Summary
헤모필루스 인플루엔자는 호흡기에서 염증을 유발합니다. 이 기사에서는 이 박테리아에 대한 반응으로 식세포와 림프구에 의한 면역 반응을 정의하기 위해 유세포분석 및 컨포칼 현미경을 사용하는 방법에 중점을 둘 것입니다.
Abstract
헤모필루스 인플루엔자 (Hi)는 다양한 호흡기 질환에서 발견되는 널리 퍼진 박테리아입니다. 이 박테리아에 대한 호흡 면역/염증 반응을 평가하기 위해 다양한 분석/기술을 사용할 수 있습니다. 유세포분석 및 컨포칼 현미경은 생물학적 반응의 상세한 특성 분석을 가능하게 하는 형광 기반 기술입니다. 세포벽 성분, 사멸/불활성화 제제 및 살아있는 박테리아를 포함한 다양한 형태의 Hi 항원을 사용할 수 있습니다. Hi는 농축 배지가 필요한 까다로운 박테리아이지만 일반적으로 표준 실험실 환경에서 쉽게 자랄 수 있습니다. 히히로 자극하기 위한 조직 샘플은 말초 혈액, 기관지 내시경 검사, 또는 절제된 폐 (예를 들어, 폐암의 치료를 위해 수술을 받는 환자에서)로부터 수득될 수 있다. 대식세포 및 호중구 기능은 식균작용, 활성 산소 종 및 세포내 사이토카인 생산을 포함하는 측정된 다양한 파라미터와 함께 유세포분석을 사용하여 포괄적으로 평가될 수 있다. 림프구 기능 (예를 들어, T 세포 및 NK 세포 기능)은 주로 세포내 시토카인 생산을 위해 유동 세포측정을 사용하여 특이적으로 평가될 수 있다. Hi 감염은 호중구 (NET)와 대 식세포 (MET) 모두에 의한 세포 외 트랩 생성의 강력한 유도제입니다. 컨포칼 현미경은 틀림없이 NET 및 MET 발현을 평가하는 가장 최적의 방법이며, 이는 프로테아제 활성을 평가하는 데에도 사용될 수 있습니다. 헤모필루스 인플루엔자에 대한 폐 면역은 유세포 분석 및 컨포칼 현미경을 사용하여 평가할 수 있습니다.
Introduction
헤모필루스 인플루엔자(Hi)는 대부분의 건강한 성인의 인두에 존재하는 정상적인 공생 박테리아입니다. 다당류 캡슐 (유형 A-F, 예를 들어, 유형 B 또는 HiB)을 갖거나 캡슐이 결여되어 있고 비유형 (NTHi)1일 수 있다. 이 박테리아에 의한 점막의 식민지화는 어린 시절부터 시작되며, 다른 식민지 균주의 회전율이 있습니다2. 이 박테리아는 또한 상부 및 하부 호흡기 모두를 침범 할 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 면역 반응및 염증 3,4의 활성화를 유도할 수 있다. 이 염증 반응은 임상 질환을 유발할 수 있으며 부비동염, 중이염, 기관지염, 낭포 성 섬유증, 폐렴 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)을 포함한 다양한 중요한 호흡기 상태에 기여할 수 있습니다. 이러한 조건의 대부분은 NTHi 균주2로 인한 것입니다. 이 기사에서는 유세포 분석 및 컨포칼 현미경을 사용하여 Hi에 대한 호흡기 면역 반응을 평가하는 방법을 설명합니다.
하기에 기술된 방법들은 Hi에 대한 염증 반응을 평가하기 위해 변형된 잘 확립된 기술로부터 적응되었다. Hi의 적절한 항원 형태의 선택은 이러한 평가의 핵심 부분이다. 항원 제제는 세포벽 구성 요소에서 살아있는 박테리아에 이르기까지 다양합니다. 분석을 확립하고 표준화하기 위해 말초 혈액 샘플을 사용하는 것이 초기에 매우 도움이 될 수 있습니다.
