Summary
Haemophilus influenzae solunum yollarında inflamasyona neden olur. Bu makalede, bu bakteriye yanıt olarak fagositler ve lenfositler tarafından immün yanıtları tanımlamak için akım sitometrisi ve konfokal mikroskopinin kullanımı üzerinde durulacaktır.
Abstract
Haemophilus influenzae (Hi), çeşitli solunum koşullarında bulunan yaygın bir bakteridir. Bu bakteriye solunum immün / enflamatuar yanıtı değerlendirmek için çeşitli farklı tahliller / teknikler kullanılabilir. Akım sitometrisi ve konfokal mikroskopi, biyolojik yanıtların ayrıntılı karakterizasyonunu sağlayan floresan tabanlı teknolojilerdir. Hücre duvarı bileşenleri, öldürülmüş / inaktive edilmiş preparatlar ve canlı bakteriler dahil olmak üzere Hi antijeninin farklı formları kullanılabilir. Hi, zenginleştirilmiş ortam gerektiren titiz bir bakteridir, ancak standart laboratuvar ortamlarında yetiştirilmesi genellikle kolaydır. Hi ile stimülasyon için doku örnekleri periferik kan, bronkoskopi veya rezeke akciğerden elde edilebilir (örneğin, akciğer kanseri tedavisi için ameliyat edilen hastalarda). Makrofaj ve nötrofil fonksiyonu, fagositoz, reaktif oksijen türleri ve hücre içi sitokin üretimi dahil olmak üzere ölçülen çeşitli parametrelerle akış sitometrisi kullanılarak kapsamlı bir şekilde değerlendirilebilir. Lenfosit fonksiyonu (örneğin, T hücresi ve NK hücre fonksiyonu), esas olarak hücre içi sitokin üretimi için akış sitometrisi kullanılarak spesifik olarak değerlendirilebilir. Hi enfeksiyonu, hem nötrofiller (NET'ler) hem de makrofajlar (MET'ler) tarafından hücre dışı tuzak üretiminin güçlü bir indükleyicisidir. Konfokal mikroskopi, proteaz aktivitesini değerlendirmek için de kullanılabilecek NET ve MET ekspresyonunu değerlendirmenin tartışmasız en uygun yoludur. Haemophilus influenzae'ye karşı akciğer bağışıklığı, akım sitometrisi ve konfokal mikroskopi kullanılarak değerlendirilebilir.
Introduction
Haemophilus influenzae (Hi), çoğu sağlıklı yetişkinin farenksinde bulunan normal bir kommensal bakteridir. Hi, polisakkarit kapsüle sahip olabilir (A-F tipleri, örneğin B veya HiB tipi) veya bir kapsülden yoksun olabilir ve yazılamaz (NTHi)1. Mukozanın bu bakteri ile kolonizasyonu erken çocukluk döneminde başlar ve farklı kolonize edici suşların devrivardır 2. Bu bakteri aynı zamanda hem üst hem de alt solunum yollarının istilasını da yapabilir; bu bağlamda immün yanıtın aktivasyonunu ve inflamasyonu indükleyebilir 3,4. Bu inflamatuar yanıt klinik hastalığa neden olabilir ve sinüzit, otitis media, bronşit, kistik fibroz, pnömoni ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) dahil olmak üzere çeşitli önemli solunum koşullarına katkıda bulunabilir. Bu koşulların çoğu NTHi suşları2'den kaynaklanmaktadır. Bu makalede, Hi'ye karşı solunum immün yanıtlarını değerlendirmek için akım sitometrisi ve konfokal mikroskopi kullanarak yöntemler açıklanacaktır.
Aşağıda açıklanan yöntemler, Hi'ye enflamatuar yanıtı değerlendirmek için modifiye edilmiş köklü tekniklerden uyarlanmıştır. Hi'nin uygun bir antijenik formunun seçimi bu değerlendirmenin önemli bir parçasıdır. Antijenik preparatlar hücre duvarı bileşenlerinden canlı bakterilere kadar uzanır. Tahlilleri oluşturmak ve standartlaştırmak için, periferik kan örneklerinin kullanımı başlangıçta çok yararlı olabilir.
Akış sitometrisi, hücresel düzeyde bir numuneden çeşitli parametrelerin ve fonksiyonel testlerin ölçülmesini sağlar. Bu teknik, spesifik hücresel yanıtların (örneğin, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi veya hücre içi sitokin üretimi), enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) veya ELISspot gibi diğer daha genel yöntemlerle karşılaştırıldığında değerlendirilebilmesi avantajına sahiptir.
