Summary
Данный протокол описывает способ получения данных функциональной магнитно-резонансной томографии (rs-fMRI) в состоянии покоя от крысы с использованием низкой дозы изофлурана в сочетании с низкой дозой дексмедетомидина.
Abstract
Функциональная магнитно-резонансная томография в состоянии покоя (rs-fMRI) становится все более популярным методом изучения функции мозга в состоянии покоя, без задачи. Этот протокол описывает доклинический метод выживания для получения данных rs-fMRI. Сочетание низких доз изофлурана с непрерывной инфузией агониста адренергических рецепторов α2 дексмедетомидина обеспечивает надежный вариант для стабильного, высококачественного сбора данных при сохранении функции сети мозга. Кроме того, эта процедура позволяет спонтанно дышать и почти нормальную физиологию у крыс. Дополнительные последовательности визуализации могут быть объединены с получением состояния покоя, создавая экспериментальные протоколы с анестезирующей стабильностью до 5 ч с использованием этого метода. Этот протокол описывает настройку оборудования, мониторинг физиологии крыс во время четырех различных фаз анестезии, получение сканов состояния покоя, оценку качества данных, восстановление животного и краткое обсуждение анализа данных после обработки. Этот протокол может быть использован в широком спектре доклинических моделей грызунов, чтобы помочь выявить результирующие изменения сети мозга, которые происходят в состоянии покоя.
Introduction
Функциональная магнитно-резонансная томография в состоянии покоя (rs-fMRI) является мерой сигнала, зависящего от уровня кислорода в крови (BOLD), когда мозг находится в состоянии покоя и не занимается какой-либо конкретной задачей. Эти сигналы могут быть использованы для измерения корреляций между областями мозга для определения функциональной связности в нейронных сетях. rs-fMRI широко используется в клинических исследованиях из-за ее неинвазивности и низкого количества усилий, требуемых от пациентов (по сравнению с фМРТ на основе задач), что делает ее оптимальной для различных групп пациентов1.
Технологические достижения позволили адаптировать rs-fMRI для использования в моделях грызунов для выявления механизмов, лежащих в основе болезненных состояний (см. ссылку2 для обзора). Доклинические модели на животных, включая модели болезней или нокаутов, допускают широкий спектр экспериментальных манипуляций, не применимых к людям, и исследования могут также использовать посмертные образцы для дальнейшего улучшения экспериментов2. Тем не менее, из-за сложности как в ограничении движения, так и в смягчении стресса, МРТ-сбор у грызунов традиционно выполняется под наркозом. Анестетики, в зависимости от их фармакокинетики, фармакодинамики и молекулярных мишеней, влияют на мозговой кровоток, метаболизм мозга и потенциально влияют на пути нервно-сосудистой связи.
Были предприняты многочисленные усилия по разработке анестезирующих протоколов, которые сохраняют нейрососудистую связь и функцию сети мозга3,4,5,6,7,8. Ранее мы сообщали об анестезирующей схеме, в котором применялась низкая доза изофлурана вместе с низкой дозой агониста адренергических рецепторовα 2 дексмедетомидина9. Крысы при этом методе анестезии демонстрировали устойчивые bold-ответы на стимуляцию усов в областях, согласующихся с установленными проекционными путями (вентролатеральные и вентромедиальные таламические ядра, первичная и вторичная соматосенсорная кора); также последовательно обнаруживали крупномасштабные сети мозга с состоянием покоя, включая сети10,11 режима по умолчанию и сеть12 в режиме покоя. Кроме того, этот протокол анестетика позволяет проводить повторную визуализацию на одном и том же животном, что важно для мониторинга прогрессирования заболевания и эффекта экспериментальных манипуляций продольно.
В настоящем исследовании мы подробно описываем экспериментальную установку, подготовку животных и процедуры физиологического мониторинга. В частности, мы описываем конкретные фазы анестезии и получение сканов во время каждой фазы. Качество данных оценивается после каждого сканирования состояния покоя. Краткое резюме анализа после сканирования также включено в обсуждение. Лаборатории, заинтересованные в раскрытии потенциала использования rs-fMRI у крыс, сочтят этот протокол полезным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились на 9,4-тотном МРТ-сканере и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Дартмутском колледже. Было получено дополнительное разрешение на запись и показ животных, используемых на видео и рисунках ниже.