유세포분석은 세포 수준에서 하나의 샘플에서 다양한 파라미터 및 기능 분석을 측정할 수 있습니다. 이 기술은 효소 결합 면역 흡착 분석 (ELISA) 또는 ELISspot과 같은 다른보다 일반적인 방법과 비교할 때 특정 세포 반응 (예 : 활성 산소 종 (ROS) 또는 세포 내 사이토 카인 생산)을 평가할 수 있다는 장점이 있습니다.
세포외 트랩은 호중구(NET)5,6,7 및 대식세포(MET)와 같은 다른 세포에 의해 발현됩니다.8. 그들은 특히 폐 9의 감염에서 주요 염증 반응으로 점점 더 인식되고있습니다. 이들은 컨포칼 형광 현미경으로 평가할 수 있습니다. 이 기술은 NET/MET의 명확한 식별을 가능하게 하고 그 발현을 다른 형태의 세포 사멸과 구별합니다6.
유세포분석과 컨포칼 현미경은 모두 형광 기반 분석법입니다. 그들의 성공은 생물학적 샘플의 최적 변형 프로토콜에 달려 있습니다. 이러한 방법은 배우는 데 시간이 걸리며 적절한 감독 전문 지식이 필요합니다. 관련된 악기는 구매 및 운영 비용이 모두 비쌉니다. 그들의 사용을위한 최적의 설정은 주요 대학 및 3 차 위탁 병원을 포함합니다.
이 프로토콜에 사용 된 방법은 호흡기 질환과 관련된 다른 유사한 유기체 (예 : Moxarella catarrhalis 및 Streptococcus pneumoniae)의 연구를 위해 양도 할 수 있습니다. NTHi는 또한 다른 일반적인 호흡기 박테리아10과 상호 작용합니다.
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Protocol
이 연구는 Monash Health의 인간 연구 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다.
1. 항원 제제
참고: Hi에 대한 면역 반응을 평가하기 위해 세 가지 다른 항원 제제를 사용할 수 있습니다. 이들은 1) 세포하 성분 (전형적으로 박테리아 세포벽으로부터); 2) 사멸 및 불활성화 박테리아; 3) 살아있는 박테리아. 임의의 실험의 개시 전에 각 항원 제제의 사용을 결정한다.
- 세포 내 구성 요소
- 상업적 제제, 자체 개발 성분 및/또는 다른 연구자로부터 공급원으로부터 세포내 성분을 얻는다.
참고: 일반적으로 박테리아 세포벽의 세포하 구성 요소가 사용될 수 있으며 P6 및 리포올리고당(LOS)11,12와 같은 외부 막 단백질을 포함합니다. 이러한 세포 내 구성 요소는 일반적으로 전문 센터에서 파생됩니다. 어떻게 만들어 졌는지에 대한 설명은이 기사의 범위를 벗어납니다. 이 분야의 전문가와 직접 연락하여 이러한 구성 요소를 얻는 것이 좋습니다.
- 상업적 제제, 자체 개발 성분 및/또는 다른 연구자로부터 공급원으로부터 세포내 성분을 얻는다.
- 사멸/비활성화된 박테리아
- 적절한 샘플에서 박테리아를 얻습니다(예: 객담 또는 기관지 내시경 검사). 적절한 미생물학 실험실을 사용하여 H. 인플루엔자로 균주를 확인하십시오. H. 인플루엔자 샘플의 타이핑을 수행하여 유형이 없는지 확인합니다(전문 미생물학 실험실에서).
- 대표적인 항원을 얻으려면 여러 NTHi 균주(각각 거의 같은 양의 최소 5개)를 사용하여 풀링된 항원을 만드십시오. 균주를 -70°C에서 마이크로원심분리 튜브의 글리세롤 브로스에 보관합니다.
참고: 이 실험에서는 10개의 별개의 균주가 사용되었습니다. - 균주(한 번에 하나의 미세 원심분리 튜브)를 초콜릿 한천 플레이트에서 해동하고 5%CO2가 있는 37°C 인큐베이터에서 밤새 성장합니다. 500μL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 박테리아를 추가하고 두 번 세척합니다(300 x g 에서 5분 동안 회전). MacFarland 표준 10 또는 분광 광도계13 을 사용하여 NTHi를10 8 mL의 농도로 분취합니다 (5 mL 용기 또는 이와 동등한 사용).
- 열은 박테리아를 56 ° C의 온도에서 10 분 동안 수조에 두어 비활성화시킵니다.
