Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة للحصول على بيانات مستقرة للتصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (rs-fMRI) من فأر باستخدام جرعة منخفضة من الأيزوفلوران بالاشتراك مع جرعة منخفضة من ديكسميدتوميدين.
Abstract
أصبح التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (rs-fMRI) طريقة شائعة بشكل متزايد لدراسة وظائف الدماغ في حالة الراحة وعدم المهمة. يصف هذا البروتوكول طريقة بقاء ما قبل السريرية للحصول على بيانات rs-fMRI. الجمع بين جرعة منخفضة isoflurane مع التسريب المستمر α2 مستقبلات الأدرينالية ناهض dexmedetomidine يوفر خيارا قويا للحصول على بيانات مستقرة وعالية الجودة مع الحفاظ على وظيفة شبكة الدماغ. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا الإجراء للتنفس التلقائي وعلم وظائف الأعضاء شبه الطبيعي في الفئران. يمكن الجمع بين تسلسل التصوير الإضافي واكتساب حالة الراحة إنشاء بروتوكولات تجريبية مع استقرار مخدر يصل إلى 5 ساعات باستخدام هذه الطريقة. يصف هذا البروتوكول إعداد المعدات، ورصد فسيولوجيا الفئران خلال أربع مراحل متميزة من التخدير، والحصول على فحوصات حالة الراحة، وتقييم جودة البيانات، واستعادة الحيوان، ومناقشة موجزة لتحليل البيانات بعد المعالجة. يمكن استخدام هذا البروتوكول عبر مجموعة واسعة من نماذج القوارض قبل السريرية للمساعدة في الكشف عن التغيرات الناتجة في شبكة الدماغ التي تحدث في الراحة.
Introduction
يستريح الدولة التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي (RS-fMRI) هو مقياس للإشارة التي تعتمد على مستوى الأكسجين في الدم (BOLD) عندما يكون الدماغ في بقية وغير منخرط في أي مهمة معينة. ويمكن استخدام هذه الإشارات لقياس الارتباطات بين مناطق الدماغ لتحديد الاتصال الوظيفي داخل الشبكات العصبية. يستخدم rs-fMRI على نطاق واسع في الدراسات السريرية نظرا لعدم غزوه وانخفاض مقدار الجهد المطلوب من المرضى (بالمقارنة مع fMRI القائم على المهام) مما يجعله الأمثل لمختلف مجموعات المرضى1.
وقد سمح التقدم التكنولوجي بتكييف RS-fMRI للاستخدام في نماذج القوارض للكشف عن الآليات الكامنة وراء حالات المرض (انظر المرجع2 للمراجعة). تسمح النماذج الحيوانية قبل السريرية ، بما في ذلك نماذج المرض أو خروج المغلوب ، بمجموعة واسعة من التلاعب التجريبي غير المطبق على البشر ، ويمكن للدراسات أيضا الاستفادة من عينات ما بعد الوفاة لزيادة تعزيز التجارب2. ومع ذلك ، نظرا لصعوبة في كل من الحد من الحركة وتخفيف التوتر ، يتم إجراء اكتساب التصوير بالرنين المغناطيسي في القوارض تقليديا تحت التخدير. تؤثر عوامل التخدير ، اعتمادا على الدوائية ، والديناميكا الدوائية ، والأهداف الجزيئية ، على تدفق دم الدماغ ، واستقلاب الدماغ ، وربما تؤثر على مسارات اقتران الأوعية الدموية العصبية.
كانت هناك جهود عديدة لتطوير بروتوكولات التخدير التي تحافظ على اقتران الأوعية الدموية العصبية ووظيفة شبكة الدماغ3،4،5،6،7،8. أبلغنا سابقا نظام مخدر التي طبقت جرعة منخفضة من ايزوفلوران جنبا إلى جنب مع جرعة منخفضة من α2 مستقبلات الأدرينالية ناهض ديكسميديتوميدين9. الفئران تحت هذه الطريقة من التخدير أظهرت استجابات جريئة قوية لتحفيز شعيرات في المناطق بما يتفق مع مسارات الإسقاط المعمول بها (نواة الثالامي البطيني والبطيني، قشرة سوماتوسينسوري الأولية والثانوية)؛ كما تم الكشف باستمرار عن شبكات الدماغ واسعة النطاق يستريح الدولة، بما في ذلك شبكة الوضع الافتراضي10و11 وشبكة بارزة12. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا البروتوكول مخدر للتصوير المتكرر على نفس الحيوان، وهو أمر مهم لرصد تطور المرض وتأثير التلاعب التجريبي طوليا.
في هذه الدراسة، نقوم بتفصيل الإعداد التجريبي وإعداد الحيوانات وإجراءات المراقبة الفسيولوجية المعنية. على وجه الخصوص، نحن نصف مراحل التخدير المحددة والحصول على الاشعة خلال كل مرحلة. يتم تقييم جودة البيانات بعد كل مسح حالة الراحة. كما يتضمن النقاش موجزا موجزا لتحليل ما بعد الفحص. المختبرات المهتمة في الكشف عن إمكانات استخدام RS-fMRI في الفئران سوف تجد هذا البروتوكول مفيد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب على ماسح التصوير بالرنين المغناطيسي 9.4 T، ووافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية دارتموث. تم الحصول على موافقة إضافية لتسجيل وإظهار الحيوانات المستخدمة في الفيديو والأرقام أدناه.