Hücre dışı tuzaklar nötrofiller (NET'ler)5,6,7 ve makrofajlar (MET'ler)8 gibi diğer hücreler tarafından eksprese edilir. Özellikle akciğer9'daki enfeksiyonda anahtar inflamatuar yanıt olarak giderek daha fazla tanınmaktadırlar. Konfokal floresan mikroskopi ile değerlendirilebilirler. Bu teknik, NET'lerin / MET'lerin kesin olarak tanımlanmasını sağlar ve ifadelerini diğer hücre ölümü biçimlerinden ayırır6.
Hem akım sitometrisi hem de konfokal mikroskopi floresan bazlı tahlillerdir. Başarıları, biyolojik örneklerin optimal gerilme protokollerine bağlıdır. Bu yöntemlerin öğrenilmesi biraz zaman alır ve uygun denetim uzmanlığı gerektirir. İlgili enstrümanlar da hem satın almak hem de çalıştırmak için pahalıdır. Kullanımları için en uygun ayar, büyük üniversiteleri ve üçüncül sevk hastanelerini içerir.
Bu protokolde kullanılan yöntemler, solunum yolu hastalığında rol oynayan diğer benzer organizmaların (örneğin, Moxarella catarrhalis ve Streptococcus pneumoniae) incelenmesi için aktarılabilir. NTHi ayrıca diğer yaygın solunum bakterileri ile etkileşime girer10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Monash Health'in insan araştırma etik komitesi tarafından onaylandı. Protokol, insan araştırma etik komitesinin yönergelerini takip eder.
1. Antijenik preparat
NOT: Hi'ye karşı immün yanıtı değerlendirmek için üç farklı antijenik preparat kullanılabilir. Bunlar 1) bir hücre altı bileşenidir (tipik olarak bakteriyel hücre duvarından); 2) öldürülmüş ve etkisiz hale getirilmiş bakteriler; ve 3) canlı bakteriler. Herhangi bir deneyin başlatılmasından önce her antijenik preparatın kullanımını belirleyin.
- Alt hücre bileşenleri
- Ticari preparatlar, şirket içi geliştirilmiş bileşenler ve / veya diğer araştırmacılardan dahil olmak üzere kaynaklardan hücre altı bileşenler elde edin.
NOT: Genellikle bakteriyel hücre duvarından gelen alt hücresel bileşenler kullanılabilir ve P6 ve lipooligosakkarit (LOS) 11,12 gibi dış zar proteinlerini içerir. Bu hücre altı bileşenler genellikle uzmanlaşmış merkezlerde türetilir. Nasıl yapıldığının açıklaması bu makalenin kapsamı dışındadır. Bu bileşenleri elde etmek için bu alandaki uzmanlarla doğrudan temas halinde olmanız önerilir.
- Ticari preparatlar, şirket içi geliştirilmiş bileşenler ve / veya diğer araştırmacılardan dahil olmak üzere kaynaklardan hücre altı bileşenler elde edin.
- Öldürülmüş/inaktive edilmiş bakteriler
- Bakterileri uygun numuneden alın (örneğin, balgam veya bronkoskopi). Uygun bir mikrobiyoloji laboratuvarı kullanarak suşu H. influenzae olarak onaylayın. Yazılamaz olduklarını doğrulamak için H. influenzae örneklerinin tiplemesini gerçekleştirin (uzman bir mikrobiyoloji laboratuvarı tarafından).
- Temsili bir antijen elde etmek için, havuzlanmış bir antijen yapmak için birden fazla NTHi suşu (her biri yaklaşık olarak aynı miktarda en az 5) kullanın. Suşları mikrosantrifüj tüplerinde gliserol suyunda -70 ° C'de saklayın.
NOT: Bu deneyde, on farklı suş kullanılmıştır. - Suşları (her seferinde bir mikrosantrifüj tüpü) çikolata agar plakalarına çözün ve% 5 CO2 ile 37 ° C'lik bir inkübatörde gece boyunca büyüyün. Bakterileri 500 μL fosfat tamponlu saline (PBS) ekleyin ve iki kez yıkayın (5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün). NTHi'yi 108 mL'lik bir konsantrasyona (5 mL'lik bir kap veya eşdeğeri kullanarak) alikot etmek için bir MacFarland standart10 veya spektrofotometre13 kullanın.
- Isı, bakterileri 10 dakika boyunca 56 ° C sıcaklıkta bir su banyosuna yerleştirerek etkisiz hale getirin.