- 30 초 동안 중저 범위의 속도로 연속 초음파 처리 설정을 사용하여 박테리아를 초음파 처리합니다.
- 적절한 양의 시료를 마이크로 원심분리 튜브에 분취합니다. 108 mL의 샘플의 경우, 50 μL의 분취량 (즉, mL 당 20 개의 샘플)을 사용하고, 필요할 때까지 -70 °C에서 동결시킨다14.
- 살아있는 박테리아
- 먼저 1.2.1단계에서 언급한 대로 살아있는 박테리아를 특성화합니다. 잘 특성화 된 균주 하나를 사용하십시오. 균주가 또한 예비로서 -70°C에서 글리세롤 배양액에 저장되는지 확인하십시오.
- 초콜릿 한천 접시와 같은 농축 배지 또는 국물에서 박테리아를 성장시킵니다.
- 초콜릿 한천 플레이트를 사용하려면 멸균 스프레더로 최소 3-4일마다 박테리아를 퍼뜨립니다.
- 또는 인자 X (헤민) 및 V (β- 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드)가 풍부한 뇌 심장 주입 (BHI) 국물을 사용하여 박테리아를 성장시킵니다. 헤민 및 β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(둘 다 10μg/mL)가 보충된 BHI 배양액 5-10mL에 하룻밤 플레이트에서 NTHi를 접종하고 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 배양합니다.
참고: 이것은 재현성, 더 높은 집락 형성 단위(CFU) 수 및 모든 박테리아가 유사한 통나무 성장 단계에 있다는 이점이 있습니다(플레이트에서 박테리아 생존율은 배양의 위치에 따라 더 클 수 있음)13,15.
- 하나의 세포에 100 개의 박테리아의 다중성 (MOI)을 사용하여 세포 생존력을 유지하면서 강력한 면역 반응을 유도합니다. MacFarland 표준10 또는 분광 광도계13 을 사용하여 박테리아 수를 평가하십시오.
- 살아있는 NTHi 분석에 사용되는 배지에 박테리아16을 죽일 수 있으므로 인간 혈청이 없는지 확인하십시오. 동물 혈청 샘플 (예를 들어, 태아 송아지 혈청)은 일반적으로 어떠한 문제도 일으키지 않는다.
참고: 아래 설명된 방법을 사용하여 말초 혈액, 기관지 내시경 샘플(특히 기관지 폐포 세척(BAL)) 및 절제된 폐 조직과 같은 표준 조직 샘플을 분석합니다. Hi 항원으로 샘플을 10분에서 24시간 이상 배양합니다.
2. 유세포 분석에 의한 식세포 기능 평가
참고: 이 분석은 용액에 세포가 필요하며 일반적으로 전혈 또는 BAL 유체를 사용하여 수행됩니다. 이 분석은 불활성화된 황색포도상구균 제제 및 Pansorbin17의 사용에 기초하여 이전에 공개된 프로토콜로부터 변형된다. 불활성화된 전혈 및 고정된 H. 인플루엔자는 판소르빈17을 대체한다.
- 사멸되고 비활성화 된 NTHi (1.2)를 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 100 μg / mL의 요오드화 프로피듐 (PI)과 실온에서 30 분 동안 1 : 1 비율로 혼합합니다. 450 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 500μL의 PBS로 세척합니다. 450 x g 에서 5분 동안 스핀다운하고 500μL의 PBS에 펠릿을 재현탁합니다.
- 450 μL의 말초 혈액 (인간 피험자의 정맥 천자로부터)을 5 mL 튜브의 37 ° C 수조에서 20 분 동안 비활성화 된 PI 표지 H. 인플루엔자 50 μL와 함께 배양합니다.
- 수조에서 샘플을 제거하고 5μL의 디히드로로다민-1,2,3(DHR)을 추가합니다. 10 초 동안 와류 한 다음 다시 수조에 10 분 더 두십시오.
- 샘플을 수조로부터 제거하고, 적혈구 (단계 2.2에서 상기 열거된 바와 같은 부피의 500μL)를 10:1 (즉, 5 mL)의 0.8% 염화암모늄 (150 mMNH4Cl, 1 mM NaHCO3, 및 0.1 mM EDTA) 용액으로 용해시킨다.
