Summary
Haemophilus influenzae induziert Entzündungen in den Atemwegen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verwendung von Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie, um Immunantworten von Phagozyten und Lymphozyten als Reaktion auf dieses Bakterium zu definieren.
Abstract
Haemophilus influenzae (Hi) ist ein weit verbreitetes Bakterium, das bei einer Reihe von Atemwegserkrankungen vorkommt. Eine Vielzahl verschiedener Assays / Techniken kann verwendet werden, um die respiratorische Immun- / Entzündungsreaktion auf dieses Bakterium zu beurteilen. Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopie sind fluoreszenzbasierte Technologien, die eine detaillierte Charakterisierung biologischer Reaktionen ermöglichen. Verschiedene Formen von Hi-Antigen können verwendet werden, einschließlich Zellwandkomponenten, abgetötete / inaktivierte Präparate und lebende Bakterien. Hi ist ein anspruchsvolles Bakterium, das angereicherte Medien benötigt, aber im Allgemeinen in Standardlaborumgebungen leicht zu züchten ist. Gewebeproben zur Stimulation mit Hi können aus peripherem Blut, Bronchoskopie oder resezierter Lunge gewonnen werden (z. B. bei Patienten, die sich einer Operation zur Behandlung von Lungenkrebs unterziehen). Die Funktion von Makrophagen und Neutrophilen kann mittels Durchflusszytometrie umfassend beurteilt werden, wobei eine Vielzahl von Parametern gemessen wird, einschließlich Phagozytose, reaktiver Sauerstoffspezies und intrazellulärer Zytokinproduktion. Die Lymphozytenfunktion (z. B. T-Zell- und NK-Zellfunktion) kann mittels Durchflusszytometrie spezifisch beurteilt werden, hauptsächlich für die intrazelluläre Zytokinproduktion. Hi-Infektion ist ein potenter Induktor der extrazellulären Fallenproduktion, sowohl durch Neutrophile (NETs) als auch durch Makrophagen (METs). Die konfokale Mikroskopie ist wohl der optimalste Weg, um die NET- und MET-Expression zu beurteilen, die auch zur Beurteilung der Proteaseaktivität verwendet werden kann. Die Lungenimmunität gegen Haemophilus influenzae kann mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie beurteilt werden.
Introduction
Haemophilus influenzae (Hi) ist ein normales kommensales Bakterium, das im Rachen der meisten gesunden Erwachsenen vorkommt. Hi kann eine Polysaccharidkapsel haben (Typ A-F, z. B. Typ B oder HiB) oder keine Kapsel haben und nicht typisierbar sein (NTHi)1. Die Besiedlung der Schleimhaut mit diesem Bakterium beginnt in der frühen Kindheit, und es gibt einen Umsatz verschiedener kolonisierender Stämme2. Dieses Bakterium ist auch in der Lage, sowohl in die oberen als auch in die unteren Atemwege einzudringen; In diesem Zusammenhang kann es eine Aktivierung der Immunantwort und Entzündung induzieren 3,4. Diese Entzündungsreaktion kann klinische Erkrankungen verursachen und zu einer Vielzahl wichtiger Atemwegserkrankungen beitragen, darunter Sinusitis, Mittelohrentzündung, Bronchitis, Mukoviszidose, Lungenentzündung und chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD). Die meisten dieser Bedingungen sind auf NTHi-Stämmezurückzuführen 2. Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Beurteilung der respiratorischen Immunantwort auf Hi mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie.
Die unten beschriebenen Methoden wurden von etablierten Techniken adaptiert, die modifiziert wurden, um die Entzündungsreaktion auf Hi zu beurteilen. Die Auswahl einer geeigneten antigenen Form von Hi ist ein wesentlicher Bestandteil dieser Bewertung. Antigene Präparate reichen von Zellwandbestandteilen bis hin zu lebenden Bakterien. Um Assays zu etablieren und zu standardisieren, kann die Verwendung von peripheren Blutproben zunächst sehr hilfreich sein.
Die Durchflusszytometrie ermöglicht die Messung einer Vielzahl von Parametern und funktionellen Assays aus einer Probe auf zellulärer Ebene. Diese Technik hat den Vorteil, dass spezifische zelluläre Reaktionen (z. B. Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) oder intrazelluläre Zytokinproduktion) im Vergleich zu anderen allgemeineren Methoden wie Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) oder ELISspot bewertet werden können.
