Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Gewinnung stabiler Ruhezustandsdaten der funktionellen Magnetresonanztomographie (rs-fMRT) von einer Ratte, die niedrig dosiertes Isofluran in Kombination mit niedrig dosiertem Dexmedetomidin verwendet.
Abstract
Die funktionelle Magnetresonanztomographie im Ruhezustand (rs-fMRT) ist zu einer immer beliebteren Methode geworden, um die Gehirnfunktion in einem ruhenden, aufgabenfreien Zustand zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt eine präklinische Überlebensmethode zur Gewinnung von rs-fMRT-Daten. Die Kombination von niedrig dosiertem Isofluran mit kontinuierlicher Infusion des α2 adrenergen Rezeptoragonisten Dexmedetomidin bietet eine robuste Option für eine stabile, qualitativ hochwertige Datenerfassung bei gleichzeitiger Erhaltung der Gehirnnetzwerkfunktion. Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren eine spontane Atmung und eine nahezu normale Physiologie bei der Ratte. Zusätzliche Bildsequenzen können mit der Erfassung des Ruhezustands kombiniert werden, wodurch experimentelle Protokolle mit einer Anästhesiestabilität von bis zu 5 h mit dieser Methode erstellt werden. Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau der Ausrüstung, die Überwachung der Rattenphysiologie während vier verschiedener Phasen der Anästhesie, die Erfassung von Ruhezustandsscans, die Qualitätsbewertung der Daten, die Genesung des Tieres und eine kurze Erörterung der Datenanalyse nach der Verarbeitung. Dieses Protokoll kann für eine Vielzahl von präklinischen Nagetiermodellen verwendet werden, um die daraus resultierenden Veränderungen des Gehirnnetzwerks aufzudecken, die in Ruhe auftreten.
Introduction
Die funktionelle Magnetresonanztomographie im Ruhezustand (rs-fMRT) ist ein Maß für das Blut-Sauerstoff-Level-abhängige (BOLD) Signal, wenn das Gehirn in Ruhe ist und keiner bestimmten Aufgabe nachliegt. Diese Signale können verwendet werden, um Korrelationen zwischen Gehirnregionen zu messen, um die funktionelle Konnektivität innerhalb neuronaler Netze zu bestimmen. rs-fMRT wird in klinischen Studien aufgrund seiner Nicht-Invasivität und des geringen Aufwands der Patienten (im Vergleich zur aufgabenbasierten fMRT) häufig eingesetzt, was es für verschiedene Patientenpopulationen optimal macht1.
Technologische Fortschritte haben es ermöglicht, rs-fMRT für den Einsatz in Nagetiermodellen anzupassen, um Mechanismen aufzudecken, die krankheitsbedingten Zuständen zugrunde liegen (siehe Referenz2 für eine Überprüfung). Präklinische Tiermodelle, einschließlich Krankheits- oder Knockout-Modelle, ermöglichen eine breite Palette von experimentellen Manipulationen, die beim Menschen nicht anwendbar sind, und Studien können auch Post-Mortem-Proben verwenden, um die Experimente weiter zu verbessern2. Aufgrund der Schwierigkeit, sowohl die Bewegung einzuschränken als auch stresslindernd zu mildern, wird die MRT-Erfassung bei Nagetieren traditionell unter Narkose durchgeführt. Anästhetika beeinflussen abhängig von ihrer Pharmakokinetik, Pharmakodynamik und molekularen Zielen den Blutfluss des Gehirns, den Gehirnstoffwechsel und beeinflussen möglicherweise die neurovaskulären Kopplungswege.
Es gab zahlreiche Bemühungen, Anästhesieprotokolle zu entwickeln, die die neurovaskuläre Kopplung und die Gehirnnetzwerkfunktion3,4,5,6,7,8erhalten. Wir berichteten zuvor über ein Anästhesieregime, bei dem eine niedrige Dosis Isofluran zusammen mit einer niedrigen Dosis des α2 adrenergen Rezeptoragonisten Dexmedetomidin9angewendet wurde. Ratten unter dieser Anästhesiemethode zeigten robuste BOLD-Reaktionen auf die Whisker-Stimulation in Regionen, die mit etablierten Projektionswegen übereinstimmen (ventrolaterale und ventromediale thalamische Kerne, primärer und sekundärer somatosensorischer Kortex); Groß angelegte Ruhezustands-Gehirnnetzwerke, einschließlich des Standardmodusnetzwerks10,11 und des Salienznetzwerks12, wurden ebenfalls konsistent erkannt. Darüber hinaus ermöglicht dieses Anästhesieprotokoll eine wiederholte Bildgebung am selben Tier, was für die Überwachung des Krankheitsverlaufs und der Wirkung experimenteller Manipulationen in Längsschnitt wichtig ist.