1. الاستعدادات قبل المسح الضوئي
- خط التسريب تحت الجلد
- إزالة جزئيا إبرة 23 G من حزمة بحيث تبقى نقطة إبرة عقيمة.
- عقد بأمان محور الإبرة واستخدام شفرة حلاقة ليسجل رمح إبرة حيث يلتقي المحور.
- المشبك حامل إبرة حول رمح مباشرة تحت التهديف وكسر بلطف رمح من المحور.
- إدراج 1/3 من رمح إبرة (نهاية حادة) في خط PE50 معقمة سابقا مع طول خط ما يكفي لتمتد من مضخة المخدرات إلى الحيوان داخل تحمل المغناطيس.
- تمييع ديكسميدتوميدين وأتيباميزول
- إعداد محلول هيدروكلوريد ديكسميدتوميدين المخفف باستخدام 0.5 مل من 0.5 ملغم / مل من المخزون مختلطة مع 9.5 مل من المالحة العقيمة في زجاجة واضحة ومعقمة (تركيز مخفف = 0.025 ملغ / مل).
- إعداد محلول من الاتيباميزول المخفف باستخدام 0.1 مل من 5 ملغ / مل من المخزون مختلطة مع 9.9 مل من المالحة المعقمة في زجاجة زجاجية واضحة ومعقمة (تركيز مخفف = 0.05 ملغم / مل).
- معلمات المسح الضوئي
- استخدم المعلمات المعروضة في الجدول 1 لإعداد تسلسلات المسح الضوئي.
2. المرحلة 1 التخدير: تحريض الحيوان وإعداد
- اعداد
- تأكد من تشغيل جميع المعدات والعمل بشكل صحيح بما في ذلك خلاط الأكسجين والهواء، ولوحة التدفئة، ونظام المسح النشط (انظر الشكل 1).
- تعيين درجة حرارة نظام التدفئة نقطة إلى 37.5 درجة مئوية.
- تحريض الحيوان
- ضع الحيوان (90 يوما من العمر ، ذكر سبراغ داولي الفئران) في غرفة التعريفي والحث على التخدير مع 2.5 ٪ isoflurane في الهواء 30 ٪ المخصب بالأوكسجين.
ملاحظة: يمكن استخدام مجموعة واسعة من الأعمار الحيوانية وكلا الجنسين. - بمجرد تخدير الحيوان ، قم بإزالتها من الغرفة ، ووزن الحيوان ، ووضعه في مخروط الأنف (بنسبة 2.5٪ isoflurane) على لوحة التدفئة في مساحة التحضير.
- ضع الحيوان (90 يوما من العمر ، ذكر سبراغ داولي الفئران) في غرفة التعريفي والحث على التخدير مع 2.5 ٪ isoflurane في الهواء 30 ٪ المخصب بالأوكسجين.
- إعداد الحيوان
- تطبيق مرهم تشحيم العيون على كل عين لمنع التجفيف.
- تأكيد عمق التخدير بسبب عدم وجود استجابة قرصة إصبع القدم.
- استخدام المقصات لحلاقة 2 "من قبل 2" منطقة مربعة على المنطقة القطنية السفلى من ظهر الحيوان (أي مباشرة فوق الذيل).
- إعطاء 0.015 ملغم/كغ من محلول ديكسميدتوميدين مع حقن داخل الصفاق (أي p.) (على سبيل المثال، فإن الفئران 300 غرام تلقي 0.18 مل) في الربع الأيمن السفلي من البطن باستخدام إبرة 25 G.
- تبديل تدفق isoflurane من الفضاء إعداد إلى مهد الحيوان.
- نقل الحيوان إلى مهد الحيوان. ضع أسنان الجرذ الأمامية بشكل آمن فوق وإلى شريط اللدغة. دفع مخروط الأنف على الأنف لضمان تناسب ضيق.
ملاحظة: إذا كان مخروط الأنف لا يغطي الفك السفلي، استخدم فيلم البارافين لعقد بلطف الفك مغلقة في حين ختم أيضا حول مخروط الأنف. - ضع لوحة التنفس تحت بطن الجرذ تحت القفص الصدري وأعيد وضعه حتى يظهر شكل موجة التنفس حوضا عميقا يتمركز على كل نفس (انظر شكل موجة التنفس في الشكل 2).
- مراقبة تنفس الحيوان باستخدام برنامج مراقبة علم وظائف الأعضاء. الانتقال إلى المرحلة التالية من التخدير عندما يكون التنفس أقل من 40 نفسا / دقيقة (bpm؛ حوالي 5 دقائق بعد حقن ديكسميدتوميدين).
3. المرحلة 2 التخدير: إعداد الحيوان
- أدخل قضبان الأذن في قناة الأذن لتثبيت رأس الجرذ في مهد الحيوان. مرة واحدة في وضع، سحب إلى الأمام على شريط لدغة وتأكيد الرأس لا يتحرك. إعادة ضبط مخروط الأنف وفيلم البارافين حسب الحاجة (انظر الشكل 3a).