Extrazelluläre Fallen werden durch Neutrophile (NETs)5,6,7 und durch andere Zellen wie Makrophagen (METs)8 exprimiert. Sie werden zunehmend als eine wichtige Entzündungsreaktion erkannt, insbesondere bei Infektionen in der Lunge9. Sie können durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie beurteilt werden. Diese Technik ermöglicht die definitive Identifizierung von NETs/METs und unterscheidet ihre Expression von anderen Formen desZelltods 6.
Sowohl die Durchflusszytometrie als auch die konfokale Mikroskopie sind fluoreszenzbasierte Assays. Ihr Erfolg hängt von optimalen Belastungsprotokollen biologischer Proben ab. Diese Methoden brauchen einige Zeit, um zu erlernen und erfordern entsprechende Aufsichtskenntnisse. Die beteiligten Instrumente sind auch teuer in der Anschaffung und im Betrieb. Der optimale Rahmen für ihren Einsatz sind große Universitäten und tertiäre Überweisungskrankenhäuser.
Die in diesem Protokoll verwendeten Methoden sind übertragbar auf die Untersuchung anderer ähnlicher Organismen, die an Atemwegserkrankungen beteiligt sind (z. B. Moxarella catarrhalis und Streptococcus pneumoniae). NTHi interagiert auch mit anderen häufigen Atemwegsbakterien10.
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Protocol
Diese Arbeit wurde von der Ethikkommission für menschliche Forschung von Monash Health genehmigt. Das Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung.
1. Antigene Zubereitung
HINWEIS: Drei verschiedene Antigenpräparate können verwendet werden, um die Immunantwort auf Hi zu beurteilen. Diese sind 1) eine subzelluläre Komponente (typischerweise von der bakteriellen Zellwand); 2) abgetötete und inaktivierte Bakterien; und 3) lebende Bakterien. Bestimmen Sie die Verwendung jedes Antigenpräparats vor Beginn von Experimenten.
- Subzelluläre Komponenten
- Beziehen Sie subzelluläre Komponenten aus Quellen, einschließlich kommerzieller Präparate, intern entwickelter Komponenten und / oder von anderen Forschern.
HINWEIS: Subzelluläre Komponenten, die normalerweise aus der bakteriellen Zellwand stammen, können verwendet werden und umfassen äußere Membranproteine wie P6 und Lipooligosaccharid (LOS)11,12. Diese subzellulären Komponenten werden normalerweise in spezialisierten Zentren abgeleitet. Die Beschreibung, wie sie hergestellt werden, würde den Rahmen dieses Artikels sprengen. Es wird empfohlen, diese Komponenten direkt mit Experten auf diesem Gebiet zu kontaktieren.
- Beziehen Sie subzelluläre Komponenten aus Quellen, einschließlich kommerzieller Präparate, intern entwickelter Komponenten und / oder von anderen Forschern.
- Abgetötete/inaktivierte Bakterien
- Entnehmen Sie die Bakterien aus der entsprechenden Probe (z. B. Sputum oder Bronchoskopie). Bestätigen Sie den Stamm als H. influenzae in einem geeigneten mikrobiologischen Labor. Führen Sie eine Typisierung der H. influenzae-Proben durch, um zu bestätigen, dass sie nicht typisierbar sind (durch ein spezialisiertes mikrobiologisches Labor).
- Um ein repräsentatives Antigen zu erhalten, verwenden Sie mehrere NTHi-Stämme (mindestens 5, jeder von ungefähr der gleichen Menge), um ein gepooltes Antigen herzustellen. Lagern Sie die Stämme bei -70 °C in Glycerinbrühe in Mikrozentrifugenröhrchen.
HINWEIS: In diesem Experiment wurden zehn verschiedene Stämme verwendet. - Die Stähle (jeweils ein Mikrozentrifugenröhrchen) auf Schokoladenagarplatten auftauen und über Nacht in einem 37 °C Inkubator mit 5% CO2 wachsen. Die Bakterien in 500 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) geben und zweimal waschen (bei 300 x g 5 min schleudern). Verwenden Sie ein MacFarland-Standard 10 oder ein Spektralphotometer13, um NTHi bis zu einer Konzentration von10 8 ml zu aliquotieren (unter Verwendung eines 5-ml-Behälters oder eines gleichwertigen Behälters).
- Hitze inaktivieren Sie die Bakterien, indem Sie sie für 10 min in ein Wasserbad bei einer Temperatur von 56 °C geben.
- Beschallen Sie die Bakterien mit einer kontinuierlichen Ultraschalleinstellung bei einer niedrigen bis mittleren Geschwindigkeit für 30 s.