- 30 s için düşük-orta aralıklı bir hızda sürekli bir sonikasyon ayarı kullanarak bakterileri sonikleştirin.
- Aliquot uygun hacimdeki numuneleri mikrosantrifüj tüplerine dönüştürün. 108 mL'lik bir numune için, 50 μL'lik alikotlar kullanın (yani, mL başına 20 numune), gerekli14'e kadar -70 ° C'de dondurun.
- Canlı bakteriler
- İlk olarak, canlı bakterileri adım 1.2.1'de belirtildiği gibi karakterize edin. İyi karakterize edilmiş bir suş kullanın. Suşun ayrıca yedek olarak -70 ° C'de gliserol suyunda depolandığından emin olun.
- Bakterileri çikolatalı agar plakaları veya et suyu gibi zenginleştirilmiş ortamlarda büyütün.
- Çikolatalı agar plakalarını kullanmak için, bakterileri steril serpiciler ile en az 3-4 günde bir yayın.
- Alternatif olarak, bakterileri büyütmek için X (hemin) ve V (β-nikotinamid adenin dinükleotid) faktörleri ile zenginleştirilmiş Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI) suyu kullanın. NTHi'yi, hem hemin hem de β-nikotinamid adenin dinükleotid (her ikisi de 10 μg / mL) ve kültürle desteklenmiş 5-10 mL BHI suyundaki gece plakalarından 5-10 mL'lik birCO2 inkübatöründe bir gecede aşılayın.
NOT: Bu, tekrarlanabilirlik, daha yüksek koloni oluşturan birimler (CFU) sayıları ve tüm bakterilerin benzer bir kütük büyümesi aşamasında olması avantajına sahiptir (plakalarda, bakteri canlılığı kültürdeki konuma bağlı olarak daha büyük olabilir)13,15.
- Hücresel canlılığı korurken güçlü bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak için bir hücreye 100 bakterilik çok sayıda enfeksiyon (MOI) kullanın. Bakteri sayısını değerlendirmek için MacFarland Standard10 veya spektrofotometre13'ü kullanın.
- Canlı NTHi testleri için kullanılan medyanın herhangi bir insan serumundan arındırılmış olduğundan emin olun, çünkü bu bakterileri öldürür16. Hayvan serum örnekleri (örneğin, fetal buzağı serumu) genellikle herhangi bir soruna neden olmaz.
NOT: Periferik kan, bronkoskopi örnekleri (özellikle bronkoalveoler lavaj (BAL)) ve rezeke edilmiş akciğer dokusu gibi standart doku örneklerini analiz etmek için aşağıda açıklanan yöntemleri kullanın. Örnekleri Hi antijeni ile 10 dakikadan 24 saate veya daha fazlasına kadar inkübe edin.
2. Fagositik fonksiyonun akım sitometrisi ile değerlendirilmesi
NOT: Bu tahlil, çözelti içindeki hücreleri gerektirir ve tipik olarak tam kanda veya BAL sıvısı kullanılarak yapılır. Bu tahlil, inaktive edilmiş Staphylococcus aureus preparatı ve Pansorbin17'nin kullanımına dayanan daha önce yayınlanmış bir protokolden değiştirilmiştir. İnaktive edilmiş tam kan ve sabit H. influenzae , Pansorbin17 ile değiştirilir.
- Öldürülmüş, inaktive edilmiş NTHi (1.2) ile 100 μg / mL'de propidium iyodür (PI) ile fosfat tamponlu salin (PBS) içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1: 1 oranında karıştırın. 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın ve ardından 500 μL PBS içinde yıkayın. 5 dakika boyunca 450 x g'de döndürün ve peleti 500 μL PBS'de yeniden askıya alın.
- 450 μL periferik kanı (bir insan deneğinin veneponksiyonundan), 50 mL'lik bir tüpte 37 ° C'de bir su banyosunda 20 dakika boyunca H. influenzae etiketli 50 μL inaktive PI ile inkübe edin.
- Numuneleri su banyosundan çıkarın ve 5 μL dihidrorodamin-1,2,3 (DHR) ekleyin. 10 sn boyunca vorteks yapın ve daha sonra 10 dakika daha su banyosuna geri yerleştirin.
- Numuneleri su banyosundan çıkarın ve eritrositleri (yukarıda adım 2.2'de listelenen 500 μL hacim) 10:1 (yani 5 mL)% 0.8 amonyum klorür (150 mM NH4Cl, 1 mM NaHCO3 ve 0.1 mM EDTA) çözeltisi ile lize edin.
