être non typable (NTHi)1. La colonisation de la muqueuse avec cette bactérie commence dans la petite enfance et il y a un renouvellement de différentes souches colonisatrices2. Cette bactérie est également capable d’envahir les voies respiratoires supérieures et inférieures; Dans ce contexte, il peut induire l’activation de la réponse immunitaire et l’inflammation 3,4. Cette réponse inflammatoire peut causer une maladie clinique et contribuer à une variété de conditions respiratoires importantes, y compris la sinusite, l’otite moyenne, la bronchite, la fibrose kystique, la pneumonie et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). La plupart de ces conditions sont dues aux souches NTHi2. Cet article décrit les méthodes d’évaluation des réponses immunitaires respiratoires à Hi à l’aide de la cytométrie en flux et de la microscopie confocale.

Les méthodes décrites ci-dessous ont été adaptées à partir de techniques bien établies qui ont été modifiées pour évaluer la réponse inflammatoire à Hi. Le choix d’une forme antigénique appropriée de Hi est un élément clé de cette évaluation. Les préparations antigéniques vont des composants de la paroi cellulaire aux bactéries vivantes. Pour établir et normaliser les essais, l’utilisation d’échantillons de sang périphérique peut être très utile au départ.

La cytométrie en flux permet de mesurer une variété de paramètres et de tests fonctionnels à partir d’un échantillon au niveau cellulaire. Cette technique présente l’avantage que des réponses cellulaires spécifiques (par exemple, la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) ou la production de cytokines intracellulaires) peuvent être évaluées par rapport à d’autres méthodes plus générales telles que le dosage immuno-enzymatique (ELISA) ou ELISspot.

Les pièges extracellulaires sont exprimés par les neutrophiles (TNE)5,6,7 et par d’autres cellules telles que les macrophages (MET)8. Ils sont de plus en plus reconnus comme une réponse inflammatoire clé, en particulier dans l’infection des poumons9. Ils peuvent être évalués par microscopie confocale à fluorescence. Cette technique permet d’identifier définitivement les TNE/MET et de distinguer leur expression des autres formes de mort cellulaire6.

La cytométrie en flux et la microscopie confocale sont des tests basés sur la fluorescence. Leur succès dépend de protocoles de filtrage optimaux des échantillons biologiques. Ces méthodes prennent un certain temps à apprendre et nécessitent une expertise de supervision appropriée. Les instruments impliqués sont également coûteux à l’achat et à l’utilisation. Le cadre optimal pour leur utilisation comprend les grandes universités et les hôpitaux de référence tertiaires.

Les méthodes utilisées dans ce protocole sont transférables pour l’étude d’autres organismes similaires impliqués dans les maladies respiratoires (par exemple, Moxarella catarrhalis et Streptococcus pneumoniae). NTHi interagit également avec d’autres bactéries respiratoires communes10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ce travail a été approuvé par le comité d’éthique de la recherche humaine de Monash Health. Le protocole suit les lignes directrices du comité d’éthique de la recherche sur des sujets humains.

1. Préparation antigénique

REMARQUE: Trois préparations antigéniques différentes peuvent être utilisées pour évaluer la réponse immunitaire à Hi. Il s’agit de 1) un composant subcellulaire (généralement de la paroi cellulaire bactérienne); 2) bactéries tuées et inactivées; et 3) les bactéries vivantes. Déterminer l’utilisation de chaque préparation antigénique avant le début de toute expérience.