- Aliquot das entsprechende Probenvolumen in Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden Sie für eine Probe von 10 bis 8 ml Aliquots von 50 μL (d. h. 20 Proben pro ml), frieren Sie sie bei -70 °C ein,bis 14 % erforderlich sind.
- Lebende Bakterien
- Charakterisieren Sie zunächst lebende Bakterien wie in Schritt 1.2.1 erwähnt. Verwenden Sie eine gut charakterisierte Sorte. Stellen Sie sicher, dass der Stamm auch in Glycerinbrühe bei -70 °C als Reserve gelagert wird.
- Züchten Sie die Bakterien auf angereicherten Medien wie Schokoladen-Agar-Tellern oder in Brühe.
- Um Schokoladen-Agar-Platten zu verwenden, verteilen Sie die Bakterien für mindestens alle 3-4 Tage mit sterilen Spreizern.
- Alternativ können Sie Brain Heart Infusion (BHI) -Brühe verwenden, die mit den Faktoren X (Hämin) und V (β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid) angereichert ist, um die Bakterien zu züchten. NTHi aus Nachtplatten in 5-10 ml BHI-Brühe, ergänzt mit Hemin und β-Nicotinamid-Adenindinukleotid (beide 10 μg/ml) und Kultur über Nacht bei 37 °C in einem 5%CO2-Inkubator .
ANMERKUNG: Dies hat den Vorteil der Reproduzierbarkeit, der höheren Anzahl koloniebildender Einheiten (CFU) und aller Bakterien, die sich in einer ähnlichen Phase des Log-Wachstums befinden (auf Platten kann die bakterielle Lebensfähigkeit je nach Position in der Kultur größer sein)13,15.
- Verwenden Sie eine Vielzahl von Infektionen (MOI) von 100 Bakterien in einer Zelle, um eine starke Immunantwort auszulösen und gleichzeitig die Zelllebensfähigkeit zu erhalten. Verwenden Sie MacFarland Standard10 oder Spektralphotometer13 , um die Anzahl der Bakterien zu bestimmen.
- Stellen Sie sicher, dass die für Live-NTHi-Assays verwendeten Medien frei von menschlichem Serum sind, da dies die Bakterien abtötet16. Tierserumproben (z.B. fetales Kälberserum) stellen in der Regel kein Problem dar.
HINWEIS: Verwenden Sie die unten beschriebenen Methoden, um Standardgewebeproben wie peripheres Blut, Bronchoskopieproben (insbesondere bronchoalveoläre Lavage (BAL)) und reseziertes Lungengewebe zu analysieren. Inkubieren Sie die Proben mit Hi-Antigen von 10 min bis 24 h oder mehr.
2. Beurteilung der phagozytischen Funktion mittels Durchflusszytometrie
HINWEIS: Dieser Assay erfordert Zellen in Lösung und wird typischerweise in Vollblut oder mit BAL-Flüssigkeit durchgeführt. Dieser Assay wurde von einem zuvor veröffentlichten Protokoll modifiziert, das auf der Verwendung von inaktiviertem Staphylococcus aureus-Präparat und Pansorbin17 basiert. Pansorbin17 wird durch inaktiviertes Vollblut und fixiertes H. influenzae ersetzt.
- Mischen Sie abgetötetes, inaktiviertes NTHi (1.2) mit Propidiumiodid (PI) bei 100 μg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) im Verhältnis 1:1 für 30 min bei Raumtemperatur. Bei 450 x g für 5 min zentrifugieren und dann 500 μL PBS einwaschen. Bei 450 x g für 5 min herunterdrehen und das Pellet in 500 μL PBS resuspendieren.
- 450 μL peripheres Blut (aus der Venenpunktion eines Menschen) mit 50 μL inaktiviertem PI-markiertem H. influenzae für 20 min in einem Wasserbad bei 37 °C in einem 5-ml-Röhrchen inkubieren.
- Die Proben werden aus dem Wasserbad genommen und 5 μL Dihydrorhodamin-1,2,3 (DHR) hinzugefügt. Wirbel für 10 s, und dann wieder für weitere 10 Minuten in das Wasserbad legen.
- Die Proben werden aus dem Wasserbad entnommen und die Erythrozyten (500 μL Volumen, wie oben in Schritt 2.2 aufgeführt) mit 10:1 (d. h. 5 ml) 0,8% Ammoniumchloridlösung (150 mM NH4Cl, 1 mM NaHCO3 und 0,1 mM EDTA) lysiert.