NOT: Alternatif olarak, Q-prep gibi otomatik bir sistem kullanılabilir. - Numuneleri bir saat içinde bir akış sitometresinde analiz edin. Temsili sonuçlar elde etmek için her örneklemden en az 3.000-5.000 hücreyi (ilgilenilen her bir alt kümeden) analiz edin (Şekil 1).
- Fagositoz örneklerini analiz etmek için, etiketli bakterileri yutan hücrelerin oranını belirleyin (floresan boyasına sahip hücrelerin oranını ölçün).
- ROS'u, bir floresan sinyaliyle sonuçlanan DHR'nin oksidasyonu ile ölçün (medyan floresandaki değişim, taban çizgisi ve uyarılmış numuneler arasında karşılaştırılır).
NOT: Nötrofiller daha granülerdir ve daha fazla yan saçılmaya sahipken, makrofajlar daha büyüktür ve daha fazla ileri saçılmaya sahiptir. - Nötrofiller ve makrofajları morfolojik olarak birbirlerinden büyüklüklerine (makrofajlar daha büyüktür) ve granülerliklerine (nötrofiller daha granüler) göre ayırt eder.
NOT: Nötrofiller ve makrofajlar için spesifik belirteçler genellikle kullanılmaz, ancak CD14 kan monositlerini etiketlemek için kullanılabilir. Akış sitometrisi, monositlerin ve makrofajların farklı fonksiyonel formlarını (örneğin, M1 ve M2 alt kümeleri)18 ayırt etmek için potansiyel olarak kullanılabilir.
- Tahlili uygun şekilde değiştirin (örneğin; fagositleri uyarmak ve DHR bölünmesi ile ROS ekspresyonunu ölçmek için canlı etiketsiz NTHi kullanın).
- Periferik kan mononükleer hücrelerini yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile izole edin. Kanı yoğunluk gradyanı santrifüjleme için belirlenen polimerin üzerine katlayın ve 30 dakika boyunca 2300 x g'de döndürün. Mononükleer tabakayı bir pipet kullanarak çıkarın, PBS ile iki kez yıkayın ve PBS'deki hücreleri mL başına 106 hücrede yeniden askıya alın.
- Alternatif olarak, BAL makrofajlarını kullanın.
- Monositleri / makrofajları kültür ortamında (RPMI) 106 hücre / mL konsantrasyonunda askıya alın. Onlara adım 1.3'te açıklandığı gibi 1 saat boyunca 100:1'lik bir MOI'de canlı NTHi bulaştırın.
- DHR'yi 10 dakika boyunca adım 2.3'te açıklandığı gibi süspansiyona ekleyin. Akış sitometrisini kullanarak ROS analizini gerçekleştirin.
3. Periferik kanda lenfosit fonksiyonunun değerlendirilmesi
- Akış sitometri testleri için tam kan veya mononükleer hücre preparatları kullanın14.
- Venaponktur ile her konudan örnekler alın. Bir lityum heparin tüpünde periferik bir damardan 4 mL kan toplayın ve kontrol ve antijen stimülasyonu için örnekleri alikotlara bölün.
- Her iki örneğe de kostimülatör antikorlar (anti-CD28 ve CD49d, 1 μL / mL) ekleyin. Antijen örneğine NTHi ekleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin. Öldürülen NTHi preparatı için, 2 mL kana 200 μL antijen ekleyin. Canlı NTHi için, beyaz hücrelere 100: 1'lik bir MOI'de canlı NTHi hücreleri ekleyin (hemositometre ile ölçüldüğü gibi).
- Golgi bloke edici ajan Brefeldin A'yı (10 μL / mL) numunelere ekleyin ve 5 saat daha inkübe edin.
NOT: Golgi aparatının bloke edilmesi, sitokinlerin hücre dışına ihraç edilmesini önler. - Tam kan kullanılıyorsa, çözelti içinde sadece lökositler bırakmak için% 0.8 amonyum klorür (adım 2.4) ile eritrositleri lize edin. Lökositleri 1 saat boyunca 500 μL% 1-2% paraformaldehit kullanarak sabitleyin.
- Hücreleri hemositometre ile sayın, 15 dakika boyunca 100 μL% 0.1 saponin ile 106 hücreyi geçirgenleştirin ve hücreleri floresan etiketli antikorlarla inkübe edin. Hücreleri yıkayın ve bir akış sitometresi kullanarak analiz edin.