  1. Composants subcellulaires
    1. Obtenir des composants subcellulaires à partir de sources, y compris des préparations commerciales, des composants développés à l’interne et/ou d’autres chercheurs.
      REMARQUE : Des composants subcellulaires provenant habituellement de la paroi cellulaire bactérienne peuvent être utilisés et comprennent des protéines de membrane externe telles que P6 et lipooligosaccharide (LOS)11,12. Ces composants subcellulaires sont généralement dérivés dans des centres spécialisés. La description de la façon dont ils sont fabriqués dépasse le cadre de cet article. Un contact direct avec des experts dans ce domaine est recommandé pour obtenir ces composants.
  2. Bactéries tuées/inactivées
    1. Obtenir les bactéries à partir de l’échantillon approprié (p. ex. expectorations ou bronchoscopie). Confirmer que la souche est H. influenzae à l’aide d’un laboratoire de microbiologie approprié. Effectuer le typage des échantillons de H. influenzae pour confirmer qu’ils ne sont pas typables (par un laboratoire de microbiologie spécialisé).
    2. Pour obtenir un antigène représentatif, utilisez plusieurs souches de NTHi (au moins 5, chacune d’une quantité approximativement identique) pour fabriquer un antigène regroupé. Conserver les souches à -70 °C dans du bouillon de glycérol dans des tubes à microcentrifugation.
      NOTE: Dans cette expérience, dix souches distinctes ont été utilisées.
    3. Décongeler les souches (un tube de microcentrifugation à la fois) sur des plaques de gélose au chocolat et pousser pendant la nuit dans un incubateur à 37 °C contenant 5 % de CO2. Ajouter les bactéries à 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et les laver deux fois (essorer à 300 x g pendant 5 min). Utiliser un étalon MacFarland 10 ou un spectrophotomètre13 pour aliquoter le NTHi à une concentration de10 à 8 mL (à l’aide d’un contenant de 5 mL ou l’équivalent).
    4. La chaleur inactive les bactéries en les plaçant dans un bain-marie à une température de 56 °C pendant 10 min.
    5. Sonicer les bactéries en utilisant un réglage de sonication continu à une vitesse faible à moyenne pendant 30 s.
    6. Aliquote le volume approprié d’échantillons dans des tubes à microcentrifugeuses. Pour un échantillon de 10 à8 mL, utiliser des aliquotes de 50 μL (c.-à-d. 20 échantillons par mL), les congeler à -70 °C jusqu’à ce qu’elles soient nécessairesà 14 mL.
  3. Bactéries vivantes
    1. Tout d’abord, caractériser les bactéries vivantes comme mentionné à l’étape 1.2.1. Utilisez une souche bien caractérisée. Assurez-vous que la souche est également stockée dans un bouillon de glycérol à -70 °C en réserve.
    2. Cultivez les bactéries sur des milieux enrichis tels que des assiettes de gélose au chocolat ou dans un bouillon.
      1. Pour utiliser des assiettes de gélose au chocolat, étalez les bactéries pendant au moins tous les 3-4 jours avec des épandeurs stériles.
      2. Alternativement, utilisez un bouillon Brain Heart Infusion (BHI) enrichi en facteurs X (hémine) et V (β-nicotinamide adénine dinucléotide) pour développer les bactéries. Inoculer le NTHi à partir de plaques de nuit dans 5 à 10 mL de bouillon de BHI complété à la fois de l’hémine et du β-nicotinamide adénine dinucléotide (10 μg/mL chacun) et le cultiver pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 .
        REMARQUE : Cela présente l’avantage de la reproductibilité, d’un nombre plus élevé d’unités formant colonies (UFC) et de toutes les bactéries se trouvant à une phase similaire de croissance logarithmique (sur plaques, la viabilité bactérienne peut être plus grande selon la position dans la culture)13,15.
    3. Utilisez une multiplicité d’infection (MOI) de 100 bactéries pour une cellule pour provoquer une forte réponse immunitaire tout en maintenant la viabilité cellulaire. Utilisez MacFarland Standard10 ou le spectrophotomètre13 pour évaluer le nombre de bactéries.
    4. S’assurer que le milieu utilisé pour les tests NTHi vivants est exempt de tout sérum humain, car cela tuerait les bactéries16. Les échantillons de sérum animal (p. ex. sérum de veau fœtal) ne causent généralement aucun problème.
      REMARQUE : Utilisez les méthodes décrites ci-dessous pour analyser les échantillons de tissus standard tels que le sang périphérique, les échantillons de bronchoscopie (en particulier le lavage broncho-alvéolaire (BAL)) et le tissu pulmonaire réséqué. Incuber les échantillons avec l’antigène Hi de 10 min à 24 h ou plus.