HINWEIS: Alternativ kann ein automatisiertes System wie Q-prep verwendet werden. - Analysieren Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer innerhalb einer Stunde. Analysieren Sie mindestens 3.000 bis 5.000 Zellen (aus jeder Teilmenge von Interesse) aus jeder Stichprobe, um repräsentative Ergebnisse zu erhalten (Abbildung 1).
- Um die Proben auf Phagozytose zu analysieren, bestimmen Sie den Anteil der Zellen, die markierte Bakterien aufgenommen haben (messen Sie den Anteil der Zellen mit der fluoreszierenden Färbung).
- Quantifizieren Sie die ROS durch die Oxidation von DHR, was zu einem fluoreszierenden Signal führt (die Verschiebung der medianen Fluoreszenz wird zwischen Baseline- und stimulierten Proben verglichen).
HINWEIS: Neutrophile sind granulärer und haben mehr Seitenstreuung, während Makrophagen größer sind und mehr Vorwärtsstreuung haben. - Unterscheiden Sie die Neutrophilen und Makrophagen morphologisch voneinander durch ihre Größe (Makrophagen sind größer) und Granularität (Neutrophile sind granularer).
HINWEIS: Spezifische Marker für Neutrophile und Makrophagen werden im Allgemeinen nicht verwendet, obwohl CD14 zur Markierung von Blutmonozyten verwendet werden kann. Die Durchflusszytometrie kann möglicherweise verwendet werden, um zwischen verschiedenen funktionellen Formen von Monozyten und Makrophagen (z. B. M1- und M2-Untergruppen) zu unterscheiden18.
- Modifizieren Sie den Assay entsprechend (z. B. verwenden Sie lebendes, unmarkiertes NTHi, um Phagozyten zu stimulieren und die ROS-Expression durch DHR-Spaltung zu messen).
- Isolieren Sie periphere mononukleäre Blutzellen durch Dichtegradientenzentrifugation. Schichten Sie das Blut über das vorgesehene Polymer für die Dichtegradientenzentrifugation und drehen Sie es bei 2300 x g für 30 min. Entfernen Sie die mononukleäre Schicht mit einer Pipette, waschen Sie sie zweimal mit PBS und resuspendieren Sie die Zellen in PBS bei 106 Zellen pro ml.
- Verwenden Sie alternativ BAL-Makrophagen.
- Die Monozyten/Makrophagen werden bei einer Konzentration von 106 Zellen/ml im Kulturmedium (RPMI) suspendiert. Infizieren Sie sie mit lebendem NTHi bei einem MOI von 100:1 für 1 Stunde, wie in Schritt 1.3 beschrieben.
- DHR wie in Schritt 2.3 beschrieben für 10 min in die Suspension geben. Führen Sie die Analyse für ROS mittels Durchflusszytometrie durch.
3. Beurteilung der Lymphozytenfunktion im peripheren Blut
- Verwenden Sie Vollblutpräparate oder mononukleäre Zellpräparate für Durchflusszytometrie-Assays14.
- Sammeln Sie Proben von jedem Subjekt durch Venenpunktion. Sammeln Sie 4 ml Blut aus einer peripheren Vene in einem Lithium-Heparin-Röhrchen und teilen Sie die Proben zur Kontrolle und Antigenstimulation in Aliquots auf.
- Fügen Sie beiden Proben kostimulatorische Antikörper (Anti-CD28 und CD49d, 1 μL/ml) hinzu. NTHi in die Antigenprobe geben und bei 37 °C und 5 %CO2 für 1 h inkubieren. Für das abgetötete NTHi-Präparat werden 200 μL des Antigens zu 2 ml Blut gegeben. Für lebende NTHi fügen Sie lebende NTHi-Zellen mit einem MOI von 100:1 zu den weißen Blutkörperchen hinzu (gemessen mit dem Hämozytometer).
- Das Golgi-Blockmittel Brefeldin A (10 μL/ml) zu den Proben geben und weitere 5 h inkubieren.
HINWEIS: Das Blockieren des Golgi-Apparates verhindert, dass die Zytokine außerhalb der Zelle exportiert werden. - Wenn Vollblut verwendet wird, lysieren Sie die Erythrozyten mit 0,8% Ammoniumchlorid (Schritt 2.4), um nur Leukozyten in Lösung zu lassen. Fixieren Sie die Leukozyten mit 500 μL 1% -2% Paraformaldehyd für 1 h.
- Zählen Sie die Zellen mit dem Hämozytometer, permeabilisieren Sie 106 Zellen mit 100 μL 0,1% Saponin für 15 min und inkubieren Sie die Zellen mit fluoreszierend markierten Antikörpern. Waschen Sie die Zellen und analysieren Sie sie mit einem Durchflusszytometer.
