Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å oppnå stabile hviletilstand funksjonelle magnetiske resonansavbildningsdata (rs-fMRI) fra en rotte ved hjelp av lavdose isofluran i kombinasjon med lavdose deksmedetomidin.
Abstract
Resting-state funksjonell magnetisk resonansavbildning (rs-fMRI) har blitt en stadig mer populær metode for å studere hjernefunksjon i hvilende, ikke-oppgavetilstand. Denne protokollen beskriver en preklinisk overlevelsesmetode for å hente rs-fMRI-data. Kombinere isofluran med lav dose med kontinuerlig infusjon av α2 adrenerge reseptoragonist deksmedetomidin gir et robust alternativ for stabil datainnsamling av høy kvalitet samtidig som hjernenettverksfunksjonen bevares. Videre tillater denne prosedyren spontan pust og nesten normal fysiologi hos rotten. Ytterligere bildesekvenser kan kombineres med resting-state-anskaffelse som skaper eksperimentelle protokoller med bedøvelsesstabilitet på opptil 5 timer ved hjelp av denne metoden. Denne protokollen beskriver oppsett av utstyr, overvåking av rottefysiologi i fire forskjellige faser av anestesi, oppkjøp av hviletilstandsskanninger, kvalitetsvurdering av data, gjenoppretting av dyret og en kort diskusjon av etterbehandling av dataanalyse. Denne protokollen kan brukes på tvers av et bredt utvalg av prekliniske gnagermodeller for å bidra til å avsløre de resulterende hjernenettverksendringene som oppstår i ro.
Introduction
Resting-state funksjonell magnetisk resonansavbildning (rs-fMRI) er et mål på det blod-oksygen-nivå-avhengige (BOLD) signalet når hjernen er i ro og ikke engasjert i noen bestemt oppgave. Disse signalene kan brukes til å måle sammenhenger mellom hjerneregioner for å bestemme den funksjonelle tilkoblingen i nevrale nettverk. rs-fMRI er mye brukt i kliniske studier på grunn av sin ikke-invasivitet og den lave innsatsen som kreves av pasienter (sammenlignet med oppgavebasert fMRI) noe som gjør den optimal for ulike pasientpopulasjoner1.
Teknologiske fremskritt har gjort det mulig å tilpasse rs-fMRI til bruk i gnagermodeller for å avdekke mekanismer som ligger til grunn for sykdomstilstander (se referanse2 for gjennomgang). Prekliniske dyremodeller, inkludert sykdoms- eller knockout-modeller, tillater et bredt spekter av eksperimentelle manipulasjoner som ikke gjelder hos mennesker, og studier kan også benytte seg av post-mortem prøver for å forbedre eksperimenter2ytterligere . Likevel, på grunn av vanskeligheten med både å begrense bevegelse og redusere stress, utføres MR-oppkjøp hos gnagere tradisjonelt under anestesi. Bedøvelsesmidler, avhengig av deres farmakokinetikk, farmakodynamikk og molekylære mål, påvirker hjernens blodstrøm, hjernemetabolisme og potensielt påvirker nevrovaskulære koblingsveier.
Det har vært mange anstrengelser for å utvikle bedøvelsesprotokoller som bevarer nevrovaskulær kobling og hjernenettverksfunksjon3,4,5,6,7,8. Vi har tidligere rapportert et bedøvelsesregime som anvendte en lav dose isofluran sammen med en lav dose av α2 adrenerge reseptoragonist deksmedetomidin9. Rotter under denne anestesimetoden viste robuste BOLD-responser på whiskerstimulering i regioner som er i samsvar med etablerte projeksjonsveier (ventrolaterale og ventromedial thalamic kjerner, primære og sekundære somatosensoriske cortex); store hjernenettverk for hviletilstand, inkludert standardmodusnettverket10,11 og salience-nettverk12, har også blitt konsekvent oppdaget. Videre tillater denne bedøvelsesprotokollen gjentatt avbildning på samme dyr, noe som er viktig for å overvåke sykdomsprogresjonen og effekten av eksperimentelle manipulasjoner langsgående.
