Summary
Haemophilus influenzae induce inflamación en el tracto respiratorio. Este artículo se centrará en el uso de la citometría de flujo y la microscopía confocal para definir las respuestas inmunes de fagocitos y linfocitos en respuesta a esta bacteria.
Abstract
Haemophilus influenzae (Hi) es una bacteria prevalente que se encuentra en una variedad de afecciones respiratorias. Se puede usar una variedad de diferentes ensayos / técnicas para evaluar la respuesta inmune / inflamatoria respiratoria a esta bacteria. La citometría de flujo y la microscopía confocal son tecnologías basadas en fluorescencia que permiten la caracterización detallada de las respuestas biológicas. Se pueden usar diferentes formas de antígeno Hi, incluidos componentes de la pared celular, preparaciones muertas / inactivadas y bacterias vivas. Hi es una bacteria fastidiosa que requiere medios enriquecidos, pero generalmente es fácil de cultivar en entornos de laboratorio estándar. Las muestras de tejido para la estimulación con Hi se pueden obtener de sangre periférica, broncoscopia o pulmón resecado (p. ej., en pacientes sometidos a cirugía para el tratamiento del cáncer de pulmón). La función de los macrófagos y los neutrófilos se puede evaluar exhaustivamente mediante citometría de flujo con una variedad de parámetros medidos, incluida la fagocitosis, las especies reactivas de oxígeno y la producción de citoquinas intracelulares. La función de los linfocitos (p. ej., la función de las células T y NK) puede evaluarse específicamente mediante citometría de flujo, principalmente para la producción de citoquinas intracelulares. La infección por Hi es un potente inductor de la producción de trampas extracelulares, tanto por neutrófilos (NET) como por macrófagos (MET). La microscopía confocal es posiblemente la forma más óptima de evaluar la expresión de NET y MET, que también se puede utilizar para evaluar la actividad de la proteasa. La inmunidad pulmonar a Haemophilus influenzae puede evaluarse mediante citometría de flujo y microscopía confocal.
Introduction
Haemophilus influenzae (Hi) es una bacteria comensal normal presente en la faringe de la mayoría de los adultos sanos. Hi puede tener una cápsula de polisacárido (tipos A-F, por ejemplo, tipo B o HiB) o carecer de una cápsula y no ser tipificable (NTHi)1. La colonización de la mucosa con esta bacteria comienza en la primera infancia, y hay un recambio de diferentes cepas colonizadoras2. Esta bacteria también es capaz de invadir tanto el tracto respiratorio superior como el inferior; En este contexto, puede inducir la activación de la respuesta inmune y la inflamación 3,4. Esta respuesta inflamatoria puede causar enfermedad clínica y contribuir a una variedad de afecciones respiratorias importantes, como sinusitis, otitis media, bronquitis, fibrosis quística, neumonía y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La mayoría de estas condiciones se deben a las cepasNTHi 2. Este artículo describirá métodos para evaluar las respuestas inmunes respiratorias a Hi utilizando citometría de flujo y microscopía confocal.
Los métodos descritos a continuación se han adaptado a partir de técnicas bien establecidas que se han modificado para evaluar la respuesta inflamatoria a Hi. La selección de una forma antigénica apropiada de Hi es una parte clave de esta evaluación. Las preparaciones antigénicas van desde componentes de la pared celular hasta bacterias vivas. Para establecer y estandarizar los ensayos, el uso de muestras de sangre periférica puede ser muy útil inicialmente.
La citometría de flujo permite la medición de una variedad de parámetros y ensayos funcionales de una muestra a nivel celular. Esta técnica tiene la ventaja de que las respuestas celulares específicas (por ejemplo, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) o la producción de citoquinas intracelulares) se pueden evaluar en comparación con otros métodos más generales, como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o ELISspot.
Las trampas extracelulares son expresadas por neutrófilos (TNE)5,6,7 y por otras células como los macrófagos (MET)8. Son cada vez más reconocidos como una respuesta inflamatoria clave, particularmente en la infección en el pulmón9. Pueden evaluarse mediante microscopía de fluorescencia confocal. Esta técnica permite la identificación definitiva de los TNE/MET y distingue su expresión de otras formas de muerte celular6.