HINWEIS: Die Menge der fluoreszenzmarkierten Antikörper ist spezifisch für jedes Zytokin. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Typischerweise werden 106 Zellen in 100 μL Lösung für 1 h gefärbt. Die meisten kommerziell gewonnenen Antikörper reichen aus, um 25-100 Tests durchzuführen. - Bestimmen Sie den Anteil der antigenreagierenden Zellen durch Gating der relevanten Lymphozytenpopulation (Zellen werden durch CD45, dann durch CD3 und später durch CD4- oder CD8-Expression gesteuert), wie in Abbildung 2 gezeigt. Führen Sie eine Hintergrundfärbung an nicht stimulierten Zellen durch, damit alle zu analysierenden Zytokine analysiert werden können. Screenen Sie 100.000 Zellen, um jedes Zytokin sowohl auf stimulierte Zellen als auch auf Kontrolle zu analysieren.
4. Beurteilung der Lymphozytenfunktion/Entzündungsmediatoren im Lungengewebe
- Es ist normalerweise nicht möglich, genügend Lymphozyten aus der Bronchoskopie zu erhalten; Verwenden Sie daher das Lungengewebe aus Lobektomieproben. Die Optimierung von Lungengewebeproben erfordert eine enge Zusammenarbeit mit dem anatomischen Pathologiedienst. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe einen Rand von mindestens 3 cm vom Tumor hat und das Zellgewebe ohne signifikantes Emphysem ist (wie vom Pathologen bestimmt).
- Zerlegen Sie das Lungengewebe in eine zelluläre Suspension, bevor es für Durchflusszytometrie-Assays verwendet werden kann. Verdauen Sie das Lungengewebe chemisch (z.B. mit Kollagenase) oder disaggregieren Sie es mechanisch.
HINWEIS: Die mechanische Disaggregation von Gewebe kann bevorzugt werden, da dies mit einer besseren Oberflächenfärbung von Zellen verbunden ist (z. B. CD3/4-Markierung)19.- Erhalten Sie Lobektomieproben von einem Pathologen (in der Regel von Patienten, die sich einer Behandlung von Lungenkrebs unterziehen). Schneiden Sie ca. 20-40 g der Probe in 3-5 mm3 Abschnitte. Legen Sie sie in eine sterile 50-μL-Kammer, bevor sie mit einem geeigneten Disaggregator mechanisch fragmentiert werden.
- Nach der Disaggregation des Gewebes lysieren Sie die roten Blutkörperchen mit 0,8% NH 4 Cl, wie in Schritt2.4erwähnt.
- Resuspendieren Sie die Zellen in sterilem RPMI (das Volumen hängt von der Zellzahl ab und beträgt im Allgemeinen 10-20 ml) und filtern Sie sie dann durch ein 100 μm steriles Nylonnetz. Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit der Trypanblau-Ausschlussmethode.
- NTHi-Infektionstest
- Resuspendieren Sie die Lungenzellen auf eine endgültige Zellkonzentration von 4 x 106 Zellen/ml pro Röhrchen (Kontroll- und stimulierte Proben).
- Verwenden Sie eine Suspension von 4 x 10 6-6 x 106 Zellen in 1 ml RPMI für das (negative) Steuerrohr. Verwenden Sie die gleiche Menge für das NTHi-Röhrchen (jede zusätzliche Probe kann als Positivkontrolle mit SEB verwendet werden). Infizieren Sie die Zellen in der NTHi-Röhre bei einem MOI von 100 Bakterien pro Zelle. Lösen Sie die Kappe eine halbe Umdrehung, um den Gastransfer in den Rohren zu ermöglichen.
- Legen Sie die Zellen in einen Röhrchenrotator und inkubieren Sie sie bei 37 °C bei 12 U/min.
- Um den extrazellulären Export von Zytokinen zu verhindern, fügen Sie den Zellsuspensionen 1 h nach Stimulation einen Golgi-Blocker (Brefeldin A) auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml hinzu. Die Zellsuspensionen werden für weitere 16-22 Stunden Inkubation auf Rotation zurückgeführt (Schritt 4.3.3).
- Die Zellsuspension wird mit 500 μL PBS gewaschen, das 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,01% NaN3 enthält. Fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen wie in Schritt 3.5 bzw. Schritt 3.6 beschrieben.