I den nåværende studien beskriver vi det eksperimentelle oppsettet, dyreforberedelsene og fysiologiske overvåkingsprosedyrer som er involvert. Spesielt beskriver vi de spesifikke bedøvelsesfasene og anskaffelsen av skanninger i hver fase. Datakvaliteten vurderes etter hver skanning i hviletilstanden. En kort oppsummering av analysen etter skanning er også inkludert i diskusjonen. Laboratorier som er interessert i å avdekke potensialet for å bruke rs-fMRI hos rotter, vil finne denne protokollen nyttig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført på en 9.4 T MR-skanner, og ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Dartmouth College. Ytterligere godkjenning ble innhentet for å registrere og vise dyrene som brukes i videoen og tallene nedenfor.
1. Forberedelser før skanning
- Subkutan infusjonslinje
- Fjern delvis en 23 G nål fra pakken slik at nålepunktet forblir sterilt.
- Hold nålen godt fast og bruk et barberblad til å score nåleakselen der den møter navet.
- Klem en nåleholder rundt akselen rett under skåringen og bryt akselen forsiktig fra navet.
- Sett inn 1/3 av nåleakselen (stump ende) i tidligere sterilisert PE50-linje med nok linjelengde til å strekke seg fra legemiddelpumpen til dyret inne i magnetboringen.
- Fortynning av deksmedetomidin og atipamezol
- Forbered en løsning av fortynnet deksmedetomidinhydroklorid ved hjelp av 0,5 ml 0,5 mg/ml lager blandet med 9,5 ml steril saltvann i en klar, steril glassflaske (fortynnet konsentrasjon = 0,025 mg/ml).
- Forbered en løsning av fortynnet atipamezol ved hjelp av 0,1 ml 5 mg/ ml lager blandet med 9,9 ml steril saltvann i en klar, steril glassflaske (fortynnet konsentrasjon = 0,05 mg / ml).
- Skanneparametere
- Bruk parameterne som presenteres i tabell 1, til å klargjøre skannesekvenser.
2. Fase 1 anestesi: Dyreinduksjon og forberedelse
- Installasjonsprogrammet
- Kontroller at alt utstyr er på og fungerer som det skal, inkludert oksygen- og luftblanderen, varmeputen og det aktive scavenging-systemet (se figur 1).
- Sett varmesystemets temperaturinnstillingspunkt til 37,5 °C.
- Dyr induksjon
- Plasser dyret (90-dagers gammel, mannlig Sprague Dawley rotte) i induksjonskammeret og induser anestesi med 2,5% isofluran i 30% oksygenberiket luft.
MERK: Et bredt spekter av dyrealder og begge kjønn kan brukes. - Når dyret er bedøvet, fjern det fra kammeret, vei dyret og legg det i nesekjeglen (ved 2,5% isofluran) på varmeputen i forberedelsesrommet.
- Plasser dyret (90-dagers gammel, mannlig Sprague Dawley rotte) i induksjonskammeret og induser anestesi med 2,5% isofluran i 30% oksygenberiket luft.
- Dyreforberedelse
- Påfør oftalmisk smøresalve på hvert øye for å forhindre tørking.
- Bekreft dybden av anestesi ved mangel på tåklemmerespons.
- Bruk clippers til å barbere et 2" x 2 " firkantet område på den nedre lumbale delen av dyrets rygg (dvs. rett over halen).
- Administrer 0,015 mg/kg av deksmedetomidinoppløsningen med en intraperitoneal (dvs.) injeksjon (f.eks. en 300 g rotte ville få 0,18 ml) i nedre høyre kvadrant i magen ved hjelp av en 25 G nål.
- Bytt isofluranstrøm fra forberedelsesrommet til dyre vuggen.
- Flytt dyret inn i dyre vuggen. Plasser rottens fortenner sikkert over og inn i bitebaren. Skyv nesekjeglen over nesen for å sikre en tett passform.
MERK: Hvis nesekjeglen ikke dekker underkjeven, bruk en parafinfilm for å holde kjeven forsiktig lukket mens du også forsegler rundt nesekjeglen. - Plasser åndedrettsputen under rottens underliv under ribbeburet og plasser den på nytt til respirasjonsbølgeformen viser et dypt trough sentrert på hvert pust (se respirasjonsbølgeform i figur 2).
- Overvåk dyrets pust ved hjelp av fysiologiovervåkingsprogramvaren. Gå til neste fase av anestesi når respirasjonen er mindre enn 40 pust/min (bpm; ca. 5 min etter deksmedetomidininjeksjon).