In der vorliegenden Studie beschreiben wir den Versuchsaufbau, die Tiervorbereitung und die physiologischen Überwachungsverfahren. Insbesondere beschreiben wir die spezifischen Anästhesiephasen und die Erfassung von Scans während jeder Phase. Die Datenqualität wird nach jedem Ruhezustandsscan bewertet. Eine kurze Zusammenfassung der Post-Scan-Analyse ist ebenfalls in der Diskussion enthalten. Labore, die daran interessiert sind, das Potenzial der Verwendung von rs-fMRT bei Ratten aufzudecken, werden dieses Protokoll nützlich finden.
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Protocol
Alle Experimente wurden mit einem 9,4 T MRT-Scanner durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee am Dartmouth College genehmigt. Zusätzliche Genehmigungen wurden eingeholt, um die im Video und in den folgenden Abbildungen verwendeten Tiere aufzuzeichnen und zu zeigen.
1. Vorbereitungen vor dem Scannen
- Subkutane Infusionsleitung
- Entfernen Sie eine 23 G Nadel teilweise aus der Verpackung, damit die Nadelspitze steril bleibt.
- Halten Sie die Nabe der Nadel sicher und verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Nadelschaft dort zu treffen, wo er auf die Nabe trifft.
- Klemmen Sie einen Nadelhalter um die Welle direkt unter der Ausbeute und brechen Sie die Welle vorsichtig von der Nabe ab.
- Führen Sie 1/3 des Nadelschaftes (stumpfes Ende) in die zuvor sterilisierte PE50-Leitung mit genügend Leitungslänge ein, um sich von der Medikamentenpumpe bis zum Tier in der Magnetbohrung zu erstrecken.
- Verdünnung von Dexmedetomidin und Atipamezol
- Bereiten Sie eine Lösung von verdünntem Dexmedetomidinhydrochlorid mit 0,5 ml 0,5 mg / ml Brühe gemischt mit 9,5 ml steriler Kochsalzlösung in einer klaren, sterilen Glasflasche (verdünnte Konzentration = 0,025 mg / ml) vor.
- Bereiten Sie eine Lösung von verdünntem Atipamezol mit 0,1 ml 5 mg / ml Brühe gemischt mit 9,9 ml steriler Kochsalzlösung in einer klaren, sterilen Glasflasche vor (verdünnte Konzentration = 0,05 mg / ml).
- Scanparameter
- Verwenden Sie die in Tabelle 1 dargestellten Parameter, um Scansequenzen vorzubereiten.
2. Phase 1 Anästhesie: Tierische Induktion und Vorbereitung
- Einrichtung
- Stellen Sie sicher, dass alle Geräte eingeschaltet sind und ordnungsgemäß funktionieren, einschließlich Sauerstoff- und Luftmischer, Heizkissen und aktivem Aufraschsystem (siehe Abbildung 1).
- Stellen Sie den Temperatursennpunkt der Heizungsanlage auf 37,5 °C ein.
- Tierische Induktion
- Legen Sie das Tier (90 Tage alte, männliche Sprague Dawley-Ratte) in die Induktionskammer und induzieren Sie die Anästhesie mit 2,5% Isofluran in 30% sauerstoffangereicherter Luft.
HINWEIS: Eine breite Palette von Tieralter und beide Geschlechter können verwendet werden. - Sobald das Tier betäubt ist, entfernen Sie es aus der Kammer, wiegen Sie das Tier und legen Sie es in den Nasenkegel (bei 2,5% Isofluran) auf das Heizkissen im Vorbereitungsraum.
- Legen Sie das Tier (90 Tage alte, männliche Sprague Dawley-Ratte) in die Induktionskammer und induzieren Sie die Anästhesie mit 2,5% Isofluran in 30% sauerstoffangereicherter Luft.
- Tierische Vorbereitung
- Tragen Sie ophthalmische Schmiersalbe auf jedes Auge auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch einen Mangel an Zehenquetschreaktion.
- Verwenden Sie Clipper, um einen quadratischen Bereich von 2 "x 2" im unteren Lendenbereich des Rückens des Tieres (dh direkt über dem Schwanz) zu rasieren.
- Verabreichung von 0,015 mg/kg der Dexmedetomidinlösung mit einer intraperitonealen (i.p.) Injektion (z. B. würde eine 300 g-Ratte 0,18 ml erhalten) in den unteren rechten Quadranten des Abdomens mit einer 25-G-Nadel.