NOT: Floresan etiketli antikorların miktarı her sitokin için spesifik olacaktır. Üreticilerin talimatlarını izleyin. Tipik olarak, 100 μL çözelti içindeki 106 hücre 1 saat boyunca boyanır. Ticari olarak elde edilen antikorların çoğu 25-100 test yapmak için yeterli olacaktır. - Antijene yanıt veren hücrelerin oranını, Şekil 2'de gösterildiği gibi ilgili lenfosit popülasyonunu (hücreler CD45, daha sonra CD3 ve daha sonra CD4 veya CD8 ekspresyonu ile geçitlenir) kapatarak belirleyin. Analiz edilecek tüm sitokinler için uyarılmamış hücreler üzerinde arka plan boyama yapın. Hem uyarılmış hücreler hem de kontrol için her bir sitokini analiz etmek için 100.000 hücreyi tarayın.
4. Akciğer dokusunda lenfosit fonksiyonu/inflamatuar mediatörlerin değerlendirilmesi
- Bronkoskopiden yeterli lenfosit elde etmek genellikle mümkün değildir; bu nedenle lobektomi örneklerinden akciğer dokusunu kullanın. Akciğer dokusu örneklerinin optimizasyonu, anatomik patoloji servisi ile yakın ilişki gerektirir. Dokunun tümörden en az 3 cm'lik bir kenar boşluğuna sahip olduğundan ve önemli amfizemi olmayan hücresel doku olduğundan emin olun (patolog tarafından belirlendiği gibi).
- Akciğer dokusunu, akış sitometri testleri için kullanılmadan önce hücresel bir süspansiyona ayırın. Akciğer dokusunu kimyasal olarak sindirin (örneğin, kollajenaz ile) veya mekanik olarak ayrıştırın.
NOT: Dokunun mekanik olarak ayrıştırılması, hücrelerin daha iyi yüzey boyanması ile ilişkili olduğu için tercih edilebilir (örneğin, CD3/4 etiketleme)19.- Bir patologdan lobektomi örnekleri alın (genellikle akciğer kanseri tedavisi gören hastalardan elde edilir). Numunenin yaklaşık 20-40 gramını 3-5 mm3 bölümlere dilimleyin. Uygun bir ayrıştırıcı kullanılarak mekanik olarak parçalanmadan önce steril bir 50 μL haznenin içine yerleştirin.
- Doku ayrışmasından sonra, kırmızı kan hücrelerini adım 2.4'te belirtildiği gibi% 0.8 NH4Cl ile lize edin.
- Hücreleri steril RPMI'da yeniden askıya alın (hacim hücre numaralarına bağlı olacaktır ve genellikle 10-20 mL'dir) ve ardından bunları 100 μm steril naylon ağdan filtreleyin. Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak uygulanabilir hücrelerin sayısını sayın.
- NTHi enfeksiyon testi
- Akciğer hücrelerini, tüp başına 4 x 106 hücre / mL'lik bir son hücre konsantrasyonuna (kontrol ve uyarılmış örnekler) yeniden askıya alın.
- (Negatif) kontrol tüpü için 1 mL RPMI'da 4 x 106-6 x 106 hücreli bir süspansiyon kullanın. NTHi tüpü için aynı miktarı kullanın (herhangi bir ek numune SEB ile pozitif kontrol olarak kullanılabilir). NTHi tüpündeki hücreleri, hücre başına 100 bakterilik bir MOI'de enfekte edin. Tüplerde gaz transferine izin vermek için kapağı yarım rotasyonla gevşetin.
- Hücreleri bir tüp rotatöre yerleştirin ve 12 rpm'de dönerken 37 ° C'de inkübe edin.
- Sitokinlerin hücre dışı ihracatını önlemek için, 10 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona stimülasyondan 1 saat sonra hücre süspansiyonlarına bir Golgi blokeri (Brefeldin A) ekleyin. Hücre süspansiyonlarını rotasyonda 16-22 saatlik bir inkübasyon için iade edin (adım 4.3.3).
- Hücre süspansiyonunu% 1 sığır serum albümini (BSA) ve% 0.01 NaN3 içeren 500 μL PBS ile yıkayın. Hücreleri sırasıyla adım 3.5 ve adım 3.6'da açıklandığı gibi sabitleyin ve geçirgenleştirin.