1. Подготовка перед сканированием
- Линия подкожной инфузии
- Частично извлеките иглу 23 г из упаковки, чтобы точка иглы оставалось стерильной.
- Надежно удерживайте ступицу иглы и используйте лезвие бритвы, чтобы забить вал иглы там, где он встречается со ступицей.
- Зажмите держатель иглы вокруг вала непосредственно под забивкой и осторожно отломить вал от ступицы.
- Вставьте 1/3 вала иглы (тупой конец) в ранее стерилизованную линию PE50 с достаточной длиной линии, чтобы простираться от насоса для лекарств до животного внутри магнитного отверстия.
- Разведение дексмедетомидина и атипамезола
- Готовят раствор разбавленного дексмедетомидина гидрохлорида, используя 0,5 мл 0,5 мг/мл бульона, смешанного с 9,5 мл стерильного физиологического раствора в прозрачном стерильном стеклянном флаконе (разбавленная концентрация = 0,025 мг/мл).
- Готовят раствор разбавленного атипамезола, используя 0,1 мл 5 мг/мл бульона, смешанного с 9,9 мл стерильного физиологического раствора в прозрачном стерильном стеклянном флаконе (разбавленная концентрация = 0,05 мг/мл).
- Параметры сканирования
- Используйте параметры, представленные в таблице 1, для подготовки последовательностей сканирования.
2. Фаза 1 анестезии: Индукция и подготовка животных
- Настройка
- Убедитесь, что все оборудование включено и работает должным образом, включая смеситель кислорода и воздуха, грелку и активную систему мусора (см. Рисунок 1).
- Установите температуру системы отопления на 37,5 °C.
- Индукция животных
- Поместите животное (90-дневная, самец крысы Sprague Dawley) в индукционную камеру и индуцировать анестезию с 2,5% изофлурана в 30% обогащенном кислородом воздухе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть использован широкий диапазон возрастов животных и обоих полов. - После того, как животное обезболивается, извлеките его из камеры, взвесьте животное и поместите в носовой конус (на 2,5% изофлурана) на грелку в помещении для приготовления.
- Поместите животное (90-дневная, самец крысы Sprague Dawley) в индукционную камеру и индуцировать анестезию с 2,5% изофлурана в 30% обогащенном кислородом воздухе.
- Подготовка животных
- Нанесите офтальмологическую смазочную мазь на каждый глаз, чтобы предотвратить пересыхание.
- Подтвердите глубину анестезии отсутствием реакции на ущемление ногой.
- Используйте кусачки, чтобы сбрить квадратную область 2 на 2 дюйма в нижней поясничной области спины животного (то есть непосредственно над хвостом).
- Вводят 0,015 мг/кг раствора дексмедетомидина внутрибрюшинной (т.п.) инъекцией (например, крыса 300 г получит 0,18 мл) в нижний правый квадрант живота с помощью иглы 25 г.
- Выключите поток изофлурана из подготовительного пространства в колыбель животного.
- Переместите животное в колыбель для животных. Надежно поместите передние зубы крысы в перекладиной. Нажмите носовой конус на нос, чтобы обеспечить плотное прилегать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если носовой конус не покрывает нижнюю челюсть, используйте парафиновую пленку, чтобы осторожно удерживать челюсть закрытой, а также запечатывать вокруг носового конуса. - Расположите дыхательную прокладку под брюшком крысы ниже грудной клетки и переместите ее до тех пор, пока форма сигнала дыхания не покажет глубокую впадину, центрированную на каждом вдохе (см. форму волны дыхания на рисунке 2).
- Следите за дыханием животного с помощью программного обеспечения для мониторинга физиологии. Переход к следующей фазе анестезии при дыхании менее 40 вдохов/мин (ут/мин; примерно через 5 мин после инъекции дексмедетомидина).
3. Фаза 2 анестезии: Установка животных
- Вставьте ушные перекладиски в ушной канал, чтобы стабилизировать голову крысы в колыбели животного. После того, как вы расположились, потяните вперед на перекладине укуса и убедитесь, что голова не двигается. При необходимости отрегулируйте носовой конус и парафиновую пленку (см. Рисунок 3а).