참고: 또는 Q-prep과 같은 자동화 시스템을 사용할 수 있습니다. - 한 시간 이내에 유세포분석기에서 샘플을 분석합니다. 각 샘플에서 최소 3,000-5,000개의 세포(관심 있는 각 하위 집합에서)를 분석하여 대표 결과를 얻습니다(그림 1).
- 식균 작용에 대한 샘플을 분석하려면 표지 된 박테리아를 섭취 한 세포의 비율을 결정하십시오 (형광 염색이있는 세포의 비율을 측정).
- 형광 신호를 생성하는 DHR의 산화에 의해 ROS를 정량화합니다(중앙값 형광의 이동은 기준선과 자극 샘플 간에 비교됨).
참고: 호중구는 더 세분화되고 측면 산란이 더 많은 반면 대식세포는 더 크고 전방 산란이 더 많습니다. - 호중구와 대 식세포를 크기 (대 식세포가 더 큼)와 세분성 (호중구가 더 세분화 됨)으로 형태 학적으로 구별합니다.
참고: 호중구 및 대식세포에 대한 특정 마커는 일반적으로 사용되지 않지만 CD14는 혈액 단핵구를 표지하는 데 사용될 수 있습니다. 유세포분석은 잠재적으로 단핵구와 대식세포의 상이한 기능적 형태(예: M1 및 M2 서브세트)를 구별하는 데 사용될 수 있습니다18.
- 분석을 적절하게 수정합니다(예: 살아있는 표지되지 않은 NTHi를 사용하여 식세포를 자극하고 DHR 절단에 의한 ROS 발현 측정).
- 밀도 구배 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포를 분리합니다. 밀도 구배 원심분리를 위해 지정된 폴리머 위에 혈액을 층상시키고 2300 x g 에서 30분 동안 회전합니다. 피펫을 사용하여 단핵층을 제거하고, PBS로 2회 세척하고, 세포를 mL당 106 세포로 PBS에 재현탁시킨다.
- 대안으로 BAL 대 식세포를 사용하십시오.
- 단핵구/대식세포를 배양 배지(RPMI)에 106 cells/mL의 농도로 현탁시킨다. 1.3단계에 설명된 대로 1시간 동안 100:1의 MOI로 살아있는 NTHi를 감염시킵니다.
- 2.3단계에 설명된 대로 현탁액에 DHR을 10분 동안 추가합니다. 유세포분석을 사용하여 ROS에 대한 분석을 수행합니다.
3. 말초혈액의 림프구 기능 평가
- 유세포 분석 분석에 전혈 또는 단핵 세포 제제 사용14.
- 정맥 천자로 각 피험자로부터 샘플을 채취하십시오. 리튬 헤파린 튜브의 말초 정맥에서 4mL의 혈액을 수집하고 샘플을 조절 및 항원 자극을 위한 분취량으로 나눕니다.
- 두 샘플 모두에 공동자극항체(항-CD28 및 CD49d, 1μL/mL)를 추가합니다. 항원 샘플에 NTHi를 첨가하고 37°C 및 5%CO2 에서 1시간 동안 배양합니다. 사멸 된 NTHi 제제의 경우 200mL의 혈액에 200μL의 항원을 첨가하십시오. 살아있는 NTHi의 경우 100 : 1의 MOI에서 살아있는 NTHi 세포를 백혈구에 추가합니다 (혈구계로 측정).
- 골지 차단제 브레펠딘 A(10 μL/mL)를 샘플에 첨가하고 5시간 더 배양합니다.
참고: 골지체를 차단하면 사이토카인이 세포 외부로 내보내지는 것을 방지할 수 있습니다. - 전혈을 사용하는 경우 적혈구를 0.8 % 염화 암모늄 (단계 2.4)으로 용해시켜 용액에 백혈구 만 남겨 둡니다. 1 시간 동안 1 % -2 % 파라 포름 알데히드 500 μL를 사용하여 백혈구를 고정하십시오.
- 혈구계로 세포를 계수하고, 106 세포를 100 μL의 0.1% 사포닌으로 15분 동안 투과화하고, 형광 표지된 항체로 세포를 배양한다. 세포를 씻고 유세포 분석기를 사용하여 분석하십시오.