- Hücre içi sitokin boyama için antikorları ekleyin (antikorların seçimi, adım 3.6'daki NOT'ta listelendiği gibi, araştırmacı tarafından belirlenmelidir). Spesifik insan lenfosit hücre yüzey belirteçleri (örneğin, CD45, CD3, vb.) için hücre süspansiyonunu 1 saat boyunca sabitleyin. Hücreleri PBS ile yıkayın, 3.5-3.6 adımlarında açıklandığı gibi sabitleyin ve geçirgenleştirin.
- Hücreleri hücre içi sitokin boyama antikorları (örneğin, IFN-γ ve TNF-α veya IL-13 ve IL-17A) ile 1 saat boyunca inkübe edin.
NOT: Önce yüzey belirteçlerinin boyanması, daha sonra hücre içi olarak boyanması önerilir, çünkü fiksasyon, antikorların bağlandığı yüzey proteinlerinde konformasyonel değişikliklere neden olabilir. - Hücreleri 500 μL PBS ile yıkayın ve bir akış sitometresinde veri toplamadan önce 100 μL PBS'de yeniden askıya alın.
- Adım 3.2'de açıklanan süpernatantı analiz etmek için bir boncuk dizisi testi birlikte kullanılabilir (Bunu Brefeldin A olmadan gerçekleştirin). Bu, çok çeşitli farklı enflamatuar mediatörlerin (potansiyel olarak 40-50 arabulucuya kadar) analizine izin verir. Süpernatantı 100 μL alikotlarda toplayın ve analize hazır olana kadar -70 ° C'de saklayın. Alternatif olarak, multipleks kemilüminesan tahliller20 kullanılabilir.
- Çözülmüş örnekleri analiz etmek için multipleks boncuk dizileri kullanın. Üreticinin talimatlarını izleyerek sitokin üretimini analiz etmek için depolanan süpernatantı kullanın.
- Bir akış sitometresinde multipleks boncuk dizisinin alımını gerçekleştirin. Aşağı akış veri analizini gerçekleştirmek için ilgili yazılımı kullanın.
NOT: Bu boncuk dizisi testi, periferik kan ve / veya BAL örneklerinden süpernatant üzerinde de yapılabilir.
5. Akciğer proteolizisinin konfokal mikroskopi ile değerlendirilmesi
NOT: Floresan konfokal mikroskopi, akış sitometrisine tamamlayıcıdır ve proteaz ve ROS enflamatuar yanıtlarını değerlendirmek için kullanılabilir. NET'ler ve MET'ler gibi hücre dışı tuzaklar, diğer inflamatuar mediatörlerle, özellikle nötrofil elastaz (NE) ve matriks metalloproteinazlar (MMP) gibi proteazlarla birlikte hücre dışı kromatinden (DNA) oluşur. Konfokal mikroskopi kullanılarak BAL ve akciğer dokusunda değerlendirilebilirler ve bu daha önce Sharma, R. ve ark.21 tarafından tanımlanmıştır.
- Konfokal mikroskopi ve in situ zimografi 15,17 kullanarak akciğer dokusunda doğrudan proteaz ekspresyonunu (adım 4.2.1'de açıklandığı gibi) değerlendirin.
- Taze veya dondurulmuş sabitlenmemiş akciğer dokusu kullanın. 4 μm kalınlığa kadar kesilmiş kesitleri süperdon/yapışma kızaklarına monte edin. Bölümleri 1x reaksiyon tamponunda 5 dakika önceden ısıtın.
- Metalloproteinazların etkisiyle proteolizi ölçmek için floresein etiketli jelatin substratını (bölüm başına 30 μg / mL) doğrudan ayrı slaytlara ekleyin.
- Slaytları yatay konuma yerleştirin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de ışık korumalı, nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.
- Bölümleri monte etmeden önce 1x reaksiyon tamponunda durulayın.
- Negatif kontrol olarak, bölümlere floresan jelatin içermeyen sadece reaksiyon tamponunu ekleyin.
- Substratın lizisini inceleyerek analiz etmek için bir konfokal mikroskop kullanın. Proteoliz kanıtı ile akciğerin alanını belirlemek için ImageJ kullanın. Bunun için, söndürülmüş numunenin arka planının üzerinde lekelenme olan akciğer alanını ölçün. Başka bir kontrol olarak, floresan jelatin eklenmemiş akciğer dokusunu15 olarak kullanın.
NOT: Bunu, her örnek için en az 10 yüksek güçlü görüş alanında (FOV) gerçekleştirin.