- Вставьте датчик температуры в предварительно смазанный одноразовый чехол для зонда. Аккуратно вставьте температурный зонд примерно на 1/2 дюйма в прямую кишку и приклейте его к основанию хвоста медицинской лентой.
- Поместите зажим пульсоксиметра на плюсневую область задней ноги, убедив, что источник света находится на нижней части стопы (ладони).
ПРИМЕЧАНИЕ: Вращение клипа может повлиять на сигнал; таким образом, создание держателя для удержания лапы и зажима в вертикальном положении приведет к большей стабильности. Также обратите внимание, что пока крыса не находится при нормальной температуре тела, насыщение кислородом может быть низким (<95%). - Используйте вес крысы для расчета скорости инфузии для выброса 0,015 мг / кг / ч дексмедетомидина (крыса с 300 г получает 0,18 мл / ч).
- Установите насос препарата для извлечения расчетной скорости инфузии.
- Заполните шприц 3 мл стерильным, разбавленным раствором дексмедетомидина и вставьте кончик иглы в открытый конец стерилизованной инфузионной линии (простирающейся от насоса препарата до колыбели животного с предварительно прикрепленной подкожной иглой). Заполните линию и закрепите шприц в держателе шприца насоса для лекарств.
- Переместите блок толкателя вперед, пока он не коснется плунжера, и препарат будет выведен на иглу, гарантируя, что линия инфузии полностью заполнена.
- Используя спиртовую салфетку, очистите выбритую область, чтобы удалить любые блуждающих волос.
- Защемляем кожу примерно на два пальца шириной выше основания хвоста. Вставьте 1/3 иглы линии инфузии в шатровую кожу.
- Прикрепите иглу к коже с помощью 3-дюймового куска широкой медицинской ленты. Поместите второй кусок широкой медицинской ленты поверх первой, поперек крысы, и прикрепите к обеим сторонам колыбели животного (см. Рисунок 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Критически важно, чтобы ферромагнитная игла была хорошо закреплена для предотвращения движения во время сканирования. - Начинают инфузию подкожного дексмедетомидина.
- Поместите кусок марли на переносицу крысы, чтобы создать ровную поверхность для катушки. Используйте бумажную ленту, которая не мешает сигналу МРТ, чтобы закрепить катушку на голове крысы, центрируя ее над мозгом (см. Рисунок 3b,c).
- Закрепите все линии и кабели в колыбели животного с помощью лабораторной ленты и проверьте, стабильны ли все физиологические сигналы (см. Рисунок 2).
- Положите бумажные полотенца поверх животного, прикрепив их к колыбели животного лабораторной лентой. Если используется система воздушного отопления, оберните пластиковый лист вокруг всей люльки, чтобы вместить теплый воздух.
- Переместите животное в отверстие и настройте магнит.
4. Анестезия фазы 3: получение анатомического сканирования
- Снижают изофлуран до 1,5%, в результате чего происходит устойчивое увеличение дыхания примерно до 45-50 ут/мин. Оставайтесь на этом уровне в течение всего времени анатомического сканирования.
- Используйте сканирование локализатора FLASH, чтобы убедиться, что мозг выровнен с изоцентроммагнита (рисунок 5a). Перепозиционирование животного и повторите при необходимости.
- Запустите сканирование ЛОКАЛИЗАТОРА RARE с более высоким разрешением и используйте этот результат сканирования, чтобы выровнять 15 сагиттальных срезов, центрированных по всему мозгу (слева направо, рисунок 5b).
- Используя средний сагиттальный срез, выровняйте центральный осевой срез до декуссации передней комиссуры, которая выглядит как темное пятно(рисунок 5c). Обратите внимание на смещение фрагмента, которое будет использоваться позже при сканировании состояния покоя.
- Приобретите 23 среза, используя осевые протоколы FLASH и RARE, чтобы помочь в регистрации в общем пространстве во время анализа после сканирования.
- Прокладка по всему мозгу с помощью последовательности PRESS.
5. Этап 4: Получение сканирования в состоянии покоя
- После завершения анатомического сканирования уменьшают изофлуран до 0,5-0,75%, корректируя так, чтобы дыхание животного было 60-65 вдохов в минуту. Оставайтесь на этом уровне не менее 10 минут, прежде чем начать сканирование в состоянии покоя, чтобы обеспечить стабильность.