Tanto la citometría de flujo como la microscopía confocal son ensayos basados en fluorescencia. Su éxito depende de protocolos de filtrado óptimos de muestras biológicas. Estos métodos toman algún tiempo para aprender y requieren la experiencia de supervisión adecuada. Los instrumentos involucrados también son caros tanto de comprar como de ejecutar. El entorno óptimo para su uso incluye las principales universidades y hospitales terciarios de referencia.
Los métodos utilizados en este protocolo son transferibles para el estudio de otros organismos similares implicados en enfermedades respiratorias (por ejemplo, Moxarella catarrhalis y Streptococcus pneumoniae). NTHi también interactúa con otras bacterias respiratorias comunes10.
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Protocol
Este trabajo fue aprobado por el comité de ética de investigación humana de Monash Health. El protocolo sigue las directrices del comité de ética de investigación humana.
1. Preparación antigénica
NOTA: Se pueden usar tres preparaciones antigénicas diferentes para evaluar la respuesta inmune al Hi. Estos son 1) un componente subcelular (típicamente de la pared celular bacteriana); 2) bacterias muertas e inactivadas; y 3) bacterias vivas. Determinar el uso de cada preparación antigénica antes del inicio de cualquier experimento.
- Componentes subcelulares
- Obtener componentes subcelulares de fuentes, incluyendo preparaciones comerciales, componentes desarrollados internamente y/o de otros investigadores.
NOTA: Se pueden utilizar componentes subcelulares generalmente de la pared celular bacteriana e incluir proteínas de la membrana externa como P6 y lipooligosacárido (LOS)11,12. Estos componentes subcelulares generalmente se derivan en centros especializados. La descripción de cómo se hacen está más allá del alcance de este artículo. Se recomienda el contacto directo con expertos en este campo para obtener estos componentes.
- Obtener componentes subcelulares de fuentes, incluyendo preparaciones comerciales, componentes desarrollados internamente y/o de otros investigadores.
- Bacterias muertas/inactivadas
- Obtenga la bacteria de la muestra apropiada (por ejemplo, esputo o broncoscopia). Confirmar la cepa como H. influenzae utilizando un laboratorio de microbiología apropiado. Realizar la tipificación de las muestras de H. influenzae para confirmar que no son de tipo (por un laboratorio especializado en microbiología).
- Para obtener un antígeno representativo, use múltiples cepas NTHi (al menos 5, cada una de aproximadamente la misma cantidad) para hacer un antígeno agrupado. Almacenar las cepas a -70 °C en caldo de glicerol en tubos de microcentrífuga.
NOTA: En este experimento, se utilizaron diez cepas distintas. - Descongele las cepas (un tubo de microcentrífuga a la vez) en placas de agar chocolate y crezca durante la noche en una incubadora a 37 °C con un 5% deCO2. Agregue las bacterias a 500 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y lávelas dos veces (gire a 300 x g durante 5 min). Utilice un estándar de MacFarland 10 o un espectrofotómetro13 para alícuota NTHi a una concentración de10 8 ml (utilizando un recipiente de 5 ml o equivalente).
- El calor inactiva las bacterias colocándolas en un baño maría a una temperatura de 56 °C durante 10 min.
- Sonicar las bacterias usando un ajuste de sonicación continua a una velocidad de rango bajo a medio durante 30 s.
- Alícuota el volumen apropiado de muestras en tubos de microcentrífuga. Para una muestra de 108 ml, utilizar alícuotas de 50 μL (es decir, 20 muestras por ml), congelarlas a -70 °C hasta que sea necesario14.
- Bacterias vivas
- En primer lugar, caracterizar las bacterias vivas como se menciona en el paso 1.2.1. Use una cepa bien caracterizada. Asegúrese de que la cepa también se almacena en caldo de glicerol a -70 °C como reserva.
- Cultive las bacterias en medios enriquecidos como platos de agar chocolate o en caldo.
- Para usar platos de agar chocolate, extienda las bacterias durante un mínimo de cada 3-4 días con esparcidores estériles.
- Alternativamente, use caldo de infusión cerebral del corazón (BHI) enriquecido con factores X (hemina) y V (dinucleótido de adenina de β-nicotinamida) para cultivar la bacteria. Inocular NTHi de placas nocturnas en 5-10 ml de caldo BHI suplementado con dinucleótido de hemina y β-nicotinamida adenina (ambos 10 μg/ml) y cultivar durante la noche a 37 °C en una incubadora deCO2 al 5%.