3. Fase 2 anestesi: Dyreoppsett
- Sett ørestenger inn i ørekanalen for å stabilisere rottens hode i dyre vuggen. Når den er plassert, trekk fremover på bitebaren og bekreft at hodet ikke beveger seg. Juster nesekjeglen og parafinfilmen etter behov (se figur 3a).
- Sett temperatursonden inn i et forhåndssmurt probedeksel til engangsbruk. Sett forsiktig temperatursonden ca. 1/2" inn i endetarmen, og tape den til bunnen av halen med medisinsk tape.
- Plasser pulsoksymeterklemmen på metatarsalområdet på bakfoten, og sørg for at lyskilden er på bunnen av foten (håndflaten).
MERK: Rotasjon av klipsen kan påvirke signalet; Dermed vil det å lage en holder for å holde poten og klipsen oppreist føre til større stabilitet. Vær også oppmerksom på at til rotten er ved normal kroppstemperatur, kan oksygenmetningen være lav (<95%). - Bruk rottens vekt til å beregne infusjonshastigheten for å løse ut 0,015 mg/kg/t deksmedetomidin (en 300 g rotte får 0,18 ml/t).
- Sett legemiddelpumpen til å løse ut den beregnede infusjonshastigheten.
- Fyll en 3 ml sprøyte med den sterile, fortynnede deksmedetomidinoppløsningen og sett nålens spiss inn i den åpne enden av den steriliserte infusjonslinjen (som strekker seg fra legemiddelpumpen til dyreholderen med den subkutane nålen som tidligere var festet). Fyll linjen og fest sprøyten i sprøyteholderen på legemiddelpumpen.
- Beveg skyveblokken fremover til den berører stempelet, og stoffet blir utvist ved nålen, og sørg for at infusjonslinjen er helt fylt.
- Bruk en alkoholserviett til å rengjøre det barberte området for å fjerne eventuelt bortkommen hår.
- Klyp huden omtrent to fingerbredder over halen. Sett 1/3 av infusjonslinjenålen inn i telthuden.
- Fest nålen til huden med et 3" stykke bredt medisinsk tape. Legg et annet stykke bredt medisinsk tape over det første, over rotten, og festet til begge sider av dyre vuggen (se figur 4).
MERK: Det er kritisk viktig at den ferromagnetiske nålen er godt festet for å forhindre bevegelse under skanningen. - Begynn infusjonen av subkutan deksmedetomidin.
- Plasser et stykke gasbind på broen av rottens nese for å skape en jevn overflate for spolen. Bruk papirbånd, som ikke forstyrrer MR-signalet, for å feste spolen til rottens hode, sentrere den over hjernen (se figur 3b,c).
- Sikre alle linjer og kabler i dyreholderen med laboratoriebånd og kontroller om alle fysiologisignalene er stabile (se figur 2).
- Legg papirhåndklær over dyret, sikre dem til dyre vuggen med laboratoriebånd. Hvis du bruker et luftvarmesystem, pakk et plastark rundt hele vuggen for å inneholde den varme luften.
- Flytt dyret inn i boringen og still magneten.
4. Fase 3 anestesi: Anatomisk skanning oppkjøp
- Reduser isofluran til 1,5%, noe som resulterer i en jevn økning i åndedrett til ca 45-50 bpm. Forbli på dette nivået så lenge den anatomiske skanningen varer.
- Bruk FLASH-lokaliseringsskanningen for å sikre at hjernen er på linje med magnetisosenteret (figur 5a). Omplasser dyret og gjenta om nødvendig.
- Kjør den sjeldne lokaliseringsskanningen med høyere oppløsning, og bruk denne skanneutgangen til å justere 15 sagittale skiver sentrert over hjernen (venstre mot høyre, figur 5b).
- Bruk det midterste skytten til å justere den midterste aksialskiven etter decussation av den fremre kommissuren, som vises som et mørkt sted (Figur 5c). Legg merke til stykkeforskyvningen som skal brukes senere i skanningen av hviletilstanden.
- Skaff deg 23 skiver ved hjelp av både FLASH- og RARE-aksiale protokoller for å hjelpe til med registrering til et felles rom under etterskanningsanalysen.
- Shim over hele hjernen ved hjelp av PRESS-sekvensen.
5. Fase 4: Henting av resting-state-skanning
- Etter å ha fullført anatomiske skanninger, reduser isofluran til 0,5% til 0,75%, og juster slik at dyrets åndedrett er 60-65 pust per minutt. Hold deg på dette nivået i minst 10 minutter før du begynner å skanne hviletilstand for å sikre stabilitet.