참고: 형광 표지된 항체의 양은 각 사이토카인에 대해 특이적입니다. 제조업체의 지침을 따르십시오. 전형적으로, 100 μL의 용액 중 10개의 6 세포가 1 시간 동안 염색 될 것이다. 상업적으로 얻은 대부분의 항체는 25-100 개의 테스트를 수행하기에 충분합니다. - 그림 2와 같이 관련 림프구 집단(세포는 CD45, CD3, 나중에 CD4 또는 CD8 발현에 의해 게이팅됨)을 게이팅하여 항원 반응 세포의 비율을 결정합니다. 분석할 모든 사이토카인에 대해 자극되지 않은 세포에 대한 배경 염색을 수행합니다. 100,000개의 세포를 스크리닝하여 자극된 세포와 대조군 모두에 대해 각각의 사이토카인을 분석하였다.
4. 폐 조직의 림프구 기능/염증 매개체 평가
- 기관지 내시경 검사에서 충분한 림프구를 얻는 것은 일반적으로 불가능합니다. 따라서 폐엽 절제술 샘플의 폐 조직을 사용하십시오. 폐 조직 샘플의 최적화에는 해부학 병리학 서비스와의 긴밀한 연락이 필요합니다. 조직이 종양에서 최소 3cm의 여백을 가지고 있고 심각한 폐기종이 없는 세포 조직인지 확인합니다(병리학자가 결정함).
- 유세포분석 분석에 사용하기 전에 폐 조직을 세포 현탁액으로 분해합니다. 폐 조직을 화학적으로 (예 : 콜라게나 제로) 소화하거나 기계적으로 분해합니다.
참고: 조직의 기계적 분해는 세포의 더 나은 표면 염색(예: CD3/4 라벨링)과 관련이 있기 때문에 선호될 수 있습니다19.- 병리학자로부터 폐엽 절제술 샘플을 얻습니다(일반적으로 폐암 치료를 받는 환자에게서 얻음). 약 20-40g의 샘플을 3-5mm3 섹션으로 자릅니다. 적절한 분해기를 사용하여 기계적으로 단편화하기 전에 멸균 된 50 μL 챔버 안에 두십시오.
- 조직 분해 후, 적혈구를 단계 2.4에서 언급한 바와 같이 0.8%NH4Cl로 용해시킨다.
- 세포를 멸균 RPMI(부피는 세포 수에 따라 다르며 일반적으로 10-20mL)에 재현탁한 다음 100μm 멸균 나일론 메쉬를 통해 여과합니다. 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다.
- NTHi 감염 분석
- 폐 세포를 튜브당 4 x 106 cells/mL의 최종 세포 농도로 재현탁합니다(대조군 및 자극된 샘플).
- (음성) 컨트롤 튜브에 RPMI 1mL에 4 x 10 6-6 x 106 셀의 현탁액을 사용합니다. NTHi 튜브에 동일한 양을 사용하십시오 (추가 샘플은 SEB와 함께 양성 대조군으로 사용될 수 있음). NTHi 튜브의 세포를 세포당 100개의 박테리아의 MOI로 감염시킵니다. 튜브에서 가스가 전달될 수 있도록 캡을 반 바퀴 풉니다.
- 세포를 튜브 회전 장치에 넣고 12rpm으로 회전하면서 37°C에서 배양합니다.
- 사이토카인의 세포외 수출을 방지하려면 자극 후 1시간 후에 골지 차단제(Brefeldin A)를 최종 농도 10μg/mL로 세포 현탁액에 추가합니다. 회전 시 추가 16-22시간 인큐베이션을 위해 세포 현탁액을 되돌립니다(단계 4.3.3).
- 세포 현탁액을 1% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.01% NaN3을 함유하는 500μL의 PBS로 세척한다. 세포를 각각 단계 3.5 및 단계 3.6에 기재된 바와 같이 고정하고 투과화한다.