NOTA: Esto tiene la ventaja de la reproducibilidad, mayores recuentos de unidades formadoras de colonias (UFC) y todas las bacterias se encuentran en una fase similar de crecimiento logarítmico (en placas, la viabilidad bacteriana puede ser mayor dependiendo de la posición en el cultivo)13,15.
- Utilice una multiplicidad de infecciones (MOI) de 100 bacterias por célula para provocar una fuerte respuesta inmune mientras se mantiene la viabilidad celular. Utilice MacFarland Standard10 o espectrofotómetro13 para evaluar el número de bacterias.
- Asegúrese de que los medios utilizados para los ensayos NTHi en vivo estén libres de suero humano, ya que esto matará a las bacterias16. Las muestras de suero animal (por ejemplo, suero fetal de ternera) generalmente no causan ningún problema.
NOTA: Utilice los métodos descritos a continuación para analizar muestras de tejido estándar, como sangre periférica, muestras de broncoscopia (particularmente lavado broncoalveolar [BAL]) y tejido pulmonar resecado. Incubar las muestras con antígeno Hi de 10 min a 24 h o más.
2. Evaluación de la función fagocítica por citometría de flujo
NOTA: Este ensayo requiere células en solución y generalmente se realiza en sangre total o con líquido BAL. Este ensayo se modifica de un protocolo previamente publicado basado en el uso de preparación inactivada de Staphylococcus aureus y Pansorbin17. La sangre entera inactivada y H. influenzae fija se sustituye por la pansorbina17.
- Mezclar NTHi (1.2) muerto e inactivado con yoduro de propidio (PI) a 100 μg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una proporción de 1:1 durante 30 min a temperatura ambiente. Centrifugar a 450 x g durante 5 min, y luego lavar en 500 μL de PBS. Girar a 450 x g durante 5 min y resuspender el pellet en 500 μL de PBS.
- Incubar 450 μL de sangre periférica (de venopunción de un sujeto humano) con 50 μL de P. influenzae marcado con PI inactivado durante 20 min en un baño maría a 37 °C en un tubo de 5 ml.
- Retirar las muestras del baño maría y añadir 5 μL de dihidrorodamina-1,2,3 (DHR). Vórtice durante 10 s, y luego colóquelo de nuevo en el baño de agua durante otros 10 minutos.
- Retirar las muestras del baño maría y lisar los eritrocitos (500 μL de volumen como se indica anteriormente en el paso 2.2) con solución de cloruro de amonio al 0,8% (150 mM NH4Cl, 1 mM NaHCO3 y 0,1 mM EDTA).
NOTA: Alternativamente, se puede utilizar un sistema automatizado como Q-prep. - Analice las muestras en un citómetro de flujo dentro de una hora. Analice un mínimo de 3.000-5.000 células (de cada subconjunto de interés) de cada muestra para obtener resultados representativos (Figura 1).
- Para analizar las muestras para la fagocitosis, determine la proporción de células que han ingerido bacterias marcadas (mida la proporción de células que tienen la tinción fluorescente).
- Cuantificar el ROS por la oxidación de DHR, lo que resulta en una señal fluorescente (el cambio en la fluorescencia mediana se compara entre las muestras basales y estimuladas).
NOTA: Los neutrófilos son más granulares y tienen más dispersión lateral, mientras que los macrófagos son más grandes y tienen más dispersión hacia adelante. - Distinguir los neutrófilos y macrófagos morfológicamente entre sí por su tamaño (los macrófagos son más grandes) y granularidad (los neutrófilos son más granulares).
NOTA: Los marcadores específicos para neutrófilos y macrófagos generalmente no se usan, aunque CD14 se puede usar para marcar monocitos sanguíneos. La citometría de flujo puede utilizarse potencialmente para distinguir entre diferentes formas funcionales de monocitos y macrófagos (por ejemplo, subconjuntos M1 y M2)18.
- Modifique el ensayo según corresponda (p. ej., utilice NTHi vivo no marcado para estimular los fagocitos y medir la expresión de ROS por escisión DHR).