2. Évaluation de la fonction phagocytaire par cytométrie en flux

REMARQUE: Ce test nécessite des cellules en solution et est généralement effectué dans le sang total ou en utilisant le liquide BAL. Ce test est modifié à partir d’un protocole précédemment publié basé sur l’utilisation d’une préparation inactivée de Staphylococcus aureus et de Pansorbin17. Le sang total inactivé et H. influenzae fixe est substitué à la Pansorbine17.

  1. Mélanger le NTHi (1,2) inactivé tué avec l’iodure de propidium (IP) à 100 μg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un rapport de 1:1 pendant 30 minutes à température ambiante. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min, puis laver 500 μL de PBS. Faire tourner à 450 x g pendant 5 min et remettre la pastille en suspension dans 500 μL de PBS.
  2. Incuber 450 μL de sang périphérique (provenant de la ponction veineuse d’un sujet humain) avec 50 μL d’IP inactivé marqué à H. influenzae pendant 20 minutes dans un bain-marie à 37 °C dans un tube de 5 mL.
  3. Prélever les échantillons du bain-marie et ajouter 5 μL de dihydrorhodamine-1,2,3 (DHR). Vortex pendant 10 s, puis replacez-le dans le bain-marie pendant 10 minutes supplémentaires.
  4. Retirer les échantillons du bain-marie et lyser les érythrocytes (500 μL de volume comme indiqué ci-dessus à l’étape 2.2) avec 10:1 (c.-à-d. 5 mL) de chlorure d’ammonium à 0,8 % (150 mM NH4Cl, 1 mMNaHCO3 et 0,1 mM EDTA).
    REMARQUE: Alternativement, un système automatisé tel que Q-prep peut être utilisé.
  5. Analysez les échantillons sur un cytomètre en flux dans l’heure. Analyser un minimum de 3 000 à 5 000 cellules (de chaque sous-ensemble d’intérêt) de chaque échantillon pour obtenir des résultats représentatifs (figure 1).
    1. Pour analyser les échantillons pour la phagocytose, déterminer la proportion de cellules ayant ingéré des bactéries marquées (mesurer la proportion de cellules ayant la coloration fluorescente).
    2. Quantifier les ROS par l’oxydation de DHR, ce qui donne un signal fluorescent (le changement de fluorescence médiane est comparé entre les échantillons de base et stimulés).
      REMARQUE: Les neutrophiles sont plus granulaires et ont plus de diffusion latérale, tandis que les macrophages sont plus gros et ont plus de diffusion vers l’avant.
    3. Distinguer morphologiquement les neutrophiles et les macrophages les uns des autres par leur taille (les macrophages sont plus gros) et leur granularité (les neutrophiles sont plus granulaires).
      REMARQUE : Les marqueurs spécifiques pour les neutrophiles et les macrophages ne sont généralement pas utilisés, bien que CD14 puisse être utilisé pour marquer les monocytes sanguins. La cytométrie de flux peut potentiellement être utilisée pour distinguer différentes formes fonctionnelles de monocytes et de macrophages (p. ex. sous-ensembles M1 et M2)18.
  6. Modifier le dosage au besoin (p. ex., utiliser du NTHi vivant non marqué pour stimuler les phagocytes et mesurer l’expression des ROS par clivage DHR).
    1. Isoler les cellules mononucléées du sang périphérique par centrifugation à gradient de densité. Déposer le sang sur le polymère désigné pour la centrifugation du gradient de densité et faire tourner à 2300 x g pendant 30 min. Retirer la couche mononucléaire à l’aide d’une pipette, la laver deux fois avec du PBS et remettre les cellules en suspension dans du PBS à 106 cellules par mL.
    2. Comme alternative, utilisez les macrophages BAL.
    3. Suspendre les monocytes/macrophages à une concentration de 106 cellules/mL dans le milieu de culture (RPMI). Infectez-les avec du NTHi vivant à une MOI de 100:1 pendant 1 h, comme décrit à l’étape 1.3.
    4. Ajouter DHR à la suspension comme décrit à l’étape 2.3 pendant 10 min. Effectuez l’analyse des ROS à l’aide de la cytométrie en flux.