- Когда физиология стабильна (диапазон дыхания составляет 60-75 бр/мин без задыхания или неровностей, температура тела ядра составляет 37,5 ± 1,0 °C, а насыщение кислородом составляет 95% или более), приобретите 15-срезовое сканирование EPI, используя то же смещение среза, что и анатомический осевой ряд.
- После завершения каждого сканирования состояния покоя проверяйте качество с помощью независимого компонентного анализа (ICA) для разложения данных на пространственные и временные компоненты.
- Получите не менее трех высококачественных сканирований состояния покоя.
6. Восстановление после сканирования
- Когда сканирование завершено, увеличивают изофлуран до 2% и прекращают подкожную инфузию дексмедетомидина.
- Снимите колыбель животного из магнитного отверстия, разверните животное и снимите ушные перекладинки, датчик температуры, зажим пульсоксиметра и иглу дексмедетомидина.
- Ввести 0,015 мг/кг разбавленного раствора атипамезола в мышцу задней ноги крысы с помощью шприца 1 мл с иглой 25 г (т.е. крыса с 300 г получит 0,09 мл).
- Поместите крысу обратно в домашнюю клетку поверх грелки и следите за тем, пока животное не будет амбулаторным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После каждого сканирования состояния покоя стабильность оценивается с помощью независимого анализа компонентов (ICA; пример сценария, включенного в дополнительные файлы). На рисунке 6 показаны примеры выходных данных компонентов сканирования в состоянии покоя. На рисунке 6a показан сигнальный компонент сканирования с высокой стабильностью. Обратите внимание, что пространственно компонент имеет высокую региональность. В течение времени ниже пространственной составляющей сигнал стабилен и непредсказуем, что свидетельствует об истинной активности мозга. Спектр мощности внизу показывает преимущественно низкие частоты. На рисунке 6b показан компонент из того же сканирования, что и на рисунке 6a, который представляет шум. Обратите внимание на нерегуляемость пространственной составляющей, высокочастотный временной ход и высокочастотный пик в спектре мощности. Наконец, на рисунке 6c показан компонент из сканирования с нестабильной анестезией. Временной курс является переменным и нерегулярным. Когда это происходит, необходимы улучшения в протоколе анестезии, как правило, в герметизации носового конуса и очистке отработанных газов.
Рисунок 1:Помещение для подготовки и МРТ-колыбель для животных. а) Подготовительное пространство. Вакуум поглощает отходы как из индукционной камеры, так и из носового конуса в колыбели животного. Грелка помогает поддерживать температуру животного как во время фазы 1, так и во время восстановления. б) МРТ колыбель для животных. Вверху указаны компоненты установки животного в Фазе 2. Внизу изображена крыса, полностью настроенная и готовая к сканированию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Выход физиологического сканирования. Насыщение кислородом (PulseOx, 96%), частота сердечных сокращений (325 BPM [удары в минуту]), частота дыхания (61 вдох/мин) и температура тела (T1, 37,5 °C) постоянно контролируются на протяжении всего сеанса сканирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Размещение носового конуса и катушки. (a) Крупный план конуса носа, запечатанный вокруг носа и нижней челюсти животного. (b)Вид сверху выравнивания поверхностной катушки к мозгу. (c)Вид сбоку выравнивания катушки со средней точкой глаза животного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Подкожная линия инфузии дексмедетомидина и размещение иглы. (а)Введение иглы в нижнюю поясничную область спины животного. (b)Лента, крепящая иглу к коже животного. (c)Лента поперек колыбели животного для предотвращения движения ферромагнитной иглы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Анатомическое выравнивание сканирования. (a) Локализатор сканирования для выравнивания мозга животного с изоцентром магнита, отмеченным перекрестием. (б)Сагиттальные срезы, выровненные по всему мозгу слева направо. (c)Выравнивание по декуссации передней комиссуры, обозначенное белой стрелкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Оценка качества с использованием независимого компонентного анализа. ( a ) Сигнальнаясоставляющаяво время устойчивой анестезии. (b)Шумовой компонент во время устойчивой анестезии. (c)Неустойчивая анестезия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Сканировать | Последовательность | Ориентация | FOV (мм x мм) | Матрица | Ломтики | Толщина среза (мм) | ТЕ (мс) | ТР (мс) | Средние | Эхо-интервал (мс) | Редкий фактор | Повторений | Время сканирования |