- Aislar células mononucleares de sangre periférica mediante centrifugación por gradiente de densidad. Coloque la sangre sobre el polímero designado para la centrifugación del gradiente de densidad y gire a 2300 x g durante 30 min. Retire la capa mononuclear con una pipeta, lávela dos veces con PBS y resuspenda las células en PBS a 106 células por ml.
- Como alternativa, use macrófagos BAL.
- Suspender los monocitos/macrófagos a una concentración de 106 células/ml en el medio de cultivo (RPMI). Intéctelos con NTHi vivo a un MOI de 100:1 durante 1 h, como se describe en el paso 1.3.
- Agregue DHR a la suspensión como se describe en el paso 2.3 durante 10 minutos. Realice el análisis de ROS utilizando citometría de flujo.
3. Evaluación de la función linfocitaria en sangre periférica
- Utilizar sangre total o preparaciones de células mononucleares para ensayos de citometría de flujo14.
- Adquirir muestras de cada sujeto por venopunción. Recolectar 4 ml de sangre de una vena periférica en un tubo de heparina de litio y dividir las muestras en alícuotas para el control y la estimulación del antígeno.
- Añadir anticuerpos coestimuladores (anti-CD28 y CD49d, 1 μL/ml) a ambas muestras. Añadir NTHi a la muestra de antígeno e incubar a 37 °C y 5% deCO2 durante 1 h. Para la preparación de NTHi muerta, agregue 200 μL del antígeno a 2 ml de sangre. Para NTHi vivo, agregue células NTHi vivas a un MOI de 100:1 a los glóbulos blancos (según lo medido por el hemocitómetro).
- Añadir el agente bloqueador de Golgi Brefeldin A (10 μL/mL) a las muestras e incubarlas durante otras 5 h.
NOTA: El bloqueo del aparato de Golgi impide que las citoquinas se exporten fuera de la célula. - Si se utiliza sangre entera, lisar los eritrocitos con cloruro de amonio al 0,8% (paso 2.4) para dejar sólo leucocitos en solución. Fijar los leucocitos utilizando 500 μL de paraformaldehído al 1%-2% durante 1 h.
- Contar las células con hemocitómetro, permeabilizar 106 células con 100 μL de saponina al 0,1% durante 15 min e incubar las células con anticuerpos marcados con fluorescencia. Lave las células y analícelas con un citómetro de flujo.
NOTA: La cantidad de anticuerpos marcados con fluorescencia será específica para cada citocina. Siga las instrucciones del fabricante. Normalmente, se tiñirán 106 células en 100 μL de solución durante 1 h. La mayoría de los anticuerpos obtenidos comercialmente serán suficientes para realizar 25-100 pruebas. - Determine la proporción de células que responden al antígeno mediante la activación de la población de linfocitos relevante (las células están activadas por CD45, luego por CD3 y más tarde por la expresión de CD4 o CD8) como se muestra en la Figura 2. Realizar tinción de fondo en células no estimuladas para todas las citoquinas a analizar. Examinar 100.000 células para analizar cada citoquina tanto para las células estimuladas como para el control.
4. Evaluación de la función linfocitaria/mediadores inflamatorios en el tejido pulmonar
- Por lo general, no es posible obtener suficientes linfocitos de la broncoscopia; Por lo tanto, use el tejido pulmonar de las muestras de lobectomía. La optimización de las muestras de tejido pulmonar requiere una estrecha relación con el servicio de anatomía patológica. Asegúrese de que el tejido tenga un margen de al menos 3 cm del tumor y sea el tejido celular sin enfisema significativo (según lo determine el patólogo).
- Romper el tejido pulmonar en una suspensión celular antes de que pueda usarse para ensayos de citometría de flujo. Digerir el tejido pulmonar químicamente (por ejemplo, con colagenasa) o desagregarlo mecánicamente.
NOTA: Se puede preferir la desagregación mecánica del tejido, ya que se asocia con una mejor tinción superficial de las células (por ejemplo, etiquetado de CD3/4)19.- Obtener muestras de lobectomía de un patólogo (generalmente obtenidas de pacientes sometidos a tratamiento de cáncer de pulmón). Cortar unos 20-40 g de la muestra en3-5 mm 3 secciones. Colóquelos dentro de una cámara estéril de 50 μL antes de fragmentarlos mecánicamente utilizando un desagregador apropiado.
- Después de la desagregación tisular, lisar los glóbulos rojos con NH 4 Cl al 0,8% como se mencionó en el paso2.4.
