Summary
Questo protocollo descrive un metodo per ottenere dati stabili di risonanza magnetica funzionale (rs-fMRI) allo stato di riposo da un ratto utilizzando isoflurano a basso dosaggio in combinazione con dexmedetomidina a basso dosaggio.
Abstract
La risonanza magnetica funzionale allo stato di riposo (rs-fMRI) è diventata un metodo sempre più popolare per studiare la funzione cerebrale in uno stato di riposo, non di attività. Questo protocollo descrive un metodo di sopravvivenza preclinica per ottenere dati rs-fMRI. La combinazione di isoflurano a basso dosaggio con infusione continua dell'agonista del recettore adrenergico α2 dexmedetomidina fornisce un'opzione robusta per un'acquisizione dati stabile e di alta qualità preservando la funzione della rete cerebrale. Inoltre, questa procedura consente la respirazione spontanea e la fisiologia quasi normale nel ratto. Ulteriori sequenze di imaging possono essere combinate con l'acquisizione dello stato di riposo creando protocolli sperimentali con stabilità anestetica fino a 5 ore utilizzando questo metodo. Questo protocollo descrive la configurazione delle apparecchiature, il monitoraggio della fisiologia del ratto durante quattro fasi distinte dell'anestesia, l'acquisizione di scansioni dello stato di riposo, la valutazione della qualità dei dati, il recupero dell'animale e una breve discussione dell'analisi dei dati post-elaborazione. Questo protocollo può essere utilizzato in un'ampia varietà di modelli di roditori preclinici per aiutare a rivelare i cambiamenti della rete cerebrale risultanti che si verificano a riposo.
Introduction
La risonanza magnetica funzionale allo stato di riposo (rs-fMRI) è una misura del segnale dipendente dal livello di ossigeno nel sangue (BOLD) quando il cervello è a riposo e non impegnato in alcun compito particolare. Questi segnali possono essere utilizzati per misurare le correlazioni tra le regioni del cervello per determinare la connettività funzionale all'interno delle reti neurali. rs-fMRI è ampiamente utilizzato negli studi clinici a causa della sua non invasività e della bassa quantità di sforzo richiesto ai pazienti (rispetto alla fMRI basata su attività) che lo rende ottimale per diverse popolazioni dipazienti 1.
I progressi tecnologici hanno permesso di adattare rs-fMRI per l'uso in modelli di roditori per scoprire i meccanismi alla base degli stati di malattia (vedi riferimento2 per la revisione). I modelli animali preclinici, compresi i modelli di malattia o knockout, consentono una vasta gamma di manipolazioni sperimentali non applicabili nell'uomo e gli studi possono anche utilizzare campioni post-mortem per migliorare ulteriormente gli esperimenti2. Tuttavia, a causa della difficoltà sia nel limitare il movimento che nel mitigare lo stress, l'acquisizione della risonanza magnetica nei roditori viene tradizionalmente eseguita in anestesia. Gli agenti anestetici, a seconda della loro farmacocinetica, farmacodinamica e bersagli molecolari, influenzano il flusso sanguigno cerebrale, il metabolismo cerebrale e potenzialmente influenzano le vie di accoppiamento neurovascolare.
Ci sono stati numerosi sforzi per sviluppare protocolli anestetici che preservino l'accoppiamento neurovascolare e la funzione della retecerebrale3,4,5,6,7,8. In precedenza abbiamo riportato un regime anestetico che applicava una bassa dose di isoflurano insieme a una bassa dose dell'agonista del recettore adrenergico α2 dexmedetomidina9. I ratti con questo metodo di anestesia hanno mostrato robuste risposte BOLD alla stimolazione dei baffi in regioni coerenti con le vie di proiezione stabilite (nuclei talamici ventrolaterali e ventromediali, corteccia somatosensoriale primaria e secondaria); sono state rilevate in modo coerente anche reti cerebrali a riposo su larga scala, tra cui la rete in modalità predefinita10,11 e la rete di salienza12. Inoltre, questo protocollo anestetico consente l'imaging ripetuto sullo stesso animale, che è importante per monitorare longitudinalmente la progressione della malattia e l'effetto delle manipolazioni sperimentali.