- Wechseln Sie den Isofluranfluss vom Vorbereitungsraum zur Tierwiege.
- Bewegen Sie das Tier in die Tierwiege. Legen Sie die Vorderzähne der Ratte sicher über und in die Bissstange. Drücken Sie den Nasenkegel über die Nase, um eine enge Passform zu gewährleisten.
HINWEIS: Wenn der Nasenkegel den Unterkiefer nicht bedeckt, verwenden Sie einen Paraffinfilm, um den Kiefer sanft geschlossen zu halten und gleichzeitig den Nasenkegel zu versiegeln. - Positionieren Sie das Atmungspad unter dem Bauch der Ratte unterhalb des Brustkorbs und positionieren Sie es neu, bis die Atmungswellenform einen tiefen Trog zeigt, der auf jedem Atemzug zentriert ist (siehe Atmungswellenform in Abbildung 2).
- Überwachen Sie die Atmung des Tieres mit der Physiologie-Überwachungssoftware. Wechseln Sie zur nächsten Phase der Anästhesie, wenn die Atmung weniger als 40 Atemzüge / min beträgt (bpm; ca. 5 min nach Dexmedetomidin-Injektion).
3. Phase 2 Anästhesie: Tieraufbau
- Setzen Sie Ohrbügel in den Gehörgang ein, um den Kopf der Ratte in der Tierwiege zu stabilisieren. Ziehen Sie nach der Positionierung an der Bissstange nach vorne und bestätigen Sie, dass sich der Kopf nicht bewegt. Stellen Sie den Nasenkegel und den Paraffinfilm nach Bedarf neu ein (siehe Abbildung 3a).
- Setzen Sie den Temperaturfühler in eine vorgeschmierte Einweg-Sondenabdeckung ein. Führen Sie den Temperaturfühler vorsichtig etwa 1/2 "in das Rektum ein und kleben Sie ihn mit medizinischem Klebeband an die Basis des Schwanzes.
- Legen Sie den Pulsoximeterclip auf den Mittelfußbereich des Hinterfußes und stellen Sie sicher, dass sich die Lichtquelle auf der Unterseite des Fußes (Handfläche) befindet.
HINWEIS: Die Drehung des Clips kann das Signal beeinflussen. Daher führt die Schaffung eines Halters, um die Pfote und den Clip aufrecht zu halten, zu einer größeren Stabilität. Beachten Sie auch, dass die Sauerstoffsättigung niedrig sein kann, bis die Ratte normale Körpertemperatur hat (<95%). - Verwenden Sie das Gewicht der Ratte, um die Infusionsrate zu berechnen, um 0,015 mg / kg / h Dexmedetomidin auszustoßen (eine 300 g-Ratte erhält 0,18 ml / h).
- Stellen Sie die Medikamentenpumpe so ein, dass die berechnete Infusionsrate ausgeworfen wird.
- Füllen Sie eine 3-ml-Spritze mit der sterilen, verdünnten Dexmedetomidinlösung und führen Sie die Nadelspitze in das offene Ende der sterilisierten Infusionsleitung ein (von der Arzneimittelpumpe bis zur Tierwiege mit zuvor angebrachter subkutaner Nadel). Füllen Sie die Leitung und befestigen Sie die Spritze im Spritzenhalter der Medikamentenpumpe.
- Bewegen Sie den Drückerblock nach vorne, bis er den Kolben berührt, und das Medikament wird an der Nadel ausgestoßen, um sicherzustellen, dass die Infusionsleitung vollständig gefüllt ist.
- Reinigen Sie den rasierten Bereich mit einem Alkoholtuch, um streunende Haare zu entfernen.
- Kneifen Sie die Haut etwa zwei Fingerbreiten über der Schwanzbasis. Führen Sie 1/3 der Infusionsliniennadel in die Zelthaut ein.
- Befestigen Sie die Nadel mit einem 3 "breiten Stück medizinischem Klebeband auf der Haut. Legen Sie ein zweites Stück breites medizinisches Klebeband über das erste, über die Ratte, und befestigen Sie es an beiden Seiten der Tierwiege (siehe Abbildung 4).
HINWEIS: Es ist von entscheidender Bedeutung, dass die ferromagnetische Nadel gut gesichert ist, um Bewegungen während des Scans zu verhindern. - Beginnen Sie mit der Infusion von subkutanem Dexmedetomidin.
- Legen Sie ein Stück Gaze auf den Nasenrücken der Ratte, um eine ebene Oberfläche für die Spule zu schaffen. Verwenden Sie Papierband, das das MRT-Signal nicht stört, um die Spule am Kopf der Ratte zu befestigen und über dem Gehirn zu zentrieren (siehe Abbildung 3b,c).