- Resuspender las células en RPMI estéril (el volumen dependerá del número de células y generalmente es de 10-20 ml), y luego filtrarlas a través de una malla de nylon estéril de 100 μm. Cuente el número de celdas viables utilizando el método de exclusión de azul de tripano.
- Ensayo de infección NTHi
- Resuspender las células pulmonares a una concentración celular final de 4 x 106 células/ml por tubo (muestras control y estimuladas).
- Utilice una suspensión de 4 x 10 6-6 x 106 celdas en 1 ml de RPMI para el tubo de control (negativo). Use la misma cantidad para el tubo NTHi (cualquier muestra adicional puede usarse como control positivo con SEB). Infectar las células en el tubo NTHi a un MOI de 100 bacterias por célula. Afloje la tapa media rotación para permitir la transferencia de gas en los tubos.
- Coloque las células en un rotador de tubo e incube a 37 °C mientras gira a 12 rpm.
- Para evitar la exportación extracelular de citoquinas, añadir un bloqueador de Golgi (Brefeldin A) a las suspensiones celulares 1 h después de la estimulación a una concentración final de 10 μg/mL. Devolver las suspensiones celulares para una incubación adicional de 16-22 h en rotación (paso 4.3.3).
- Lavar la suspensión celular con 500 μL de PBS que contengan 1% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,01% de NaN3. Fijar y permeabilizar las células como se describe en el paso 3.5 y el paso 3.6, respectivamente.
- Añadir los anticuerpos para la tinción intracelular de citoquinas (la elección de los anticuerpos debe ser determinada por el investigador, como se indica en la NOTA en el paso 3.6). Tiñe la suspensión celular para marcadores específicos de superficie celular de linfocitos humanos (por ejemplo, CD45, CD3, etc.) durante 1 h. Lave las células con PBS, fíjelas y permeabilícelas como se describe en los pasos 3.5-3.6.
- Incubar las células con anticuerpos intracelulares de tinción de citoquinas (p. ej., IFN-γ y TNF-α o IL-13 e IL-17A) durante 1 h.
NOTA: Se recomienda teñir primero los marcadores superficiales, luego intracelulares, ya que la fijación puede causar cambios conformacionales en las proteínas de superficie a las que se unen los anticuerpos. - Lave las células con 500 μL de PBS y resuspenda en 100 μL de PBS antes de la adquisición de datos en un citómetro de flujo.
- Se puede utilizar un ensayo de matriz de perlas junto con el sobrenadante descrito en el paso 3.2 (Realice esto sin Brefeldin A). Esto permite el análisis de una amplia variedad de diferentes mediadores inflamatorios (potencialmente hasta 40-50 mediadores). Recoger el sobrenadante en alícuotas de 100 μL y almacenar a -70 °C hasta que esté listo para el análisis. Alternativamente, se pueden utilizar ensayos quimioluminiscentes multiplex20.
- Utilice matrices de cuentas multiplex para analizar las muestras descongeladas. Utilice el sobrenadante almacenado para analizar la producción de citoquinas siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Realice la adquisición de la matriz de perlas multiplex en un citómetro de flujo. Utilice el software relevante para realizar el análisis de datos posteriores.
NOTA: Este ensayo de matriz de perlas también se puede realizar con sobrenadante de sangre periférica y / o muestras de BAL.
5. Evaluación de la proteólisis pulmonar por microscopía confocal
NOTA: La microscopía confocal fluorescente es complementaria a la citometría de flujo y se puede utilizar para evaluar las respuestas inflamatorias de la proteasa y ROS. Las trampas extracelulares como los NET y los MET están compuestos de cromatina extracelular (ADN) con otros mediadores inflamatorios, particularmente proteasas como la elastasa de neutrófilos (NE) y las metaloproteinasas de matriz (MMP). Pueden ser evaluados en BAL y tejido pulmonar mediante microscopía confocal, y esto ha sido descrito previamente por Sharma, R. et al.21.
- Evaluar la expresión directa de proteasa en el tejido pulmonar (como se describe en el paso 4.2.1) mediante microscopía confocal y zimografía in situ 15,17.
- Use tejido pulmonar no fijado fresco o congelado. Monte las secciones cortadas a un espesor de 4 μm en portaobjetos de supercongelación/adhesión. Precaliente las secciones en un tampón de reacción 1x durante 5 min.