3. Évaluation de la fonction lymphocytaire dans le sang périphérique

  1. Utiliser du sang total ou des préparations de cellules mononucléaires pour les tests de cytométrie en flux14.
  2. Obtenir des échantillons de chaque sujet par ponction veineuse. Prélever 4 mL de sang dans une veine périphérique dans un tube d’héparine de lithium et diviser les échantillons en aliquotes pour le contrôle et la stimulation antigénique.
  3. Ajouter des anticorps costimulants (anti-CD28 et CD49d, 1 μL/mL) aux deux échantillons. Ajouter NTHi à l’échantillon d’antigène et incuber à 37 °C et 5% de CO2 pendant 1 h. Pour la préparation NTHi tuée, ajouter 200 μL de l’antigène à 2 mL de sang. Pour les NTHi vivants, ajouter des cellules NTHi vivantes à un MOI de 100:1 aux globules blancs (mesuré par hémocytomètre).
  4. Ajouter l’agent bloquant le Golgi Brefeldin A (10 μL/mL) aux échantillons et les incuber pendant encore 5 h.
    REMARQUE: Le blocage de l’appareil de Golgi empêche les cytokines d’être exportées à l’extérieur de la cellule.
  5. Si du sang total est utilisé, lyser les érythrocytes avec du chlorure d’ammonium à 0,8% (étape 2.4) pour ne laisser que les leucocytes en solution. Fixez les leucocytes en utilisant 500 μL de paraformaldéhyde à 1% à 2% pendant 1 h.
  6. Compter les cellules par hémocytomètre, perméabiliser 10 à6 cellules avec 100 μL de saponine à 0,1% pendant 15 min et incuber les cellules avec des anticorps marqués par fluorescence. Lavez les cellules et analysez-les à l’aide d’un cytomètre en flux.
    REMARQUE : La quantité d’anticorps marqués par fluorescence sera spécifique à chaque cytokine. Suivez les instructions du fabricant. En règle générale, 106 cellules dans 100 μL de solution seront colorées pendant 1 h. La plupart des anticorps obtenus commercialement seront suffisants pour effectuer 25 à 100 tests.
  7. Déterminer la proportion de cellules répondant à l’antigène en contrôlant la population lymphocytaire pertinente (les cellules sont fermées par CD45, puis par CD3, et plus tard par l’expression de CD4 ou CD8) comme le montre la figure 2. Effectuer une coloration de fond sur les cellules non stimulées pour toutes les cytokines à analyser. Criblez 100 000 cellules pour analyser chaque cytokine à la fois pour les cellules stimulées et le contrôle.

4. Évaluation de la fonction lymphocytaire/médiateurs inflammatoires dans le tissu pulmonaire