- Sichern Sie alle Leitungen und Kabel innerhalb der Tierwiege mit Laborband und prüfen Sie, ob alle physiologischen Signale stabil sind (siehe Abbildung 2).
- Legen Sie Papierhandtücher über das Tier und besichern Sie sie mit Laborband an der Tierwiege. Wenn Sie ein Luftheizungssystem verwenden, wickeln Sie eine Plastikfolie um die gesamte Wiege, um die warme Luft zu enthalten.
- Bewegen Sie das Tier in die Bohrung und stimmen Sie den Magneten ab.
4. Phase 3 Anästhesie: Anatomische Scan-Erfassung
- Reduzieren Sie Isofluran auf 1,5%, was zu einem stetigen Anstieg der Atmung auf etwa 45-50 bpm führt. Bleiben Sie für die Dauer des anatomischen Scannens auf diesem Niveau.
- Verwenden Sie den FLASH-Lokalisierungsscan, um sicherzustellen, dass das Gehirn mit dem Magnetisozentrum ausgerichtet ist (Abbildung 5a). Positionieren Sie das Tier neu und wiederholen Sie es bei Bedarf.
- Führen Sie den RARE-Lokalisierungsscan mit höherer Auflösung aus, und verwenden Sie diese Scanausgabe, um 15 sagittale Scheiben im Gehirn zentriert auszurichten (von links nach rechts, Abbildung 5b).
- Richten Sie die mittlere sagittale Scheibe mit der mittleren axialen Scheibe an der Deklusion der vorderen Kommissur aus, die als dunkler Fleck erscheint (Abbildung 5c). Notieren Sie sich den Slice-Offset, der später in den Ruhezustandsscans verwendet werden soll.
- Erfassen Sie 23 Slices mit dem axialen Flash- und RARE-Protokoll, um die Registrierung in einem gemeinsamen Raum während der Post-Scan-Analyse zu unterstützen.
- Shim über das gesamte Gehirn mit der PRESS-Sequenz.
5. Phase 4: Erfassung des Ruhezustandsscans
- Reduzieren Sie Isofluran nach Abschluss der anatomischen Scans auf 0,5% bis 0,75% und passen Sie sich so an, dass die Atmung des Tieres 60-65 Atemzüge pro Minute beträgt. Bleiben Sie mindestens 10 Minuten auf diesem Niveau, bevor Sie mit dem Scannen im Ruhezustand beginnen, um die Stabilität zu gewährleisten.
- Wenn die Physiologie stabil ist (der Atembereich beträgt 60-75 bpm ohne Keuchen oder Unregelmäßigkeiten, die Körperkerntemperatur beträgt 37,5 ± 1,0 °C und die Sauerstoffsättigung 95% oder mehr), erhalten Sie einen 15-Scheiben-EPI-Scan mit dem gleichen Slice-Offset wie die anatomische axiale Serie.
- Überprüfen Sie nach Abschluss jedes Ruhezustandsscans die Qualität mithilfe einer unabhängigen Komponentenanalyse (ICA), um die Daten in räumliche und zeitliche Komponenten zu zerlegen.
- Rufen Sie mindestens drei hochwertige Ruhezustandsscans ab.
6. Wiederherstellung nach dem Scan
- Wenn der Scanvorgang abgeschlossen ist, erhöhen Sie Isofluran auf 2% und stoppen Sie die subkutane Dexmedetomidin-Infusion.
- Entfernen Sie die Tierwiege aus der Magnetbohrung, wickeln Sie das Tier aus und entfernen Sie Ohrbügel, Temperaturfühler, Pulsoximeterclip und die Dexmedetomidinnadel.
- Injizieren Sie 0,015 mg/kg der verdünnten Atipamezollösung mit einer 1-ml-Spritze mit einer 25-g-Nadel in den Hinterbeinmuskel der Ratte (d. h. eine 300-g-Ratte würde 0,09 ml erhalten).
- Legen Sie die Ratte wieder in den Hauskäfig auf ein Heizkissen und überwachen Sie, bis das Tier ambulant ist.
