Summary
インフルエンザ 菌は気道に炎症を誘発します。この記事では、フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡を使用して、この細菌に応答する食細胞とリンパ球による免疫応答を定義することに焦点を当てます。
Abstract
インフルエンザ菌 (Hi)は、さまざまな呼吸器疾患に見られる一般的な細菌です。この細菌に対する呼吸器免疫/炎症反応を評価するために、さまざまな異なるアッセイ/技術を使用できます。フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡は、生物学的反応の詳細な特性評価を可能にする蛍光ベースの技術です。細胞壁成分、死滅/不活化製剤、生菌など、さまざまな形態のHi抗原を使用できます。Hiは、濃縮培地を必要とする潔癖な細菌ですが、一般的に標準的な実験室の設定では増殖しやすいです。Hiによる刺激のための組織サンプルは、末梢血、気管支鏡検査、または切除された肺から得ることができる(例えば、肺癌の治療のための手術を受けている患者において)。マクロファージおよび好中球の機能は、食作用、活性酸素種、細胞内サイトカイン産生など、さまざまなパラメータを測定したフローサイトメトリーを使用して包括的に評価できます。リンパ球機能(例えば、T細胞およびNK細胞機能)は、主に細胞内サイトカイン産生について、フローサイトメトリーを用いて特異的に評価され得る。Hi感染は、好中球(NET)とマクロファージ(MET)の両方による細胞外トラップ産生の強力な誘導因子です。共焦点顕微鏡法は、NETおよびMET発現を評価するための最も最適な方法であり、プロテアーゼ活性の評価にも使用できます。 インフルエンザ 菌に対する肺免疫は、フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡を使用して評価できます。
Introduction
インフルエンザ菌 (Hi)は、ほとんどの健康な成人の咽頭に存在する正常な共生細菌です。Hiは、多糖カプセル(タイプA〜F、例えばタイプBまたはHiB)を有するか、またはカプセルを欠いており、タイプ不可能(NTHi)1である。この細菌による粘膜のコロニー形成は幼児期に始まり、異なるコロニー形成株の代謝回転があります2。この細菌はまた、上気道と下気道の両方に侵入することができます。これに関連して、免疫応答および炎症の活性化を誘導し得る3、4。この炎症反応は臨床疾患を引き起こし、副鼻腔炎、中耳炎、気管支炎、嚢胞性線維症、肺炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)など、さまざまな重要な呼吸器疾患の一因となる可能性があります。これらの状態のほとんどは、NTHi株2によるものです。この記事では、フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡を使用してHiに対する呼吸免疫応答を評価する方法について説明します。
以下に記載される方法は、Hiに対する炎症反応を評価するために改変された十分に確立された技術から適応されている。Hiの適切な抗原形態の選択は、この評価の重要な部分です。抗原製剤は、細胞壁成分から生きた細菌まで多岐にわたります。アッセイを確立して標準化するために、末梢血サンプルの使用は最初は非常に役立つかもしれません。
フローサイトメトリーは、細胞レベルで1つのサンプルからさまざまなパラメータと機能アッセイの測定を可能にします。この技術は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)またはELISspotなどの他のより一般的な方法と比較した場合に、特定の細胞応答(例えば、活性酸素種(ROS)の産生または細胞内サイトカイン産生)を評価できるという利点を有する。
細胞外トラップは、好中球(NET)5,6,7およびマクロファージ(MET)などの他の細胞によって発現されます8。それらは、特に肺9の感染症において、重要な炎症反応としてますます認識されています。それらは共焦点蛍光顕微鏡によって評価され得る。この手法により、NET/METの決定的な同定が可能になり、その発現が他の形態の細胞死と区別されます6。
フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡はどちらも蛍光ベースのアッセイです。それらの成功は、生物学的サンプルの最適なひずみプロトコルに依存しています。これらの方法は学習に時間がかかり、適切な監督の専門知識が必要です。関連する機器は、購入と実行の両方に費用がかかります。それらの使用に最適な設定には、主要な大学と三次紹介病院が含まれます。
このプロトコルで使用される方法は、呼吸器疾患に関与する他の同様の生物(例えば、 Moxarella catarrhalis および 肺炎連鎖球菌)の研究に転用可能である。NTHiはまた、他の一般的な呼吸器細菌とも相互作用します10。
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Protocol
この作業は、モナッシュヘルスの人間の研究倫理委員会によって承認されました。プロトコルは、人間の研究倫理委員会のガイドラインに従います。
1.抗原製剤
注:Hiに対する免疫応答を評価するために、3つの異なる抗原製剤を使用できます。これらは、1)細胞内成分(典型的には細菌細胞壁由来)であり;2)死滅し不活化した細菌;3)生きたバクテリア。実験を開始する前に、各抗原製剤の使用を決定します。
- 細胞内成分
- 市販の製剤、社内で開発された成分、および/または他の研究者からの供給源から細胞内成分を入手します。
注:通常、細菌の細胞壁由来の細胞内成分が使用され、P6やリポオリゴ糖(LOS)などの外膜タンパク質が含まれます11,12。これらの細胞内成分は通常、特殊なセンターに由来します。それらがどのように作られるかの説明は、この記事の範囲を超えています。これらのコンポーネントを入手するには、この分野の専門家と直接連絡することをお勧めします。
- 市販の製剤、社内で開発された成分、および/または他の研究者からの供給源から細胞内成分を入手します。
- 死滅/不活化細菌
- 適切なサンプル(喀痰や気管支鏡検査など)から細菌を取得します。適切な微生物学研究所を使用して、菌株を インフルエンザ菌 として確認してください。 H.インフルエンザ サンプルのタイピングを実行して、タイプできないことを確認します(専門の微生物学研究所による)。
- 代表的な抗原を得るには、複数のNTHi株(少なくとも5つ、それぞれほぼ同じ量)を使用して、プールされた抗原を作成します。菌株を-70°Cの微量遠心チューブ内のグリセロールブロスで保存します。
注:この実験では、10の異なる菌株が使用されました。 - 菌株(一度に1本の微量遠心チューブ)をチョコレート寒天プレート上に解凍し、5%CO2を含む37°Cのインキュベーターで一晩増殖させます。細菌を500 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に加え、2回洗浄します(300 x gで5分間回転させます)。マクファーランド標準10または分光光度計13を使用して、NTHiを10 8 mLの濃度に分注します(5 mL容器または同等のものを使用)。
- 細菌を56°Cの温度の水浴に10分間入れて、細菌を熱不活性化します。
- 30秒間、低から中域の速度で連続超音波処理設定を使用して細菌を超音波処理します。
- 適切な量のサンプルを微量遠心チューブに分注します。108 mLのサンプルの場合、50 μLのアリコート(つまり、1mLあたり20サンプル)を使用し、必要になるまで-70°Cで凍結します14。
- 生きたバクテリア
- まず、ステップ1.2.1で述べたように生きた細菌を特徴付けます。よく特徴付けられた株を1つ使用してください。菌株が予備として-70°Cのグリセロールブロスにも保存されていることを確認してください。
- チョコレート寒天プレートやブロスなどの濃縮培地でバクテリアを増殖させます。
- チョコレート寒天プレートを使用するには、滅菌スプレッダーで最低3〜4日ごとにバクテリアを広げます。
- または、因子X(ヘミン)およびV因子(β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)が豊富なブレインハートインフュージョン(BHI)ブロスを使用して細菌を増殖させます。ヘミンとβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(両方とも10 μg / mL)の両方を添加した5〜10 mLのBHIブロスで一晩プレートからNTHiを接種し、5%CO2 インキュベーターで37°Cで一晩培養します。
注:これには、再現性、コロニー形成単位(CFU)数の増加、およびすべての細菌が丸太増殖の同様の段階にあるという利点があります(プレート上では、培養中の位置に応じて細菌の生存率が高くなる可能性があります)13,15。