- Agregue sustrato de gelatina marcado con fluoresceína (30 μg / ml por sección) directamente en portaobjetos individuales para medir la proteólisis a través de la acción de las metaloproteinasas.
- Colocar los portaobjetos en posición horizontal e incubar en una cámara humidificada protegida contra la luz a 37 °C durante 1 h.
- Enjuague las secciones en un tampón de reacción 1x antes de montarlas.
- Como control negativo, agregue solo el tampón de reacción sin gelatina fluorescente a las secciones.
- Utilice un microscopio confocal para evaluar la lisis del sustrato mediante el examen. Use ImageJ para determinar el área del pulmón con evidencia de proteólisis. Para esto, mida el área pulmonar que tiene tinción sobre el fondo de la muestra apagada. Como otro control, utilizar el tejido pulmonar sin gelatina fluorescente añadida15.
NOTA: Realice esto en un mínimo de 10 campos de visión de alta potencia (FOV) para cada muestra.
- Medir la expresión de ROS extracelular en tejido pulmonar por inmunoreactividad para 3-nitrotirosina (un producto tóxico para el estrés oxidativo)13.
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Representative Results
Los resultados representativos muestran cómo las respuestas inmunes inflamatorias a NTHi pueden ser evaluadas / cuantificadas por citometría de flujo y microscopía confocal. Una parte clave de la interpretación de los resultados es la comparación en fluorescencia entre muestras de control y estimuladas. Por lo general, se requieren una serie de experimentos preliminares para optimizar la tinción de las muestras. Cuántos colores diferentes se pueden examinar simultáneamente dependerá del número de canales disponibles en el citómetro de flujo/microscopio confocal. Se muestran resultados para la evaluación de 1) producción de ROS, 2) tinción intracelular de citoquinas del tejido pulmonar humano y 3) zimografía in situ para medir la proteólisis pulmonar.
La Figura 1 muestra la representación de la producción de ROS por monocitos. La medición de ROS es por la oxidación de DHR123 para producir fluorescencia. Las células están cerradas y su fluorescencia mediana se evalúa mediante citometría de flujo. La mediana de fluorescencia de la muestra estimulada se compara con el control.
La figura 2 muestra la producción intracelular de citoquinas por linfocitos derivados del tejido pulmonar humano. El tejido pulmonar debe descomponerse en suspensión unicelular antes de que se puedan realizar ensayos de citometría de flujo para evaluar la producción de mediadores inflamatorios, por ejemplo, la producción de citoquinas por los linfocitos. El tejido pulmonar puede descomponerse mecánicamente o digerirse químicamente, por ejemplo, por la colagenasa. Los métodos de degradación mecánica pueden producir resultados superiores, particularmente en términos de retención de la tinción de la superficie celular (por ejemplo, CD3 y CD4). El filtrado de las muestras es importante para excluir residuos que puedan interferir con el análisis.
La Figura 3 muestra la expresión de la actividad de la proteasa medida por zimografía in situ . El tejido no fijado se utiliza para evaluar la actividad de la proteasa. Estas muestras se congelan normalmente a -70 °C hasta el análisis. Se mide el área del tejido que tiene fluorescencia proteasa y se comparan los resultados entre las muestras de control y estimuladas.
Figura 1: Producción de ROS por monocitos. (A) El panel muestra la estrategia de compuerta para las células mononucleares de sangre periférica (PBMC), con dispersión hacia adelante y dispersión lateral que se utiliza para definir la población de fagocitos. En el panel (B), la población de fagocitos se define aún más por la expresión de CD14 para marcar los monocitos. Esta población de monocitos se analiza para la fluorescencia DHR en muestras de control (C) y estimuladas (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Producción de citoquinas en el tejido pulmonar. Las células se analizan primero para determinar su expresión del marcador leucocitario CD45 (A) mediante citometría de flujo. Esta población se analiza más a fondo para la expresión de CD3 (B) y CD4 / CD8 (C). Las células CD3/CD4+ se evalúan para determinar la producción intracelular de citoquinas en muestras de control (D) y estimuladas por NTHi (E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Zimografía pulmonar in situ . El panel (A) muestra la expresión de cromatina/DAPI en secciones de tejido pulmonar. El panel (B) muestra tinción fluorescente, lo que indica la presencia de actividad MMP. El panel (C) muestra la imagen combinada que indica que la actividad MMP también está colocalizada con la expresión de cromatina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los métodos enumerados aquí utilizan citometría de flujo basada en fluorescencia y técnicas de microscopía confocal que se pueden utilizar en conjunto para obtener información detallada sobre la respuesta pulmonar inflamatoria a Hi.