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Representative Results
Nach jedem Ruhezustandsscan wird die Stabilität mithilfe einer unabhängigen Komponentenanalyse (ICA; Beispielskript in Supplementary Files enthalten)bewertet. Abbildung 6 zeigt Beispiele für Komponentenausgaben aus Ruhezustandsscans. Abbildung 6a zeigt eine Signalkomponente aus einem Scan mit hoher Stabilität. Beachten Sie, dass die Komponente räumlich eine hohe Regionalität auf hat. Innerhalb des Zeitverlaufs unterhalb der räumlichen Komponente ist das Signal stabil und nicht vorhersehbar, was auf eine echte Gehirnaktivität hinweist. Das Leistungsspektrum an der Unterseite zeigt überwiegend tiefe Frequenzen. Abbildung 6b zeigt eine Komponente aus demselben Scan wie Abbildung 6a, die Rauschen darstellt. Beachten Sie die Nichtregionalität in der räumlichen Komponente, den Hochfrequenzzeitverlauf und den Hochfrequenzpeak im Leistungsspektrum. Schließlich zeigt Abbildung 6c eine Komponente aus einem Scan mit instabiler Anästhesie. Der Zeitverlauf ist variabel und unregelmäßig. In diesem Fall sind Verbesserungen des Anästhesieprotokolls erforderlich, in der Regel bei der Versiegelung des Nasenkegels und der Abscheidung von Abgasen.
Abbildung 1: Vorbereitungsraum und MRT-Tierwiege. a) Vorbereitungsraum. Das Vakuum saugt Abgase sowohl aus der Induktionskammer als auch aus dem Nasenkegel an der Tierwiege ab. Das Heizkissen hilft, die Temperatur des Tieres sowohl während Phase 1 als auch während der Erholung aufrechtzuerhalten. b) MRT-Tierwiege. Die Oberseite zeigt Komponenten des Tieraufbaus in Phase 2 an. Die Unterseite zeigt eine Ratte, die vollständig eingerichtet und zum Scannen bereit ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2:Physiologische Scanausgabe. Sauerstoffsättigung (PulseOx, 96%), Herzfrequenz (325 BPM [Schläge pro Minute]), Atemfrequenz (61 Atemzüge/min) und Körperkerntemperatur (T1, 37,5 °C) werden während der gesamten Scansitzung ständig überwacht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Nasenkegel und Spulenplatzierung. a)Nahaufnahme des Nasenkegels, der um die Nase und den Unterkiefer des Tieres versiegelt ist. (b) Overhead-Ansicht der Ausrichtung der Oberflächenspule zum Gehirn. c)Seitenansicht der Spulenausrichtung mit dem Mittelpunkt des Auges des Tieres. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Subkutane Dexmedetomidin-Infusionsleitung und Nadelplatzierung. (a) Nadeleinführung in die untere Lendengegend des Rückens des Tieres. b)Klebeband, das die Nadel an der Haut des Tieres besichert. c)Klebeband über die Tierwiege, um eine Bewegung der ferromagnetischen Nadel zu verhindern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Anatomische Scanausrichtung. (a) Lokalisator-Scan, um das Gehirn des Tieres auf das Magnetisozentrum auszurichten, notiert mit Fadenkreuz. (b) Sagittale Scheiben, die von links nach rechts über das Gehirn ausgerichtet sind. c) Ausrichtung an die Entscheidung des vorderen Kommissariats, gekennzeichnet durch den weißen Pfeil. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Qualitätsbewertung mittels unabhängiger Komponentenanalyse. (a) Signalkomponente während der Daueranästhesie. (b) Lärmkomponente während der Daueranästhesie. (c) Instationäre Anästhesie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Abtasten | Reihenfolge | Orientierung | Sichtfeld (mm x mm) | Matrix | Scheiben | Schichtdicke (mm) | TE (ms) | TR (ms) | Durchschnitte | Echoabstand (ms) | Seltener Faktor | Wiederholungen | Scanzeit |
| Localizer | BLITZ | Alle Flugzeuge | 50 | 256 | 1/Dir | 1 | 2.5 | 100 | 1 | 1 | 12,8 s | ||
| Localizer | SELTEN | Alle Flugzeuge | 35 | 192 | 1/Dir | 0.75 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 Min. |
| Anat | SELTEN | Sagittal | 35 | 192 | 15 | 1 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 Min. |
| Anat | BLITZ | Axial | 35 | 192 | 23 | 1 | 5 | 250 | 2 | 1 | 1 Min. 36 s | ||
| Anat | SELTEN | Axial | 35 | 192 | 23 | 1 | 28 | 2500 | 4 | 7 | 8 | 1 | 4 Min. |
| Klemmstück | PRESSE | Alle Flugzeuge | 16.223 | 2500 | 1 | 1 | 2,5 s | ||||||
| Ruhezustand | EPI | Axial | 35 | 64 | 15 | 1 | 15 | 1200 | 1 | 300 | je 6 min |
Tabelle 1: Referenztabelle der Scanparameter. Parameter für die im Protokoll beschriebenen Sequenzen. FLASH = Fast Low Angle Shot, RARE = Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement, PRESS = Point RESolved Spectroscopy, EPI = Echo Planar Imaging.