- 세포내 사이토카인 염색을 위한 항체를 추가한다 (항체의 선택은 단계 3.6의 참고에 열거된 바와 같이 연구자에 의해 결정된다). 특정 인간 림프구 세포 표면 마커 (예를 들어, CD45, CD3 등)에 대한 세포 현탁액을 1 시간 동안 염색한다. PBS로 세포를 씻고 3.5-3.6 단계에 설명 된대로 고정하고 투과시킵니다.
- 세포를 세포내 시토카인 염색 항체 (예를 들어, IFN-γ 및 TNF-α 또는 IL-13 및 IL-17A)와 함께 1시간 동안 인큐베이션한다.
참고: 표면 마커를 먼저 염색한 다음 고정하면 항체가 결합하는 표면 단백질에 구조적 변화가 발생할 수 있으므로 세포 내에서 염색하는 것이 좋습니다. - 세포를 500μL의 PBS로 세척하고 유세포분석기에서 데이터를 수집하기 전에 100μL의 PBS에 재현탁합니다.
- 비드 어레이 분석은 단계 3.2에 기재된 상청액을 분석하기 위해 함께 사용될 수 있다(이를 Brefeldin A 없이 수행). 이를 통해 다양한 염증 매개체 (잠재적으로 최대 40-50 개의 매개체)를 분석 할 수 있습니다. 상청액을 100 μL 분취량으로 수집하고 분석 준비가 될 때까지 -70°C에서 보관한다. 대안적으로, 다중 화학발광 분석법(20)을 사용할 수 있다.
- 멀티플렉스 비드 배열을 사용하여 해동된 샘플을 분석합니다. 저장된 상청액을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 사이토카인 생산을 분석합니다.
- 유세포분석기 상에서 멀티플렉스 비드 어레이의 획득을 수행한다. 관련 소프트웨어를 사용하여 다운스트림 데이터 분석을 수행합니다.
참고: 이 비드 어레이 분석은 말초 혈액 및/또는 BAL 샘플로부터의 상청액에 대해서도 수행될 수 있다.
5. 공초점 현미경에 의한 폐 단백질 분해 평가
참고: 형광 컨포칼 현미경은 유세포분석에 보완적이며 프로테아제 및 ROS 염증 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. NETs 및 MET와 같은 세포외 트랩은 다른 염증 매개체, 특히 호중구 엘라스타제(NE) 및 기질 금속단백분해효소(MMP)와 같은 프로테아제와 함께 세포외 염색질(DNA)로 구성됩니다. 이들은 컨포칼 현미경을 사용하여 BAL 및 폐 조직에서 평가할 수 있으며, 이는 이전에 Sharma, R. et al.21에 의해 설명되었습니다.
- 공초점 현미경 및 현장 접합15,17을 사용하여 폐 조직(4.2.1단계에 설명된 대로)에서 직접 프로테아제 발현을 평가합니다.
- 신선하거나 냉동 고정되지 않은 폐 조직을 사용하십시오. 4μm 두께로 자른 섹션을 슈퍼프로스트/접착 슬라이드에 장착합니다. 1x 반응 버퍼에서 섹션을 5분 동안 예열합니다.
- 플루오레세인 표지된 젤라틴 기질(섹션당 30μg/mL)을 개별 슬라이드에 직접 추가하여 금속단백분해효소의 작용을 통한 단백질 분해를 측정합니다.
- 슬라이드를 수평 위치에 놓고 37°C의 빛으로 보호되는 가습 챔버에서 1시간 동안 배양합니다.
- 장착하기 전에 1x 반응 완충액으로 섹션을 헹굽니다.
- 음성 대조군으로서, 형광 젤라틴이 없는 반응 완충액만을 절편에 첨가한다.
- 컨포칼 현미경을 사용하여 검사에 의한 기질의 용해를 분석합니다. ImageJ를 사용하여 단백질 분해의 증거가있는 폐 면적을 결정하십시오. 이를 위해 담금질 된 샘플의 배경 위에 얼룩이있는 폐 영역을 측정하십시오. 다른 대조군으로서, 형광 젤라틴15가 첨가되지 않은 폐 조직을 사용한다.
참고: 각 샘플에 대해 최소 10개의 고출력 시야(FOV)에서 이 작업을 수행합니다.
- 3-니트로티로신(독성 산화 스트레스 생성물)에 대한 면역반응성으로 폐 조직에서 세포외 ROS 발현을 측정합니다13.