- Fügen Sie die Antikörper für die intrazelluläre Zytokinfärbung hinzu (die Wahl der Antikörper wird vom Prüfarzt festgelegt, wie in der ANMERKUNG in Schritt 3.6 aufgeführt). Färbung der Zellsuspension für spezifische humane Lymphozytenzelloberflächenmarker (z. B. CD45, CD3 usw.) für 1 h. Waschen Sie die Zellen mit PBS, fixieren und permeabilisieren Sie sie wie in den Schritten 3.5-3.6 beschrieben.
- Inkubieren Sie die Zellen mit intrazellulären Zytokin-Färbe-Antikörpern (z. B. IFN-γ und TNF-α oder IL-13 und IL-17A) für 1 h.
HINWEIS: Es wird empfohlen, zuerst Oberflächenmarker und dann intrazellulär zu färben, da die Fixierung Konformationsänderungen in den Oberflächenproteinen verursachen kann, an die Antikörper binden. - Waschen Sie die Zellen mit 500 μL PBS und resuspendieren Sie sie in 100 μL PBS, bevor Sie die Daten auf einem Durchflusszytometer erfassen.
- Ein Bead-Array-Assay kann in Verbindung mit der Analyse des in Schritt 3.2 beschriebenen Überstands verwendet werden (Führen Sie dies ohne Brefeldin A durch). Dies ermöglicht die Analyse einer Vielzahl unterschiedlicher Entzündungsmediatoren (potentiell bis zu 40-50 Mediatoren). Sammeln Sie den Überstand in 100 μL Aliquots und lagern Sie ihn bei -70 °C, bis er für die Analyse bereit ist. Alternativ kann man Multiplex-Chemilumineszenz-Assays20 verwenden.
- Verwenden Sie Multiplex-Bead-Arrays, um die aufgetauten Proben zu analysieren. Verwenden Sie den gespeicherten Überstand, um die Zytokinproduktion gemäß den Anweisungen des Herstellers zu analysieren.
- Führen Sie die Erfassung des Multiplex-Perlenarrays auf einem Durchflusszytometer durch. Verwenden Sie entsprechende Software, um die nachgelagerte Datenanalyse durchzuführen.
HINWEIS: Dieser Bead-Array-Assay kann auch an Überständen aus peripheren Blut- und/oder BAL-Proben durchgeführt werden.
5. Beurteilung der Lungenproteolyse durch konfokale Mikroskopie
HINWEIS: Die fluoreszierende konfokale Mikroskopie ist komplementär zur Durchflusszytometrie und kann zur Beurteilung von Protease- und ROS-Entzündungsreaktionen verwendet werden. Extrazelluläre Fallen wie NETs und METs bestehen aus extrazellulärem Chromatin (DNA) mit anderen Entzündungsmediatoren, insbesondere Proteasen wie Neutrophilen-Elastase (NE) und Matrix-Metalloproteinasen (MMP). Sie können in BAL- und Lungengewebe mittels konfokaler Mikroskopie beurteilt werden, und dies wurde zuvor von Sharma, R. et al.21 beschrieben.
- Beurteilung der direkten Proteaseexpression im Lungengewebe (wie in Schritt 4.2.1 beschrieben) mittels konfokaler Mikroskopie und In-situ-Zymographie 15,17.
- Verwenden Sie entweder frisches oder gefrorenes unfixiertes Lungengewebe. Montieren Sie die auf eine Dicke von 4 μm zugeschnittenen Profile auf Superfrost-/Adhäsionsobjektträgern. Die Abschnitte in 1x Reaktionspuffer für 5 min vorwärmen.
- Fügen Sie fluoresceinmarkiertes Gelatinesubstrat (30 μg / ml pro Abschnitt) direkt auf einzelne Objektträger hinzu, um die Proteolyse über die Wirkung von Metalloproteinasen zu messen.
- Die Objektträger horizontal platzieren und in einer lichtgeschützten, befeuchteten Kammer bei 37 °C für 1 h inkubieren.
- Spülen Sie die Abschnitte vor der Montage in 1x Reaktionspuffer.
- Als Negativkontrolle fügen Sie nur den Reaktionspuffer ohne fluoreszierende Gelatine zu den Abschnitten hinzu.
- Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, um die Lyse des Substrats durch Untersuchung zu untersuchen. Verwenden Sie ImageJ, um den Bereich der Lunge mit Anzeichen einer Proteolyse zu bestimmen. Messen Sie dazu den Lungenbereich, der über dem Hintergrund der gelöschten Probe eine Färbung aufweist. Als weitere Kontrolle verwenden Sie das Lungengewebe ohne Zusatz von fluoreszierender Gelatine15.