  1. Il n’est généralement pas possible d’obtenir suffisamment de lymphocytes par bronchoscopie; Par conséquent, utilisez le tissu pulmonaire provenant d’échantillons de lobectomie. L’optimisation des échantillons de tissus pulmonaires nécessite une liaison étroite avec le service d’anatomopathologie. Assurez-vous que le tissu a une marge d’au moins 3 cm de la tumeur et est le tissu cellulaire sans emphysème significatif (tel que déterminé par le pathologiste).
  2. Briser le tissu pulmonaire en une suspension cellulaire avant de pouvoir l’utiliser pour les tests de cytométrie en flux. Digérer le tissu pulmonaire chimiquement (p. ex. avec de la collagénase) ou le désagréger mécaniquement.
    REMARQUE : La désagrégation mécanique des tissus peut être préférée, car elle est associée à une meilleure coloration superficielle des cellules (p. ex. marquage CD3/4)19.
    1. Obtenir des échantillons de lobectomie d’un pathologiste (généralement obtenus à partir de patients subissant un traitement du cancer du poumon). Trancher environ 20-40 g de l’échantillon en 3-5 mm3 sections. Placez-les dans une chambre stérile de 50 μL avant d’être fragmentés mécaniquement à l’aide d’un désagrégateur approprié.
    2. Après désagrégation tissulaire, lyser les globules rouges avec 0,8%NH4Clcomme mentionné à l’étape 2.4.
    3. Remettez les cellules en suspension dans un RPMI stérile (le volume dépendra du nombre de cellules et est généralement de 10 à 20 mL), puis filtrez-les à travers un maillage en nylon stérile de 100 μm. Compter le nombre de cellules viables en utilisant la méthode d’exclusion du bleu trypan.
  3. Test d’infection NTHi
    1. Resuspendre les cellules pulmonaires à une concentration cellulaire finale de 4 x 106 cellules/mL par tube (échantillons témoins et stimulés).
    2. Utiliser une suspension de 4 x 10 6-6 x 106 cellules dans 1 mL de RPMI pour le tube témoin (négatif). Utiliser la même quantité pour le tube NTHi (tout échantillon supplémentaire peut être utilisé comme témoin positif avec SEB). Infecter les cellules du tube NTHi à une MOI de 100 bactéries par cellule. Desserrez le bouchon d’une demi-rotation pour permettre le transfert de gaz dans les tubes.
    3. Placer les cellules dans un rotateur tubulaire et les incuber à 37 °C tout en tournant à 12 tr/min.
    4. Pour empêcher l’exportation extracellulaire de cytokines, ajouter un bloqueur de Golgi (Brefeldin A) aux suspensions cellulaires 1 h après la stimulation à une concentration finale de 10 μg/mL. Remettre les suspensions cellulaires pendant une incubation supplémentaire de 16 à 22 heures en rotation (étape 4.3.3).
    5. Laver la suspension cellulaire avec 500 μL de PBS contenant 1% d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,01% de NaN3. Fixez et perméabilisez les cellules comme décrit aux étapes 3.5 et 3.6, respectivement.
    6. Ajouter les anticorps pour la coloration intracellulaire des cytokines (le choix des anticorps doit être déterminé par l’investigateur, comme indiqué dans la NOTE à l’étape 3.6). Colorer la suspension cellulaire pour des marqueurs spécifiques de la surface cellulaire des lymphocytes humains (p. ex. CD45, CD3, etc.) pendant 1 h. Lavez les cellules avec du PBS, fixez-les et perméabilisez-les comme décrit aux étapes 3.5-3.6.
    7. Incuber les cellules avec des anticorps de coloration intracellulaire des cytokines (par exemple, IFN-γ et TNF-α ou IL-13 et IL-17A) pendant 1 h.
      REMARQUE: Il est recommandé de colorer d’abord les marqueurs de surface, puis intracellulaire, car la fixation peut provoquer des changements conformationnels dans les protéines de surface auxquelles les anticorps se lient.
    8. Laver les cellules avec 500 μL de PBS et les remettre en suspension dans 100 μL de PBS avant l’acquisition des données sur un cytomètre en flux.
  4. Un essai de réseau de billes peut être utilisé conjointement pour analyser le surnageant décrit à l’étape 3.2 (effectuer cette opération sans Brefeldin A). Cela permet d’analyser une grande variété de médiateurs inflammatoires différents (potentiellement jusqu’à 40-50 médiateurs). Recueillir le surnageant dans des aliquotes de 100 μL et conserver à -70 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’analyse. Alternativement, on peut utiliser des dosages chimioluminescents multiplex20.
    1. Utilisez des réseaux de billes multiplex pour analyser les échantillons décongelés. Utilisez le surnageant stocké pour analyser la production de cytokines en suivant les instructions du fabricant.
    2. Effectuer l’acquisition du réseau de billes multiplex sur un cytomètre en flux. Utilisez le logiciel approprié pour effectuer l’analyse des données en aval.
      REMARQUE : Ce test de réseau de billes peut également être effectué sur du surnageant provenant d’échantillons de sang périphérique et/ou de BAL.