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Representative Results
대표적인 결과는 NTHi에 대한 염증성 면역 반응이 유세포 분석 및 공초점 현미경으로 어떻게 평가 / 정량화 될 수 있는지 보여줍니다. 결과 해석의 핵심 부분은 대조군과 자극 샘플 간의 형광 비교입니다. 일반적으로 샘플의 염색을 최적화하기 위해 많은 예비 실험이 필요합니다. 동시에 검사할 수 있는 색상의 수는 유세포분석기/컨포칼 현미경에서 사용할 수 있는 채널 수에 따라 다릅니다. 폐 단백질 분해를 측정하기 위한 1) ROS 생산, 2) 인간 폐 조직의 세포내 사이토카인 염색, 및 3) 계내 자이뮤 노그래피의 평가에 대한 결과가 표시됩니다.
도 1 은 단핵구에 의한 ROS 생산의 표현을 나타낸다. ROS의 측정은 DHR123의 산화에 의해 형광을 생성한다. 세포는 게이트가 부착되고 중앙 형광은 유세포 분석으로 평가됩니다. 자극된 샘플의 중간 형광을 대조군과 비교한다.
도 2 는 인간 폐 조직으로부터 유래된 림프구에 의한 사이토카인의 세포내 생산을 나타낸다. 림프구에 의한 사이토카인 생산과 같은 염증 매개체 생산을 평가하기 위해 유세포분석 분석을 수행하기 전에 폐 조직을 단일 세포 현탁액으로 분해해야 합니다. 폐 조직은 기계적으로 분해되거나 화학적으로, 예를 들어 콜라게나제에 의해 소화될 수 있습니다. 기계적 분해 방법은 특히 세포 표면 염색(예: CD3 및 CD4)을 유지하는 측면에서 우수한 결과를 생성할 수 있습니다. 시료의 여과는 분석을 방해할 수 있는 파편을 배제하는 데 중요합니다.
도 3 은 계내 자이모 그래피에 의해 측정된 프로테아제 활성의 발현을 나타낸다. 고정되지 않은 조직은 프로테아제 활성을 평가하는 데 사용됩니다. 이들 샘플은 전형적으로 분석될 때까지 -70°C에서 동결된다. 프로테아제 형광을 갖는 조직의 면적을 측정하고, 결과를 대조군 샘플과 자극된 샘플 간에 비교한다.
그림 1: 단핵구에 의한 ROS 생산. (A) 패널은 식세포 집단을 정의하기 위해 전방 산란 및 측면 산란이 사용되는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에 대한 게이팅 전략을 보여줍니다. 패널 (B)에서, 식세포 집단은 단핵구를 표지하는 CD14 발현에 의해 추가로 정의된다. 이 단핵구 집단은 대조군 (C) 및 자극 된 샘플 (D)에서 DHR 형광에 대해 분석됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 폐 조직에서의 사이토카인 생산. 세포는 먼저 유동 세포분석을 사용하여 백혈구 마커 CD45(A)의 발현에 대해 분석된다. 그런 다음 이 집단을 CD3 발현 (B) 및 CD4/CD8 발현 (C)에 대해 추가로 분석합니다. CD3/CD4+ 세포는 대조군(D) 및 NTHi 자극 샘플(E)에서 세포내 사이토카인 생산에 대해 평가됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 폐 현장 자이모그래피. 패널 (A)는 폐 조직의 절편에서 염색질/DAPI의 발현을 나타낸다. 패널 (B)는 MMP 활성의 존재를 나타내는 형광 염색을 나타낸다. 패널 (C)는 MMP 활성이 또한 크로마틴의 발현과 공동국재화됨을 나타내는 병합된 이미지를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 나열된 방법은 Hi에 대한 염증성 폐 반응에 대한 자세한 정보를 얻기 위해 함께 사용할 수 있는 형광 기반 유동 세포분석 및 공초점 현미경 기술을 사용합니다.