Nel presente studio, descriviamo in dettaglio la configurazione sperimentale, la preparazione degli animali e le procedure di monitoraggio fisiologico coinvolte. In particolare, descriviamo le fasi anestetiche specifiche e l'acquisizione delle scansioni durante ogni fase. La qualità dei dati viene valutata dopo ogni scansione a riposo. Nella discussione è incluso anche un breve riepilogo dell'analisi post-scansione. I laboratori interessati a scoprire il potenziale dell'uso di rs-fMRI nei ratti troveranno utile questo protocollo.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti su uno scanner MRI 9.4 T e sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee del Dartmouth College. È stata ottenuta un'ulteriore approvazione per registrare e mostrare gli animali utilizzati nel video e nelle figure seguenti.
1. Preparazioni prima della scansione
- Linea di infusione sottocutanea
- Rimuovere parzialmente un ago da 23 G dalla confezione in modo che la punta dell'ago rimanga sterile.
- Tenere saldamente il mozzo dell'ago e utilizzare una lama di rasoio per segnare l'albero dell'ago dove incontra il mozzo.
- Bloccare un portaaghi attorno all'albero direttamente sotto il punteggio e rompere delicatamente l'albero dal mozzo.
- Inserire 1/3 dell'albero dell'ago (estremità smussata) nella linea PE50 precedentemente sterilizzata con una lunghezza della linea sufficiente per estendersi dalla pompa del farmaco all'animale all'interno del foro del magnete.
- Diluizione di dexmedetomidina e atipamezolo
- Preparare una soluzione di dexmedetomidina cloridrato diluito utilizzando 0,5 mL di 0,5 mg/mL di brodo miscelato con 9,5 mL di soluzione salina sterile in un flacone di vetro trasparente e sterile (concentrazione diluita = 0,025 mg/mL).
- Preparare una soluzione di atipamezolo diluito utilizzando 0,1 mL di brodo da 5 mg/mL miscelato con 9,9 mL di soluzione salina sterile in un flacone di vetro trasparente e sterile (concentrazione diluita = 0,05 mg/mL).
- Parametri di scansione
- Utilizzare i parametri presentati nella Tabella 1 per preparare le sequenze di scansione.
2. Anestesia di fase 1: induzione e preparazione animale
- Apparecchio
- Assicurarsi che tutte le apparecchiature siano accese e funzionino correttamente, compresi il miscelatore di ossigeno e aria, la piastra riscaldante e il sistema di scavenging attivo (vedere figura 1).
- Impostare il set point di temperatura dell'impianto di riscaldamento su 37,5 °C.
- Induzione animale
- Posizionare l'animale (ratto Sprague Dawley maschio di 90 giorni) nella camera di induzione e indurre l'anestesia con il 2,5% di isoflurano nel 30% di aria arricchita di ossigeno.
NOTA: è possibile utilizzare una vasta gamma di età degli animali ed entrambi i sessi. - Una volta che l'animale è anestetizzato, rimuoverlo dalla camera, pesare l'animale e posizionarlo nel cono del naso (al 2,5% di isoflurano) sulla piastra riscaldante nello spazio di preparazione.
- Posizionare l'animale (ratto Sprague Dawley maschio di 90 giorni) nella camera di induzione e indurre l'anestesia con il 2,5% di isoflurano nel 30% di aria arricchita di ossigeno.
- Preparazione animale
- Applicare un unguento lubrificante oftalmico su ciascun occhio per evitare l'essiccazione.
- Confermare la profondità dell'anestesia con una mancanza di risposta al pizzico della dita.
- Usa i clipper per radere un'area quadrata di 2 "per 2" sulla regione lombare inferiore della schiena dell'animale (cioè direttamente sopra la coda).
- Somministrare 0,015 mg/kg di soluzione di dexmedetomidina con un'iniezione intraperitoneale (p.i.) (ad esempio, un ratto da 300 g riceverebbe 0,18 ml) nel quadrante inferiore destro dell'addome utilizzando un ago da 25 G.