- 1つの細胞に100個の細菌の多重度感染(MOI)を使用して、細胞の生存率を維持しながら強力な免疫応答を誘発します。マクファーランドスタンダード10 または分光光度計13 を使用して、細菌の数を評価します。
- 生きたNTHiアッセイに使用される培地にヒト血清が含まれていないことを確認してください, これは細菌を殺すので16.動物血清サンプル(例えば、ウシ胎児血清)は、一般的に問題を引き起こしません。
注:以下に説明する方法を使用して、末梢血、気管支鏡検査サンプル(特に気管支肺胞洗浄(BAL))、切除された肺組織などの標準的な組織サンプルを分析します。サンプルをHi抗原で10分から24時間以上インキュベートします。
2. フローサイトメトリーによる貪食機能の評価
注:このアッセイは溶液中の細胞を必要とし、通常、全血またはBAL液を使用して行われます。このアッセイは、不活化 黄色ブドウ球 菌調製物およびパンソルビン17の使用に基づく以前に公開されたプロトコールから改変される。不活化全血および固定 されたインフルエンザ菌 は、パンソルビン17の代わりになる。
- 死滅した不活化NTHi(1.2)とヨウ化プロピジウム(PI)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で100 μg/mLで室温で30分間1:1の比率で混合します。450 x g で5分間遠心分離した後、500 μLのPBSで洗浄します。450 x g で5分間スピンダウンし、ペレットを500 μLのPBSに再懸濁します。
- 450 μLの末梢血(ヒト被験者の静脈穿刺から)を50 μLの不活化PI標識 インフルエンザ 菌とともに、5 mLチューブ中の37°Cの水浴中で20分間インキュベートします。
- サンプルを水浴から取り出し、5 μLのジヒドロローダミン-1,2,3(DHR)を加えます。10秒間ボルテックスしてから、さらに10分間水浴に戻します。
- サンプルを水浴から取り出し、赤血球(上記のステップ2.2に記載されている容量500 μL)を10:1(つまり、5 mL)の0.8%塩化アンモニウム(150 mM NH4Cl、1 mM NaHCO3、および0.1 mM EDTA)溶液で溶解します。
注:または、Q-prepなどの自動システムを使用することもできます。 - 1時間以内にフローサイトメーターでサンプルを分析します。各サンプルから(関心のある各サブセットから)最低3,000〜5,000個の細胞を分析して、代表的な結果を取得します(図1)。
- 貪食のためにサンプルを分析するために、摂取された標識細菌を有する細胞の割合を決定する(蛍光染色を有する細胞の割合を測定する)。
- DHRの酸化によってROSを定量し、蛍光シグナルを生じます(蛍光の中央値のシフトは、ベースラインサンプルと刺激サンプルの間で比較されます)。
注:好中球はより粒状で側方散乱が多いですが、マクロファージはより大きく、前方散乱が多くなっています。 - 好中球とマクロファージを形態学的に区別するのは、そのサイズ(マクロファージが大きい)と粒度(好中球はより粒状)です。
注:好中球およびマクロファージの特異的マーカーは一般的に使用されませんが、CD14は血液単球の標識に使用できます。フローサイトメトリーは、単球とマクロファージの異なる機能形態(例えば、M1およびM2サブセット)を区別するために使用される可能性があります18。
- アッセイを適宜修正する(例えば、生きた非標識NTHiを使用して食細胞を刺激し、DHR切断によるROS発現を測定する)。
- 末梢血単核細胞を密度勾配遠心分離により単離します。密度勾配遠心分離用に指定されたポリマーの上に血液を重ね、2300 x g で30分間スピンします。ピペットを使用して単核層を除去し、PBSで2回洗浄し、細胞をPBSに106 細胞/mLで再懸濁します。
- 別の方法として、BALマクロファージを使用してください。
- 単球/マクロファージを106 細胞/mLの濃度で培地(RPMI)に懸濁します。手順1.3で説明されているように、100:1のMOIで1.3時間生きたNTHiに感染させます。
- 手順2.3の説明に従って、DHRを懸濁液に10分間追加します。フローサイトメトリーを使用してROSの分析を実行します。
3.末梢血中リンパ球機能の評価
- フローサイトメトリーアッセイに全血または単核球製剤を使用する14.