- أدخل مسبار درجة الحرارة في غطاء مسبار مشحم مسبقا يمكن التخلص منه. أدخل بلطف مسبار درجة الحرارة حوالي 1/2 بوصة في المستقيم، وألصقه على قاعدة الذيل بشريط طبي.
- ضع مقطع مقياس أكسدة النبض على منطقة مشط القدم الخلفية ، مما يضمن أن مصدر الضوء في أسفل القدم (النخيل).
ملاحظة: دوران القصاصة يمكن أن يؤثر على الإشارة; وبالتالي، فإن إنشاء حامل للحفاظ على مخلب ومقطع تستقيم يؤدي إلى مزيد من الاستقرار. لاحظ أيضا أنه حتى يكون الجرذ في درجة حرارة الجسم العادية ، قد يكون تشبع الأكسجين منخفضا (<95٪). - استخدم وزن الجرذ لحساب معدل التسريب لإخراج 0.015 ملغم/كغ/ساعة من ديكسميدتوميدين (يتلقى الجرذ 300 غرام 0.18 مل/ساعة).
- تعيين مضخة الدواء لإخراج معدل التسريب المحسوبة.
- ملء حقنة 3 مل مع المعقمة، محلول ديكسميدتوميدين المخفف وإدراج غيض من الإبرة في الطرف المفتوح من خط التسريب المعقم (تمتد من مضخة المخدرات إلى مهد الحيوان مع إبرة تحت الجلد المرفقة سابقا). ملء الخط وتأمين الحقنة في حامل حقنة من مضخة المخدرات.
- حرك كتلة الدفع إلى الأمام حتى تلمس المكبس ، ويتم طرد الدواء عند الإبرة ، مما يضمن ملء خط التسريب تماما.
- باستخدام مسح الكحول، وتنظيف منطقة حلق لإزالة أي شعر ضال.
- قرصة الجلد ما يقرب من اثنين من عرض الإصبع فوق قاعدة الذيل. أدخل 1/3 من إبرة خط التسريب في الجلد الخيام.
- تأمين الإبرة إلى الجلد مع قطعة 3 "من الشريط الطبي واسعة. ضع قطعة ثانية من الشريط الطبي الواسع فوق الأول ، عبر الجرذ ، وتعلق على جانبي مهد الحيوان (انظر الشكل 4).
ملاحظة: من المهم للغاية أن يتم تأمين إبرة المغناطيسي الحديدي بشكل جيد لمنع الحركة أثناء الفحص. - بدء ضخ ديكسميدتوميدين تحت الجلد.
- ضع قطعة من الشاش على جسر أنف الجرذ لإنشاء سطح مستو لللفائف. استخدام الشريط الورقي، الذي لا تتداخل مع إشارة التصوير بالرنين المغناطيسي، لتأمين لفائف إلى رأس الجرذ، تتمحور على الدماغ (انظر الشكل 3b،ج).
- تأمين جميع خطوط وكابلات داخل مهد الحيوان مع شريط المختبر والتحقق مما إذا كانت جميع إشارات علم وظائف الأعضاء مستقرة (انظر الشكل 2).
- ضع مناشف ورقية فوق الحيوان ، وتأمينها إلى مهد الحيوان مع شريط المختبر. إذا كنت تستخدم نظام تسخين الهواء، قم بلف ورقة بلاستيكية حول المهد بأكمله لاحتواء الهواء الدافئ.
- نقل الحيوان إلى تحمل وضبط المغناطيس.
4. المرحلة 3 التخدير: التشريحية مسح اكتساب
- خفض isoflurane إلى 1.5٪، مما أدى إلى زيادة مطردة في التنفس إلى ما يقرب من 45-50 bpm. البقاء في هذا المستوى لمدة المسح التشريحي.
- استخدام فلاش المسح الموضعي لضمان محاذاة الدماغ مع isocenter المغناطيس (الشكل 5a). إعادة وضع الحيوان وكرر إذا لزم الأمر.
- تشغيل فحص الموضعية النادرة أعلى دقة واستخدام هذا الإخراج المسح الضوئي لمحاذاة 15 شرائح القوس تركزت عبر الدماغ (من اليسار إلى اليمين، الشكل 5b).
- باستخدام الشريحة القوسية الوسطى، قم بمحاذاة الشريحة المحورية الوسطى إلى تناقص الخانة الأمامية، والتي تظهر كبقعة داكنة(الشكل 5c). لاحظ إزاحة الشريحة لاستخدامها لاحقا في عمليات المسح الضوئي حالة الراحة.
- الحصول على 23 شرائح باستخدام كل من FLASH والبروتوكولات المحورية النادرة للمساعدة في التسجيل إلى مساحة مشتركة أثناء تحليل ما بعد المسح الضوئي.
- شيم عبر الدماغ كله باستخدام تسلسل الصحافة.