| Локализатор | ВСПЫШКА | Все самолеты | 50 | 256 | 1/реж | 1 | 2.5 | 100 | 1 | 1 | 12.8 с | ||
| Локализатор | РЕДКИЙ | Все самолеты | 35 | 192 | 1/реж | 0.75 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 мин |
| Анат | РЕДКИЙ | Сагиттальный | 35 | 192 | 15 | 1 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 мин |
| Анат | ВСПЫШКА | Осевой | 35 | 192 | 23 | 1 | 5 | 250 | 2 | 1 | 1 мин 36 с | ||
| Анат | РЕДКИЙ | Осевой | 35 | 192 | 23 | 1 | 28 | 2500 | 4 | 7 | 8 | 1 | 4 мин |
| Клин | ДАВИТЬ | Все самолеты | 16.223 | 2500 | 1 | 1 | 2,5 с | ||||||
| Состояние покоя | ЭПИ | Осевой | 35 | 64 | 15 | 1 | 15 | 1200 | 1 | 300 | 6 мин каждый |
Таблица 1: Справочная таблица параметров сканирования. Параметры последовательностей, описанных в протоколе. FLASH = Быстрый низкоугловой снимок, RARE = Быстрое получение с усилением релаксации, PRESS = Точечная ререшенная спектроскопия, EPI = Эхо-планарная визуализация.
Дополнительные файлы: Пример скрипта для оценки качества ICA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Стабильность животного, как физически, так и физиологически, является ключом к получению высококачественных данных о состоянии покоя. Этот протокол достигает стабильности, проходя через четыре различные фазы анестезии. Крайне важно, чтобы животное соответствовало установленным физиологическим порогам, прежде чем перейти к следующей фазе анестезии; Поскольку этот метод опирается на физиологические ауторегуляторные механизмы, отдельным животным может потребоваться немного разное количество времени на каждой фазе анестезии. Наш опыт показывает, что занимать больше времени на каждой фазе более эффективно, чем спешить с более ранними стадиями, не давая физиологии крысы достаточно времени для осеспокоения. Ключевыми компонентами, которые обеспечивают стабильность, являются посадка носового конуса и правильная очистка отработанных газов.
Правильно запечатанный носовой конус и мусор позволяют животному оставаться стабильным с регулярно расположенным дыханием и устойчивым уровнем насыщения кислородом. Если происходит задыхание, нерегулярное расстояние, задержка дыхания или снижение уровня насыщения кислородом, следует работать над улучшением уплотнения и уплотнения конуса носа. Носовой конус должен плотно прилегать, но не должен вдвигаться в переносицу. Возможно, потребуется изготовить специальный носовой конус. Оригинальный носовой конус от нашего производителя имел слишком маленький клапан отвода воздуха, поэтому соколиная трубка была оснащена более крупной герметичной вакуумной линией ближе к животному. Это привело к лучшему клиренсу просроченного CO2 и устойчивому насыщению кислородом. Как упоминалось в протоколе, парафиновая пленка может быть обернута вокруг нижней челюсти и края носового конуса, но если обернуть слишком плотно, это может ограничить дыхание и привести к нестабильности. Кроме того, неправильное размещение ушных вкладышей и прикуса не только влияет на необходимую стабильность головы для визуализации, но также может повлиять на дыхание; продолжающееся моргание или слышимый шум от животного является вероятным признаком неправильного размещения ушной перекладины. Передние зубы должны надежно сидеть на прикусе и вытягиваться вперед после установки ушной перекладины, чтобы обеспечить плотное прилегать. Язык крысы, возможно, придется вытянуть вперед, если он сидит слишком далеко во рту и ограничивает правильное дыхание.