Ergänzende Dateien: Beispielskript für die ICA-Qualitätsbewertung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Stabilität des Tieres, sowohl physisch als auch physiologisch, ist der Schlüssel, um qualitativ hochwertige Ruhezustandsdaten zu erhalten. Dieses Protokoll erreicht Stabilität, indem es vier verschiedene Phasen der Anästhesie durchgeht. Es ist unerlässlich, dass das Tier die festgelegten physiologischen Schwellenwerte erreicht hat, bevor es in die nächste Phase der Anästhesie übergeht. Da diese Methode auf physiologischen Autoregulationsmechanismen beruht, können einzelne Tiere in jeder Anästhesiephase leicht unterschiedliche Zeiträume benötigen. Es ist unsere Erfahrung, dass es effizienter ist, sich in jeder Phase mehr Zeit zu nehmen, als sich durch frühere Stadien zu beeilen, ohne der Physiologie der Ratte genügend Zeit zu geben, sich niederzulassen. Die Schlüsselkomponenten, die Stabilität ermöglichen, sind die Passform des Nasenkegels und die ordnungsgemäße Abgasreinigung.
Ein richtig versiegelter Nasenkegel und eine Aufräumarbeiten ermöglichen es dem Tier, mit regelmäßiger Atmung und gleichmäßiger Sauerstoffsättigung stabil zu bleiben. Wenn Keuchen, unregelmäßige Abstände, Atemnot oder abnehmende Sauerstoffsättigung auftreten, sollte man daran arbeiten, die Nasenkegelversiegelung und das Aufräumen zu verbessern. Der Nasenkegel sollte eng anliegen, aber nicht in den Nasenrücken drücken. Möglicherweise muss ein benutzerdefinierter Nasenkegel hergestellt werden. Der originale Nasenkegel unseres Herstellers hatte ein zu kleines Luftablassventil, so dass ein Falkenschlauch mit einer größeren versiegelten Vakuumleitung näher am Tier ausgestattet war. Dies führte zu einer besseren Clearance von abgelaufenem CO2 und einer stetigen Sauerstoffsättigung. Wie im Protokoll erwähnt, kann Paraffinfilm um den Unterkiefer und den Rand des Nasenkegels gewickelt werden, aber wenn er zu fest gewickelt ist, kann er die Atmung einschränken und zu Instabilität führen. Darüber hinaus beeinträchtigt eine unsachgemäße Platzierung von Ohrbügeln und Bissstangen nicht nur die notwendige Stabilität des Kopfes für die Bildgebung, sondern kann auch die Atmung beeinträchtigen. fortgesetztes Blinzeln oder hörbare Geräusche des Tieres sind ein wahrscheinlicher Hinweis auf eine unsachgemäße Platzierung der Ohrstange. Die Vorderzähne sollten sicher auf der Bissstange sitzen und nach der Platzierung der Ohrstange nach vorne gezogen werden, um eine enge Passform zu gewährleisten. Die Zunge der Ratte muss möglicherweise nach vorne gezogen werden, wenn sie zu weit hinten im Mund sitzt und die richtige Atmung einschränkt.
Da jedes System einzigartig ist, ist eine Feinabstimmung des Vakuumniveaus erforderlich, um eine optimale Aufrastung zu erreichen. Als praktischer Leitfaden sollte es möglich sein, eine kleine Menge an Saugkraft zu spüren, indem man entweder einen Finger über die Vakuumleitungsöffnung im Nasenkegel legt oder die gesamte Nasenkegelöffnung mit der Handfläche versiegelt. Die Passende Durchflussrate für den Anästhesieeingang (hier wurden 0,8 L/min verwendet) ist ein guter Ausgangspunkt. Die Sauerstoffsättigung im Tier sollte während des gesamten Scans über 95% bleiben. Zeigt die Sauerstoffsättigung einen abnehmenden Trend, kann dies ein Hinweis darauf sein, dass sich CO2 im Nasenkegel ansempft und die Aufrastung erhöht werden muss. Eine andere Möglichkeit ist, dass der Druck des Pulsoximeterclips am Fuß eingestellt, entweder gelockert wird, um die Durchblutung zu verbessern, oder gesträgt werden muss, um ein starkes, stabiles Signal zu gewährleisten. Wenn die Atmung des Tieres höher als die angegebenen Schwellenwerte ist, kann dies darauf hindeuten, dass das Aufräumen zu hoch eingestellt ist und zu viel Isofluran entfernt wird. In seltenen Fällen kann es notwendig sein, die Dosis von subkutanem Dexmedetomidin auf 0,02 mg / kg / h zu erhöhen, aber wir haben festgestellt, dass 0,015 mg / kg in einem breiten Spektrum von Rattenalter und beiden Geschlechtern gut funktioniert haben und in pharmakologischen Studien unterstützt werden4.