사용되는 Hi의 적절한 항원 제형을 확립하는 것이 중요하며, 이와 관련하여 미생물학자로부터 구체적인 의견을 듣는 것이 좋습니다. Live Hi는 더 강한 반응을 유도하는 반면, 사멸 Hi 제제 및 Hi 구성 요소는 더 표준화되고 저장하기 쉽습니다. PI는 죽은 박테리아22에만 라벨을 붙입니다. 카르복시플루오레세인 숙신이미딜에스테르(CFSE)와 같은 다른 염료는 식균작용 분석23을 위해 살아있는 박테리아를 표지하는 데 사용될 수 있습니다. 적절한 항원을 최적화하기 위해 일련의 예비 실험을 수행해야합니다. 라이브 NTHi를 사용하려면 100:1의 MOI가 최적입니다. 낮은 MOI는 명확한 면역 반응을 유도하지 않을 수 있지만 높은 MOI는 세포에 유독 할 수 있습니다. 그러나, 용량-반응 곡선은 유용한 정보를 제공할 수 있고, 특히 기술(24)의 초기 최적화와 함께 매우 가치가 있을 수 있다. 양성 대조군으로서, 상업적으로 수득된 형태의 불활성화된 황색포도상구균 항원이 사용될 수 있으며, 이는 또한 ROS/식작용 분석을 위해 위와 같이 PI로 표지된다. T 세포 분석을 위해, 포도상구균 초항원 E (SEB)에 의한 자극이 양성 대조군으로서 사용될 수 있다19,25.
BAL 및/또는 폐 조직 샘플을 얻기 위한 프로토콜을 명확하게 설정해야 합니다. BAL 샘플은 연산자마다 매우 가변적일 수 있습니다. 오른쪽 중간 엽 세척을위한 휴대용 주사기는 좋은 결과를 산출합니다26. 폐엽 절제술 샘플에서 폐 조직 샘플을 얻으려면 병리학자와의 협력이 필요합니다. 폐 조직 샘플은 종양에서 약간의 여유가 있어야합니다 (이상적으로는 적어도 3-4cm). 더 큰 샘플 (예 : 최소 25-50g)은 더 많은 세포뿐만 아니라 명백한 폐기종이없는 근위 샘플을 생성합니다. 폐 조직의 기계적 분해는 시간이 많이 걸리며 일반적으로 각 샘플19,27에 대해 적어도 2-3 시간이 걸립니다.
유세포분석과 컨포칼 현미경 모두에 대해 다양한 형광단의 염색을 최적화하기 위해 예비 실험을 수행해야 합니다. 집중해야 할 영역에는 최상의 염색 패널 식별, 염색/농축 및 생존력을 극대화하기 위한 세포/조직 처리가 포함됩니다28. 폐 조직의 사용은 혈액 또는 BAL과 같은 다른 유체 샘플보다 더 많은 조직 파편과 관련될 수 있으며, 이는 유세포분석에 의한 상이한 세포 집단의 분화에 약간의 영향을 미칠 수 있다. 항체의 적절한 선택은 예비 실험에서 결정되고 최적화되어야 합니다. 림프구의 표면 표지를 위해, 항 -CD3 및 CD4는 T 헬퍼 세포에, 항 -CD3 및 CD8은 세포 독성 T 세포에, 항 -CD3 및 CD56은 NK 세포에 사용될 수있다. 연구될 세포내 사이토카인의 선택은 관심있는 매개체 및 유동 세포분석기(29) 상에서 분석될 수 있는 파라미터/색상의 수에 의존한다. 폐 조직에서 대식세포로 작업하는 특정 과제는 높은 수준의 자가형광30; 이 문제는 자극 된 세포를 배경 대조군과 비교하고 프로테아제 및 히스톤과 같은 염증에 대한 특정 마커를 추가함으로써 처리 할 수 있습니다.
이러한 기술의 한계는 실험을 수행하기 위해 적절하게 훈련되고 숙련 된 직원이 필요하다는 것입니다. 잘 정립된 유세포분석 및 현미경 시설도 필요합니다. 인간 조직 샘플의 사용은 특히 폐 조직을 사용할 때 상당한 가변성과 관련이 있습니다. 이를 위해서는 분석을 최적화하기 위해 일련의 예비 실험이 필요할 수 있습니다(특히 배경 염색 문제가 있는 경우).
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 이 작업에 도움을 준 Monash Health의 임상 면역학 직원에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
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