- Når fysiologien er stabil (åndedrettsområdet er 60-75 bpm uten gisping eller uregelmessigheter, er kroppstemperaturen 37,5 ± 1,0 °C, og oksygenmetningen er 95 % eller høyere), anskaffe en 15-skiver EPI-skanning ved hjelp av samme skiveforskyvning som den anatomiske aksialserien.
- Når hver hviletilstandsskanning er fullført, kontrollerer du kvaliteten ved hjelp av en uavhengig komponentanalyse (ICA) for å dekomponere dataene i romlige og tidsmessige komponenter.
- Få minst tre skanninger av hviletilstand av høy kvalitet.
6. Gjenoppretting etter skanning
- Når skanningen er fullført, øk isofluranen til 2% og stopp den subkutane deksmedetomidininfusjonen.
- Fjern dyreholderen fra magnetboringen, pakk ut dyret, og fjern ørestenger, temperatursonde, pulsoksymeterklemme og deksmedetomidinnålen.
- Injiser 0,015 mg/kg av den fortynnede atipamezoloppløsningen i rottens bakbensmuskel ved hjelp av en 1 ml sprøyte med en 25 G nål (dvs. en 300 g rotte ville få 0,09 ml).
- Plasser rotten tilbake i hjemmeburet på toppen av en varmepute og overvåk til dyret er ambulerende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter hver skanning i hviletilstand vurderes stabilitet ved hjelp av en uavhengig komponentanalyse (ICA, eksempelskript inkludert i tilleggsfiler). Figur 6 viser eksempler på komponentutganger fra hviletilstandsskanninger. Figur 6a viser en signalkomponent fra en skanning med høy stabilitet. Vær oppmerksom på at komponenten har høy regionalitet. Innenfor tidsforløpet under den romlige komponenten er signalet stabilt og ikke forutsigbart, noe som indikerer sann hjerneaktivitet. Kraftspekteret nederst viser overveiende lave frekvenser. Figur 6b viser en komponent fra samme skanning som figur 6a som representerer støy. Legg merke til ikke-regionaliteten i den romlige komponenten, høyfrekvent tidsforløp og høyfrekvent topp i kraftspekteret. Til slutt viser figur 6c en komponent fra en skanning med ustabil anestesi. Tidsforløpet er variabelt og uregelmessig. Når dette skjer, er det nødvendig med forbedringer i bedøvelsesprotokollen, vanligvis til forsegling av nesekjeglen og scavenging av avfallsgasser.
Figur 1: Forberedelsesrom og MR-dyre vugge. a) Forberedelsesrom. Vakuumet scavenges avfallsgasser fra både induksjonskammeret og nesekjeglen på dyre vuggen. Varmeputen bidrar til å opprettholde dyretemperaturen under både fase 1 og utvinning. b) MR dyr vugge. Toppen indikerer komponenter i dyreoppsettet i fase 2. Bunnen viser en rotte fullt oppsett og klar for skanning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fysisk skanneutgang. Oksygenmetning (PulseOx, 96 %), hjertefrekvens (325 BPM [slag per minutt]), åndedrettsfrekvens (61 pust/min) og kroppstemperatur (T1, 37,5 °C) overvåkes kontinuerlig gjennom hele skanneøkten. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Plassering av nesekjegle og spole. (a) Nærbilde av nesekjeglen forseglet rundt dyrets nese og underkjeve. (b) Overhead visning av justering av overflatespole til hjernen. (c) Sidevisning av spolejustering med midtpunktet i dyrets øye. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Subkutan deksmedetomidininfusjonslinje og nålplassering. (a) Nålinnsetting i nedre lumbalområde på dyrets rygg. (b) Tape som fester nålen til dyrets hud. (c) Tape over dyreholderen for å forhindre bevegelse av den ferromagnetiske nålen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Anatomisk skannejustering. (a) Lokaliseringsskanning for å justere dyrets hjerne til magnetisosenteret, notert med trådkors. (b) Sagittal skiver justert over hjernen fra venstre til høyre. (c) Justering til decussation av fremre kommissær, angitt av den hvite pilen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Kvalitetsvurdering ved hjelp av uavhengig komponentanalyse. (a) Signalkomponent under stabil anestesi. (b) Støykomponent under jevn anestesi. (c) Ustabil anestesi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Skanne | Sekvens | Orientering | FOV (mm x mm) | Matrise | Skiver | Skivetykkelse (mm) | TE (ms) | TR (ms) | Gjennomsnitt | Avstand mellom ekko (ms) | Sjelden faktor | Gjentakelser | Skannetid |