5. Évaluation de la protéolyse pulmonaire par microscopie confocale

REMARQUE : La microscopie confocale fluorescente est complémentaire à la cytométrie en flux et peut être utilisée pour évaluer les réponses inflammatoires à la protéase et aux ROS. Les pièges extracellulaires tels que les TNE et les MET sont composés de chromatine extracellulaire (ADN) avec d’autres médiateurs inflammatoires, en particulier les protéases telles que l’élastase neutrophile (NE) et les métalloprotéinases matricielles (MMP). Ils peuvent être évalués dans le BAL et le tissu pulmonaire en utilisant la microscopie confocale, ce qui a été décrit précédemment par Sharma, R. et al.21.

  1. Évaluer l’expression directe de la protéase dans le tissu pulmonaire (tel que décrit à l’étape 4.2.1) par microscopie confocale et zymographie in situ 15,17.
    1. Utilisez du tissu pulmonaire non fixé frais ou congelé. Monter les sections coupées à une épaisseur de 4 μm sur des lames de supergel/adhérence. Préchauffer les sections dans 1x tampon de réaction pendant 5 min.
    2. Ajouter un substrat de gélatine marqué à la fluorescéine (30 μg/mL par section) directement sur des lames individuelles pour mesurer la protéolyse par l’action des métalloprotéinases.
    3. Placer les lames en position horizontale et incuber dans une chambre humidifiée à 37 °C à l’abri de la lumière pendant 1 h.
    4. Rincer les sections dans un tampon de réaction 1x avant de les monter.
    5. Comme témoin négatif, ajouter uniquement le tampon de réaction sans gélatine fluorescente aux sections.
    6. Utilisez un microscope confocal pour doser la lyse du substrat par examen. Utilisez ImageJ pour déterminer la région du poumon présentant des signes de protéolyse. Pour cela, mesurez la région pulmonaire qui a une coloration au-dessus du fond de l’échantillon trempé. Comme autre témoin, utiliser le tissu pulmonaire sans gélatine fluorescente ajoutée15.
      REMARQUE: Effectuez cette opération sur un minimum de 10 champs de vision haute puissance (FOV) pour chaque échantillon.
  2. Mesurer l’expression extracellulaire des ROS dans le tissu pulmonaire par immunoréactivité de la 3-nitrotyrosine (un produit toxique de stress oxydatif)13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Les résultats représentatifs montrent comment les réponses immunitaires inflammatoires à la NTHi peuvent être évaluées/quantifiées par cytométrie de flux et microscopie confocale. Un élément clé de l’interprétation des résultats est la comparaison en fluorescence entre les échantillons témoins et stimulés. Un certain nombre d’expériences préliminaires sont généralement nécessaires pour optimiser la coloration des échantillons. Le nombre de couleurs différentes pouvant être examinées simultanément dépendra du nombre de canaux disponibles sur le cytomètre en flux / microscope confocal. Les résultats sont présentés pour l’évaluation de 1) la production de ROS, 2) la coloration intracellulaire des cytokines du tissu pulmonaire humain et 3) la zymographie in situ pour mesurer la protéolyse pulmonaire.

La figure 1 montre la représentation de la production de ROS par les monocytes. La mesure des ROS se fait par oxydation de DHR123 pour produire une fluorescence. Les cellules sont fermées et leur fluorescence médiane est évaluée par cytométrie en flux. La fluorescence médiane de l’échantillon stimulé est comparée au témoin.

La figure 2 montre la production intracellulaire de cytokines par les lymphocytes dérivés du tissu pulmonaire humain. Le tissu pulmonaire doit être décomposé en suspension unicellulaire avant que des tests de cytométrie en flux puissent être effectués pour évaluer la production de médiateurs inflammatoires, par exemple la production de cytokines par les lymphocytes. Le tissu pulmonaire peut être décomposé mécaniquement ou digéré chimiquement, par exemple par la collagénase. Les méthodes de dégradation mécanique peuvent produire des résultats supérieurs, en particulier en termes de rétention de la coloration de la surface cellulaire (par exemple, CD3 et CD4). Le filtrage des échantillons est important pour exclure les débris qui pourraient interférer avec l’analyse.