- 静脈穿刺によって各被験者からサンプルを取得します。リチウムヘパリンチューブの末梢静脈から4 mLの血液を採取し、サンプルをアリコートに分割して制御と抗原刺激を行います。
- 共刺激抗体(抗CD28およびCD49d、1 μL / mL)を両方のサンプルに追加します。抗原サンプルにNTHiを加え、37°C、5%CO2 で1時間インキュベートします。死滅したNTHi製剤の場合、200 μLの抗原を2 mLの血液に加えます。生NTHiの場合、生NTHi細胞を100:1のMOIで白血球に追加します(血球計算盤で測定)。
- ゴルジ体ブロッキング剤のブレフェルジンA(10 μL/mL)をサンプルに加え、さらに5時間インキュベートします。
注:ゴルジ体をブロックすると、サイトカインが細胞外に輸出されるのを防ぎます。 - 全血を使用する場合は、赤血球を0.8%塩化アンモニウムで溶解し(ステップ2.4)、白血球のみを溶液中に残します。500μLの1%-2%パラホルムアルデヒドを1時間使用して白血球を固定します。
- 血球計算盤で細胞をカウントし、10μL の0.1%サポニンで10 6個の細胞を15分間透過処理し、蛍光標識抗体で細胞をインキュベートします。細胞を洗浄し、フローサイトメーターを使用して分析します。
注:蛍光標識抗体の量は、サイトカインごとに特異的です。製造元の指示に従ってください。通常、100 μLの溶液中の106 細胞を1時間染色します。ほとんどの市販の抗体は、25〜100回の検査を行うのに十分です。 - 図2に示すように、関連するリンパ球集団(細胞はCD45、次にCD3、および後でCD4またはCD8発現によってゲーティングされる)をゲーティングすることにより、抗原応答細胞の割合を決定します。分析するすべてのサイトカインについて、非刺激細胞のバックグラウンド染色を実行します。100,000個の細胞をスクリーニングして、刺激された細胞とコントロールの両方の各サイトカインを分析します。
4.肺組織におけるリンパ球機能/炎症メディエーターの評価
- 気管支鏡検査から十分なリンパ球を得ることは通常不可能です。したがって、葉切除サンプルからの肺組織を使用してください。肺組織サンプルの最適化には、解剖病理学サービスとの緊密な連携が必要です。組織が腫瘍から少なくとも3 cmのマージンを持ち、重大な肺気腫のない細胞組織であることを確認してください(病理学者によって決定されます)。
- フローサイトメトリーアッセイに使用する前に、肺組織を細胞懸濁液に分解してください。肺組織を化学的に(コラゲナーゼなどで)消化するか、機械的に分解します。
注:組織の機械的脱凝集は、細胞のより良い表面染色(CD3/4標識など)に関連しているため、好ましい場合があります19。- 病理学者から葉切除サンプルを入手してください(通常、肺がんの治療を受けている患者から入手)。約20〜40gのサンプルを3〜5mm3 の切片にスライスする。滅菌済みの50 μLチャンバー内に置き、適切なディスアグリゲーターを使用して機械的に断片化します。
- 組織脱凝集後、ステップ2.4で述べたように、赤血球を0.8%NH4Clで溶解します。
- 細胞を滅菌RPMI(容量は細胞数に依存し、通常は10〜20 mL)に再懸濁し、100 μmの滅菌ナイロンメッシュでろ過します。トリパンブルー排除法を使用して生細胞の数をカウントします。
- NTHi感染アッセイ
- 肺細胞をチューブあたり4 x 106 細胞/ mLの最終細胞濃度に再懸濁します(対照および刺激サンプル)。
- (陰性)コントロールチューブには、1 mLのRPMIに4 x 10 6-6x 10 6細胞の懸濁液を使用します。NTHiチューブに同じ量を使用します(追加のサンプルはSEBのポジティブコントロールとして使用できます)。NTHiチューブ内の細胞を細胞あたり100細菌のMOIで感染させます。キャップを半回転緩めて、チューブ内のガス移動を可能にします。
- 細胞をチューブローテーターに入れ、12rpmで回転させながら37°Cでインキュベートします。