| Lokalisering | BLINKE | Alle fly | 50 | 256 | 1/dir | 1 | 2.5 | 100 | 1 | 1 | 12,8 s | ||
| Lokalisering | SJELDEN | Alle fly | 35 | 192 | 1/dir | 0.75 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 min |
| Anat | SJELDEN | Skytten | 35 | 192 | 15 | 1 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 min |
| Anat | BLINKE | Aksial | 35 | 192 | 23 | 1 | 5 | 250 | 2 | 1 | 1 min 36 s | ||
| Anat | SJELDEN | Aksial | 35 | 192 | 23 | 1 | 28 | 2500 | 4 | 7 | 8 | 1 | 4 min |
| Shim | PRESSE | Alle fly | 16.223 | 2500 | 1 | 1 | 2,5 s | ||||||
| Hviletilstand | EPI | Aksial | 35 | 64 | 15 | 1 | 15 | 1200 | 1 | 300 | 6 min hver |
Tabell 1: Referansetabell for skanneparametere. Parametere for sekvensene som er beskrevet i protokollen. FLASH = Raskt skudd i lav vinkel, SJELDNE = Rask oppkjøp med avslapningsforbedring, PRESS = Point RESolved Spectroscopy, EPI = Echo Planar Imaging.
Tilleggsfiler: Eksempelskript for ICA-kvalitetsvurdering. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dyrets stabilitet, både fysisk og fysiologisk, er nøkkelen til å skaffe hviletilstandsdata av høy kvalitet. Denne protokollen oppnår stabilitet ved å bevege seg gjennom fire forskjellige faser av anestesi. Det er viktig at dyret har møtt de angitte fysiologiske tersklene før du går til neste fase av anestesi; siden denne metoden er avhengig av fysiologiske autoregulatoriske mekanismer, kan individuelle dyr kreve litt forskjellige mengder tid i hver anestesifase. Det er vår erfaring at det å ta mer tid i hver fase er mer effektivt enn å skynde seg gjennom tidligere stadier uten å gi rottens fysiologi tilstrekkelig tid til å bosette seg. Nøkkelkomponentene som tillater stabilitet er passformen til nesekjeglen og riktig avfallsgassoppfanging.
En riktig forseglet nesekjegle og scavenging gjør at dyret kan forbli stabilt med regelmessig spredt pust og stabile oksygenmetningsnivåer. Hvis det oppstår gisping, uregelmessig avstand, holde pusten eller redusere oksygenmetningsnivået, bør man arbeide for å forbedre nesekjeglen og scavenging. Nesekjeglen skal passe tett, men bør ikke skyve inn i nesebroen. En tilpasset nesekegle må kanskje fremstilles. Den originale nesekjeglen fra produsenten vår hadde en luftuttaksventil som var for liten, så et falkerør ble utstyrt med en større forseglet vakuumlinje nærmere dyret. Dette resulterte i bedre clearance av utgått CO2 og jevn oksygenmetning. Som nevnt i protokollen, kan parafinfilm pakkes rundt underkjeven og kanten av nesekjeglen, men hvis den pakkes for tett, kan den begrense pusten og føre til ustabilitet. I tillegg påvirker feil plassering av ørestenger og bitebar ikke bare den nødvendige stabiliteten til hodet for avbildning, men kan også påvirke pusten; fortsatt blinkende eller hørbar støy fra dyret er en sannsynlig indikasjon på feil plassering av ørestangen. De fremre tennene skal sitte sikkert på bitebaren og trekkes fremover etter plassering av ørestangen for å sikre en tett passform. Rottens tunge må kanskje trekkes fremover hvis den sitter for langt tilbake i munnen og begrenser riktig pust.