5. المرحلة 4: الراحة الدولة مسح الاستحواذ
- بعد الانتهاء من المسح التشريحي، والحد من isoflurane إلى 0.5٪ إلى 0.75٪، وتعديل بحيث التنفس الحيوان هو 60-65 نفسا في الدقيقة الواحدة. البقاء على هذا المستوى لمدة 10 دقائق على الأقل قبل البدء في المسح الضوئي للراحة لضمان الاستقرار.
- عندما علم وظائف الأعضاء مستقرة (نطاق التنفس هو 60-75 bpm مع عدم وجود اللهاث أو المخالفات، ودرجة حرارة الجسم الأساسية هي 37.5 ± 1.0 درجة مئوية، وتشبع الأكسجين هو 95٪ أو أكثر)، والحصول على 15 شريحة مسح EPI باستخدام نفس شريحة تعويض السلسلة المحورية التشريحية.
- بعد اكتمال كل فحص حالة الراحة، تحقق من الجودة باستخدام تحليل مكون مستقل (ICA) لتحليل البيانات إلى مكونات مكانية وزمنية.
- الحصول على ما لا يقل عن ثلاثة عالية الجودة يستريح الدولة بمسح.
6. بعد المسح الانتعاش
- عند اكتمال المسح الضوئي، قم بزيادة الأيزوفلوران إلى 2٪ وتوقف ضخ ديكسميدتوميدين تحت الجلد.
- إزالة مهد الحيوان من تحمل المغناطيس، فك الحيوان، وإزالة قضبان الأذن، مسبار درجة الحرارة، مقطع oximeter نبض، وإبرة ديكسميدتوميدين.
- حقن 0.015 ملغم/كغ من محلول الاتيباميزول المخفف في عضلة الساق الخلفية للجرذ باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 25 غرام (أي أن الجرذ 300 غرام سيتلقى 0.09 مل).
- ضع الجرذ مرة أخرى في القفص المنزلي على رأس وسادة التدفئة ورصد حتى الحيوان هو الإسعافية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد كل فحص حالة الراحة، يتم تقييم الاستقرار باستخدام تحليل مكون مستقل (ICA؛ مثال البرنامج النصي المضمن في الملفات التكميلية). يوضح الشكل 6 أمثلة على مخرجات المكونات من عمليات المسح الضوئي لحالة الراحة. يظهر الشكل 6a مكون إشارة من المسح الضوئي مع استقرار عالية. لاحظ أن العنصر له مكانيا إقليمية عالية. في غضون الدورة الزمنية تحت المكون المكاني ، تكون الإشارة مستقرة وغير متوقعة ، مما يدل على نشاط الدماغ الحقيقي. يظهر طيف الطاقة في الأسفل ترددات منخفضة في الغالب. يظهر الشكل 6b مكون من نفس المسح الضوئي ك الشكل 6a الذي يمثل الضوضاء. لاحظ عدم الإقليمية في العنصر المكاني، والدورة الزمنية عالية التردد، وذروة التردد العالي في طيف الطاقة. وأخيرا، يظهر الشكل 6c مكونا من الفحص مع تخدير غير مستقر. الدورة الزمنية متغيرة وغير منتظمة. عندما يحدث هذا، هناك حاجة إلى إدخال تحسينات على بروتوكول مخدر، عادة إلى ختم مخروط الأنف ومسح الغازات النفايات.
الشكل 1: إعداد الفضاء ومهد الحيوان التصوير بالرنين المغناطيسي. أ) إعداد الفضاء. الفراغ يمسح غازات النفايات من كل من غرفة التعريفي ومخروط الأنف في مهد الحيوان. تساعد وسادة التدفئة على الحفاظ على درجة حرارة الحيوان خلال المرحلة الأولى والانتعاش. ب) مهد الحيوانات التصوير بالرنين المغناطيسي. يشير الجزء العلوي إلى مكونات إعداد الحيوان في المرحلة 2. يظهر الجزء السفلي فأرا جاهزا وجاهزا للمسح الضوئي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إخراج المسح الفسيولوجي. يتم مراقبة تشبع الأكسجين (PulseOx، 96٪)، ومعدل ضربات القلب (325 BPM [نبضة في الدقيقة])، ومعدل التنفس (61 نفسا / دقيقة)، ودرجة حرارة الجسم الأساسية (T1، 37.5 درجة مئوية) باستمرار طوال جلسة المسح الضوئي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مخروط الأنف ووضع لفائف. أ)عن قرب عرض مخروط الأنف مختومة حول أنف الحيوان والفك السفلي. (ب) منظر علوي لمحاذاة لفائف السطح إلى الدماغ. (ج) منظر جانبي لمحاذاة الملف مع نقطة الوسط لعين الحيوان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: خط التسريب تحت الجلد dexmedetomidine ووضع إبرة. (أ) إبرة الإدراج في المنطقة القطنية السفلى من ظهر الحيوان. (ب) شريط تأمين الإبرة إلى جلد الحيوان. (ج) الشريط عبر مهد الحيوان لمنع حركة الإبرة المغناطيسية الحديدية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التشريحية المسح الضوئي المحاذاة. (أ) المسح الموضعي لمحاذاة دماغ الحيوان إلى isocenter المغناطيس، وأشار مع