Summary
Denne protokol beskriver en metode til at opnå stabile hviletilstandsfunktionelle magnetisk resonansbilleddannelsesdata (rs-fMRI) fra en rotte ved hjælp af lavdosisisofluran i kombination med lavdosis dexmedetomidin.
Abstract
Hviletilstand funktionel magnetisk resonansbilleddannelse (rs-fMRI) er blevet en stadig mere populær metode til at studere hjernefunktion i en hvilende, ikke-opgavetilstand. Denne protokol beskriver en præklinisk overlevelsesmetode til indhentning af rs-fMRI-data. Kombinationen af lavdosisisoflurane med kontinuerlig infusion af α2 adrenergic receptor agonist dexmedetomidin giver en robust mulighed for stabil dataopsamling af høj kvalitet, samtidig med at hjernens netværksfunktion bevares. Desuden giver denne procedure mulighed for spontan vejrtrækning og næsten normal fysiologi hos rotten. Yderligere billedsekvenser kan kombineres med hviletilstandserhvervelse, der skaber eksperimentelle protokoller med bedøvelsesstabilitet på op til 5 timer ved hjælp af denne metode. Denne protokol beskriver opsætningen af udstyr, overvågning af rottefysiologi i fire forskellige faser af anæstesi, erhvervelse af hviletilstandsscanninger, kvalitetsvurdering af data, genopretning af dyret og en kort diskussion af efterbehandlingsdataanalyse. Denne protokol kan bruges på tværs af en bred vifte af prækliniske gnavermodeller for at hjælpe med at afsløre de resulterende hjernenetværksændringer, der opstår i hvile.
Introduction
Hviletilstand funktionel magnetisk resonansbilleddannelse (rs-fMRI) er et mål for det blod-ilt-niveau-afhængige (FED) signal, når hjernen er i hvile og ikke er involveret i nogen bestemt opgave. Disse signaler kan bruges til at måle korrelationer mellem hjerneregioner for at bestemme den funktionelle forbindelse inden for neurale netværk. rs-fMRI anvendes i vid udstrækning i kliniske undersøgelser på grund af dets ikke-invasivitet og den lave indsats, der kræves af patienter (sammenlignet med opgavebaseret fMRI), hvilket gør det optimalt for forskellige patientpopulationer1.
De teknologiske fremskridt har gjort det muligt at tilpasse rs-fMRI til brug i gnavermodeller for at afdække mekanismer, der ligger til grund for sygdomstilstande (se reference2 til revision). Prækliniske dyremodeller, herunder sygdoms- eller knockoutmodeller, tillader en bred vifte af eksperimentelle manipulationer, der ikke kan anvendes hos mennesker, og undersøgelser kan også gøre brug af post mortem-prøver til yderligere at forbedre forsøg2. Ikke desto mindre, på grund af vanskelighederne med både at begrænse bevægelse og formildende stress, udføres MR-erhvervelse hos gnavere traditionelt under anæstesi. Bedøvelsesmidler, afhængigt af deres farmakokinetik, farmakodynamik og molekylære mål, påvirker hjernens blodgennemstrømning, hjernens stofskifte og potentielt påvirker neurovaskulære koblingsveje.
Der har været mange bestræbelser på at udvikle anæstesiprotokoller, der bevarer neurovaskulær kobling og hjernenetværksfunktion3,4,5,6,7,8. Vi har tidligere rapporteret en bedøvelse regime, der anvendes en lav dosis af isoflurane sammen med en lav dosis af α2 adrenergic receptor agonist dexmedetomidin9. Rotter under denne anæstesimetode udviste robuste FED-reaktioner på whisker stimulation i regioner i overensstemmelse med etablerede projektionsveje (ventrolateral og ventromedial thalamic nuclei, primær og sekundær somatosensorisk cortex); store hviletilstandshjernenetværk, herunder standardtilstandsnetværket10,11 og salience-netværk12, er også konsekvent blevet opdaget. Desuden giver denne bedøvelsesprotokol mulighed for gentagen billeddannelse på det samme dyr, hvilket er vigtigt for overvågningen af sygdomsprogressionen og effekten af eksperimentelle manipulationer i længderetningen.
I denne undersøgelse beskriver vi de eksperimentelle opsætnings-, dyreforberedelses- og fysiologiske overvågningsprocedurer, der er involveret. Vi beskriver især de specifikke anæstesifaser og erhvervelse af scanninger i hver fase. Datakvaliteten vurderes efter hver hviletilstandsscanning. En kort oversigt over analyse efter scanningen er også inkluderet i diskussionen. Laboratorier, der er interesseret i at afdække potentialet ved at anvende rs-fMRI hos rotter, vil finde denne protokol nyttig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter blev udført på en 9,4 T MR-scanner, og blev godkendt af den institutionelle Animal Care and Use Committee på Dartmouth College. Yderligere godkendelse blev opnået for at optage og vise de dyr, der anvendes i videoen og tallene nedenfor.
1. Præparater før scanning
- Subkutan infusionslinje
- Fjern delvist en 23 G nål fra pakken, så nålepunktet forbliver sterilt.
- Hold nålens nav sikkert, og brug et barberblad til at score nåleskakten, hvor den møder navet.
- Klem en nåleholder rundt om akslen lige under scoringen, og bryd forsigtigt akslen fra navet.
- Sæt 1/3 af nåleskaftet (stump ende) i tidligere steriliseret PE50-linje med tilstrækkelig linjelængde til at strække sig fra lægemiddelpumpen til dyret inde i magnetboringen.
- Fortynding af dexmedetomidin og atipamezol
- Der fremstilles en opløsning af fortyndet dexmedetomidinhydrochlorid ved hjælp af 0,5 ml 0,5 mg/ml bestand blandet med 9,5 ml steril saltvand i en klar, steril glasflaske (fortyndet koncentration = 0,025 mg/mL).
- Der fremstilles en opløsning af fortyndet atipamezol ved hjælp af 0,1 ml 5 mg/ml bestand blandet med 9,9 ml steril saltvand i en klar, steril glasflaske (fortyndet koncentration = 0,05 mg/ml).
- Parametre for scanning
- Brug de parametre, der er vist i tabel 1, til at forberede scanningssekvenser.
2. Fase 1 anæstesi: Induktion og tilberedning af dyr
- Installationsprogrammet
- Sørg for, at alt udstyr er tændt og fungerer korrekt, herunder ilt- og luftblander, varmepude og aktivt skyllesystem (se figur 1).
- Sæt varmesystemets temperatursætpunkt til 37,5 °C.
- Induktion af dyr
- Placer dyret (90-dages gammel, mandlig sprague Dawley rotte) i induktionskammeret og inducere anæstesi med 2,5% isoflurane i 30% iltberiget luft.
BEMÆRK: En bred vifte af dyrealder og begge køn kan bruges. - Når dyret er bedøvet, skal du fjerne det fra kammeret, veje dyret og placere det i næsekeglerne (ved 2,5% isoflurane) på varmepuden i forberedelsesrummet.
- Placer dyret (90-dages gammel, mandlig sprague Dawley rotte) i induktionskammeret og inducere anæstesi med 2,5% isoflurane i 30% iltberiget luft.
- Tilberedning af dyr
- Påfør oftalmisk smøre salve på hvert øje for at forhindre tørring.
- Bekræft dybden af anæstesi ved en mangel på tå knivspids respons.
- Brug klipperen til at barbere et 2" med 2" firkantet område på den nederste lændehvirvelregion på dyrets ryg (dvs. direkte over halen).
- 0,015 mg/kg af dexmedetomidinopløsningen gives med intraperitoneal (i.p.) injektion (f.eks. ville en rotte på 300 g modtage 0,18 ml) i underlivets nederste højre kvadrant ved hjælp af en 25 G nål.
- Skift isoflurane flow fra forberedelsesrummet til dyreholderen.
- Flyt dyret ind i dyre vuggen. Placer rottens fortænder sikkert over og ind i bidestangen. Skub næseke keglen over næsen for at sikre en stram pasform.
BEMÆRK: Hvis næsekeglet ikke dækker underkæben, skal du bruge en paraffinfilm til forsigtigt at holde kæben lukket, mens du også forsegler omkring næsekeglet. - Placer åndedrætspuden under rottens underliv under brystkassen, og placer den igen, indtil åndedrætsbølgeformen viser et dybt trug centreret om hvert åndedrag (se åndedrætsbølgeform i figur 2).
- Overvåg dyrets vejrtrækning ved hjælp af fysiologiovervågningssoftwaren. Gå videre til næste fase af anæstesi, når åndedrættet er mindre end 40 vejrtrækninger/min. (bpm; ca. 5 minutter efter dexmedetomidinindsprøjtning).
3. Fase 2 anæstesi: Animalsk opsætning
- Sæt ørestænger i øregangen for at stabilisere rottens hoved i dyreholderen. Når det er placeret, skal du trække fremad på bidestangen og bekræfte, at hovedet ikke bevæger sig. Omjuster næsekeglerne og paraffinfilmen efter behov (se figur 3a).
- Sæt temperatursonden i et forsmurt, engangssondedæksel. Sæt forsigtigt temperatursonden ca. 1/2" ind i endetarmen, og tape den til bunden af halen med medicinsk tape.
- Placer pulsoximeterclipsen på bagfodens mellemfodsområde, så lyskilden er på bunden af foden (håndfladen).
BEMÆRK: Kliprotationen kan påvirke signalet. således vil det føre til større stabilitet at skabe en holder til at holde poten og klippe oprejst. Bemærk også, at indtil rotten er ved normal kropstemperatur, kan iltmætningen være lav (<95%). - Brug rottens vægt til at beregne infusionshastigheden til udslyngning af 0,015 mg/kg dexmedetomidin (en rotte på 300 g får 0,18 mL/h).
- Indstil lægemiddelpumpen til at skubbe den beregnede infusionshastighed ud.
- Fyld en 3 ml sprøjte med den sterile, fortyndede dexmedetomidinopløsning, og sæt nålespidsen i den åbne ende af den steriliserede infusionslinje (der strækker sig fra lægemiddelpumpen til dyre vuggen med den subkutane nål, der tidligere er fastgjort). Fyld linjen og fastgør sprøjten i sprøjteholderen på lægemiddelpumpen.
- Flyt skubbeblokken fremad, indtil den rører stemplet, og stoffet udvises ved nålen, hvilket sikrer, at infusionslinjen er helt fyldt.
- Brug en alkohol tørre, rense barberet område for at fjerne eventuelle omstrejfende hår.
- Klem huden ca. to fingerbredder over bunden af halen. Sæt 1/3 af infusionslinjens nål ind i den telthud.
- Fastgør nålen til huden med et 3"-stykke bredt medicinsk tape. Placer et andet stykke bredt medicinsk tape over det første, på tværs af rotten, og fastgøres til begge sider af dyre vuggen (se figur 4).
BEMÆRK: Det er af afgørende betydning, at den ferromagnetiske nål er godt fastgjort for at forhindre bevægelse under scanningen. - Begynd infusionen af subkutan dexmedetomidin.
- Placer et stykke gaze på broen af rottens næse for at skabe en plan overflade til spolen. Brug papirtape, som ikke forstyrrer MRI-signalet, til at fastgøre spolen til rottens hoved og centrere den over hjernen (se figur 3b, c).
- Fastgør alle linjer og kabler i dyreholderen med laboratoriebånd, og kontroller, om alle fysiologisignalerne er stabile (se figur 2).
- Placer papirhåndklæder over dyret og fastgør dem til dyre vuggen med laboratorietape. Hvis du bruger et luftvarmesystem, skal du pakke et plastfolie rundt om hele holderen for at indeholde den varme luft.
- Flyt dyret ind i boringen og tune magneten.
4. Fase 3 anæstesi: Anatomisk scanning erhvervelse
- Reducer isoflurane til 1,5%, hvilket resulterer i en støt stigning i respiration til ca 45-50 bpm. Forblive på dette niveau under den anatomiske scanning.
- Brug FLASH-lokaliseringsscanningen til at sikre, at hjernen er på linje med magnetisocenteret (Figur 5a). Flyt dyret og gentag om nødvendigt.
- Kør den højere opløsning RARE localizer scanning og bruge denne scanning output til at justere 15 sagittal skiver centreret over hjernen (fra venstre mod højre, Figur 5b).
- Brug den midterste sagittal skive, justere midten aksial skive til decussation af den forreste commissure, der vises som en mørk plet (Figur 5c). Bemærk den udsnitsforskydning, der skal bruges senere i hviletilstandsscanningerne.
- Anskaf 23 skiver ved hjælp af både FLASH- og RARE-aksialprotokollerne for at hjælpe med registrering til et fælles rum under analyse efter scanningen.
- Shim på tværs af hele hjernen ved hjælp af PRESS sekvens.
5. Fase 4: Resting-state scanning erhvervelse
- Efter at have afsluttet anatomiske scanninger, reducere isoflurane til 0,5% til 0,75%, justere, så dyrets åndedræt er 60-65 vejrtrækninger i minuttet. Forblive på dette niveau i mindst 10 minutter, før du begynder hviletilstandsscanning for at sikre stabilitet.
- Når fysiologien er stabil (åndedrætsområdet er 60-75 bpm uden gispning eller uregelmæssigheder, kerne kropstemperaturen er 37,5 ± 1,0 °C, og iltmætning er 95% eller derover), erhverve en 15 skive EPI-scanning ved hjælp af samme skive offset som den anatomiske aksiale serie.
- Når hver hviletilstandsscanning er afsluttet, skal du kontrollere kvaliteten ved hjælp af en uafhængig komponentanalyse (ICA) for at opdele dataene i rumlige og tidsmæssige komponenter.
- Få mindst tre hviletilstandsscanninger af høj kvalitet.
6. Gendannelse efter scanning
- Når scanningen er færdig, øge isoflurane til 2% og stoppe subkutane dexmedetomidin infusion.
- Fjern dyreholderen fra magnetboringen, udpak dyret, og fjern ørestænger, temperatursonde, pulsoximeterclips og dexmedetomidinnålen.
- Der injiceres 0,015 mg/kg af den fortyndede atipamezoleopløsning i rottens bagbensmuskel ved hjælp af en 1 ml sprøjte med en 25 G nål (dvs. en rotte på 300 g ville få 0,09 ml).
- Placer rotten tilbage i hjemmeburet oven på en varmepude og overvåg, indtil dyret er ambulant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter hver hviletilstandsscanning vurderes stabiliteten ved hjælp af en uafhængig komponentanalyse (ICA; eksempelscript, der er inkluderet i supplerende filer). Figur 6 viser eksempler på komponentoutput fra scanninger i hviletilstand. Figur 6a viser en signalkomponent fra en scanning med høj stabilitet. Bemærk, at komponenten geografisk har høj regionalitet. Inden for tidsforløbet under den rumlige komponent er signalet stabilt og ikke forudsigeligt, hvilket indikerer ægte hjerneaktivitet. Effektspektret nederst viser overvejende lave frekvenser. Figur 6b viser en komponent fra samme scanning som figur 6a, der repræsenterer støj. Bemærk den ikke-regionale komponent i den rumlige komponent, højfrekvente tidsforløb og højfrekvente spidsbelastning i effektspektret. Endelig viser figur 6c en komponent fra en scanning med ustabil anæstesi. Tidsforløbet er variabelt og uregelmæssigt. Når dette sker, er der behov for forbedringer af bedøvelsesprotokollen, almindeligvis til forsegling af næsekeglet og scavenging af affaldsgasser.
Figur 1:Forberedelsesrum og MR-dyre vugge a) Forberedelsesplads. Vakuumet skyller affaldsgasser fra både induktionskammeret og næsekegleren ved dyreholderen. Varmepuden hjælper med at opretholde dyrs temperatur under både fase 1 og genopretning. b) MRI-dyreholder. Toppen angiver komponenter i dyreopsætningen i fase 2. Bunden viser en rotte fuldt set-up og klar til scanning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fysiologisk scanningsoutput. Iltmætning (PulseOx, 96%), puls (325 BPM [slag pr. minut]), åndedrætshastighed (61 vejrtrækninger/min. ) og kernehustemperatur (T1, 37,5 °C) overvåges konstant under hele scanningssessionen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:Næsekegler og spoleplacering. (a) Nærbillede af næsekeglet forseglet omkring dyrets næse og underkæbe. (b) Overliggende billede af tilpasningen af overfladespolen til hjernen. c) Side udsyn til spolejustering med midtpunktet af dyrets øje. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Subkutan dexmedetomidin infusionslinje og nåleplacering. b)Tape, der fastgør nålen til dyrets hud. c) Tape hen over dyreholderen for at forhindre, at den ferromagnetiske nål bevæger sig. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:Anatomisk scanningsjustering. (a) Lokaliseringsscanning for at tilpasse dyrets hjerne til magnetisocentret, noteret med sigtekorn. (b) Sagittal skiver justeret over hjernen fra venstre mod højre. c) Tilpasning til den forreste kommissions decussation, angivet med den hvide pil. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Kvalitetsvurdering ved hjælp af uafhængig komponentanalyse. (b)Støjkomponent under konstant anæstesi. c)Ustabil anæstesi. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Scanne | Sekvens | Orientering | FOV (mm x mm) | Matrix | Skiver | Skivetykkelse (mm) | TE (ms) | TR (ms) | Gennemsnit | Ekkoafstand (ms) | Sjælden faktor | Gentagelser | Scanningstid |
| Localizer | BLINKE | Alle fly | 50 | 256 | 1/dir | 1 | 2.5 | 100 | 1 | 1 | 12,8 s | ||
| Localizer | SJÆLDEN | Alle fly | 35 | 192 | 1/dir | 0.75 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 min. |
| Anat | SJÆLDEN | Sagittal | 35 | 192 | 15 | 1 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 min. |
| Anat | BLINKE | Aksial | 35 | 192 | 23 | 1 | 5 | 250 | 2 | 1 | 1 min 36 s | ||
| Anat | SJÆLDEN | Aksial | 35 | 192 | 23 | 1 | 28 | 2500 | 4 | 7 | 8 | 1 | 4 min. |
| Shim | PRESSE | Alle fly | 16.223 | 2500 | 1 | 1 | 2,5 s | ||||||
| Hviletilstand | EPI | Aksial | 35 | 64 | 15 | 1 | 15 | 1200 | 1 | 300 | 6 min hver |
Tabel 1: Referencetabel over scanningsparametre. Parametre for de sekvenser, der er skitseret i protokollen. FLASH = Hurtig lav vinkel Shot, RARE = Hurtig erhvervelse med afslapning Enhancement, PRESS = Point RESolved Spectroscopy, EPI = Echo Planar Imaging.
Supplerende filer: Eksempelscript til ICA-kvalitetsvurdering. Klik her for at hente denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dyrets stabilitet, både fysisk og fysiologisk, er nøglen til at opnå hviletilstandsdata af høj kvalitet. Denne protokol opnår stabilitet ved at bevæge sig gennem fire forskellige faser af anæstesi. Det er bydende nødvendigt, at dyret har opfyldt de fastsatte fysiologiske tærskler, før det går videre til næste fase af anæstesi; da denne metode er afhængig af fysiologiske autoregulatoriske mekanismer, kan individuelle dyr kræve lidt forskellige mængder tid i hver anæstesifase. Det er vores erfaring, at det er mere effektivt at tage mere tid i hver fase end at skynde sig gennem tidligere stadier uden at give rottens fysiologi tilstrækkelig tid til at bosætte sig. De vigtigste komponenter, der giver mulighed for stabilitet, er pasformen af næsekeglerne og korrekt affaldsgas scavenging.
En korrekt forseglet næsekegle og scavenging gør det muligt for dyret at forblive stabilt med regelmæssigt afstand vejrtrækning og stabil iltmætning niveauer. Hvis der opstår gispende, uregelmæssig afstand, indånding af åndedrættet eller faldende iltmætningsniveauer, bør man arbejde for at forbedre næsekegletætning og scavenging. Næsekeglerne skal passe tæt, men bør ikke skubbe ind i næsebroen. En brugerdefineret næse kegle kan være nødvendigt at fremstille. Den oprindelige næsekegle fra vores producent havde en luftudtagsventil, der var for lille, så et falkrør var udstyret med en større forseglet vakuumlinje tættere på dyret. Dette resulterede i bedre frihøjde af udløbet CO2 og stabil iltmætning. Som nævnt i protokollen kan paraffinfilm vikles rundt om underkæben og kanten af næsekeglerne, men hvis den er pakket for tæt ind, kan den begrænse vejrtrækningen og føre til ustabilitet. Derudover påvirker forkert placering af ørestænger og bidestang ikke kun den nødvendige stabilitet i hovedet til billeddannelse, men kan også påvirke vejrtrækningen; fortsat blinkende eller hørbar støj fra dyret er en sandsynlig indikation af forkert placering af ørestangen. Fortænderne skal sidde sikkert på bidestangen og trækkes frem efter placering af ørestangen for at sikre en tæt pasform. Rottens tunge skal muligvis trækkes fremad, hvis den sidder for langt tilbage i munden og begrænser korrekt vejrtrækning.
Da hvert system er unikt, er det nødvendigt at finjustere vakuumniveauet for at opnå optimal scavenging. Som en praktisk vejledning skal det være muligt at føle en lille mængde sugning enten ved at placere en finger over vakuumlinjen, der åbner inde i næsekeglet, eller ved at forsegle hele næsekegleåbningen med håndfladen. Matchende strømningshastighed for anæstesi input (0,8 L / min blev brugt her) er et godt udgangspunkt. Iltmætning i dyret skal forblive over 95% under hele scanningen. Hvis iltmætningen viser en faldende tendens, kan dette være et tegn på, at CO2 er ved at opbygge sig i næsekeglerne, og at skyllevæsken skal øges. En anden mulighed er, at trykket af pulsoximeterclipsen på foden skal justeres, enten løsnes for at forbedre blodgennemstrømningen eller strammes for at sikre et stærkt, stabilt signal. Hvis dyrets åndedræt er højere end de skitserede tærskler, kan dette indikere, at skyllevæsken er sat for højt og fjerner for meget isofluran. I sjældne tilfælde kan det være nødvendigt at øge dosis af subkutan dexmedetomidin til 0,02 mg/kg/t, men vi har konstateret, at 0,015 mg/kg har fungeret godt på tværs af en lang række rottealderr og begge køn og støttes i farmakologiske undersøgelser4.
Den scanningsvarighed, der er nødvendig for fMRI-aktivering, er en funktion af effektstørrelse, rumligt signal-til-støj-forhold (SNR) og tidsmæssig SNR, som det tidligere er vist af Murphy et al.13. Brugen af en lille overfladespole (2 cm) og et højt magnetfelt (9,4 T) øger SNR- og FED-følsomheden betydeligt. Med vores billedopsætning har vi fundet ud af, at en enkelt 6 min scanning er tilstrækkelig til at registrere et robust funktionelt hviletilstandsforbindelsesnetværk i overensstemmelse med vores tidligere rapport10. Ikke desto mindre gentager vi typisk scanningen 3 til 4 gange og gennemsnit af resultaterne for at udlede funktionelle hjernenetværk for de enkelte dyr. Alternativt kan man scanne en enkelt gang med en længere varighed (10 min eller mere) for at udlede funktionelle forbindelsesnetværk14.
Når du har indsamlet rs-fMRI af høj kvalitet ved hjælp af denne protokol, skal du forarbejde dataene, som de tidligere er udgivet15,16. Med brug af både ørestænger og en bidestang er bevægelsesartefakter i fMRI-tidskurset minimale, og brugen af bevægelseskorrektion har ikke haft en mærkbar effekt på vores data. Individuelle hviletilstand EPI-scanninger skal være kraniet-strippet og registreret til et fælles rum (vi bruger en enkelt repræsentativ rottehjerne)16,17. Fjern startvolumenerne fra hver EPI, så de inkluderede alle erhverves, når magneten er i stabil tilstand (vi fjerner 5 tidspunkter). Denoise individuelle scanninger (se Repræsentative resultater for eksempler på signal- og støjkomponenter). Anvend korrektion af skivetid samt lineær og kvadratisk tendensfjernelse, båndpasfiltrering (0,005-0,1 Hz) og rumlig udjævning (0,6 mm FWHM [fuld bredde ved halvt maksimum]). Derudover skal du fjerne den gennemsnitlige signaltidskurs fra det hvide stof og hjertekamrene gennem lineær regression. Efter disse standardforbehandlingstrin kan der udføres yderligere analyse på gruppeniveau , herunder frøbaseret funktionel forbindelse11,15,18,19,20,21,22, uafhængige komponenter analyserer10,20,22og modularitetsanalyser12,19.
Der er to hovedfordele ved den nuværende protokol: 1) det giver mulighed for spontan hjerneaktivitet; og 2) det holder dyret på næsten normal fysiologi. Alternative bedøvelsesmetoder (såsom propofol21, α-chloralose15og pancuroniumbromid i kombination med et andet bedøvelsesmiddel21,23) er også blevet anvendt til at erhverve hviletilstandsdata. Men ved hjælp af en kombination af lav dosis isoflurane med lav dosis dexmedetomidin, som beskrevet i denne protokol, har vist sig kun minimalt forstyrre hjernens netværk funktioner og samtidig give den fysiologiske stabilitet er nødvendig for at opnå kvalitet hvile-tilstand funktionelle tilslutningsmuligheder data9,10,18,24. Desuden kan DRISTIGE reaktioner fra somatosensorisk stimulation9 og mekanisk whisker deformation11 ses på eller efter en periode på 90 minutter, når du bruger denne protokol, hvilket tyder på et ensartet ophidselsesniveau. Interessant nok kan brug af dexmedetomidin isoleret fremkalde epileptisk aktivitet; denne aktivitet blev dog afskaffet med et suppleret isofluran8. En anden fordel ved den nuværende protokol er, at den eliminerer behovet for kunstig ventilation. Selv om mekanisk ventilation kan føre til et snævrere udvalg af delvis kuldioxid og iltmætning på tværs af dyr, kan opretholdelse af fysiologiske parametre i langsgående undersøgelser uden behov for intubation resultere i færre komplikationer og uønskede bivirkninger.
Interessen for hviletilstand fMRI er vokset betydeligt i de sidste 10 år, og dermed et behov for at erhverve prækliniske hviletilstandsscanninger af høj kvalitet fra gnavere. Denne overlevelsesprotokol opnår stabil anæstesi i op til 5 timer med næsten normal fysiologi under hviletilstandserhvervelse. Da protokollen er meget stabil, kan der let tilføjes yderligere sekvenser (konstruktion, stimulering, farmakologisk MRI osv.) for at opnå det ønskede eksperimentelle design. Kombinationen af lavdosis isofluran med dexmedetomidin, der anvendes i denne protokol, giver mulighed for en bred vifte af prækliniske undersøgelser for efterforskere, der er interesseret i at studere gnaverhjernen i sin hviletilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler fra National Institute of Health (NIH)'s National Institute on Drug Abuse (NIDA) [DJW, EDKS, og EMB blev støttet af Grant R21DA044501 tildelt Alan I. Green og DJW blev støttet af Grant T32DA037202 til Alan J. Budney] og National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIAAA) [Grant F31AA028413 til Emily D. K. Sullivan]. Yderligere støtte blev ydet gennem Alan I. Greens begavede fond som Raymond Sobel professor i psykiatri i Dartmouth.
Hanbing Lu støttes af National Institute on Drug Abuse Intramural Research Program, NIH.
Forfatterne ønsker at anerkende og takke den afdøde Alan I. Green. Hans urokkelige dedikation til området for samforekomne lidelser bidrog til at etablere samarbejde mellem forfatterne. Vi takker ham for hans mentorskab og vejledning, som vil blive savnet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9.4T MRI | Varian/Bruker | Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software | |
| Air-Oxygen Mixer | Sechrist | Model 3500CP-G | |
| Analysis of Functional NeuroImages (AFNI) | NIMH/NIH | Version AFNI_18.3.03 | Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/ |
| Animal Cradle | RAPID Biomedical | LHRXGS-00563 | rat holder with bite bar, nose cone and ear bars |
| Animal Physiology Monitoring & Gating System | SAII | Model 1025 | MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on |
| Antisedan (atipamezole hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-867-7097 | Zoetis, Manufacturer Item #10000449 |
| Ceramic MRI-Safe Scissors | MRIequip.com | MT-6003 | |
| Clippers | Patterson Veterinary | 07-882-1032 | Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201 |
| Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-893-1801 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10 |
| Digital Rectal Thermometer Covers | Medline | MDS9608 | |
| FMRIB Software Library | FMRIB | MELODIC Version 3.15 | Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki |
| Heating Pad | Cara Inc. | Model 50 | |
| Hemostat forceps, straight | Kent Scientific | INS750451-2 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06 |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip Inc. | 911103 | |
| Lab Tape, 3/4" | VWR International | 89097-990 | |
| Needles, 23 gauge | BD | 305145 | plastic hub removed |
| Parafilm Laboratory Film | Patterson Veterinary | 07-893-0260 | Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A |
| Planar Surface Coil | Bruker | T12609 | 2cm |
| Polyethylene Tubing | Braintree Scientific | PE50 50FT | 0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter) |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38 |
| Sprague Dawley Rats | Charles River | 400 SAS SD | |
| Sterile 0.9% Saline Solution | Patterson Veterinary | 07-892-4348 | Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186 |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Medline | MDS090735 | |
| Surgical Tape, 1" (3M Durapore) | Medline | MMM15381Z | 3M Healthcare, "wide medical tape" |
| Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore) | Medline | MMM15300 | 3M Healthcare |
| Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle | BD | 309626 | |
| Syringes, 3 mL | BD | 309657 | |
| Vented induction and scavenging system | VetEquip Inc. | 942102 | 2 liter induction chamber with active scavenging |
| 411724 | omega flowmeter | ||
| 931600 | scavenging cube, "vacuum" | ||
| 921616 | nose cone, non-rebreathing |
References
- Smitha, K. A., et al. Resting state fMRI: A review on methods in resting state connectivity analysis and resting state networks. The Neuroradiology Journal. 30 (4), 305-317 (2017).
- Gorges, M., et al. Functional connectivity mapping in the animal model: Principles and applications of resting-state fMRI. Frontiers in Neurology. 8, (2017).
- Paasonen, J., Stenroos, P., Salo, R. A., Kiviniemi, V., Gröhn, O. Functional connectivity under six anesthesia protocols and the awake condition in rat brain. NeuroImage. 172, 9-20 (2018).
- Pawela, C. P., et al. A protocol for use of medetomidine anesthesia in rats for extended studies using task-induced BOLD contrast and resting-state functional connectivity. NeuroImage. 46 (4), 1137-1147 (2009).
- Jonckers, E., et al. Different anesthesia regimes modulate the functional connectivity outcome in mice. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (4), 1103-1112 (2014).
- Williams, K. A., et al. Comparison of alpha-chloralose, medetomidine and isoflurane anesthesia for functional connectivity mapping in the rat. Magnetic Resonance Imaging. 28 (7), 995-1003 (2010).
- Zhurakovskaya, E., et al. Global functional connectivity differences between sleep-like states in urethane anesthetized rats measured by fMRI. PloS One. 11 (5), 0155343 (2016).
- Fukuda, M., Vazquez, A. L., Zong, X., Kim, S. -G. Effects of the α2-adrenergic receptor agonist dexmedetomidine on neural, vascular and BOLD fMRI responses in the somatosensory cortex. The European Journal of Neuroscience. 37 (1), 80-95 (2013).
- Brynildsen, J. K., et al. Physiological characterization of a robust survival rodent fMRI method. Magnetic Resonance Imaging. 35, 54-60 (2017).
- Lu, H., et al. Rat brains also have a default mode network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3979-3984 (2012).
- Lu, H., et al. Low- but not high-frequency LFP correlates with spontaneous BOLD fluctuations in rat whisker barrel cortex. Cerebral Cortex. 26 (2), 683-694 (2016).
- Tsai, P. -J., et al. Converging structural and functional evidence for a rat salience network. Biological Psychiatry. 88 (11), 867-878 (2020).
- Murphy, K., Bodurka, J., Bandettini, P. A. How long to scan? The relationship between fMRI temporal signal to noise ratio and necessary scan duration. NeuroImage. 34 (2), 565-574 (2007).
- Birn, R. M., et al. The effect of scan length on the reliability of resting-state fMRI connectivity estimates. NeuroImage. 83, 550-558 (2013).
- Lu, H., et al. Synchronized delta oscillations correlate with the resting-state functional MRI signal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18265-18269 (2007).
- Lu, H., et al. Registering and analyzing rat fMRI data in the stereotaxic framework by exploiting intrinsic anatomical features. Magnetic Resonance Imaging. 28 (1), 146-152 (2010).
- Cox, R. W. AFNI: software for analysis and visualization of functional magnetic resonance neuroimages. Computers and Biomedical Research. 29 (3), 162-173 (1996).
- Ash, J. A., et al. Functional connectivity with the retrosplenial cortex predicts cognitive aging in rats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (43), 12286-12291 (2016).
- Hsu, L. -M., et al. Intrinsic insular-frontal networks predict future nicotine dependence severity. The Journal of Neuroscience. 39 (25), 5028-5037 (2019).
- Li, Q., et al. Resting-state functional MRI reveals altered brain connectivity and its correlation with motor dysfunction in a mouse model of Huntington's disease. Scientific Reports. 7, (2017).
- Lu, H., et al. Abstinence from cocaine and sucrose self-administration reveals altered mesocorticolimbic circuit connectivity by resting state MRI. Brain Connectivity. 4 (7), 499-510 (2014).
- Seewoo, B. J., Joos, A. C., Feindel, K. W. An analytical workflow for seed-based correlation and independent component analysis in interventional resting-state fMRI studies. Neuroscience Research. 165, 26-37 (2021).
- Broadwater, M. A., et al. Adolescent alcohol exposure decreases frontostriatal resting-state functional connectivity in adulthood. Addiction Biology. 23 (2), 810-823 (2018).
- Jaime, S., Cavazos, J. E., Yang, Y., Lu, H. Longitudinal observations using simultaneous fMRI, multiple channel electrophysiology recording, and chemical microiontophoresis in the rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 306, 68-76 (2018).