Поскольку каждая система уникальна, для достижения оптимальной уборки требуется тонкая настройка уровня вакуума. В качестве практического руководства, должно быть возможно ощутить небольшое количество всасывания, либо поместив палец на вакуумную линию, открывающуюся внутри носового конуса, либо запечатав все отверстие носового конуса ладонью. Согласование скорости потока для анестезии (здесь использовалось 0,8 л/мин) является хорошей отправной точкой. Насыщение кислородом у животного должно оставаться выше 95% на протяжении всего сканирования. Если насыщение кислородом показывает тенденцию к снижению, это может быть признаком того, что CO2 накапливается в носовом конусе и необходимо увеличить падальщик. Другая возможность заключается в том, что давление клипсы пульсоксиметра на стопе необходимо отрегулировать, либо ослабить, чтобы улучшить кровоток, либо затянуть, чтобы обеспечить сильный, стабильный сигнал. Если дыхание животного выше установленных порогов, это может указывать на то, что мусор установлен слишком высоко и удаляет слишком много изофлурана. В редких случаях может потребоваться увеличить дозу подкожного дексмедетомидина до 0,02 мг / кг / ч, но мы обнаружили, что 0,015 мг / кг хорошо работает в широком диапазоне возрастов крыс и обоих полов и поддерживается в фармакологических исследованиях4.
Длительность сканирования, необходимая для активации фМРТ, является функцией размера эффекта, пространственного отношения сигнал/шум (SNR) и временного SNR, как показано ранее Murphy et al.13. Использование малой поверхностной катушки (2 см) и высокого магнитного поля (9,4 Тл) существенно повышает чувствительность SNR и BOLD. С помощью нашей настройки образа мы обнаружили, что одного 6-минутного сканирования достаточно для обнаружения надежной функциональной сети подключения в состоянии покоя, что согласуется с нашим предыдущим отчетом10. Тем не менее, мы обычно повторяем сканирование от 3 до 4 раз и усредняем результаты, чтобы получить функциональные мозговые сети для отдельных животных. Альтернативно, можно сканировать один раз с большей продолжительностью (10 мин или более) для получения функциональных сетей связи14.
После сбора высококачественной rs-fMRI с использованием этого протокола, предварительная обработка данных, как было ранее опубликовано15,16. С использованием как ушных вкладышей, так и прикуса артефакты движения во временном курсе фМРТ минимальны, а использование коррекции движения не оказало заметного влияния на наши данные. Индивидуальные сканирования EPI в состоянии покоя должны быть лишены черепа и зарегистрированы в общем пространстве (мы используем один репрезентативный мозг крысы)16,17. Удалите начальные объемы из каждого EPI, чтобы все включенные были получены, когда магнит находится в установившемся состоянии (мы удаляем 5 временных точек). Разшумируйте отдельные сканирования (примеры сигнальных и шумовых компонентов см. в разделе Репрезентативные результаты). Применяйте коррекцию времени среза, а также линейное и квадратичное удаление трендов, фильтрацию полосового пропуска (0,005-0,1 Гц) и пространственное сглаживание (0,6 мм FWHM [полная ширина при половине максимума]). Кроме того, удаляют среднее время прохождения сигнала из белого вещества и желудочков посредством линейной регрессии. После этих стандартных этапов предварительной обработки может быть выполнен дальнейший анализ на уровне группы, включая функциональные связина основесемян11, 15,18, 19,20, 21,22,независимые анализы компонентов10,20,22и анализ модульности12,19.
Есть два основных преимущества действующего протокола: 1) он допускает спонтанную мозговую активность; и 2) он поддерживает животное при почти нормальной физиологии. Альтернативные методы анестетика (такие как пропофол21,α-хлоралоза15и бромид панкурония в сочетании с другим анестетиком21,23)также использовались для получения данных о состоянии покоя. Однако было показано, что использование комбинации низких доз изофлурана с низкой дозой дексмедетомидина, как описано в этом протоколе, лишь минимально нарушает функции сети мозга, а также обеспечивает физиологической стабильность, необходимой для получения качественных данных функциональной связности состояния покоя9,10,18,24. Кроме того, ответы BOLD от соматосенсорной стимуляции9 и механического отклоненияусов 11 можно увидеть через 90 мин или после него при использовании этого протокола, что предполагает постоянный уровень возбуждения. Интересно, что использование дексмедетомидина в изоляции может вызвать эпилептическую активность; однако эта деятельность была отменена с добавлением изофлурана8. Еще одним преимуществом действующего протокола является то, что он исключает необходимость искусственной вентиляции легких. Хотя механическая вентиляция может привести к более узкому диапазону частичного насыщения углекислым газом и кислородом у животных, в продольных исследованиях поддержание физиологических параметров без необходимости интубации может привести к меньшему количеству осложнений и нежелательных побочных эффектов.
За последние 10 лет значительно возрос интерес к фМРТ в состоянии покоя, а вместе с ним и потребность в приобретении высококачественных доклинических сканирований состояния покоя у грызунов. Этот протокол выживания обеспечивает стабильную анестезию в течение 5 ч с почти нормальной физиологией во время приобретения состояния покоя. Поскольку протокол очень стабилен, дополнительные последовательности (структурные, стимулирующие, фармакологические МРТ и т. Д.) Могут быть легко добавлены для достижения желаемого экспериментального дизайна. Комбинация низких доз изофлурана с дексмедетомидином, используемым в этом протоколе, позволяет проводить широкий спектр доклинических исследований для исследователей, заинтересованных в изучении мозга грызунов в состоянии покоя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансированием Национального института здравоохранения (NIH) Национального института здравоохранения (NIH) по борьбе со злоупотреблением наркотиками (NIDA) [DJW, EDKS и EMB были поддержаны грантом R21DA044501, присужденным Алану И. Грину, а DJW был поддержан грантом T32DA037202 Алану Дж. Дополнительная поддержка была оказана через фонд Алана И. Грина в качестве профессора психиатрии Раймонда Собеля в Дартмуте.
Hanbing Lu поддерживается Национальным институтом по борьбе со злоупотреблением наркотиками Intramural Research Program, NIH.
Авторы хотели бы выразить признательность и благодарность покойному Алану И. Грину. Его непоколебимая преданность области сопутствующих расстройств помогла наладить сотрудничество между авторами. Мы благодарим его за наставничество и руководство, которых будет очень не хватать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9.4T MRI | Varian/Bruker | Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software | |
| Air-Oxygen Mixer | Sechrist | Model 3500CP-G | |
| Analysis of Functional NeuroImages (AFNI) | NIMH/NIH | Version AFNI_18.3.03 | Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/ |
| Animal Cradle | RAPID Biomedical | LHRXGS-00563 | rat holder with bite bar, nose cone and ear bars |
| Animal Physiology Monitoring & Gating System | SAII | Model 1025 | MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on |
| Antisedan (atipamezole hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-867-7097 | Zoetis, Manufacturer Item #10000449 |
| Ceramic MRI-Safe Scissors | MRIequip.com | MT-6003 | |
| Clippers | Patterson Veterinary | 07-882-1032 | Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201 |
| Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-893-1801 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10 |
| Digital Rectal Thermometer Covers | Medline | MDS9608 | |
| FMRIB Software Library | FMRIB | MELODIC Version 3.15 | Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki |
| Heating Pad | Cara Inc. | Model 50 | |
| Hemostat forceps, straight | Kent Scientific | INS750451-2 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06 |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip Inc. | 911103 | |
| Lab Tape, 3/4" | VWR International | 89097-990 | |
| Needles, 23 gauge | BD | 305145 | plastic hub removed |
| Parafilm Laboratory Film | Patterson Veterinary | 07-893-0260 | Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A |
| Planar Surface Coil | Bruker | T12609 | 2cm |
| Polyethylene Tubing | Braintree Scientific | PE50 50FT | 0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter) |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38 |
| Sprague Dawley Rats | Charles River | 400 SAS SD | |
| Sterile 0.9% Saline Solution | Patterson Veterinary | 07-892-4348 | Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186 |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Medline | MDS090735 | |
| Surgical Tape, 1" (3M Durapore) | Medline | MMM15381Z | 3M Healthcare, "wide medical tape" |
| Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore) | Medline | MMM15300 | 3M Healthcare |
| Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle | BD | 309626 | |
| Syringes, 3 mL | BD | 309657 | |
| Vented induction and scavenging system | VetEquip Inc. | 942102 | 2 liter induction chamber with active scavenging |
| 411724 | omega flowmeter | ||
| 931600 | scavenging cube, "vacuum" | ||
| 921616 | nose cone, non-rebreathing |
References
- Smitha, K. A., et al. Resting state fMRI: A review on methods in resting state connectivity analysis and resting state networks. The Neuroradiology Journal. 30 (4), 305-317 (2017).
- Gorges, M., et al. Functional connectivity mapping in the animal model: Principles and applications of resting-state fMRI. Frontiers in Neurology. 8, (2017).
- Paasonen, J., Stenroos, P., Salo, R. A., Kiviniemi, V., Gröhn, O. Functional connectivity under six anesthesia protocols and the awake condition in rat brain. NeuroImage. 172, 9-20 (2018).
- Pawela, C. P., et al. A protocol for use of medetomidine anesthesia in rats for extended studies using task-induced BOLD contrast and resting-state functional connectivity. NeuroImage. 46 (4), 1137-1147 (2009).
- Jonckers, E., et al. Different anesthesia regimes modulate the functional connectivity outcome in mice. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (4), 1103-1112 (2014).
- Williams, K. A., et al. Comparison of alpha-chloralose, medetomidine and isoflurane anesthesia for functional connectivity mapping in the rat. Magnetic Resonance Imaging. 28 (7), 995-1003 (2010).
- Zhurakovskaya, E., et al. Global functional connectivity differences between sleep-like states in urethane anesthetized rats measured by fMRI. PloS One. 11 (5), 0155343 (2016).
- Fukuda, M., Vazquez, A. L., Zong, X., Kim, S. -G. Effects of the α2-adrenergic receptor agonist dexmedetomidine on neural, vascular and BOLD fMRI responses in the somatosensory cortex. The European Journal of Neuroscience. 37 (1), 80-95 (2013).
- Brynildsen, J. K., et al. Physiological characterization of a robust survival rodent fMRI method. Magnetic Resonance Imaging. 35, 54-60 (2017).
- Lu, H., et al. Rat brains also have a default mode network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3979-3984 (2012).
- Lu, H., et al. Low- but not high-frequency LFP correlates with spontaneous BOLD fluctuations in rat whisker barrel cortex. Cerebral Cortex. 26 (2), 683-694 (2016).
- Tsai, P. -J., et al. Converging structural and functional evidence for a rat salience network. Biological Psychiatry. 88 (11), 867-878 (2020).
- Murphy, K., Bodurka, J., Bandettini, P. A. How long to scan? The relationship between fMRI temporal signal to noise ratio and necessary scan duration. NeuroImage. 34 (2), 565-574 (2007).
- Birn, R. M., et al. The effect of scan length on the reliability of resting-state fMRI connectivity estimates. NeuroImage. 83, 550-558 (2013).
- Lu, H., et al. Synchronized delta oscillations correlate with the resting-state functional MRI signal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18265-18269 (2007).
- Lu, H., et al. Registering and analyzing rat fMRI data in the stereotaxic framework by exploiting intrinsic anatomical features. Magnetic Resonance Imaging. 28 (1), 146-152 (2010).
- Cox, R. W. AFNI: software for analysis and visualization of functional magnetic resonance neuroimages. Computers and Biomedical Research. 29 (3), 162-173 (1996).
- Ash, J. A., et al. Functional connectivity with the retrosplenial cortex predicts cognitive aging in rats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (43), 12286-12291 (2016).
- Hsu, L. -M., et al. Intrinsic insular-frontal networks predict future nicotine dependence severity. The Journal of Neuroscience. 39 (25), 5028-5037 (2019).
- Li, Q., et al. Resting-state functional MRI reveals altered brain connectivity and its correlation with motor dysfunction in a mouse model of Huntington's disease. Scientific Reports. 7, (2017).
- Lu, H., et al. Abstinence from cocaine and sucrose self-administration reveals altered mesocorticolimbic circuit connectivity by resting state MRI. Brain Connectivity. 4 (7), 499-510 (2014).
- Seewoo, B. J., Joos, A. C., Feindel, K. W. An analytical workflow for seed-based correlation and independent component analysis in interventional resting-state fMRI studies. Neuroscience Research. 165, 26-37 (2021).
- Broadwater, M. A., et al. Adolescent alcohol exposure decreases frontostriatal resting-state functional connectivity in adulthood. Addiction Biology. 23 (2), 810-823 (2018).
- Jaime, S., Cavazos, J. E., Yang, Y., Lu, H. Longitudinal observations using simultaneous fMRI, multiple channel electrophysiology recording, and chemical microiontophoresis in the rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 306, 68-76 (2018).