- Commutare il flusso di isoflurano dallo spazio di preparazione alla culla dell'animale.
- Sposta l'animale nella culla dell'animale. Posizionare saldamente i denti anteriori del topo sopra e nella barra del morso. Spingere il cono del naso sopra il naso per garantire una vestibilità aderente.
NOTA: Se il cono del naso non copre la mascella inferiore, utilizzare un film di paraffina per tenere delicatamente la mascella chiusa mentre si sigilla anche intorno al cono del naso. - Posizionare il pad respiratorio sotto l'addome del ratto sotto la gabbia toracica e ricodizionarlo fino a quando la forma d'onda della respirazione mostra una depressione profonda centrata su ciascun respiro (vedere la forma d'onda della respirazione nella Figura 2).
- Monitorare la respirazione dell'animale utilizzando il software di monitoraggio della fisiologia. Passare alla fase successiva dell'anestesia quando la respirazione è inferiore a 40 respiri/ min (bpm; circa 5 minuti dopo l'iniezione di dexmedetomidina).
3. Anestesia di fase 2: configurazione animale
- Inserire le barre auricolari nel condotto uditivo per stabilizzare la testa del ratto nella culla dell'animale. Una volta posizionato, tirare in avanti sulla barra del morso e confermare che la testa non si muova. Regolare di riconseguire il cono del naso e il film di paraffina secondo necessità (vedere Figura 3a).
- Inserire la sonda di temperatura in un coperchio della sonda monouso prelubrificato. Inserire delicatamente la sonda di temperatura di circa 1/2 "nel retto e fissarla alla base della coda con nastro adesivo medico.
- Posizionare la clip del pulsossimetro sull'area metatarsale del piede posteriore, assicurandosi che la fonte di luce si trova sul fondo del piede (palmo).
NOTA: la rotazione della clip può influire sul segnale; quindi, la creazione di un supporto per mantenere la zampa e la clip in posizione verticale porterà a una maggiore stabilità. Si noti inoltre che fino a quando il ratto non è a temperatura corporea normale, la saturazione di ossigeno può essere bassa (<95%). - Utilizzare il peso del ratto per calcolare la velocità di infusione per espellere 0,015 mg/kg/h di dexmedetomidina (un ratto da 300 g riceve 0,18 ml/h).
- Impostare la pompa del farmaco per espellere la velocità di infusione calcolata.
- Riempire una siringa da 3 ml con la soluzione sterile e diluita di dexmedetomidina e inserire la punta dell'ago nell'estremità aperta della linea di infusione sterilizzata (che si estende dalla pompa del farmaco alla culla animale con l'ago sottocutaneo precedentemente attaccato). Riempire la linea e fissare la siringa nel supporto della siringa della pompa del farmaco.
- Spostare il blocco pusher in avanti fino a quando non tocca lo stantuffo e il farmaco viene espulso dall'ago, assicurandosi che la linea di infusione sia completamente piena.
- Usando una salvietta icool, pulire l'area rasata per rimuovere eventuali peli randagi.
- Pizzicare la pelle di circa due dita sopra la base della coda. Inserire 1/3 dell'ago della linea di infusione nella pelle tendata.
- Fissare l'ago alla pelle con un pezzo da 3 "di nastro medico largo. Posizionare un secondo pezzo di nastro medico largo sopra il primo, attraverso il ratto, e attaccato a entrambi i lati della culla dell'animale (vedere Figura 4).
NOTA: È di fondamentale importanza che l'ago ferromagnetico sia ben fissato per impedire il movimento durante la scansione. - Iniziare l'infusione di dexmedetomidina sottocutanea.
- Posiziona un pezzo di garza sul ponte del naso del ratto per creare una superficie piana per la bobina. Utilizzare nastro di carta, che non interferisce con il segnale MRI, per fissare la bobina alla testa del ratto, centrandola sul cervello (vedere Figura 3b,c).
- Fissare tutte le linee e i cavi all'interno della culla animale con nastro da laboratorio e verificare se tutti i segnali fisiologici sono stabili (vedere Figura 2).