La figure 3 montre l’expression de l’activité de la protéase mesurée par zymographie in situ . Le tissu non fixé est utilisé pour évaluer l’activité de la protéase. Ces échantillons sont généralement congelés à -70 °C jusqu’à l’analyse. La zone du tissu qui a une fluorescence de protéase est mesurée, et les résultats sont comparés entre les échantillons témoins et stimulés.

Figure 1
Figure 1 : Production de ROS par les monocytes. (A) Le panel montre la stratégie de déclenchement pour les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), avec une diffusion vers l’avant et une dispersion latérale utilisées pour définir la population de phagocytes . Dans le panel (B), la population de phagocytes est définie plus en détail par l’expression de CD14 pour marquer les monocytes. Cette population de monocytes est analysée pour la fluorescence DHR dans les échantillons témoins (C) et stimulés (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Production de cytokines dans le tissu pulmonaire. Les cellules sont d’abord analysées pour leur expression du marqueur leucocytaire CD45 (A) par cytométrie de flux. Cette population est ensuite analysée plus en détail pour l’expression de CD3 (B) et l’expression de CD4/CD8 (C). Les cellules CD3/CD4+ sont évaluées pour la production intracellulaire de cytokines dans des échantillons témoins (D) et stimulés par la NTHi (E). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Zymographie pulmonaire in situ. Le panneau (A) montre l’expression de la chromatine/DAPI dans des sections de tissu pulmonaire. Le panneau (B) montre une coloration fluorescente, indiquant la présence d’une activité MMP. Le panneau (C) montre l’image fusionnée indiquant que l’activité MMP est également colocalisée avec l’expression de la chromatine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Les méthodes énumérées ici utilisent la cytométrie en flux basée sur la fluorescence et des techniques de microscopie confocale qui peuvent être utilisées conjointement pour obtenir des informations détaillées sur la réponse pulmonaire inflammatoire à Hi.

Il est essentiel d’établir la formulation antigénique appropriée de Hi à utiliser, et il est conseillé d’avoir une contribution spécifique d’un microbiologiste à cet égard. Live Hi induit une réponse plus forte, tandis que les préparations Hi tuées et les composants Hi sont plus standardisés et sont plus faciles à stocker. PI n’étiquetera que les bactéries mortes22; d’autres colorants tels que la carboxyfluorescéine succinimidylester (CFSE) pourraient être utilisés pour marquer les bactéries vivantes pour les tests de phagocytose23. Une série d’expériences préliminaires doit être entreprise pour optimiser l’antigène approprié. Pour l’utilisation de NTHi en direct, un MOI de 100:1 est optimal; un MOI plus faible peut ne pas induire une réponse immunitaire claire, tandis qu’un MOI plus élevé peut être toxique pour les cellules. Cependant, une courbe dose-réponse peut donner des informations utiles et peut être très utile, notamment avec l’optimisation initiale de la technique24. En tant que témoin positif, une forme commercialement obtenue de l’antigène inactivé de Staphylococcus aureus peut être utilisée, qui est également marquée avec PI comme ci-dessus pour le test ROS / phagocytose. Pour les tests sur les lymphocytes T, la stimulation par le superantigène E staphylococcique (PBU) peut être utilisée comme témoin positif19,25.

Les protocoles d’obtention d’échantillons de BAL et/ou de tissus pulmonaires doivent être clairement établis. Les échantillons BAL peuvent être très variables entre différents opérateurs. Une seringue portative pour le lavage du lobe moyen droit donne de bons résultats26. L’obtention de l’échantillon de tissu pulmonaire à partir d’échantillons de lobectomie nécessite l’établissement d’une collaboration avec un pathologiste. L’échantillon de tissu pulmonaire doit avoir une certaine marge de la tumeur (idéalement au moins 3-4 cm). Des échantillons plus gros (par exemple, au moins 25-50 g) donneront plus de cellules, ainsi que des échantillons plus proximaux sans emphysème évident. La désagrégation mécanique du tissu pulmonaire prend beaucoup de temps et prendra généralement au moins 2-3 heures pour chaque échantillon19,27.