Siden hvert system er unikt, er det nødvendig å finjustere vakuumnivået for å oppnå optimal scavenging. Som en praktisk guide bør det være mulig å føle en liten mengde sug enten ved å plassere en finger over vakuumlinjeåpningen inne i nesekjeglen, eller ved å forsegle hele nesekjegleåpningen med håndflaten. Samsvarende strømningshastighet for anestesiinngang (0,8 l/min ble brukt her) er et godt utgangspunkt. Oksygenmetning i dyret skal forbli over 95% gjennom hele skanningen. Hvis oksygenmetning viser en avtagende trend, kan dette være en indikasjon på at CO2 bygger seg opp i nesekjeglen og scavenging må økes. En annen mulighet er at trykket på pulsoksymeterklemmen på foten må justeres, enten løsnes for å forbedre blodstrømmen eller strammes for å sikre et sterkt, stabilt signal. Hvis åndedrett av dyret er høyere enn tersklene som er skissert, kan dette tyde på at scavenging er satt for høyt og fjerner for mye isofluran. I sjeldne tilfeller kan det være nødvendig å øke dosen av subkutan deksmedetomidin til 0,02 mg/kg/t, men vi har funnet ut at 0,015 mg/kg har fungert godt over et bredt spekter av rottealder og begge kjønn, og støttes i farmakologiske studier4.
Skannevarigheten som er nødvendig for fMRI-aktivering er en funksjon av effektstørrelse, romlig signal-til-støy-forhold (SNR) og temporal SNR, som vist tidligere av Murphy et al.13. Bruken av en liten overflatespole (2 cm) og et høyt magnetfelt (9,4 T) forbedrer SNR og BOLD-følsomheten betydelig. Med bildeoppsettet vårt har vi funnet ut at en enkelt skanning på 6 minutter er tilstrekkelig til å oppdage et robust funksjonsnettverk for hviletilstand, i samsvar med vår forrige rapport10. Likevel gjentar vi vanligvis skanningen 3 til 4 ganger, og gjennomsnittlig resultatene for å utlede funksjonelle hjernenettverk for individuelle dyr. Alternativt kan man skanne en enkelt gang med lengre varighet (10 minutter eller mer) for å utlede funksjonelle tilkoblingsnettverk14.
Når du har samlet inn rs-fMRI av høy kvalitet ved hjelp av denne protokollen, forhåndsbehandler du dataene slik de tidligere er publisert15,16. Ved bruk av både ørestenger og en bitebar er bevegelsesartefakter i fMRI-tidsforløpet minimale, og bruken av bevegelseskorrigering har ikke hatt en merkbar effekt på dataene våre. Individuelle EPI-skanninger i hviletilstand må være hodeskalle-strippet og registrert på et felles rom (vi bruker en enkelt representativ rottehjerne)16,17. Fjern startvolumene fra hver EPI slik at de inkluderte er alle anskaffet når magneten er i steady-state (vi fjerner 5 tidspunkter). Denoise individuelle skanninger (se Representative Results for eksempler på signal- og støykomponenter). Bruk korrigering av stykketid, samt lineær og kvadratisk trendfjerning, båndpassfiltrering (0,005-0,1 Hz) og romlig utjevning (0,6 mm FWHM [full bredde ved halv maksimum]). I tillegg fjerner du gjennomsnittlig signaltidskurs fra det hvite stoffet og ventriklene gjennom lineær regresjon. Etter disse standard trinnene for forhåndsbehandling kan ytterligere gruppenivåanalyse utføres, inkludert frøbasert funksjonell tilkobling11,15,18,19,20,21,22, uavhengige komponentanalyser10,20,22og modularitetsanalyser12,19.
Det er to hovedfordeler ved den nåværende protokollen: 1) det tillater spontan hjerneaktivitet; og 2) det holder dyret på nesten normal fysiologi. Alternative bedøvelsesmetoder (for eksempel propofol21, α-kloralose15og pancuroniumbromid i kombinasjon med en annen bedøvelse21,23) har også blitt brukt til å skaffe hviletilstandsdata. Bruk av en kombinasjon av lavdose isofluran med lavdose deksmedetomidin, som beskrevet i denne protokollen, har imidlertid vist seg å bare forstyrre hjernenettverksfunksjonene minimalt, samtidig som den gir den fysiologiske stabiliteten som trengs for å oppnå funksjonelle tilkoblingsdata for hviletilstand av høy kvalitet9,10,18,24. Videre kan BOLD-responser fra somatosensorisk stimulering9 og mekanisk whisker-avbøyning11 ses på eller etter en periode på 90 minutter når du bruker denne protokollen, noe som tyder på et konsistent opphisselsesnivå. Interessant, ved hjelp av deksmedetomidin isolert kan fremkalle epileptisk aktivitet; Denne aktiviteten ble imidlertid avskaffet med supplert isofluran8. En annen fordel med den nåværende protokollen er at den eliminerer behovet for kunstig ventilasjon. Selv om mekanisk ventilasjon kan føre til et smalere utvalg av delvis karbondioksid og oksygenmetning på tvers av dyr, i langsgående studier, kan opprettholde fysiologiske parametere uten behov for intubasjon føre til færre komplikasjoner og uønskede bivirkninger.
Interessen for hvile-stat fMRI har vokst betydelig de siste 10 årene, og med det et behov for å skaffe seg prekliniske hviletilstandsskanninger av høy kvalitet fra gnagere. Denne overlevelsesprotokollen oppnår stabil anestesi i opptil 5 timer med nesten normal fysiologi under oppkjøp av hviletilstand. Siden protokollen er svært stabil, kan ytterligere sekvenser (strukturell, stimulering, farmakologisk MR, etc.) enkelt legges til for å oppnå ønsket eksperimentell design. Kombinasjonen av lavdose isofluran med deksmedetomidin som brukes i denne protokollen tillater et bredt utvalg av prekliniske studier for etterforskere som er interessert i å studere gnagerhjernen i hviletilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av midler fra National Institute of Health (NIH)s National Institute on Drug Abuse (NIDA) [DJW, EDKS, og EMB ble støttet av Grant R21DA044501 tildelt Alan I. Green og DJW ble støttet av Grant T32DA037202 til Alan J. Budney] og National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIAAA) [Grant F31AA028413 til Emily D. K. Sullivan]. Ytterligere støtte ble gitt gjennom Alan I. Greens begavede fond som Raymond Sobel Professor of Psychiatry i Dartmouth.
Hanbing Lu støttes av National Institute on Drug Abuse Intramural Research Program, NIH.
Forfatterne ønsker å anerkjenne og takke avdøde Alan I. Green. Hans urokkelige dedikasjon til feltet samtidige lidelser bidro til å etablere samarbeid mellom forfatterne. Vi takker ham for hans mentorskap og veiledning, som vil bli sterkt savnet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9.4T MRI | Varian/Bruker | Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software | |
| Air-Oxygen Mixer | Sechrist | Model 3500CP-G | |
| Analysis of Functional NeuroImages (AFNI) | NIMH/NIH | Version AFNI_18.3.03 | Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/ |
| Animal Cradle | RAPID Biomedical | LHRXGS-00563 | rat holder with bite bar, nose cone and ear bars |
| Animal Physiology Monitoring & Gating System | SAII | Model 1025 | MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on |
| Antisedan (atipamezole hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-867-7097 | Zoetis, Manufacturer Item #10000449 |
| Ceramic MRI-Safe Scissors | MRIequip.com | MT-6003 | |
| Clippers | Patterson Veterinary | 07-882-1032 | Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201 |
| Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-893-1801 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10 |
| Digital Rectal Thermometer Covers | Medline | MDS9608 | |
| FMRIB Software Library | FMRIB | MELODIC Version 3.15 | Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki |
| Heating Pad | Cara Inc. | Model 50 | |
| Hemostat forceps, straight | Kent Scientific | INS750451-2 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06 |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip Inc. | 911103 | |
| Lab Tape, 3/4" | VWR International | 89097-990 | |
| Needles, 23 gauge | BD | 305145 | plastic hub removed |
| Parafilm Laboratory Film | Patterson Veterinary | 07-893-0260 | Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A |
| Planar Surface Coil | Bruker | T12609 | 2cm |
| Polyethylene Tubing | Braintree Scientific | PE50 50FT | 0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter) |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38 |
| Sprague Dawley Rats | Charles River | 400 SAS SD | |
| Sterile 0.9% Saline Solution | Patterson Veterinary | 07-892-4348 | Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186 |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Medline | MDS090735 | |
| Surgical Tape, 1" (3M Durapore) | Medline | MMM15381Z | 3M Healthcare, "wide medical tape" |
| Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore) | Medline | MMM15300 | 3M Healthcare |
| Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle | BD | 309626 | |
| Syringes, 3 mL | BD | 309657 | |
| Vented induction and scavenging system | VetEquip Inc. | 942102 | 2 liter induction chamber with active scavenging |
| 411724 | omega flowmeter | ||
| 931600 | scavenging cube, "vacuum" | ||
| 921616 | nose cone, non-rebreathing |
References
- Smitha, K. A., et al. Resting state fMRI: A review on methods in resting state connectivity analysis and resting state networks. The Neuroradiology Journal. 30 (4), 305-317 (2017).