HINWEIS: Führen Sie dies für mindestens 10 Hochleistungssichtfelder (FOV) pro Probe durch.
- Messung der extrazellulären ROS-Expression im Lungengewebe durch Immunreaktivität für 3-Nitrotyrosin (ein toxisches oxidatives Stressprodukt)13.
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Representative Results
Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, wie entzündliche Immunantworten auf NTHi mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie beurteilt/quantifiziert werden können. Ein wichtiger Teil der Interpretation der Ergebnisse ist der Vergleich der Fluoreszenz zwischen Kontroll- und stimulierten Proben. Eine Reihe von Vorversuchen ist in der Regel erforderlich, um die Färbung von Proben zu optimieren. Wie viele verschiedene Farben gleichzeitig untersucht werden können, hängt von der Anzahl der Kanäle ab, die auf dem Durchflusszytometer/Konfokalmikroskop verfügbar sind. Es werden Ergebnisse für die Beurteilung von 1) ROS-Produktion, 2) intrazellulärer Zytokinfärbung von menschlichem Lungengewebe und 3) In-situ-Zymographie zur Messung der Lungenproteolyse gezeigt.
Abbildung 1 zeigt die Darstellung der ROS-Produktion durch Monozyten. Die Messung von ROS erfolgt durch die Oxidation von DHR123 zur Erzeugung von Fluoreszenz. Die Zellen werden angegängt und ihre mediane Fluoreszenz wird durch Durchflusszytometrie beurteilt. Die mediane Fluoreszenz der stimulierten Probe wird mit der Kontrolle verglichen.
Abbildung 2 zeigt die intrazelluläre Produktion von Zytokinen durch Lymphozyten, die aus menschlichem Lungengewebe stammen. Das Lungengewebe muss in Einzelzellsuspension zerlegt werden, bevor durchflusszytometrische Assays durchgeführt werden können, um die Produktion von Entzündungsmediatoren, z. B. die Zytokinproduktion durch Lymphozyten, zu beurteilen. Lungengewebe kann mechanisch abgebaut oder chemisch verdaut werden, z.B. durch Kollagenase. Die mechanischen Abbaumethoden können zu überlegenen Ergebnissen führen, insbesondere in Bezug auf die Beibehaltung der Zelloberflächenfärbung (z. B. CD3 und CD4). Die Filterung der Proben ist wichtig, um Ablagerungen auszuschließen, die die Analyse beeinträchtigen könnten.
Abbildung 3 zeigt die Expression der Proteaseaktivität, gemessen mittels in situ Zymographie. Unfixiertes Gewebe wird verwendet, um die Proteaseaktivität zu beurteilen. Diese Proben werden typischerweise bis zur Analyse bei -70 °C eingefroren. Der Bereich des Gewebes, der Proteasefluoreszenz aufweist, wird gemessen, und die Ergebnisse werden zwischen Kontroll- und stimulierten Proben verglichen.
Abbildung 1: ROS-Produktion durch Monozyten. (A) Das Panel zeigt die Gating-Strategie für periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC), wobei Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung verwendet werden, um die Phagozytenpopulation zu definieren. In Panel (B) wird die Phagozytenpopulation weiter durch CD14-Expression definiert, um die Monozyten zu markieren. Diese Monozytenpopulation wird auf DHR-Fluoreszenz in Kontroll- (C) und stimulierten Proben (D) analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Zytokinproduktion im Lungengewebe. Die Zellen werden zunächst mittels Durchflusszytometrie auf ihre Expression des Leukozytenmarkers CD45(A) untersucht. Diese Population wird dann weiter auf CD3-Expression (B) und CD4/CD8-Expression (C) analysiert. CD3/CD4+-Zellen werden auf intrazelluläre Zytokinproduktion in Kontroll- (D) und NTHi-stimulierten Proben (E) untersucht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Lungen-in-situ-Enzymographie . Panel (A) zeigt die Expression von Chromatin/DAPI in Abschnitten des Lungengewebes. Panel (B) zeigt eine fluoreszierende Färbung, die auf das Vorhandensein von MMP-Aktivität hinweist. Panel (C) zeigt das zusammengeführte Bild, das anzeigt, dass die MMP-Aktivität auch mit der Expression von Chromatin kolokalisiert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die hier aufgeführten Methoden verwenden fluoreszenzbasierte Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopietechniken, die in Verbindung verwendet werden können, um detaillierte Informationen über die entzündliche Lungenantwort auf Hi zu erhalten.