مرمى. (ب) شرائح القوس الانحياز عبر الدماغ من اليسار إلى اليمين. (ج) المحاذاة إلى تناقص الخانة الأمامية، المشار إليها بالسهم الأبيض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6:تقييم الجودة باستخدام تحليل مكون مستقل. (أ) مكون إشارة أثناء التخدير المطرد. (ب) مكون الضوضاء أثناء التخدير الثابت. (ج) التخدير غير المستقر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مسح ضوئي | تسلسل | اتجاه | FOV (مم × مم) | مصفوفة | شرائح | سمك الشريحة (مم) | TE (ms) | TR (مللي ثانية) | المتوسطات | تباعد الصدى (مللي ثانية) | عامل نادر | التكرار | وقت المسح الضوئي |
| المترجم | برق | جميع الطائرات | 50 | 256 | 1/دير | 1 | 2.5 | 100 | 1 | 1 | 12.8 ق | ||
| المترجم | نادر | جميع الطائرات | 35 | 192 | 1/دير | 0.75 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | دقيقة واحدة |
| عنات | نادر | السهمي | 35 | 192 | 15 | 1 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | دقيقة واحدة |
| عنات | برق | المحوري | 35 | 192 | 23 | 1 | 5 | 250 | 2 | 1 | دقيقة واحدة و 36 ق | ||
| عنات | نادر | المحوري | 35 | 192 | 23 | 1 | 28 | 2500 | 4 | 7 | 8 | 1 | 4 دقائق |
| الرقاقه | كبس | جميع الطائرات | 16.223 | 2500 | 1 | 1 | 2.5 ق | ||||||
| الدولة المريحة | برنامج التحصين الموسع | المحوري | 35 | 64 | 15 | 1 | 15 | 1200 | 1 | 300 | 6 دقائق لكل منهما |
الجدول 1: الجدول المرجعي لمعلمات المسح الضوئي. معلمات التسلسلات الموضحة في البروتوكول. فلاش = سريع زاوية منخفضة النار، نادرة = اكتساب سريع مع تعزيز الاسترخاء، PRESS = نقطة RESolved الطيفي، EPI = صدى التصوير بلانار.
الملفات التكميلية: مثال على ذلك البرنامج النصي لتقييم جودة ICA. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استقرار الحيوان ، جسديا وفسيولوجيا ، هو المفتاح للحصول على بيانات عالية الجودة يستريح الدولة. هذا البروتوكول يحقق الاستقرار من خلال التحرك من خلال أربع مراحل متميزة من التخدير. من الضروري أن الحيوان قد اجتمع عتبات الفسيولوجية مجموعة قبل الانتقال إلى المرحلة التالية من التخدير; وبما أن هذه الطريقة تعتمد على آليات التنظيم الذاتي الفسيولوجية ، فقد تتطلب الحيوانات الفردية كميات مختلفة قليلا من الوقت في كل مرحلة تخدير. ومن تجربتنا أن أخذ المزيد من الوقت في كل مرحلة هو أكثر كفاءة من التسرع من خلال المراحل السابقة دون إعطاء فسيولوجيا الفئران ما يكفي من الوقت لتسوية. المكونات الرئيسية التي تسمح للاستقرار هي تناسب مخروط الأنف والنفايات المناسبة الغاز الزبال.
يسمح مخروط الأنف المغلق بشكل صحيح والمسح للحيوان بالبقاء مستقرا مع التنفس المتباعد بانتظام ومستويات تشبع الأكسجين الثابتة. إذا حدث اللهاث أو التباعد غير المنتظم أو حبس النفس أو انخفاض مستويات تشبع الأكسجين ، فيجب على المرء العمل على تحسين ختم مخروط الأنف ومسحه. يجب أن تناسب مخروط الأنف عن كثب ولكن لا ينبغي أن تدفع إلى جسر الأنف. قد يحتاج مخروط الأنف المخصص إلى أن يكون ملفقا. كان مخروط الأنف الأصلي من الشركة المصنعة لدينا صمام امتصاص الهواء الذي كان صغيرا جدا ، لذلك تم تزويد أنبوب الصقر بخط فراغ مختوم أكبر أقرب إلى الحيوان. وأدى ذلك إلى إزالة أفضلل ثاني أكسيد الكربون المنتهي الصلاحية وتشبع الأكسجين المطرد. كما ذكر في البروتوكول ، قد يكون فيلم البارافين ملفوفا حول الفك السفلي وحافة مخروط الأنف ، ولكن إذا كان ملفوفا بإحكام شديد ، فيمكن أن يحد من التنفس ويؤدي إلى عدم الاستقرار. بالإضافة إلى ذلك ، لا يؤثر التنسيب غير السليم لقضبان الأذن وشريط العض على الاستقرار الضروري للرأس للتصوير فحسب ، بل يمكن أن يؤثر أيضا على التنفس ؛ استمرار وامض أو الضوضاء مسموعة من الحيوان هو مؤشر محتمل على وضع شريط الأذن غير لائق. يجب أن تجلس الأسنان الأمامية بشكل آمن على شريط اللدغة ويتم سحبها إلى الأمام بعد وضع شريط الأذن لضمان نوبة ضيقة. قد يحتاج لسان الجرذ إلى سحبه إلى الأمام إذا كان يجلس بعيدا جدا في الفم ويقيد التنفس السليم.