- Akciğer dokusundaki hücre dışı ROS ekspresyonunu, 3-nitrotirozin (toksik oksidatif stres ürünü) için immünoreaktivite ile ölçün13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temsili sonuçlar, NTHi'ye inflamatuar immün yanıtların akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi ile nasıl değerlendirilebileceğini / nicelleştirilebileceğini göstermektedir. Sonuçların yorumlanmasının önemli bir kısmı, kontrol ve uyarılmış numuneler arasındaki floresan karşılaştırmasıdır. Numunelerin boyanmasını optimize etmek için genellikle bir dizi ön deney gereklidir. Aynı anda kaç farklı rengin incelenebileceği, akış sitometresi / konfokal mikroskopta bulunan kanal sayısına bağlı olacaktır. 1) ROS üretiminin, 2) insan akciğer dokusunun hücre içi sitokin boyanmasının ve 3) akciğer proteolizini ölçmek için in situ zimografinin değerlendirilmesi için sonuçlar gösterilmiştir.
Şekil 1 , ROS üretiminin monositler tarafından temsilini göstermektedir. ROS'un ölçümü, floresan üretmek için DHR123'ün oksidasyonu ile yapılır. Hücreler kapılıdır ve medyan floresanları akış sitometrisi ile değerlendirilir. Uyarılan numunenin medyan floresansı kontrol ile karşılaştırılır.
Şekil 2 , insan akciğer dokusundan türetilen lenfositler tarafından sitokinlerin hücre içi üretimini göstermektedir. İnflamatuar mediatör üretimini, örneğin lenfositler tarafından sitokin üretimini değerlendirmek için akış sitometri testleri yapılmadan önce akciğer dokusunun tek hücreli süspansiyona bölünmesi gerekir. Akciğer dokusu mekanik olarak parçalanabilir veya kimyasal olarak, örneğin kollajenaz ile sindirilebilir. Mekanik parçalanma yöntemleri, özellikle hücre yüzeyi boyamasının (örneğin, CD3 ve CD4) tutulması açısından üstün sonuçlar üretebilir. Numunelerin filtrelenmesi, analize müdahale edebilecek kalıntıları dışlamak için önemlidir.
Şekil 3 , in situ zymografi ile ölçülen proteaz aktivitesinin ekspresyonunu göstermektedir. Sabit olmayan doku, proteaz aktivitesini değerlendirmek için kullanılır. Bu numuneler tipik olarak analize kadar -70 ° C'de dondurulur. Proteaz floresansı olan dokunun alanı ölçülür ve sonuçlar kontrol ve uyarılmış örnekler arasında karşılaştırılır.
Resim 1: Monositlerle ROS üretimi. (A) Panel, periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) için geçit stratejisini gösterir; fagosit popülasyonunu tanımlamak için ileri saçılma ve yan saçılma kullanılır. Panelde (B), fagosit popülasyonu, monositleri etiketlemek için CD14 ekspresyonu ile daha da tanımlanır. Bu monosit popülasyonu, kontroldeki DHR floresansı (C) ve uyarılmış örnekler (D) için analiz edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Akciğer dokusunda sitokin üretimi. Hücreler ilk önce akış sitometrisi kullanılarak lökosit belirteci CD45 (A) ekspresyonu için analiz edilir. Bu popülasyon daha sonra CD3 ekspresyonu (B) ve CD4 / CD8 ekspresyonu (C) için daha fazla analiz edilir. CD3 / CD4 + hücreleri, kontrol (D) ve NTHi ile uyarılmış örneklerde (E) hücre içi sitokin üretimi için değerlendirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 3: Akciğer in situ zimografisi. Panel (A) akciğer dokusunun bölümlerinde kromatin/DAPI ekspresyonunu gösterir. Panel (B), MMP aktivitesinin varlığını gösteren floresan boyamayı gösterir. Panel (C), MMP aktivitesinin kromatin ekspresyonu ile birlikte lokalize olduğunu gösteren birleştirilmiş görüntüyü gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada listelenen yöntemler, Hi'ye inflamatuar akciğer yanıtı hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için birlikte kullanılabilecek floresan bazlı akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi tekniklerini kullanır.