Die für die fMRT-Aktivierung erforderliche Scandauer ist eine Funktion der Effektgröße, des räumlichen Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) und des temporalen SNR, wie zuvor von Murphy et al.13gezeigt. Die Verwendung einer kleinen Oberflächenspule (2 cm) und eines hohen Magnetfeldes (9,4 T) erhöht die SNR- und BOLD-Empfindlichkeit erheblich. Mit unserem Imaging-Setup haben wir festgestellt, dass ein einziger 6-minütiger Scan ausreicht, um ein robustes funktionales Konnektivitätsnetzwerk im Ruhezustand zu erkennen, das mit unserem vorherigen Bericht10übereinstimmt. Dennoch wiederholen wir den Scan in der Regel 3 bis 4 Mal und durchschnittlich die Ergebnisse, um funktionelle Gehirnnetzwerke für einzelne Tiere abzuleiten. Alternativ kann man ein einzelnes Mal mit einer längeren Dauer (10 Minuten oder mehr) scannen, um funktionale Konnektivitätsnetzwerkeabzuleiten 14.
Nachdem Sie qualitativ hochwertige rs-fMRT mit diesem Protokoll gesammelt haben, verarbeiten Sie die Daten wie zuvor veröffentlicht15,16. Mit der Verwendung von Ohrbügeln und einer Bissstange sind Bewegungsartefakte im fMRT-Zeitverlauf minimal, und die Verwendung von Bewegungskorrektur hat sich nicht spürbar auf unsere Daten ausgewirkt. Individuelle EPI-Scans im Ruhezustand müssen schädelabstreift und in einem gemeinsamen Raum registriert werden (wir verwenden ein einzelnes repräsentatives Rattengehirn)16,17. Entfernen Sie die Anfangsvolumina von jedem EPI, damit die enthaltenen Volumen alle erfasst werden, wenn sich der Magnet im stationären Zustand befindet (wir entfernen 5 Zeitpunkte). Denoise einzelne Scans (siehe Repräsentative Ergebnisse für Beispiele von Signal- und Rauschkomponenten). Wenden Sie Slice-Timing-Korrektur sowie lineare und quadratische Trendentfernung, Bandpassfilterung (0,005-0,1 Hz) und räumliche Glättung (0,6 mm FWHM [volle Breite bei halbem Maximum]) an. Entfernen Sie zusätzlich den durchschnittlichen Signalzeitverlauf durch lineare Regression von der weißen Substanz und den Ventrikeln. Nach diesen Standard-Vorverarbeitungsschritten können weitere Analysen auf Gruppenebene durchgeführt werden, einschließlich der seedbasierten funktionalen Konnektivität11,15,18,19,20,21,22, unabhängige Komponentenanalysen10,20,22und Modularitätsanalysen12,19.
Es gibt zwei Hauptvorteile des aktuellen Protokolls: 1) Es ermöglicht spontane Gehirnaktivität; und 2) es hält das Tier auf einer nahezu normalen Physiologie. Alternative Anästhesiemethoden (wie Propofol21, α-Chloralose15und Pancuroniumbromid in Kombination mit einem anderen Anästhetikum21,23) wurden ebenfalls verwendet, um Ruhezustandsdaten zu erhalten. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Verwendung einer Kombination von niedrig dosiertem Isofluran mit niedrig dosiertem Dexmedetomidin, wie in diesem Protokoll beschrieben, die Gehirnnetzwerkfunktionen nur minimal stört und gleichzeitig die physiologische Stabilität bietet, die erforderlich ist, um qualitativ hochwertige funktionelle Konnektivitätsdaten im Ruhezustand zu erhalten9,10,18,24. Darüber hinaus können BOLD-Reaktionen von somatosensorischer Stimulation9 und mechanischer Schnurrhaarablenkung11 bei oder nach einem Zeitraum von 90 Minuten bei Verwendung dieses Protokolls beobachtet werden, was auf ein konsistentes Erregungsniveau hindeutet. Interessanterweise kann die isolierte Verwendung von Dexmedetomidin epileptische Aktivität hervorrufen; diese Aktivität wurde jedoch mit ergänzten Isofluran8abgeschafft. Ein weiterer Vorteil des aktuellen Protokolls ist, dass es die Notwendigkeit einer künstlichen Beatmung eliminiert. Obwohl die mechanische Beatmung zu einem engeren Bereich der partiellen Kohlendioxid- und Sauerstoffsättigung bei Tieren führen kann, kann in Längsschnittstudien die Aufrechterhaltung physiologischer Parameter ohne Intubation zu weniger Komplikationen und unerwünschten Nebenwirkungen führen.