كما هو فريد من نوعه كل نظام، وضبط مستوى الفراغ مطلوب لتحقيق الزبال الأمثل. كدليل عملي، ينبغي أن يكون من الممكن أن يشعر كمية صغيرة من الشفط إما عن طريق وضع إصبع على فتحة خط فراغ داخل مخروط الأنف، أو عن طريق ختم مخروط الأنف كامل فتح مع النخيل. مطابقة معدل التدفق لإدخال التخدير (0.8 L/min تم استخدامه هنا) هو نقطة انطلاق جيدة. يجب أن يظل تشبع الأكسجين في الحيوان أعلى من 95٪ طوال فترة الفحص. إذا أظهر تشبع الأكسجين اتجاها متناقصا ، فقد يكون هذا مؤشرا على أن ثاني أكسيد الكربون يتراكم فيمخروط الأنف ويحتاج الزبال إلى زيادة. وهناك احتمال آخر هو أن ضغط مقطع أكسدة النبض على القدم يحتاج إلى تعديل، إما تخفيف لتحسين تدفق الدم أو تشديد لضمان إشارة قوية ومستقرة. إذا كان تنفس الحيوان أعلى من العتبات المبينة ، فقد يشير هذا إلى أن الزبال يتم تعيينه مرتفعا جدا ويزيل الكثير من الأيزوفلوران. في ظروف نادرة، قد يكون من الضروري زيادة جرعة ديكسميديتوميدين تحت الجلد إلى 0.02 ملغم/كغ/ساعة، ولكن وجدنا أن 0.015 ملغم/كغ عملت بشكل جيد عبر مجموعة واسعة من أعمار الفئران وكلا الجنسين، ويدعم في الدراسات الدوائية4.
مدة المسح الضوئي اللازمة لتنشيط التصوير بالرنين المتري هي وظيفة من حجم التأثير، ونسبة الإشارة إلى الضوضاءالمكانية (SNR) وSNR الزمنية، كما هو مبين سابقا من قبل ميرفي وآخرون. استخدام لفائف سطح صغير (2 سم) والمجال المغناطيسي العالي (9.4 T) يعزز بشكل كبير SNR وحساسية BOLD. مع إعداد التصوير لدينا، وجدنا أن مسح واحد 6 دقائق كافية للكشف عن شبكة اتصال وظيفية قوية يستريح الدولة، بما يتفق مع تقريرنا السابق10. ومع ذلك، فإننا عادة ما نكرر الفحص 3 إلى 4 مرات، ومتوسط النتائج لاشتقاق شبكات الدماغ الوظيفية للحيوانات الفردية. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن تفحص مرة واحدة مع مدة أطول (10 دقيقة أو أكثر) لاشتقاق شبكات الاتصال وظيفية14.
بعد جمع عالية الجودة RS-fMRI باستخدام هذا البروتوكول، preprocess البيانات كما تم نشره سابقا15،16. مع استخدام كل من قضبان الأذن وشريط لدغة، والتحف الحركة في الدورة الزمنية fMRI هي الحد الأدنى، واستخدام تصحيح الحركة لم يكن له تأثير ملحوظ على بياناتنا. الفردية يستريح الدولة EPI بمسح تحتاج إلى أن تكون الجمجمة جردت ومسجلة في مساحة مشتركة (نستخدم الدماغ الفئران ممثل واحد)16,17. إزالة وحدات التخزين بداية من كل EPI بحيث يتم الحصول على جميع تلك المدرجة عندما المغناطيس هو في حالة ثابتة (نزيل 5 نقاط زمنية). مسح Denoise الفردي (راجع النتائج التمثيلية للحصول على أمثلة لمكونات الإشارة والضوضاء). تطبيق تصحيح توقيت شريحة، فضلا عن إزالة الاتجاه الخطي والتربيعي، وتصفية تمرير النطاق (0.005-0.1 هرتز) وتنعيم المكانية (0.6 ملم FWHM [العرض الكامل في نصف الحد الأقصى]). بالإضافة إلى ذلك، قم بإزالة متوسط مسار وقت الإشارة من المادة البيضاء والبطينين من خلال الانحدار الخطي. بعد هذه الخطوات القياسية قبل المعالجة، يمكن إجراء مزيد من التحليل على مستوى المجموعة بما في ذلك الاتصال الوظيفي القائم على البذور11،15،18،19،20،21،22، تحليلات المكونات المستقلة10،20،22، وتحليلات وحدات12،19.
هناك ميزتان رئيسيتان للبروتوكول الحالي: 1) أنه يسمح لنشاط الدماغ التلقائي. و 2) فإنه يحتفظ الحيوان في علم وظائف الأعضاء شبه طبيعية. كما تم استخدام طرق مخدر بديلة (مثل البروبوفول21، α - الكلورالوز15، وبروميد بانكورونيوم بالاشتراك مع مخدر آخر21،23)للحصول على بيانات حالة الراحة. ومع ذلك، باستخدام مزيج من جرعة منخفضة isoflurane مع جرعة منخفضة dexmedetomidine، كما هو موضح في هذا البروتوكول، وقد ثبت أن تعطيل وظائف شبكة الدماغ الحد الأدنى فقط في حين توفر أيضا الاستقرار الفسيولوجي اللازمة للحصول على جودة الراحة الدولة بيانات الاتصال الوظيفي9،10،18،24. وعلاوة على ذلك، يمكن رؤية استجابات BOLD من التحفيز الحسي سوماتوسوري9 وانحراف شعيرات الميكانيكية11 في أو بعد فترة 90 دقيقة عند استخدام هذا البروتوكول، مما يشير إلى مستوى الإثارة متسقة. ومن المثير للاهتمام, استخدام ديكسميدتوميدين في عزلة يمكن أن تثير نشاط الصرع; ومع ذلك، تم إلغاء هذا النشاط مع إيزوفلورانتكملة 8. ميزة أخرى للبروتوكول الحالي هو أنه يلغي الحاجة إلى التهوية الاصطناعية. على الرغم من أن التهوية الميكانيكية قد تؤدي إلى نطاق أضيق من ثاني أكسيد الكربون الجزئي وتشبع الأكسجين عبر الحيوانات ، في الدراسات الطولية ، فإن الحفاظ على المعلمات الفسيولوجية دون الحاجة إلى التنبيب قد يؤدي إلى مضاعفات أقل وآثار جانبية غير مرغوب فيها.
وقد نما الاهتمام بالري بالرنين المغناطيسي للراحة بشكل كبير في السنوات العشر الماضية، ومعه الحاجة إلى الحصول على فحوصات عالية الجودة قبل السريرية للراحة من القوارض. هذا البروتوكول البقاء على قيد الحياة يحقق تخدير مستقر لمدة تصل إلى 5 ساعة مع علم وظائف الأعضاء شبه طبيعية أثناء الحصول على الراحة الدولة. وبما أن البروتوكول مستقر للغاية ، يمكن بسهولة إضافة تسلسلات إضافية (الهيكلية والتحفيز والتصوير بالرنين المغناطيسي الدوائي ، وما إلى ذلك) لتحقيق التصميم التجريبي المطلوب. مزيج من جرعة منخفضة isoflurane مع ديكسميدتوميدين المستخدمة في هذا البروتوكول يسمح لمجموعة واسعة من الدراسات قبل السريرية للمحققين المهتمين في دراسة الدماغ القوارض في حالته يستريح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل بتمويل من المعهد الوطني للصحة (NIH) حول تعاطي المخدرات (NIDA) [DJW، تم دعم EDKS و EMB من قبل غرانت R21DA044501 الممنوح لآلان غرين وDJW بدعم من غرانت T32DA037202 إلى ألان ج. بودني] والمعهد الوطني لتعاطي الكحول وإدمان الكحول (NIAAA) [منح F31AA028413 إلى إميلي د. ك. سوليفان]. تم تقديم دعم إضافي من خلال صندوق آلان غرين الموهوب كأستاذ رايموند سوبيل للطب النفسي في دارتموث.
ويدعم هانبينغ لو من قبل المعهد الوطني لتعاطي المخدرات برنامج البحوث داخل الأم، المعاهد القومية للصحة.
ويود المؤلفان أن يعترفا بالراحل آلان غرين وأن يشكراه. وقد ساعد تفانيه الثابت في مجال الاضطرابات التي تحدث بشكل مشترك على إقامة التعاون بين المؤلفين. ونشكره على إرشاده وتوجيهه، اللذين سيفتقدان كثيرا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9.4T MRI | Varian/Bruker | Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software | |
| Air-Oxygen Mixer | Sechrist | Model 3500CP-G | |
| Analysis of Functional NeuroImages (AFNI) | NIMH/NIH | Version AFNI_18.3.03 | Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/ |
| Animal Cradle | RAPID Biomedical | LHRXGS-00563 | rat holder with bite bar, nose cone and ear bars |
| Animal Physiology Monitoring & Gating System | SAII | Model 1025 | MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on |
| Antisedan (atipamezole hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-867-7097 | Zoetis, Manufacturer Item #10000449 |
| Ceramic MRI-Safe Scissors | MRIequip.com | MT-6003 | |
| Clippers | Patterson Veterinary | 07-882-1032 | Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201 |
| Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-893-1801 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10 |
| Digital Rectal Thermometer Covers | Medline | MDS9608 | |
| FMRIB Software Library | FMRIB | MELODIC Version 3.15 | Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki |
| Heating Pad | Cara Inc. | Model 50 | |
| Hemostat forceps, straight | Kent Scientific | INS750451-2 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06 |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip Inc. | 911103 | |
| Lab Tape, 3/4" | VWR International | 89097-990 | |
| Needles, 23 gauge | BD | 305145 | plastic hub removed |
| Parafilm Laboratory Film | Patterson Veterinary | 07-893-0260 | Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A |
| Planar Surface Coil | Bruker | T12609 | 2cm |
| Polyethylene Tubing | Braintree Scientific | PE50 50FT | 0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter) |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38 |
| Sprague Dawley Rats | Charles River | 400 SAS SD | |
| Sterile 0.9% Saline Solution | Patterson Veterinary | 07-892-4348 | Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186 |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Medline | MDS090735 | |
| Surgical Tape, 1" (3M Durapore) | Medline | MMM15381Z | 3M Healthcare, "wide medical tape" |
| Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore) | Medline | MMM15300 | 3M Healthcare |
| Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle | BD | 309626 | |
| Syringes, 3 mL | BD | 309657 | |
| Vented induction and scavenging system | VetEquip Inc. | 942102 | 2 liter induction chamber with active scavenging |
| 411724 | omega flowmeter | ||
| 931600 | scavenging cube, "vacuum" | ||
| 921616 | nose cone, non-rebreathing |
References
- Smitha, K. A., et al. Resting state fMRI: A review on methods in resting state connectivity analysis and resting state networks. The Neuroradiology Journal. 30 (4), 305-317 (2017).