- Posiziona gli asciugamani di carta sopra l'animale, fissandoli alla culla dell'animale con del nastro da laboratorio. Se si utilizza un sistema di riscaldamento ad aria, avvolgere un foglio di plastica attorno all'intera culla per contenere l'aria calda.
- Sposta l'animale nel foro e sintonizza il magnete.
4. Anestesia di fase 3: acquisizione della scansione anatomica
- Ridurre l'isoflurano all'1,5%, con conseguente aumento costante della respirazione a circa 45-50 bpm. Rimanere a questo livello per tutta la durata della scansione anatomica.
- Utilizzare la scansione del localizzatore FLASH per assicurarsi che il cervello sia allineato con l'isocentro del magnete (Figura 5a). Riposizionare l'animale e ripetere se necessario.
- Eseguire la scansione del localizzatore RARE ad alta risoluzione e utilizzare questo output di scansione per allineare 15 fette sagittali centrate sul cervello (da sinistra a destra, Figura 5b).
- Usando la fetta sagittale centrale, allineare la fetta assiale centrale alla decussazione della commessura anteriore, che appare come una macchia scura (Figura 5c). Prendete nota dell'offset della sezione da utilizzare in un secondo momento nelle scansioni dello stato di riposo.
- Acquisisci 23 fette utilizzando i protocolli assiali FLASH e RARE per aiutare nella registrazione in uno spazio comune durante l'analisi post-scansione.
- Shim attraverso tutto il cervello usando la sequenza PRESS.
5. Fase 4: acquisizione della scansione dello stato di riposo
- Dopo aver completato le scansioni anatomiche, ridurre l'isoflurano allo 0,5% allo 0,75%, regolando in modo che la respirazione dell'animale sia di 60-65 respiri al minuto. Rimanere a questo livello per almeno 10 minuti prima di iniziare la scansione dello stato di riposo per garantire la stabilità.
- Quando la fisiologia è stabile (l'intervallo respiratorio è di 60-75 bpm senza ansimare o irregolarità, la temperatura corporea interna è di 37,5 ± 1,0 ° C e la saturazione di ossigeno è del 95% o superiore), acquisire una scansione EPI a 15 fette utilizzando la stessa fetta offset della serie assiale anatomica.
- Al termine di ogni scansione dello stato di riposo, controllare la qualità utilizzando un'analisi dei componenti indipendente (ICA) per scomporre i dati in componenti spaziali e temporali.
- Ottenere almeno tre scansioni dello stato di riposo di alta qualità.
6. Recupero post-scansione
- Al termine della scansione, aumentare l'isoflurano al 2% e interrompere l'infusione sottocutanea di dexmedetomidina.
- Rimuovere la culla dell'animale dal foro del magnete, scartare l'animale e rimuovere le barre auricolari, la sonda di temperatura, la clip del pulsossimetro e l'ago dexmedetomidina.
- Iniettare 0,015 mg/kg della soluzione diluita di atipamezolo nel muscolo della zampa posteriore del ratto usando una siringa da 1 mL con un ago da 25 G (cioè, un ratto da 300 g riceverebbe 0,09 ml).
- Rimettete il topo nella gabbia di casa sopra una piastra riscaldante e monitorate fino a quando l'animale non è deambulante.
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Representative Results
Dopo ogni scansione dello stato di riposo, la stabilità viene valutata utilizzando un'analisi dei componenti indipendente (ICA; script di esempio incluso in File supplementari). Nella Figura 6 sono illustrati esempi di output di componenti da scansioni a stato di riposo. La Figura 6a mostra un componente di segnale da una scansione con elevata stabilità. Si noti che spazialmente, il componente ha un'elevata regionalità. All'interno del corso temporale al di sotto della componente spaziale, il segnale è stabile e non prevedibile, indicativo della vera attività cerebrale. Lo spettro di potenza nella parte inferiore mostra prevalentemente basse frequenze. La Figura 6b mostra un componente della stessa scansione della Figura 6a che rappresenta il rumore. Si noti la non regionalità nella componente spaziale, il corso temporale ad alta frequenza e il picco ad alta frequenza nello spettro di potenza. Infine, la Figura 6c mostra un componente di una scansione con anestesia instabile. Il corso del tempo è variabile e irregolare. Quando ciò accade, sono necessari miglioramenti al protocollo anestetico, comunemente alla sigillatura del cono del naso e allo scavenging dei gas di scarico.