- サイトカインの細胞外への輸送を防ぐために、刺激の1時間後にゴルジ遮断薬(ブレフェルジンA)を細胞懸濁液に最終濃度10 μg/mLまで加えます。細胞懸濁液を回転時にさらに16〜22時間インキュベートするために戻す(ステップ4.3.3)。
- 細胞懸濁液を、1%ウシ血清アルブミン(BSA)および0.01%NaN3を含む500 μLのPBSで洗浄します。細胞を固定し、それぞれステップ3.5およびステップ3.6に記載されるように透過処理する。
- 細胞内サイトカイン染色用の抗体を追加します(抗体の選択は、ステップ3.6のNOTEに記載されているように、研究者が決定する必要があります)。特定のヒトリンパ球細胞表面マーカー(CD45、CD3など)の細胞懸濁液を1時間染色します。細胞をPBSで洗浄し、ステップ3.5〜3.6の説明に従ってそれらを固定して透過処理します。
- 細胞内サイトカイン染色抗体(IFN-γおよびTNF-αまたはIL-13およびIL-17Aなど)で細胞を1時間インキュベートします。
注:固定は抗体が結合する表面タンパク質の立体構造変化を引き起こす可能性があるため、最初に表面マーカーを染色し、次に細胞内を染色することをお勧めします。 - 細胞を500 μLのPBSで洗浄し、100 μLのPBSに再懸濁してから、フローサイトメーターでデータを取得します。
- ビーズアレイアッセイは、ステップ3.2(ブレフェルジンAなしでこれを実行する)に記載される上清を分析するために併せて使用され得る。これにより、多種多様な異なる炎症メディエーター(潜在的に最大40〜50個のメディエーター)の分析が可能になります。上清を100 μLアリコートで回収し、分析の準備ができるまで-70°Cで保存します。あるいは、マルチプレックス化学発光アッセイ20を使用することができる。
- マルチプレックスビーズアレイを使用して、解凍したサンプルを分析します。保存された上清を使用して、製造元の指示に従ってサイトカイン産生を分析します。
- マルチプレックスビーズアレイの取得をフローサイトメーターで行います。関連するソフトウェアを使用して、ダウンストリームデータ分析を実行します。
注:このビーズアレイアッセイは、末梢血および/またはBALサンプルの上清に対しても実行できます。
5. 共焦点顕微鏡による肺タンパク質分解の評価
注:蛍光共焦点顕微鏡はフローサイトメトリーと補完的であり、プロテアーゼおよびROS炎症反応の評価に使用できます。NETやMETなどの細胞外トラップは、細胞外クロマチン(DNA)と他の炎症メディエーター、特に好中球エラスターゼ(NE)やマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)などのプロテアーゼで構成されています。それらは共焦点顕微鏡を用いてBALおよび肺組織において評価することができ、これはSharma、R.らによって以前に説明されている21。
- 共焦点顕微鏡およびin situザイモグラフィ15,17を使用して、肺組織における直接プロテアーゼ発現を評価します(ステップ4.2.1に記載)。
- 新鮮または凍結した未固定の肺組織を使用してください。4μmの厚さにカットされた切片をスーパーフロスト/接着スライドに取り付けます。切片を1x反応バッファーで5分間予熱します。
- フルオレセイン標識ゼラチン基質(切片あたり30 μg/mL)を個々のスライドに直接添加し、メタロプロテイナーゼの作用によるタンパク質分解を測定します。
- スライドを水平位置に置き、光で保護された加湿チャンバーで37°Cで1時間インキュベートします。
- マウントする前に、1x反応バッファーで切片をすすぎます。
- 陰性対照として、蛍光ゼラチンを含まない反応緩衝液のみを切片に加える。
- 共焦点顕微鏡を使用して、検査によって基質の溶解をアッセイします。ImageJを使用して、タンパク質分解の証拠とともに肺の領域を決定します。このために、急冷されたサンプルの背景の上に染色がある肺領域を測定します。別の対照として、蛍光ゼラチンを添加していない肺組織を使用する15。