Establecer la formulación antigénica apropiada de Hi para ser utilizada es fundamental, y es aconsejable contar con aportes específicos de un microbiólogo a este respecto. Live Hi induce una respuesta más fuerte, mientras que las preparaciones de Hi muertas y los componentes Hi están más estandarizados y son más fáciles de almacenar. PI solo etiquetará las bacterias muertas22; otros colorantes como la carboxifluoresceína succinimidylester (CFSE) podrían usarse para marcar bacterias vivas para ensayos de fagocitosis23. Se debe realizar una serie de experimentos preliminares para optimizar el antígeno apropiado. Para usar NTHi en vivo, un MOI de 100: 1 es óptimo; un MOI más bajo puede no inducir una respuesta inmune clara, mientras que un MOI más alto puede ser tóxico para las células. Sin embargo, una curva dosis-respuesta puede dar información útil y puede ser muy valiosa, particularmente con la optimización inicial de la técnica24. Como control positivo, se puede usar una forma obtenida comercialmente del antígeno inactivado de Staphylococcus aureus, que también se etiqueta con IP como se mencionó anteriormente para el ensayo ROS/fagocitosis. Para los ensayos de células T, la estimulación con superantígeno E estafilocócico (SEB) puede ser utilizada como control positivo19,25.
Los protocolos para obtener muestras de BAL y/o de tejido pulmonar deben estar claramente establecidos. Las muestras BAL pueden ser bastante variables entre diferentes operadores. Una jeringa de mano para el lavado del lóbulo medio derecho produce buenos resultados26. La obtención de la muestra de tejido pulmonar a partir de muestras de lobectomía requiere el establecimiento de una colaboración con un patólogo. La muestra de tejido pulmonar debe tener algún margen del tumor (idealmente al menos 3-4 cm). Las muestras más grandes (por ejemplo, al menos 25-50 g) producirán más células, así como muestras que son más proximales sin enfisema obvio. La desagregación mecánica del tejido pulmonar requiere mucho tiempo y generalmente tomará al menos 2-3 h por cada muestra19,27.
Se deben realizar experimentos preliminares para optimizar la tinción de diferentes fluoróforos tanto para citometría de flujo como para microscopía confocal. Las áreas en las que concentrarse incluyen la identificación del mejor panel de tinción, la tinción/concentración y el tratamiento de células/tejidos para maximizar la viabilidad28. El uso de tejido pulmonar puede estar asociado con más restos de tejido que otras muestras de fluidos como sangre o BAL, y esto puede tener algún efecto sobre la diferenciación de diferentes poblaciones celulares por citometría de flujo. La elección apropiada de anticuerpos debe determinarse y optimizarse en experimentos preliminares. Para el marcado de la superficie de los linfocitos, se pueden usar anti-CD3 y CD4 para las células T auxiliares, anti-CD3 y CD8 para las células T citotóxicas, y anti-CD3 y CD56 para las células NK. La elección de las citocinas intracelulares a ser estudiadas depende de los mediadores de interés y del número de parámetros/colores que pueden ser analizados en el citómetro de flujo29. Un desafío específico de trabajar con macrófagos en el tejido pulmonar es su alto nivel de autofluorescencia30; Este problema se puede tratar comparando las células estimuladas con el control de fondo y la adición de marcadores específicos para la inflamación, como proteasas e histonas.
Una limitación de estas técnicas es el requisito de contar con personal debidamente capacitado y capacitado para realizar los experimentos. También se requieren instalaciones bien establecidas de citometría de flujo y microscopía. El uso de muestras de tejido humano se asocia con una variabilidad significativa, particularmente cuando se utiliza tejido pulmonar; Esto puede requerir una serie de experimentos preliminares para optimizar los ensayos (especialmente con problemas de tinción de fondo).
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al personal de Inmunología Clínica de Monash Health por su ayuda con este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
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