Figura 1: Spazio di preparazione e culla per animali MRI. a) Spazio di preparazione. Il vuoto elimina i gas di scarico sia dalla camera di induzione che dal cono del naso nella culla dell'animale. La piastra riscaldante aiuta a mantenere la temperatura dell'animale sia durante la Fase 1 che durante il recupero. b) Culla per animali MRI. La parte superiore indica i componenti della configurazione animale nella Fase 2. La parte inferiore mostra un ratto completamente impostato e pronto per la scansione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Output della scansione fisiologica. La saturazione di ossigeno (PulseOx, 96%), la frequenza cardiaca (325 BPM [battiti al minuto]), la frequenza respiratoria (61 respiri/min) e la temperatura corporea interna (T1, 37,5 °C) sono costantemente monitorate durante tutta la sessione di scansione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Posizionamento del cono del naso e della bobina. a)Vista ravvicinata del cono del naso sigillato attorno al naso e alla mascella inferiore dell'animale. b)Vista dall'alto dell'allineamento della bobina di superficie al cervello. c)Vista laterale dell'allineamento della bobina con il punto medio dell'occhio dell'animale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Linea di infusione sottocutanea di dexmedetomidina e posizionamento dell'ago. (a) Inserimento dell'ago nella regione lombare inferiore della schiena dell'animale. b)Nastro adesivo che fissa l'ago alla pelle dell'animale. c)Nastro adesivo attraverso la culla animale per impedire il movimento dell'ago ferromagnetico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Allineamento della scansione anatomica. (a) Scansione localizzatore per allineare il cervello dell'animale all'isocentro del magnete, notata con il mirino. (b)Fette sagittali allineate attraverso il cervello da sinistra a destra. c)Allineamento alla decussazione della commessura anteriore, indicato dalla freccia bianca. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Valutazione della qualità mediante analisi indipendente dei componenti. (a) Componente di segnale durante l'anestesia costante. b)Componente acustica durante l'anestesia costante. c)Anestesia instabile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Scannerizzare | Sequenza | Orientamento | FOV (mm x mm) | Matrice | Fette | Spessore fetta (mm) | TE (ms) | TR (ms) | Medie | Spaziatura eco (ms) | Fattore raro | Ripetizioni | Tempo di scansione |
| Localizzatore | FLASH | Tutti gli aerei | 50 | 256 | 1/dir | 1 | 2.5 | 100 | 1 | 1 | 12,8 s | ||
| Localizzatore | RARO | Tutti gli aerei | 35 | 192 | 1/dir | 0.75 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 min |
| Anat | RARO | Sagittale | 35 | 192 | 15 | 1 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 min |
| Anat | FLASH | Assiale | 35 | 192 | 23 | 1 | 5 | 250 | 2 | 1 | 1 min 36 s | ||
| Anat | RARO | Assiale | 35 | 192 | 23 | 1 | 28 | 2500 | 4 | 7 | 8 | 1 | 4 minuti |
| Shim | PASSEGGIATA | Tutti gli aerei | 16.223 | 2500 | 1 | 1 | 2,5 s | ||||||
| Stato di riposo | EPI | Assiale | 35 | 64 | 15 | 1 | 15 | 1200 | 1 | 300 | 6 min ciascuno |
Tabella 1: Tabella di riferimento dei parametri di scansione. Parametri per le sequenze delineate nel protocollo. FLASH = Fast Low Angle Shot, RARE = Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement, PRESS = Point RESolved Spectroscopy, EPI = Echo Planar Imaging.
File supplementari: Script di esempio per la valutazione della qualità ICA. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
La stabilità dell'animale, sia fisicamente che fisiologicamente, è la chiave per ottenere dati di alta qualità sullo stato di riposo. Questo protocollo raggiunge la stabilità muovendosi attraverso quattro fasi distinte di anestesia. È imperativo che l'animale abbia raggiunto le soglie fisiologiche impostate prima di passare alla fase successiva dell'anestesia; poiché questo metodo si basa su meccanismi autoregolatori fisiologici, i singoli animali possono richiedere quantità di tempo leggermente diverse in ogni fase dell'anestesia. È nostra esperienza che prendere più tempo in ogni fase è più efficiente che affrettarsi attraverso le fasi precedenti senza dare alla fisiologia del ratto il tempo sufficiente per stabilirsi. I componenti chiave che consentono la stabilità sono l'adattamento del cono del naso e il corretto spurgo dei gas di scarico.
Un cono nasale adeguatamente sigillato e lo scavenging consentono all'animale di rimanere stabile con una respirazione regolarmente distanziata e livelli di saturazione di ossigeno costanti. Se si verificano ansimanti, spaziatura irregolare, trattenimento del respiro o diminuzione dei livelli di saturazione di ossigeno, si dovrebbe lavorare per migliorare la sigillatura e lo scavenging del cono del naso. Il cono del naso dovrebbe adattarsi da vicino ma non dovrebbe spingere nel ponte del naso. Potrebbe essere necessario fabbricare un cono nasale personalizzato. Il cono nasale originale del nostro produttore aveva una valvola di uscita dell'aria troppo piccola, quindi un tubo del falco era dotato di una linea di vuoto sigillata più grande più vicina all'animale. Ciò ha comportato una migliore clearance della CO2 scaduta e una saturazione costante di ossigeno. Come accennato nel protocollo, il film di paraffina può essere avvolto attorno alla mascella inferiore e al bordo del cono del naso, ma se avvolto troppo strettamente, può limitare la respirazione e portare all'instabilità. Inoltre, il posizionamento improprio delle barre auricolari e della barra del morso non solo influisce sulla stabilità necessaria della testa per l'imaging, ma può anche influenzare la respirazione; il continuo lampeggiamento o il rumore udibile dell'animale è una probabile indicazione di un posizionamento improprio della barra delle orecchie. I denti anteriori dovrebbero sedersi saldamente sulla barra del morso ed essere tirati in avanti dopo il posizionamento della barra dell'orecchio per garantire una vestibilità aderente. La lingua del ratto potrebbe aver bisogno di essere tirata in avanti se si trova troppo indietro nella bocca e limita la corretta respirazione.
Poiché ogni sistema è unico, è necessaria la messa a punto del livello di vuoto per ottenere uno scavenging ottimale. Come guida pratica, dovrebbe essere possibile sentire una piccola quantità di aspirazione posizionando un dito sopra l'apertura della linea del vuoto all'interno del cono del naso o sigillando l'intera apertura del cono del naso con il palmo. La portata corrispondente per l'ingresso dell'anestesia (qui sono stati utilizzati 0,8 L / min) è un buon punto di partenza. La saturazione di ossigeno nell'animale dovrebbe rimanere superiore al 95% durante la scansione. Se la saturazione di ossigeno mostra una tendenza decrescente, questa può essere un'indicazione che la CO2 si sta accumulando nel cono del naso e lo scavenging deve essere aumentato. Un'altra possibilità è che la pressione della clip del pulsossimetro sul piede debba essere regolata, allentata per migliorare il flusso sanguigno o serrata per garantire un segnale forte e stabile. Se la respirazione dell'animale è superiore alle soglie delineate, ciò potrebbe indicare che lo scavenging è impostato troppo in alto e sta rimuovendo troppo isoflurano. In rare circostanze, potrebbe essere necessario aumentare la dose di dexmedetomidina sottocutanea a 0,02 mg / kg / ora, ma abbiamo scoperto che 0,015 mg / kg ha funzionato bene in una vasta gamma di età dei ratti ed entrambi i sessi ed è supportato in studi farmacologici4.
La durata della scansione necessaria per l'attivazione della fMRI è una funzione della dimensione dell'effetto, del rapporto segnale-rumore spaziale (SNR) e dell'SNR temporale, come mostrato in precedenza da Murphy et al.13. L'uso di una piccola bobina superficiale (2 cm) e di un alto campo magnetico (9,4 T) migliora notevolmente la sensibilità SNR e BOLD. Con la nostra configurazione di imaging, abbiamo scoperto che una singola scansione di 6 minuti è sufficiente per rilevare una robusta rete di connettività funzionale a stato di riposo, in linea con il nostro precedente rapporto10. Tuttavia, in genere ripetiamo la scansione da 3 a 4 volte e facciamo la media dei risultati per ricavare reti cerebrali funzionali per i singoli animali. In alternativa, è possibile eseguire la scansione di una singola volta con una durata maggiore (10 minuti o più) per derivare reti di connettività funzionale14.
Dopo aver raccolto rs-fMRI di alta qualità utilizzando questo protocollo, pre-elaborare i dati come è stato precedentemente pubblicato15,16. Con l'uso di entrambe le barre auricolari e una barra del morso, gli artefatti di movimento nel corso del tempo fMRI sono minimi e l'uso della correzione del movimento non ha avuto un effetto notevole sui nostri dati. Le singole scansioni EPI in stato di riposo devono essere spogliate del cranio e registrate in uno spazio comune (usiamo un singolo cervello di ratto rappresentativo)16,17. Rimuovi i volumi iniziali da ogni EPI in modo che quelli inclusi siano tutti acquisiti quando il magnete è allo stato stazionario (rimuoviamo 5 punti temporali). Scansione individuale denoise (vedere Risultati rappresentativi per esempi di componenti di segnale e rumore). Applicare la correzione della temporizzazione delle sezioni, nonché la rimozione delle tendenze lineari e quadratiche, il filtraggio passabanda (0,005-0,1 Hz) e la levigatura spaziale (0,6 mm FWHM [larghezza completa a metà massimo]). Inoltre, rimuovere il corso medio del tempo del segnale dalla sostanza bianca e dai ventricoli attraverso la regressione lineare. Dopo queste fasi standard di pre-elaborazione, è possibile eseguire ulteriori analisi a livello di gruppo, tra cui la connettività funzionale basata su seme11,15,18, 19,20, 21,22,le analisi dei componenti indipendenti10,20,22e le analisi di modularità12,19.
Ci sono due vantaggi principali del protocollo attuale: 1) consente l'attività cerebrale spontanea; e 2) mantiene l'animale a una fisiologia quasi normale. Metodi anestetici alternativi (come propofol21, α-cloralosio15e bromuro di pancuronio in combinazione con un altro anestetico21,23) sono stati utilizzati anche per acquisire dati sullo stato di riposo. Tuttavia, l'uso di una combinazione di isoflurano a basso dosaggio con dexmedetomidina a basso dosaggio, come descritto in questo protocollo, ha dimostrato di interrompere solo minimamente le funzioni della rete cerebrale, fornendo allo stesso tempo la stabilità fisiologica necessaria per ottenere dati di connettività funzionale dello stato di riposo di qualità9,10,18,24. Inoltre, le risposte BOLD dalla stimolazione somatosensoriale9 e dalla deflessione meccanica dei baffi11 possono essere viste a o dopo un periodo di 90 minuti quando si utilizza questo protocollo, suggerendo un livello di eccitazione coerente. È interessante notare che l'uso di dexmedetomidina in isolamento può suscitare attività epilettica; tuttavia, questa attività è stata abolita con isoflurano8integrato . Un altro vantaggio del protocollo attuale è che elimina la necessità di ventilazione artificiale. Sebbene la ventilazione meccanica possa portare a una gamma più ristretta di anidride carbonica parziale e saturazione di ossigeno tra gli animali, negli studi longitudinali, il mantenimento di parametri fisiologici senza la necessità di intubazione può comportare meno complicazioni ed effetti collaterali indesiderati.