注意: これは、サンプルごとに最低10の高出力視野(FOV)で実行します。
- 3-ニトロチロシン(有毒な酸化ストレス産物)の免疫反応性によって、肺組織における細胞外ROS発現を測定します13。
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Representative Results
代表的な結果は、NTHiに対する炎症性免疫応答をフローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡によってどのように評価/定量できるかを示しています。結果の解釈の重要な部分は、対照サンプルと刺激サンプル間の蛍光の比較です。サンプルの染色を最適化するには、通常、いくつかの予備実験が必要です。同時に検査できる色の数は、フローサイトメーター/共焦点顕微鏡で利用可能なチャンネル数によって異なります。1)ROS産生、2)ヒト肺組織の細胞内サイトカイン染色、および3)肺タンパク質分解を測定するための in situ ザイモグラフィの評価の結果が示されています。
図1 は、単球によるROS産生の表現を示す。ROSの測定は、蛍光を生成するDHR123の酸化によるものです。細胞をゲートオンにし、蛍光の中央値をフローサイトメトリーで評価します。刺激されたサンプルの蛍光の中央値をコントロールと比較します。
図2 は、ヒト肺組織由来のリンパ球によるサイトカインの細胞内産生を示す。リンパ球によるサイトカイン産生などの炎症メディエーター産生を評価するためにフローサイトメトリーアッセイを実施する前に、肺組織を単一細胞懸濁液に分解する必要があります。肺組織は、機械的に分解するか、または化学的に、例えばコラゲナーゼによって消化することができる。機械的破壊法は、特に細胞表面染色(例えば、CD3およびCD4)を保持するという点で、優れた結果を生み出す可能性がある。サンプルのフィルタリングは、分析を妨げる可能性のある破片を排除するために重要です。
図3 は、 in situ ザイモグラフィにより測定されたプロテアーゼ活性の発現を示す。未固定組織は、プロテアーゼ活性を評価するために使用されます。これらのサンプルは通常、分析されるまで-70°Cで凍結されます。プロテアーゼ蛍光を有する組織の面積を測定し、対照サンプルと刺激サンプルの間で結果を比較します。
図1:単球によるROS産生。 (A)パネルは、末梢血単核細胞(PBMC)のゲーティング戦略を示しており、前方散乱と側方散乱を使用して食細胞集団を定義します。パネル(B)において、食細胞集団は、単球を標識するCD14発現によってさらに定義される。この単球集団を、対照(C)および刺激試料(D)におけるDHR蛍光について分析する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:肺組織におけるサイトカイン産生。 細胞は、まず、フローサイトメトリーを用いて白血球マーカーCD45(A)の発現について分析される。次に、この集団をCD3発現(B)およびCD4/CD8発現(C)についてさらに分析します。CD3/CD4+細胞は、対照(D)およびNTHi刺激サンプル(E)における細胞内サイトカイン産生について評価されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:肺 のin situ ザイモグラフィー。 パネル(A)は、肺組織の切片におけるクロマチン/DAPIの発現を示す。パネル(B)は蛍光染色を示し、MMP活性の存在を示す。パネル(C)は、MMP活性もクロマチンの発現と共局在していることを示すマージ画像を示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここにリストされている方法は、Hiに対する炎症性肺応答に関する詳細な情報を得るために併用することができる蛍光ベースのフローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡技術を使用する。