- Gorges, M., et al. Functional connectivity mapping in the animal model: Principles and applications of resting-state fMRI. Frontiers in Neurology. 8, (2017).
- Paasonen, J., Stenroos, P., Salo, R. A., Kiviniemi, V., Gröhn, O. Functional connectivity under six anesthesia protocols and the awake condition in rat brain. NeuroImage. 172, 9-20 (2018).
- Pawela, C. P., et al. A protocol for use of medetomidine anesthesia in rats for extended studies using task-induced BOLD contrast and resting-state functional connectivity. NeuroImage. 46 (4), 1137-1147 (2009).
- Jonckers, E., et al. Different anesthesia regimes modulate the functional connectivity outcome in mice. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (4), 1103-1112 (2014).
- Williams, K. A., et al. Comparison of alpha-chloralose, medetomidine and isoflurane anesthesia for functional connectivity mapping in the rat. Magnetic Resonance Imaging. 28 (7), 995-1003 (2010).
- Zhurakovskaya, E., et al. Global functional connectivity differences between sleep-like states in urethane anesthetized rats measured by fMRI. PloS One. 11 (5), 0155343 (2016).
- Fukuda, M., Vazquez, A. L., Zong, X., Kim, S. -G. Effects of the α2-adrenergic receptor agonist dexmedetomidine on neural, vascular and BOLD fMRI responses in the somatosensory cortex. The European Journal of Neuroscience. 37 (1), 80-95 (2013).
- Brynildsen, J. K., et al. Physiological characterization of a robust survival rodent fMRI method. Magnetic Resonance Imaging. 35, 54-60 (2017).
- Lu, H., et al. Rat brains also have a default mode network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3979-3984 (2012).
- Lu, H., et al. Low- but not high-frequency LFP correlates with spontaneous BOLD fluctuations in rat whisker barrel cortex. Cerebral Cortex. 26 (2), 683-694 (2016).
- Tsai, P. -J., et al. Converging structural and functional evidence for a rat salience network. Biological Psychiatry. 88 (11), 867-878 (2020).
- Murphy, K., Bodurka, J., Bandettini, P. A. How long to scan? The relationship between fMRI temporal signal to noise ratio and necessary scan duration. NeuroImage. 34 (2), 565-574 (2007).
- Birn, R. M., et al. The effect of scan length on the reliability of resting-state fMRI connectivity estimates. NeuroImage. 83, 550-558 (2013).
- Lu, H., et al. Synchronized delta oscillations correlate with the resting-state functional MRI signal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18265-18269 (2007).
- Lu, H., et al. Registering and analyzing rat fMRI data in the stereotaxic framework by exploiting intrinsic anatomical features. Magnetic Resonance Imaging. 28 (1), 146-152 (2010).
- Cox, R. W. AFNI: software for analysis and visualization of functional magnetic resonance neuroimages. Computers and Biomedical Research. 29 (3), 162-173 (1996).
- Ash, J. A., et al. Functional connectivity with the retrosplenial cortex predicts cognitive aging in rats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (43), 12286-12291 (2016).
- Hsu, L. -M., et al. Intrinsic insular-frontal networks predict future nicotine dependence severity. The Journal of Neuroscience. 39 (25), 5028-5037 (2019).
- Li, Q., et al. Resting-state functional MRI reveals altered brain connectivity and its correlation with motor dysfunction in a mouse model of Huntington's disease. Scientific Reports. 7, (2017).
- Lu, H., et al. Abstinence from cocaine and sucrose self-administration reveals altered mesocorticolimbic circuit connectivity by resting state MRI. Brain Connectivity. 4 (7), 499-510 (2014).
- Seewoo, B. J., Joos, A. C., Feindel, K. W. An analytical workflow for seed-based correlation and independent component analysis in interventional resting-state fMRI studies. Neuroscience Research. 165, 26-37 (2021).
- Broadwater, M. A., et al. Adolescent alcohol exposure decreases frontostriatal resting-state functional connectivity in adulthood. Addiction Biology. 23 (2), 810-823 (2018).
- Jaime, S., Cavazos, J. E., Yang, Y., Lu, H. Longitudinal observations using simultaneous fMRI, multiple channel electrophysiology recording, and chemical microiontophoresis in the rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 306, 68-76 (2018).