L'interesse per la fMRI a riposo è cresciuto considerevolmente negli ultimi 10 anni e con esso la necessità di acquisire scansioni precliniche di alta qualità dello stato di riposo dai roditori. Questo protocollo di sopravvivenza raggiunge un'anestesia stabile fino a 5 ore con fisiologia quasi normale durante l'acquisizione dello stato di riposo. Poiché il protocollo è altamente stabile, è possibile aggiungere facilmente sequenze aggiuntive (strutturali, di stimolazione, di risonanza magnetica farmacologica, ecc.) per ottenere il progetto sperimentale desiderato. La combinazione di isoflurano a basso dosaggio con dexmedetomidina utilizzata in questo protocollo consente un'ampia varietà di studi preclinici per i ricercatori interessati a studiare il cervello del roditore nel suo stato di riposo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti del National Institute of Health (NIH) del National Institute on Drug Abuse (NIDA) [DJW, EDKS ed EMB sono stati supportati dalla sovvenzione R21DA044501 assegnata ad Alan I. Green e DJW sono stati supportati da Grant T32DA037202 ad Alan J. Budney] e dal National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIAAA) [Grant F31AA028413 a Emily D. K. Sullivan]. Un ulteriore supporto è stato fornito attraverso il fondo di alan I. Green come Raymond Sobel Professor of Psychiatry a Dartmouth.
Hanbing Lu è supportato dal National Institute on Drug Abuse Intramural Research Program, NIH.
Gli autori desiderano riconoscere e ringraziare il compianto Alan I. Green. La sua incrollabile dedizione al campo dei disturbi concomitanti ha contribuito a stabilire la collaborazione tra gli autori. Lo ringraziamo per il suo tutoraggio e la sua guida, che ci mancherà molto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9.4T MRI | Varian/Bruker | Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software | |
| Air-Oxygen Mixer | Sechrist | Model 3500CP-G | |
| Analysis of Functional NeuroImages (AFNI) | NIMH/NIH | Version AFNI_18.3.03 | Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/ |
| Animal Cradle | RAPID Biomedical | LHRXGS-00563 | rat holder with bite bar, nose cone and ear bars |
| Animal Physiology Monitoring & Gating System | SAII | Model 1025 | MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on |
| Antisedan (atipamezole hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-867-7097 | Zoetis, Manufacturer Item #10000449 |
| Ceramic MRI-Safe Scissors | MRIequip.com | MT-6003 | |
| Clippers | Patterson Veterinary | 07-882-1032 | Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201 |
| Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-893-1801 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10 |
| Digital Rectal Thermometer Covers | Medline | MDS9608 | |
| FMRIB Software Library | FMRIB | MELODIC Version 3.15 | Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki |
| Heating Pad | Cara Inc. | Model 50 | |
| Hemostat forceps, straight | Kent Scientific | INS750451-2 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06 |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip Inc. | 911103 | |
| Lab Tape, 3/4" | VWR International | 89097-990 | |
| Needles, 23 gauge | BD | 305145 | plastic hub removed |
| Parafilm Laboratory Film | Patterson Veterinary | 07-893-0260 | Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A |
| Planar Surface Coil | Bruker | T12609 | 2cm |
| Polyethylene Tubing | Braintree Scientific | PE50 50FT | 0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter) |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38 |
| Sprague Dawley Rats | Charles River | 400 SAS SD | |
| Sterile 0.9% Saline Solution | Patterson Veterinary | 07-892-4348 | Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186 |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Medline | MDS090735 | |
| Surgical Tape, 1" (3M Durapore) | Medline | MMM15381Z | 3M Healthcare, "wide medical tape" |
| Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore) | Medline | MMM15300 | 3M Healthcare |
| Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle | BD | 309626 | |
| Syringes, 3 mL | BD | 309657 | |
| Vented induction and scavenging system | VetEquip Inc. | 942102 | 2 liter induction chamber with active scavenging |
| 411724 | omega flowmeter | ||
| 931600 | scavenging cube, "vacuum" | ||
| 921616 | nose cone, non-rebreathing |
References
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