Des expériences préliminaires devraient être effectuées pour optimiser la coloration de différents fluorophores pour la cytométrie en flux et la microscopie confocale. Les domaines sur lesquels se concentrer comprennent l’identification du meilleur panneau de coloration, la coloration / concentration et le traitement des cellules / tissus pour maximiser la viabilité28. L’utilisation de tissu pulmonaire peut être associée à plus de débris tissulaires que d’autres échantillons de liquide tels que le sang ou le BAL, ce qui peut avoir un effet sur la différenciation de différentes populations cellulaires par cytométrie en flux. Le choix approprié des anticorps doit être déterminé et optimisé dans les expériences préliminaires. Pour le marquage de surface des lymphocytes, les anti-CD3 et CD4 peuvent être utilisés pour les cellules T auxiliaires, anti-CD3 et CD8 pour les cellules T cytotoxiques, et anti-CD3 et CD56 pour les cellules NK. Le choix des cytokines intracellulaires à étudier dépend des médiateurs d’intérêt et du nombre de paramètres/couleurs pouvant être analysés sur le cytomètre en flux29. Un défi spécifique du travail avec des macrophages dans le tissu pulmonaire est leur niveau élevé d’autofluorescence30; Ce problème peut être résolu en comparant les cellules stimulées avec le contrôle de fond et l’ajout de marqueurs spécifiques de l’inflammation tels que les protéases et les histones.

Une limite de ces techniques est la nécessité d’un personnel correctement formé et qualifié pour effectuer les expériences. Des installations de cytométrie en flux et de microscopie bien établies sont également nécessaires. L’utilisation d’échantillons de tissus humains est associée à une variabilité importante, en particulier lors de l’utilisation de tissu pulmonaire; Cela peut nécessiter une série d’expériences préliminaires pour optimiser les tests (en particulier avec les problèmes de coloration de fond).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier le personnel d’immunologie clinique de Monash Health pour son aide dans ce travail.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium chloride Sigma Aldrich 213330
Brefeldin Sigma Aldrich B6542
CD28 Thermofisher 16-0289-81
CD49d Thermofisher 534048
DAPI prolong gold Thermofisher P36931
DHR123 Sigma Aldrich 109244-58-8
Filcon sterile nylon mesh Becton Dickinson 340606
Gelatin substrate, Enzchek Molecular probes E12055
MACS mix tube rotater Miltenyi Biotec 130-090-753
Medimachine Becton Dickinson Catalogue number not available
Medicons 50 µm Becton Dickinson 340592
Pansorbin Sigma Aldrich 507858
Propidium iodide Sigma Aldrich P4170
Saponin Sigma Aldrich 8047152
Superfrost slides Thermofisher 11562203

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
  2. Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
  3. King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
  4. Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
  5. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  6. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
  7. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
  8. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
  9. Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
  10. Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
  11. Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
  12. Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, Suppl 1 181-184 (1992).
  13. Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 6, Unit 6D (2010).
  14. King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
  15. Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
  16. King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
  17. King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
  18. Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
  19. King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
  20. Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
  21. Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
  22. Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
  23. Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
  24. Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
  25. Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
  26. Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
  27. Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
  28. Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
  29. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
  30. Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).

Tags

Immunologie et infection numéro 172 bactéries poumon inflammation cytométrie en flux microscopie confocale
Évaluation des réponses immunitaires respiratoires à <em>Haemophilus influenzae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dousha, L., Sharma, R., Lim, S.,… More

Dousha, L., Sharma, R., Lim, S., Ngui, J., Buckle, A. M., King, P. T. Assessing Respiratory Immune Responses to Haemophilus Influenzae. J. Vis. Exp. (172), e62572, doi:10.3791/62572 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter