Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לקבלת נתוני הדמיית תהודה מגנטית תפקודית יציבה של מצב מנוחה (rs-fMRI) מעכברוש המשתמש באיזופלוראן במינון נמוך בשילוב עם dexmedetomidine במינון נמוך.
Abstract
הדמיית תהודה מגנטית תפקודית של מצב מנוחה (rs-fMRI) הפכה לשיטה פופולרית יותר ויותר לחקר תפקוד המוח במצב מנוחה ולא משימה. פרוטוקול זה מתאר שיטת הישרדות פרה-אקלינית לקבלת נתוני rs-fMRI. שילוב איזופלוראן במינון נמוך עם עירוי מתמשך של אגוניסט אגוניסט קולטן adrenergic α2 dexmedetomidine מספק אפשרות חזקה לרכישת נתונים יציבה ואיכותית תוך שמירה על תפקוד רשת המוח. יתר על כן, הליך זה מאפשר נשימה ספונטנית ופיזיולוגיה כמעט נורמלית בחולדה. רצפי הדמיה נוספים יכולים להיות משולבים עם רכישת מצב מנוחה יצירת פרוטוקולים ניסיוניים עם יציבות הרדמה של עד 5 שעות בשיטה זו. פרוטוקול זה מתאר את ההתקנה של ציוד, ניטור של פיזיולוגיה חולדה במהלך ארבעה שלבים נפרדים של הרדמה, רכישת סריקות מצב מנוחה, הערכת איכות של נתונים, שחזור של החיה, ודיון קצר של ניתוח נתונים לאחר עיבוד. פרוטוקול זה יכול לשמש על פני מגוון רחב של מודלים מכרסמים פרה-קליניים כדי לעזור לחשוף את השינויים ברשת המוח המתקבלים המתרחשים במנוחה.
Introduction
הדמיית תהודה מגנטית תפקודית של מצב מנוחה (rs-fMRI) היא מדד לאות תלוי רמת החמצן בדם (BOLD) כאשר המוח נמצא במנוחה ואינו עוסק בשום משימה מסוימת. אותות אלה יכולים לשמש למדידת מתאם בין אזורי המוח כדי לקבוע את הקישוריות התפקודית בתוך רשתות עצביות. rs-fMRI נמצא בשימוש נרחב במחקרים קליניים בשל אי פולשניותו וכמות המאמץ הנמוכה הנדרשת מחולים (בהשוואה ל- fMRI מבוסס משימה) מה שהופך אותו לאופטימלי עבור אוכלוסיות חולים מגוונות1.
ההתקדמות הטכנולוגית אפשרה rs-fMRI להיות מותאם לשימוש במודלים מכרסמים כדי לחשוף מנגנונים שבבסיס מצבי המחלה (ראה התייחסות2 לבדיקה). מודלים פרה-קליניים של בעלי חיים, כולל מודלים של מחלות או נוקאאוט, מאפשרים מגוון רחב של מניפולציות ניסיוניות שאינן ישימות בבני אדם, ומחקרים יכולים גם לעשות שימוש בדגימות שלאחר המוות כדי לשפר עוד יותר את הניסויים2. עם זאת, בשל הקושי הן להגביל את התנועה והן להקל על הלחץ, רכישת MRI במכרסמים מבוצעת באופן מסורתי תחת הרדמה. חומרי הרדמה, בהתאם לפרמקוקינטיקה שלהם, פרמקודינמיקה, ויעדים מולקולריים, להשפיע על זרימת הדם במוח, חילוף החומרים במוח, ועלול להשפיע על מסלולי צימוד נוירווסקולרי.
היו מאמצים רבים לפתח פרוטוקולים הרדמה המשמרים צימוד נוירווסקולרי ותפקוד רשת המוח3,4,5,6,7,8. דיווחנו בעבר משטר הרדמה שהפעיל מינון נמוך של איזופלוראן יחד עם מינון נמוך של α2 אגוניסט קולטן adrenergic dexmedetomidine9. חולדות בשיטה זו של הרדמה הציגו תגובות BOLD חזקות לגירוי שפם באזורים התואמים את מסלולי ההקרנה הוקמה (גרעינים תלמיים גחוניים וגחוניים, קליפת המוח הסומטו-סנסורית העיקרית והמשנית); רשתות מוח במצב מנוחה בקנה מידה גדול, כולל רשת מצב ברירת המחדל10,11 ורשת salience12 זוהו גם הם בעקביות. יתר על כן, פרוטוקול הרדמה זה מאפשר הדמיה חוזרת על אותה חיה, אשר חשוב לניטור התקדמות המחלה ואת ההשפעה של מניפולציות ניסיוניות לאורך.
במחקר הנוכחי אנו מפרטים את ההתקנה הניסיונית, הכנת בעלי החיים והליכי הניטור הפיזיולוגי המעורבים. בפרט, אנו מתארים את השלבים ההרדמה הספציפיים ורכישת סריקות במהלך כל שלב. איכות הנתונים מוערכת לאחר כל סריקה של מצב מנוחה. סיכום קצר של ניתוח לאחר הסריקה נכלל גם הוא בדיון. מעבדות המעוניינות לחשוף את הפוטנציאל של שימוש rs-fMRI בחולדות ימצאו פרוטוקול זה שימושי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו בסורק MRI 9.4 T, ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש במכללת דארטמות'. אישור נוסף הושג כדי להקליט ולהציג את בעלי החיים המשמשים בסרטון ובדמויות להלן.
1. הכנות לפני הסריקה
- קו עירוי תת עורי
- הסר חלקית מחט 23 G מהחבילה שלה, כך נקודת המחט נשאר סטרילי.
- החזק בבטחה את רכזת המחט והשתמש בסכין גילוח כדי להבקיע את פיר המחט שבו הוא פוגש את הרכזת.
- מהדק מחזיק מחט סביב הפיר ישירות מתחת לניקוד ולשבור בעדינות את הפיר מהרכזת.
- הכנס 1/3 של פיר המחט (קצה קהה) לתוך קו PE50 מעוקר בעבר עם אורך קו מספיק כדי להרחיב ממשאבת הסמים לחיה בתוך המגנט משעמם.
- דילול של דקסמדטומידין ואטיפמזול
- הכן פתרון של הידרוכלוריד dexmedetomidine מדולל באמצעות 0.5 מ"ל של 0.5 מ"ג / מ"ל מלאי מעורבב עם 9.5 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית בבקבוק זכוכית ברור, סטרילי (ריכוז מדולל = 0.025 מ"ג / מ"ל).
- הכן פתרון של atipamezole מדולל באמצעות 0.1 מ"ל של 5 מ"ג / מ"ל מלאי מעורבב עם 9.9 מ"ל של מלוחים סטריליים בבקבוק זכוכית ברור, סטרילי (ריכוז מדולל = 0.05 מ"ג / מ"ל).
- פרמטרי סריקה
- השתמש בפרמטרים המוצגים בטבלה 1 כדי להכין רצפי סריקה.
2. הרדמה שלב 1: אינדוקציה והכנה של בעלי חיים
- ההתקנה
- ודאו שכל הציוד פועל ופועל כראוי, כולל מערבל החמצן והאוויר, כרית החימום ומערכת ניקוי אקטיבית (ראו איור 1).
- הגדר את נקודת סט הטמפרטורה של מערכת החימום ל 37 °C (5 °F).
- אינדוקציה של בעלי חיים
- מניחים את החיה (חולדת ספראג דולי זכר בת 90 יום) בתא האינדוקציה ומעוררים הרדמה עם 2.5% איזופלוראן ב-30% אוויר מועשר בחמצן.
הערה: ניתן להשתמש במגוון רחב של גילאים של בעלי חיים ושני המינים. - לאחר החיה הוא מרדים, להסיר אותו מהתא, לשקול את החיה, ומניחים אותו חרוט האף (ב 2.5% איזופלוראן) על כרית החימום בחלל ההכנה.
- מניחים את החיה (חולדת ספראג דולי זכר בת 90 יום) בתא האינדוקציה ומעוררים הרדמה עם 2.5% איזופלוראן ב-30% אוויר מועשר בחמצן.
- הכנת בעלי חיים
- יש למרוח משחת סיכה עיניים על כל עין כדי למנוע ייבוש.
- אשר את עומק ההרדמה על ידי חוסר תגובה צביטת בוהן.
- השתמש בקוצץ כדי לגלח שטח מרובע בגודל 2 אינץ' על 2 אינץ' על החלק התחתון של גב החיה (כלומר, ישירות מעל הזנב).
- לנהל 0.015 מ"ג/ק"ג של תמיסה dexmedetomidine עם הזרקה intraperitoneal (i.p.) (למשל, חולדה 300 גרם יקבל 0.18 מ"ל) לתוך הרביע הימני התחתון של הבטן באמצעות מחט 25 G.
- החלף את זרימת האיזופלוראן מחלל ההכנה לעריסת בעלי החיים.
- תזיז את החיה לעריסת החיות. מניחים את השיניים הקדמיות של החולדה בבטחה מעל לתוך מוט הנשיכה. לדחוף את חרוט האף מעל האף כדי להבטיח התאמה הדוקה.
הערה: אם חרוט האף אינו מכסה את הלסת התחתונה, השתמש בסרט פרפין כדי להחזיק בעדינות את הלסת סגורה תוך איטום סביב חרוט האף. - מקמו את משטח הנשימה מתחת לבטן החולדה מתחת לכלוב הצלעות ומיקמו אותו מחדש עד שצורת גל הנשימה מראה שוקת עמוקה שבמרכזה כל נשימה (ראו צורת גל נשימה באיור 2).
- נטר את נשימת החיה באמצעות תוכנת ניטור פיזיולוגיה. לעבור לשלב הבא של הרדמה כאשר הנשימה היא פחות מ 40 נשימות / דקה (bpm; כ 5 דקות לאחר הזרקת dexmedetomidine).
3. שלב 2 הרדמה: הגדרת בעלי חיים
- הכנס מוטות אוזניים לתוך תעלת האוזן כדי לייצב את ראשו של החולדה בעריסת החיה. לאחר מיקום, למשוך קדימה על מוט הנשיכה ולאשר את הראש לא זז. כווננו מחדש את קונוס האף ואת סרט הפרפין לפי הצורך (ראו איור 3a).
- הכנס את בדיקת הטמפרטורה לכיסוי בדיקה חד פעמי משומן מראש. מכניסים בעדינות את בדיקת הטמפרטורה כ-1/2 אינץ' לפי הטבעת, ומדביקים אותה לבסיס הזנב עם סרט רפואי.
- מניחים את קליפ האוקסימטר הדופק על אזור metatarsal של כף הרגל האחורית, להבטיח את מקור האור הוא על החלק התחתון של כף הרגל (כף היד).
הערה: סיבוב של הקליפ יכול להשפיע על האות; לכן, יצירת מחזיק כדי לשמור על כף רגל קליפ זקוף יוביל ליציבות רבה יותר. כמו כן, שים לב כי עד החולדה היא בטמפרטורת גוף נורמלית, רוויית החמצן עשויה להיות נמוכה (<95%). - השתמש במשקל של החולדה כדי לחשב את קצב עירוי כדי להוציא 0.015 מ"ג / קילוגרם / שעה של dexmedetomidine (חולדה 300 גרם מקבל 0.18 מ"ל / שעה).
- הגדר את משאבת התרופה כדי להוציא את שיעור עירוי מחושב.
- מלא מזרק 3 מ"ל עם פתרון dexmedetomidine סטרילי, מדולל ולהכניס את קצה המחט לתוך הקצה הפתוח של קו עירוי מעוקר (המשתרע ממשאבת הסמים לעריסת החיה עם המחט התת עורית שחוברה בעבר). מלא את הקו ואבטח את המזרק במחזיק המזרק של משאבת הסמים.
- הזז את בלוק דוחף קדימה עד שהוא נוגע הבוכנה, ואת התרופה מסולקת על המחט, להבטיח את קו עירוי הוא מלא לחלוטין.
- באמצעות מגבון אלכוהול, לנקות את האזור המגולח כדי להסיר כל שיער תועה.
- צבוט את העור כשתי אצבעות רוחב מעל בסיס הזנב. הכנס 1/3 של מחט קו עירוי לתוך העור אוהל.
- אבטחו את המחט לעור עם פיסת סרט רפואי רחבה של 3". הניחו חתיכה שנייה של סרט רפואי רחב מעל הראשון, על פני החולדה, ומחוברים לשני צידי עריסת החיות (ראו איור 4).
הערה: חשוב מאוד שהמחט הפרומגנטית מאובטחת היטב כדי למנוע תנועה במהלך הסריקה. - התחל עירוי של dexmedetomidine תת עורי.
- מניחים חתיכת גזה על גשר האף של החולדה כדי ליצור משטח רמה ל סליל. השתמשו בסרט נייר, שאינו מפריע לאות ה-MRI, כדי לאבטח את סליל לראש החולדה, ולרכז אותו מעל המוח (ראו איור 3b, c).
- אבטחו את כל הקווים והכבלים בתוך עריסת החיות עם סרט מעבדה ובדקו אם כל אותות הפיזיולוגיה יציבים (ראו איור 2).
- מניחים מגבות נייר מעל החיה, מאבטחים אותם לעריסת החיות עם סרט מעבדה. אם משתמשים במערכת חימום אוויר, עוטפים יריעת פלסטיק סביב העריסה כולה כדי להכיל את האוויר החם.
- תזיזו את החיה לתוך השעמום ותכוונו את המגנט.
4. הרדמה שלב 3: רכישת סריקה אנטומית
- להפחית איזופלוראן ל 1.5%, וכתוצאה מכך עלייה מתמדת בנשימה כ 45-50 bpm. הישאר ברמה זו למשך הסריקה האנטומית.
- השתמש בסריקת לוקליזציה של FLASH כדי להבטיח שהמוח מיושר עם איזו-מרכז המגנט(איור 5a). מקם מחדש את החיה וחוזר על הפעולה במידת הצורך.
- הפעל את סריקת התזרים הנדיר ברזולוציה גבוהה יותר והשתמש בפלט הסריקה הזה כדי ליישר 15 פרוסות קשת ממורכזות במוח (משמאל לימין, איור 5b).
- בעזרת פרוסת הקשת האמצעית, יישרו את הפרוסה צירית מרכזית לפירוק של הקומיסור החלקירי, המופיע כנקודה כהה(איור 5c). שים לב להיסט הפרוסה לשימוש מאוחר יותר בסריקות מצב המנוחה.
- רכוש 23 פרוסות באמצעות הפרוטוקולים ציריים FLASH ו- RARE כדי לסייע ברישום למרחב משותף במהלך ניתוח שלאחר הסריקה.
- שיים על פני כל המוח באמצעות רצף PRESS.
5. שלב 4: רכישת סריקת מצב מנוחה
- לאחר השלמת סריקות אנטומיות, להפחית איזופלוראן ל 0.5% עד 0.75%, התאמה כך הנשימה של החיה היא 60-65 נשימות לדקה. הישאר ברמה זו לפחות 10 דקות לפני תחילת סריקת מצב המנוחה כדי להבטיח יציבות.
- כאשר הפיזיולוגיה יציבה (טווח הנשימה הוא 60-75 bpm ללא התנשפות או אי סדרים, טמפרטורת גוף הליבה היא 37.5 ± 1.0 מעלות צלזיוס, ורוויה חמצן היא 95% ומעלה), לרכוש 15 פרוסות EPI סריקה באמצעות אותו פרוסה היסט כמו סדרת ציר אנטומית.
- לאחר השלמת כל סריקת מצב מנוחה, בדוק את האיכות באמצעות ניתוח רכיבים עצמאי (ICA) כדי לפרק את הנתונים לרכיבים מרחביים וטמפורליים.
- השג לפחות שלוש סריקות מצב מנוחה באיכות גבוהה.
6. שחזור לאחר הסריקה
- לאחר השלמת הסריקה, להגדיל איזופלוראן ל 2% ולעצור את עירוי dexmedetomidine תת עורי.
- הסר את עריסת החיה מן המגנט נשא, לפרוק את החיה, ולהסיר מוטות אוזניים, בדיקת טמפרטורה, קליפ אוקסימטר דופק, ואת מחט dexmedetomidine.
- הזריק 0.015 מ"ג/ק"ג של פתרון atipamezole מדולל לתוך שריר הרגל האחורית של החולדה באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 25 G (כלומר, חולדה 300 גרם יקבל 0.09 מ"ל).
- מניחים את החולדה בחזרה בכלוב הביתי על גבי כרית חימום ומפקחים עד שהחיה אמבולטורית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר כל סריקה של מצב מנוחה, היציבות מוערכת באמצעות ניתוח רכיבים עצמאי (ICA; סקריפט לדוגמה הכלול בקבצים משלימים). איור 6 מציג דוגמאות לפלט רכיבים מסריקות במצב מנוחה. איור 6a מציג רכיב אות מסריקה עם יציבות גבוהה. שימו לב כי מרחבית, לרכיב יש אזוריות גבוהה. בתוך מסלול הזמן מתחת למרכיב המרחבי, האות יציב ולא צפוי, מה שמעיד על פעילות מוחית אמיתית. ספקטרום הכוח בתחתית מראה בעיקר תדרים נמוכים. איור 6b מציג רכיב מאותה סריקה כמו איור 6a המייצג רעש. שים לב לא-אזוריות ברכיב המרחבי, במסלול הזמן בתדר גבוה ובשיא התדר הגבוה בספקטרום הכוח. לבסוף, איור 6c מראה רכיב מתוך סריקה עם הרדמה לא יציבה. מסלול הזמן משתנה ולא סדיר. כאשר זה קורה, שיפורים נדרשים פרוטוקול הרדמה, בדרך כלל לאיטום של חרוט האף ואת ניקוי של גזי פסולת.
איור 1: מרחב הכנה ועריסת בעלי חיים MRI. א) מרחב הכנה. הוואקום אוכל גזי פסולת הן מתא האינדוקציה והן מחרוט האף בעריסת החיות. כרית החימום מסייעת לשמור על טמפרטורת בעלי החיים במהלך שלב 1 והתאוששות. ב) עריסת בעלי חיים MRI. החלק העליון מציין רכיבים של הגדרת בעלי החיים בשלב 2. התחתון מראה חולדה מוכנה לחלוטין לסריקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פלט סריקה פיזיולוגית. רוויית חמצן (PulseOx, 96%), קצב לב (325 פעימות לדקה]), קצב נשימה (61 נשימות/דקה) וטמפרטורת גוף הליבה (T1, 37.5 °C) מנוטרים כל הזמן לאורך כל מפגש הסריקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3:מיקום חרוט ו סליל באף. (א)תסגור את מבטו על חרוט האף הסגור סביב אפו של בעל החיים והלסת התחתונה. (ב)מבט תקורה על יישור סליל פני השטח למוח. (ג)מבט צדדי של יישור סליל עם נקודת האמצע של עין החיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: קו עירוי דקמדטומידין תת עורי ומיקום מחט. (א)הכנסת מחט לאזור המותני התחתון של גב החיה. (ב)קלטת המאבטחת את המחט לעור החיה. (ג)סרט על עריסת החיה כדי למנוע תנועה של המחט הפרומגנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: יישור סריקה אנטומית. (א)סריקת לוקליזציה כדי ליישר את מוח החיה למרכז המגנט, שצוין עם כוונת. (ב)פרוסות קשת מיושרות על פני המוח משמאל לימין. (ג)יישור לפירוק של ההנעה החלקה הצולבת, המצוינת על ידי החץ הלבן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: הערכת איכות באמצעות ניתוח רכיבים עצמאי. (א)רכיב איתות במהלך הרדמה יציבה. (ב)רכיב רעש במהלך הרדמה קבועה. (ג)הרדמה לא יציבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| סרק | רצף | כיוון | FOV (מ"מ x מ"מ) | מטריצה | פרוסות | עובי פרוסה (מ"מ) | TE (ms) | TR (ms) | ממוצעים | מרווח בין הד (ms) | גורם נדיר | חזרות | זמן סריקה |
| לוקליזציה | פלאש | כל המטוסים | 50 | 256 | 1/dir | 1 | 2.5 | 100 | 1 | 1 | 12.8 s | ||
| לוקליזציה | נדיר | כל המטוסים | 35 | 192 | 1/dir | 0.75 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 דק' |
| ענת | נדיר | קשת | 35 | 192 | 15 | 1 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 דק' |
| ענת | פלאש | צירית | 35 | 192 | 23 | 1 | 5 | 250 | 2 | 1 | דקה ו-36 | ||
| ענת | נדיר | צירית | 35 | 192 | 23 | 1 | 28 | 2500 | 4 | 7 | 8 | 1 | 4 דקות |
| שים | ללחוץ | כל המטוסים | 16.223 | 2500 | 1 | 1 | 2.5 s | ||||||
| מצב מנוחה | אפינפרין | צירית | 35 | 64 | 15 | 1 | 15 | 1200 | 1 | 300 | 6 דקות כל אחד |
טבלה 1: טבלת הפניות של פרמטרי סריקה. פרמטרים עבור הרצפים המתוארים בפרוטוקול. FLASH = זריקת זווית נמוכה מהירה, נדיר = רכישה מהירה עם שיפור הרפיה, PRESS = ספקטרוסקופיה פתורה נקודה, EPI = הדמיה פלנארית אקו.
קבצים משלימים: קובץ Script לדוגמה להערכת איכות ICA. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יציבות החיה, הן פיזית והן מבחינה פיזיולוגית, היא המפתח להשגת נתוני מצב מנוחה באיכות גבוהה. פרוטוקול זה משיג יציבות על ידי מעבר דרך ארבעה שלבים נפרדים של הרדמה. זה הכרחי כי החיה פגשה את הסף הפיזיולוגי להגדיר לפני המעבר לשלב הבא של הרדמה; מאז שיטה זו מסתמכת על מנגנוני autoregulatory פיזיולוגיים, בעלי חיים בודדים עשויים לדרוש כמויות שונות במקצת של זמן בכל שלב הרדמה. הניסיון שלנו הוא שלוקח יותר זמן בכל שלב הוא יעיל יותר מאשר למהר בשלבים מוקדמים יותר מבלי לתת לפיזיולוגיה של החולדה מספיק זמן להתיישב. המרכיבים העיקריים המאפשרים יציבות הם התאמת חרוט האף ונבלות גז פסולת נכונה.
חרוט אף אטום כראוי ונבלות מאפשרים לחיה להישאר יציב עם נשימה מרווחת באופן קבוע ורמות רוויית חמצן יציבות. אם מתרחשים התנשפות, ריווח לא סדיר, החזקת נשימה או ירידה ברמות רוויית החמצן, יש לפעול לשיפור איטום חרוט האף וניקיון. חרוט האף צריך להתאים היטב אבל לא צריך לדחוף לתוך גשר האף. ייתכן שיהיה צורך לפברק חרוט אף מותאם אישית. חרוט האף המקורי מהיצרן שלנו היה שסתום תימת אוויר שהיה קטן מדי, כך צינור בז היה מצויד בקו ואקום אטום גדול יותר קרוב יותר לחיה. התוצאה הייתה אישור טוב יותר של CO2 שפג תוקפו ורוויה חמצן יציבה. כפי שהוזכר בפרוטוקול, סרט פרפין עשוי להיות כרוך סביב הלסת התחתונה ואת הקצה של חרוט האף, אבל אם עטוף חזק מדי, זה יכול להגביל את הנשימה ולהוביל לחוסר יציבות. בנוסף, מיקום לא תקין של מוטות אוזניים וחטיף נשיכה לא רק משפיע על היציבות הדרושה של הראש להדמיה, אלא גם יכול להשפיע על הנשימה; המשך מצמוץ או רעש נשמע מן החיה הוא אינדיקציה סבירה של מיקום מוט האוזן לא תקין. השיניים הקדמיות צריכות לשבת בבטחה על מוט הנשיכה ולהימשך קדימה לאחר מיקום מוט האוזן כדי להבטיח התאמה הדוקה. ייתכן שיהיה צורך למשוך את לשונו של החולדה קדימה אם היא יושבת רחוק מדי אחורה בפה ומגבילה נשימה נכונה.
מכיוון שכל מערכת היא ייחודית, כוונון עדין של רמת הוואקום נדרש כדי להשיג ניקוי אופטימלי. כמדריך מעשי, זה צריך להיות אפשרי להרגיש כמות קטנה של יניקה או על ידי הנחת אצבע מעל קו הוואקום פתיחת בתוך חרוט האף, או על ידי איטום כל פתח חרוט האף עם כף היד. קצב זרימה תואם עבור קלט הרדמה (0.8 L / min שימש כאן) הוא נקודת התחלה טובה. רוויית חמצן בבעלי החיים צריכה להישאר מעל 95% לאורך הסריקה. אם רוויית חמצן מראה מגמה יורדת, זה עשוי להיות אינדיקציה כי CO2 בונה חרוט האף ו scavenging צריך להיות מוגבר. אפשרות נוספת היא כי הלחץ של קליפ oximeter הדופק על כף הרגל צריך להיות מותאם, או משוחרר כדי לשפר את זרימת הדם או הידוק כדי להבטיח אות חזק ויציב. אם הנשימה של החיה גבוהה יותר מהסף המתואר, הדבר עשוי להצביע על כך שהאוחז מוגדר גבוה מדי ומסיר יותר מדי איזופלוראן. בנסיבות נדירות, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את המינון של dexmedetomidine תת עורי ל 0.02 מ"ג / קילוגרם / שעה, אבל מצאנו כי 0.015 מ"ג / קילוגרם עבד היטב על פני מגוון רחב של גילאי חולדה ושני המינים, והוא נתמך במחקרים פרמקולוגיים4.
משך הסריקה הדרוש להפעלת fMRI הוא פונקציה של גודל אפקט, יחס אות לרעש מרחבי (SNR) ו- SNR זמני, כפי שהוצג בעבר על ידי מרפי ואח'13. השימוש ב סליל משטח קטן (2 ס"מ) ושדה מגנטי גבוה (9.4 T) משפר באופן משמעותי את הרגישות של SNR ו- BOLD. עם הגדרת ההדמיה שלנו, מצאנו כי סריקה אחת של 6 דקות מספיקה כדי לזהות רשת קישוריות פונקציונלית חזקה של מצב מנוחה, העולה בקנה אחד עם הדוח הקודם שלנו10. עם זאת, אנו בדרך כלל חוזרים על הסריקה 3 עד 4 פעמים, וממוצע התוצאות כדי להפיק רשתות מוח פונקציונליות עבור בעלי חיים בודדים. לחלופין, ניתן לסרוק פעם אחת עם משך זמן ארוך יותר (10 דקות או יותר) כדי להפיק רשתות קישוריות פונקציונליות14.
לאחר איסוף rs-fMRI באיכות גבוהה באמצעות פרוטוקול זה, עיבוד מקדים של הנתונים כפי שפורסם בעבר15,16. עם השימוש הן בסורגי אוזניים והן בסרגל נשיכה, ממצאי תנועה בקורס הזמן fMRI הם מינימליים, והשימוש בתיקון תנועה לא השפיע באופן ניכר על הנתונים שלנו. סריקות EPI בודדות של מצב מנוחה צריכות להיות מופשטות בגולגולת ולרשום למרחב משותף (אנו משתמשים במוח עכברוש מייצג יחיד)16,17. הסר את אמצעי האחסון ההתחלתיים מכל EPI כך שכל אלה הכלולים נרכשים כאשר המגנט נמצא במצב יציב (אנו מסירים 5 נקודות זמן). תיעד סריקות בודדות (ראה תוצאות מייצגות עבור דוגמאות של רכיבי אות ורעש). החל תיקון תזמון פרוסה, כמו גם הסרת מגמה ליניארית ורביעית, סינון מעבר פס (0.005-0.1 הרץ) והחלקה מרחבית (FWHM של 0.6 מ"מ [רוחב מלא בחצי מקסימום]). בנוסף, הסר את מסלול זמן האות הממוצע מהחומר הלבן ומהחלים באמצעות רגרסיה ליניארית. לאחר שלבים סטנדרטיים אלה של עיבוד מקדים, ניתן לבצע ניתוח נוסף של רמת הקבוצה, כולל קישוריות פונקציונלית מבוססת זרעים11,15,18,19,20,21,22, רכיבים עצמאיים מנתחים10,20,22,וניתוח מודולריות12,19.
ישנם שני יתרונות עיקריים של הפרוטוקול הנוכחי: 1) הוא מאפשר פעילות מוחית ספונטנית; ו -2) זה שומר על החיה בפיזיולוגיה כמעט נורמלית. שיטות הרדמה חלופיות (כגון propofol21, α-כלורלוז15, ו pancuronium ברומיד בשילוב עם הרדמה אחרת21,23) שימשו גם כדי לרכוש נתונים מצב מנוחה. עם זאת, באמצעות שילוב של איזופלוראן במינון נמוך עם dexmedetomidine במינון נמוך, כפי שתואר בפרוטוקול זה, הוכח רק לשבש באופן מינימלי את תפקודי רשת המוח תוך מתן היציבות הפיזיולוגית הדרושה כדי לקבל איכות מצב מנוחה פונקציונלי נתוניםקישוריות 9,10,18,24. יתר על כן, תגובות BOLD מגירוי סומטוסנסורי9 והסתה שפם מכני11 ניתן לראות או אחרי תקופה של 90 דקות בעת שימוש בפרוטוקול זה, מה שמרמז על רמת עוררות עקבית. מעניין, באמצעות dexmedetomidine בבידוד יכול לעורר פעילות אפילפטית; עם זאת, פעילות זו בוטלה עם איזופלוראן נוסף8. יתרון נוסף לפרוטוקול הנוכחי הוא שהוא מבטל את הצורך באוורור מלאכותי. למרות אוורור מכני עלול להוביל לטווח צר יותר של פחמן דו חמצני חלקי ורוויה חמצן על פני בעלי חיים, במחקרים אורך, שמירה על פרמטרים פיזיולוגיים ללא צורך צנרור עלול לגרום פחות סיבוכים ותופעות לוואי לא רצויות.
העניין ב-fMRI של מצב מנוחה גדל במידה ניכרת בעשר השנים האחרונות, ואיתו הצורך לרכוש סריקות איכותיות ופרה-אקליניות של מצב מנוחה ממכרסמים. פרוטוקול הישרדות זה משיג הרדמה יציבה עד 5 שעות עם פיזיולוגיה כמעט נורמלית במהלך רכישת מצב מנוחה. כמו הפרוטוקול הוא יציב מאוד, רצפים נוספים (מבני, גירוי, MRI פרמקולוגי, וכו ') ניתן להוסיף בקלות כדי להשיג את העיצוב הניסיוני הרצוי. השילוב של איזופלוראן במינון נמוך עם dexmedetomidine מנוצל בפרוטוקול זה מאפשר מגוון רחב של מחקרים פרה קליניים לחוקרים המעוניינים לחקור את מוח המכרסם במצב המנוחה שלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מהמכון הלאומי לבריאות (NIH) על שימוש בסמים (NIDA) [DJW, EDKS, ו- EMB נתמכו על ידי גרנט R21DA044501 שהוענק לאלן א. גרין ו- DJW נתמך על ידי גרנט T32DA037202 לאלן ג 'בדני] והמכון הלאומי לאלכוהול ואלכוהוליזם (NIAAA) [Grant F31AA028413 לאמילי ד . סאליבן]. תמיכה נוספת ניתנה באמצעות הקרן המוענקת של אלן גרין כפרופסור לפסיכיאטריה של ריימונד סובל ב דארטמות'.
Hanbing Lu נתמך על ידי המכון הלאומי על סמים שימוש תוך-מלונטרלי תוכנית מחקר, NIH.
המחברים רוצים להודות ולאלן א. גרין המנוח. מסירותו הבלתי מעורערת לתחום ההפרעות המתרחשות במשותף סייעה לבסס שיתוף פעולה בין המחברים. אנו מודים לו על חונכותו והדרכתו, אשר יחסר מאוד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9.4T MRI | Varian/Bruker | Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software | |
| Air-Oxygen Mixer | Sechrist | Model 3500CP-G | |
| Analysis of Functional NeuroImages (AFNI) | NIMH/NIH | Version AFNI_18.3.03 | Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/ |
| Animal Cradle | RAPID Biomedical | LHRXGS-00563 | rat holder with bite bar, nose cone and ear bars |
| Animal Physiology Monitoring & Gating System | SAII | Model 1025 | MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on |
| Antisedan (atipamezole hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-867-7097 | Zoetis, Manufacturer Item #10000449 |
| Ceramic MRI-Safe Scissors | MRIequip.com | MT-6003 | |
| Clippers | Patterson Veterinary | 07-882-1032 | Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201 |
| Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-893-1801 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10 |
| Digital Rectal Thermometer Covers | Medline | MDS9608 | |
| FMRIB Software Library | FMRIB | MELODIC Version 3.15 | Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki |
| Heating Pad | Cara Inc. | Model 50 | |
| Hemostat forceps, straight | Kent Scientific | INS750451-2 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06 |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip Inc. | 911103 | |
| Lab Tape, 3/4" | VWR International | 89097-990 | |
| Needles, 23 gauge | BD | 305145 | plastic hub removed |
| Parafilm Laboratory Film | Patterson Veterinary | 07-893-0260 | Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A |
| Planar Surface Coil | Bruker | T12609 | 2cm |
| Polyethylene Tubing | Braintree Scientific | PE50 50FT | 0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter) |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38 |
| Sprague Dawley Rats | Charles River | 400 SAS SD | |
| Sterile 0.9% Saline Solution | Patterson Veterinary | 07-892-4348 | Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186 |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Medline | MDS090735 | |
| Surgical Tape, 1" (3M Durapore) | Medline | MMM15381Z | 3M Healthcare, "wide medical tape" |
| Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore) | Medline | MMM15300 | 3M Healthcare |
| Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle | BD | 309626 | |
| Syringes, 3 mL | BD | 309657 | |
| Vented induction and scavenging system | VetEquip Inc. | 942102 | 2 liter induction chamber with active scavenging |
| 411724 | omega flowmeter | ||
| 931600 | scavenging cube, "vacuum" | ||
| 921616 | nose cone, non-rebreathing |
References
- Smitha, K. A., et al. Resting state fMRI: A review on methods in resting state connectivity analysis and resting state networks. The Neuroradiology Journal. 30 (4), 305-317 (2017).
- Gorges, M., et al. Functional connectivity mapping in the animal model: Principles and applications of resting-state fMRI. Frontiers in Neurology. 8, (2017).
- Paasonen, J., Stenroos, P., Salo, R. A., Kiviniemi, V., Gröhn, O. Functional connectivity under six anesthesia protocols and the awake condition in rat brain. NeuroImage. 172, 9-20 (2018).
- Pawela, C. P., et al. A protocol for use of medetomidine anesthesia in rats for extended studies using task-induced BOLD contrast and resting-state functional connectivity. NeuroImage. 46 (4), 1137-1147 (2009).
- Jonckers, E., et al. Different anesthesia regimes modulate the functional connectivity outcome in mice. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (4), 1103-1112 (2014).
- Williams, K. A., et al. Comparison of alpha-chloralose, medetomidine and isoflurane anesthesia for functional connectivity mapping in the rat. Magnetic Resonance Imaging. 28 (7), 995-1003 (2010).
- Zhurakovskaya, E., et al. Global functional connectivity differences between sleep-like states in urethane anesthetized rats measured by fMRI. PloS One. 11 (5), 0155343 (2016).
- Fukuda, M., Vazquez, A. L., Zong, X., Kim, S. -G. Effects of the α2-adrenergic receptor agonist dexmedetomidine on neural, vascular and BOLD fMRI responses in the somatosensory cortex. The European Journal of Neuroscience. 37 (1), 80-95 (2013).
- Brynildsen, J. K., et al. Physiological characterization of a robust survival rodent fMRI method. Magnetic Resonance Imaging. 35, 54-60 (2017).
- Lu, H., et al. Rat brains also have a default mode network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3979-3984 (2012).
- Lu, H., et al. Low- but not high-frequency LFP correlates with spontaneous BOLD fluctuations in rat whisker barrel cortex. Cerebral Cortex. 26 (2), 683-694 (2016).
- Tsai, P. -J., et al. Converging structural and functional evidence for a rat salience network. Biological Psychiatry. 88 (11), 867-878 (2020).
- Murphy, K., Bodurka, J., Bandettini, P. A. How long to scan? The relationship between fMRI temporal signal to noise ratio and necessary scan duration. NeuroImage. 34 (2), 565-574 (2007).
- Birn, R. M., et al. The effect of scan length on the reliability of resting-state fMRI connectivity estimates. NeuroImage. 83, 550-558 (2013).
- Lu, H., et al. Synchronized delta oscillations correlate with the resting-state functional MRI signal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18265-18269 (2007).
- Lu, H., et al. Registering and analyzing rat fMRI data in the stereotaxic framework by exploiting intrinsic anatomical features. Magnetic Resonance Imaging. 28 (1), 146-152 (2010).
- Cox, R. W. AFNI: software for analysis and visualization of functional magnetic resonance neuroimages. Computers and Biomedical Research. 29 (3), 162-173 (1996).
- Ash, J. A., et al. Functional connectivity with the retrosplenial cortex predicts cognitive aging in rats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (43), 12286-12291 (2016).
- Hsu, L. -M., et al. Intrinsic insular-frontal networks predict future nicotine dependence severity. The Journal of Neuroscience. 39 (25), 5028-5037 (2019).
- Li, Q., et al. Resting-state functional MRI reveals altered brain connectivity and its correlation with motor dysfunction in a mouse model of Huntington's disease. Scientific Reports. 7, (2017).
- Lu, H., et al. Abstinence from cocaine and sucrose self-administration reveals altered mesocorticolimbic circuit connectivity by resting state MRI. Brain Connectivity. 4 (7), 499-510 (2014).
- Seewoo, B. J., Joos, A. C., Feindel, K. W. An analytical workflow for seed-based correlation and independent component analysis in interventional resting-state fMRI studies. Neuroscience Research. 165, 26-37 (2021).
- Broadwater, M. A., et al. Adolescent alcohol exposure decreases frontostriatal resting-state functional connectivity in adulthood. Addiction Biology. 23 (2), 810-823 (2018).
- Jaime, S., Cavazos, J. E., Yang, Y., Lu, H. Longitudinal observations using simultaneous fMRI, multiple channel electrophysiology recording, and chemical microiontophoresis in the rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 306, 68-76 (2018).