Die Festlegung der geeigneten Antigenformulierung von Hi ist von entscheidender Bedeutung, und es ist ratsam, diesbezüglich spezifische Beiträge von einem Mikrobiologen zu erhalten. Live Hi induziert eine stärkere Reaktion, während abgetötete Hi-Präparate und Hi-Komponenten standardisierter und einfacher zu lagern sind. PI markiert nur tote Bakterien22; andere Farbstoffe wie Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE) könnten verwendet werden, um lebende Bakterien für Phagozytose-Assays zu markieren23. Eine Reihe von Vorexperimenten sollte durchgeführt werden, um das geeignete Antigen zu optimieren. Für die Verwendung von Live-NTHi ist ein MOI von 100:1 optimal; Ein niedrigerer MOI kann keine klare Immunantwort induzieren, während ein höherer MOI für die Zellen toxisch sein kann. Eine Dosis-Wirkungs-Kurve kann jedoch nützliche Informationen liefern und sehr wertvoll sein, insbesondere bei der anfänglichen Optimierung der Technik24. Als Positivkontrolle kann eine kommerziell erhaltene Form des inaktivierten Staphylococcus aureus-Antigens verwendet werden, das auch wie oben für den ROS/Phagozytose-Assay mit PI markiert ist. Für die T-Zell-Assays kann die Stimulation mit Staphylokokken-Superantigen E (SEB) als Positivkontrolle verwendet werden19,25.
Die Protokolle für die Gewinnung von BAL- und/oder Lungengewebeproben müssen eindeutig festgelegt werden. Die BAL-Stichproben können zwischen verschiedenen Operatoren sehr variabel sein. Eine Handspritze für die rechte Mittellappenspülung liefert gute Ergebnisse26. Die Gewinnung der Lungengewebeprobe aus Lobektomieproben erfordert die Zusammenarbeit mit einem Pathologen. Die Lungengewebeprobe sollte einen gewissen Abstand zum Tumor haben (idealerweise mindestens 3-4 cm). Größere Proben (z. B. mindestens 25-50 g) ergeben mehr Zellen sowie Proben, die proximaler ohne offensichtliches Emphysem sind. Die mechanische Disaggregation des Lungengewebes ist zeitaufwendig und dauert in der Regel mindestens 2-3 h für jede Probe19,27.
Vorläufige Experimente sollten durchgeführt werden, um die Färbung verschiedener Fluorophore sowohl für die Durchflusszytometrie als auch für die konfokale Mikroskopie zu optimieren. Zu den Bereichen, auf die man sich konzentrieren sollte, gehören die Identifizierung des besten Färbepanels, die Färbung / Konzentration und die Behandlung von Zellen / Gewebe, um die Lebensfähigkeit zu maximieren28. Die Verwendung von Lungengewebe kann mit mehr Gewebetrümmern assoziiert sein als andere Flüssigkeitsproben wie Blut oder BAL, und dies kann einen gewissen Einfluss auf die Differenzierung verschiedener Zellpopulationen durch Durchflusszytometrie haben. Die geeignete Auswahl der Antikörper muss in Vorversuchen bestimmt und optimiert werden. Zur Oberflächenmarkierung von Lymphozyten können Anti-CD3 und CD4 für T-Helferzellen, Anti-CD3 und CD8 für zytotoxische T-Zellen und Anti-CD3 und CD56 für NK-Zellen verwendet werden. Die Wahl der zu untersuchenden intrazellulären Zytokine hängt von den interessierenden Mediatoren und der Anzahl der Parameter/Farben ab, die auf dem Durchflusszytometer29 analysiert werden können. Eine besondere Herausforderung bei der Arbeit mit Makrophagen im Lungengewebe ist ihr hoher Autofluoreszenzgrad30; Dieses Problem kann durch den Vergleich stimulierter Zellen mit Hintergrundkontrolle und die Zugabe spezifischer Entzündungsmarker wie Proteasen und Histone gelöst werden.
Eine Einschränkung dieser Techniken ist die Anforderung an entsprechend ausgebildetes und qualifiziertes Personal, um die Experimente durchzuführen. Etablierte Durchflusszytometrie- und Mikroskopieeinrichtungen sind ebenfalls erforderlich. Die Verwendung menschlicher Gewebeproben ist mit einer signifikanten Variabilität verbunden, insbesondere bei der Verwendung von Lungengewebe; Dies kann eine Reihe von Vorexperimenten erfordern, um Assays zu optimieren (insbesondere bei Problemen der Hintergrundfärbung).
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Die Autoren danken den Mitarbeitern der Klinischen Immunologie von Monash Health für ihre Unterstützung bei dieser Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
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