使用するHiの適切な抗原製剤を確立することは重要であり、この点に関して微生物学者から特定の意見を得ることをお勧めします。Live Hiはより強い反応を誘発しますが、殺されたHi製剤とHiコンポーネントはより標準化されており、保管が容易です。PIは死んだバクテリア22にのみラベルを付けます。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)などの他の色素を使用して、食作用アッセイ23の生細菌を標識することができます。適切な抗原を最適化するために、一連の予備実験を実施する必要があります。ライブ NTHi を使用する場合は、100:1 の MOI が最適です。低いMOIは明確な免疫応答を誘導しない可能性がありますが、より高いMOIは細胞に有毒である可能性があります。しかしながら、用量反応曲線は、有用な情報を与え得、特に技術24の初期最適化において非常に貴重であり得る。ポジティブコントロールとして、市販で入手した不活化 黄色ブドウ 球菌抗原の形態を使用することができ、ROS/食作用アッセイでは上記のようにPIで標識されています。T細胞アッセイの場合、 ブドウ球菌 スーパー抗原E(SEB)による刺激をポジティブコントロールとして使用してもよい19、25。
BALおよび/または肺組織サンプルを取得するためのプロトコルは、明確に確立する必要があります。BAL サンプルは、異なる演算子間で大きく変動する可能性があります。右中葉洗浄用のハンドヘルド注射器は良好な結果をもたらします26。葉切除サンプルから肺組織サンプルを取得するには、病理学者とのコラボレーションの確立が必要です。肺組織サンプルには、腫瘍からある程度のマージン(理想的には少なくとも3〜4 cm)が必要です。より大きなサンプル(例えば、少なくとも25〜50g)は、より多くの細胞、ならびに明らかな肺気腫のないより近位のサンプルを生成する。肺組織の機械的脱凝集は時間がかかり、一般に各サンプルにつき少なくとも2〜3時間かかる19、27。
フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡の両方で異なる蛍光色素の染色を最適化するために、予備実験を行う必要があります。集中すべき分野には、最適な染色パネルの特定、染色/濃縮、および生存率を最大化するための細胞/組織の処理が含まれます28。肺組織の使用は、血液やBALなどの他の体液サンプルよりも多くの組織破片と関連している可能性があり、これはフローサイトメトリーによる異なる細胞集団の分化に何らかの影響を与える可能性があります。抗体の適切な選択は、予備実験で決定および最適化する必要があります。リンパ球の表面標識には、TヘルパーT細胞には抗CD3およびCD4、細胞傷害性T細胞には抗CD3およびCD8、NK細胞には抗CD3およびCD56を使用できます。研究する細胞内サイトカインの選択は、関心のあるメディエーターおよびフローサイトメーター29で分析できるパラメータ/色の数に依存する。肺組織におけるマクロファージを扱う際の特定の課題は、それらの高レベルの自己蛍光です30;この問題は、刺激された細胞をバックグラウンドコントロールと比較し、プロテアーゼやヒストンなどの炎症の特異的マーカーを追加することで対処できます。
これらの技術の制限は、実験を実行するために適切に訓練された熟練したスタッフの要件です。確立されたフローサイトメトリーおよび顕微鏡検査施設も必要です。ヒト組織サンプルの使用は、特に肺組織を使用する場合、有意な変動性と関連しています。これには、アッセイを最適化するための一連の予備実験が必要になる場合があります(特にバックグラウンド染色の問題があります)。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
著者らは、この作業を支援してくれたMonash Healthの臨床免疫学のスタッフに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
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