Kullanılacak Hi'nin uygun antijenik formülasyonunun oluşturulması kritik öneme sahiptir ve bu konuda bir mikrobiyologdan spesifik girdi alınması tavsiye edilir. Live Hi daha güçlü bir tepki verirken, öldürülen Hi preparatları ve Hi bileşenleri daha standartlaştırılmıştır ve depolanması daha kolaydır. PI sadece ölü bakterileri22 olarak etiketleyecektir; karboksifloresein süksinimidilester (CFSE) gibi diğer boyalar, fagositoz testleri23 için canlı bakterileri etiketlemek için kullanılabilir. Uygun antijeni optimize etmek için bir dizi ön deney yapılmalıdır. Canlı NTHi kullanmak için, 100: 1'lik bir MOI en uygunudur; Daha düşük bir MOI net bir bağışıklık tepkisine neden olmayabilirken, daha yüksek bir MOI hücreler için toksik olabilir. Bununla birlikte, bir doz-yanıt eğrisi yararlı bilgiler verebilir ve özellikle tekniğin ilk optimizasyonu ile çok değerli olabilir24. Pozitif bir kontrol olarak, ticari olarak elde edilen inaktive edilmiş bir Staphylococcus aureus antijeni formu kullanılabilir, bu da ROS / fagositoz testi için yukarıdaki gibi PI ile etiketlenir. T hücre tahlilleri için, Stafilokokal süperantijen E (SEB) ile stimülasyon pozitif kontrol19,25 olarak kullanılabilir.
BAL ve/veya akciğer doku örneklerinin alınmasına ilişkin protokollerin açıkça belirlenmesi gerekmektedir. BAL numuneleri farklı operatörler arasında oldukça değişken olabilir. Sağ orta lob lavajı için elde taşınan bir şırınga iyi sonuçlar verir26. Lobektomi örneklerinden akciğer dokusu örneğinin alınması, bir patologla işbirliği kurulmasını gerektirir. Akciğer dokusu örneğinin tümörden bir miktar marjı olmalıdır (ideal olarak en az 3-4 cm). Daha büyük örnekler (örneğin, en az 25-50 g), belirgin amfizem olmadan daha proksimal olan örneklerin yanı sıra daha fazla hücre verecektir. Akciğer dokusunun mekanik ayrışması zaman alıcıdır ve genellikle her örnek için en az 2-3 saat sürecektir19,27.
Hem akış sitometrisi hem de konfokal mikroskopi için farklı floroforların boyanmasını optimize etmek için ön deneyler yapılmalıdır. Odaklanılması gereken alanlar arasında en iyi boyama panelinin belirlenmesi, boyanabilirlik/konsantrasyon ve canlılığı en üst düzeye çıkarmak için hücrelerin/dokuların tedavisiyer alır 28. Akciğer dokusunun kullanımı, kan veya BAL gibi diğer sıvı örneklerinden daha fazla doku enkazı ile ilişkili olabilir ve bu, akış sitometrisi ile farklı hücresel popülasyonların farklılaşması üzerinde bir miktar etkiye sahip olabilir. Uygun antikor seçiminin ön deneylerde belirlenmesi ve optimize edilmesi gerekir. Lenfositlerin yüzey etiketlemesi için, T yardımcı hücreleri için anti-CD3 ve CD4, sitotoksik T hücreleri için anti-CD3 ve CD8 ve NK hücreleri için anti-CD3 ve CD56 kullanılabilir. İncelenecek hücre içi sitokinlerin seçimi, ilgilenilen aracılara ve akış sitometresinde analiz edilebilecek parametrelerin / renklerin sayısına bağlıdır29. Akciğer dokusunda makrofajlarla çalışmanın özel bir zorluğu, yüksek otofloresan seviyesidir30; Bu sorun, uyarılmış hücreleri arka plan kontrolü ile karşılaştırarak ve proteazlar ve histonlar gibi inflamasyon için spesifik belirteçlerin eklenmesiyle ele alınabilir.
Bu tekniklerin bir sınırlaması, deneyleri gerçekleştirmek için uygun şekilde eğitilmiş ve yetenekli personelin gerekliliğidir. İyi kurulmuş akış sitometrisi ve mikroskopi tesisleri de gereklidir. İnsan doku örneklerinin kullanımı, özellikle akciğer dokusu kullanılırken önemli değişkenlik ile ilişkilidir; bu, tahlilleri optimize etmek için bir dizi ön deney gerektirebilir (özellikle arka plan boyama konularında).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Monash Health'teki Klinik İmmünoloji personeline bu çalışmadaki yardımları için teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
- Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
- Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
- King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
- Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
- Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
- Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
- Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, Suppl 1 181-184 (1992).
- Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 6, Unit 6D (2010).
- King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
- Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
- King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
- Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
- King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
- Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
- Sharma, R., O'Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
- Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
- Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
- Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
- Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).