- Gorges, M., et al. Functional connectivity mapping in the animal model: Principles and applications of resting-state fMRI. Frontiers in Neurology. 8, (2017).
- Paasonen, J., Stenroos, P., Salo, R. A., Kiviniemi, V., Gröhn, O. Functional connectivity under six anesthesia protocols and the awake condition in rat brain. NeuroImage. 172, 9-20 (2018).
- Pawela, C. P., et al. A protocol for use of medetomidine anesthesia in rats for extended studies using task-induced BOLD contrast and resting-state functional connectivity. NeuroImage. 46 (4), 1137-1147 (2009).
- Jonckers, E., et al. Different anesthesia regimes modulate the functional connectivity outcome in mice. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (4), 1103-1112 (2014).
- Williams, K. A., et al. Comparison of alpha-chloralose, medetomidine and isoflurane anesthesia for functional connectivity mapping in the rat. Magnetic Resonance Imaging. 28 (7), 995-1003 (2010).
- Zhurakovskaya, E., et al. Global functional connectivity differences between sleep-like states in urethane anesthetized rats measured by fMRI. PloS One. 11 (5), 0155343 (2016).
- Fukuda, M., Vazquez, A. L., Zong, X., Kim, S. -G. Effects of the α2-adrenergic receptor agonist dexmedetomidine on neural, vascular and BOLD fMRI responses in the somatosensory cortex. The European Journal of Neuroscience. 37 (1), 80-95 (2013).
- Brynildsen, J. K., et al. Physiological characterization of a robust survival rodent fMRI method. Magnetic Resonance Imaging. 35, 54-60 (2017).
- Lu, H., et al. Rat brains also have a default mode network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3979-3984 (2012).
- Lu, H., et al. Low- but not high-frequency LFP correlates with spontaneous BOLD fluctuations in rat whisker barrel cortex. Cerebral Cortex. 26 (2), 683-694 (2016).
- Tsai, P. -J., et al. Converging structural and functional evidence for a rat salience network. Biological Psychiatry. 88 (11), 867-878 (2020).
- Murphy, K., Bodurka, J., Bandettini, P. A. How long to scan? The relationship between fMRI temporal signal to noise ratio and necessary scan duration. NeuroImage. 34 (2), 565-574 (2007).
- Birn, R. M., et al. The effect of scan length on the reliability of resting-state fMRI connectivity estimates. NeuroImage. 83, 550-558 (2013).
- Lu, H., et al. Synchronized delta oscillations correlate with the resting-state functional MRI signal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18265-18269 (2007).
- Lu, H., et al. Registering and analyzing rat fMRI data in the stereotaxic framework by exploiting intrinsic anatomical features. Magnetic Resonance Imaging. 28 (1), 146-152 (2010).
- Cox, R. W. AFNI: software for analysis and visualization of functional magnetic resonance neuroimages. Computers and Biomedical Research. 29 (3), 162-173 (1996).
- Ash, J. A., et al. Functional connectivity with the retrosplenial cortex predicts cognitive aging in rats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (43), 12286-12291 (2016).
- Hsu, L. -M., et al. Intrinsic insular-frontal networks predict future nicotine dependence severity. The Journal of Neuroscience. 39 (25), 5028-5037 (2019).
- Li, Q., et al. Resting-state functional MRI reveals altered brain connectivity and its correlation with motor dysfunction in a mouse model of Huntington's disease. Scientific Reports. 7, (2017).
- Lu, H., et al. Abstinence from cocaine and sucrose self-administration reveals altered mesocorticolimbic circuit connectivity by resting state MRI. Brain Connectivity. 4 (7), 499-510 (2014).
- Seewoo, B. J., Joos, A. C., Feindel, K. W. An analytical workflow for seed-based correlation and independent component analysis in interventional resting-state fMRI studies. Neuroscience Research. 165, 26-37 (2021).
- Broadwater, M. A., et al. Adolescent alcohol exposure decreases frontostriatal resting-state functional connectivity in adulthood. Addiction Biology. 23 (2), 810-823 (2018).
- Jaime, S., Cavazos, J. E., Yang, Y., Lu, H. Longitudinal observations using simultaneous fMRI, multiple channel electrophysiology recording, and chemical microiontophoresis in the rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 306, 68-76 (2018).