Das Interesse an der fMRT im Ruhezustand ist in den letzten 10 Jahren erheblich gewachsen und damit die Notwendigkeit, qualitativ hochwertige, präklinische Ruhezustandsscans von Nagetieren zu erwerben. Dieses Überlebensprotokoll erreicht eine stabile Anästhesie für bis zu 5 h mit nahezu normaler Physiologie während der Ruhezustandserfassung. Da das Protokoll sehr stabil ist, können zusätzliche Sequenzen (Struktur, Stimulation, pharmakologische MRT usw.) leicht hinzugefügt werden, um das gewünschte experimentelle Design zu erreichen. Die Kombination von niedrig dosiertem Isofluran mit Dexmedetomidin, die in diesem Protokoll verwendet wird, ermöglicht eine Vielzahl von präklinischen Studien für Forscher, die daran interessiert sind, das Nagetiergehirn in seinem Ruhezustand zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Mittel des National Institute on Drug Abuse (NIDA) des National Institute of Health (NIH) unterstützt [DJW, EDKS und EMB wurden durch Grant R21DA044501 unterstützt, der alan I. Green und DJW wurde durch Grant T32DA037202 an Alan J. Budney] und das National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIAAA) [Grant F31AA028413 an Emily D. K. Sullivan] unterstützt. Zusätzliche Unterstützung wurde durch Alan I. Greens Fonds als Raymond Sobel Professor für Psychiatrie in Dartmouth bereitgestellt.
Hanbing Lu wird vom National Institute on Drug Abuse Intramural Research Program, NIH, unterstützt.
Die Autoren möchten dem verstorbenen Alan I. Green danken und ihm danken. Sein unerschütterliches Engagement auf dem Gebiet der gleichzeitig auftretenden Störungen trug dazu bei, die Zusammenarbeit zwischen den Autoren zu etablieren. Wir danken ihm für seine Mentorschaft und Führung, die sehr vermisst werden wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9.4T MRI | Varian/Bruker | Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software | |
| Air-Oxygen Mixer | Sechrist | Model 3500CP-G | |
| Analysis of Functional NeuroImages (AFNI) | NIMH/NIH | Version AFNI_18.3.03 | Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/ |
| Animal Cradle | RAPID Biomedical | LHRXGS-00563 | rat holder with bite bar, nose cone and ear bars |
| Animal Physiology Monitoring & Gating System | SAII | Model 1025 | MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on |
| Antisedan (atipamezole hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-867-7097 | Zoetis, Manufacturer Item #10000449 |
| Ceramic MRI-Safe Scissors | MRIequip.com | MT-6003 | |
| Clippers | Patterson Veterinary | 07-882-1032 | Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201 |
| Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-893-1801 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10 |
| Digital Rectal Thermometer Covers | Medline | MDS9608 | |
| FMRIB Software Library | FMRIB | MELODIC Version 3.15 | Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki |
| Heating Pad | Cara Inc. | Model 50 | |
| Hemostat forceps, straight | Kent Scientific | INS750451-2 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06 |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip Inc. | 911103 | |
| Lab Tape, 3/4" | VWR International | 89097-990 | |
| Needles, 23 gauge | BD | 305145 | plastic hub removed |
| Parafilm Laboratory Film | Patterson Veterinary | 07-893-0260 | Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A |
| Planar Surface Coil | Bruker | T12609 | 2cm |
| Polyethylene Tubing | Braintree Scientific | PE50 50FT | 0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter) |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38 |
| Sprague Dawley Rats | Charles River | 400 SAS SD | |
| Sterile 0.9% Saline Solution | Patterson Veterinary | 07-892-4348 | Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186 |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Medline | MDS090735 | |
| Surgical Tape, 1" (3M Durapore) | Medline | MMM15381Z | 3M Healthcare, "wide medical tape" |
| Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore) | Medline | MMM15300 | 3M Healthcare |
| Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle | BD | 309626 | |
| Syringes, 3 mL | BD | 309657 | |
| Vented induction and scavenging system | VetEquip Inc. | 942102 | 2 liter induction chamber with active scavenging |
| 411724 | omega flowmeter | ||
| 931600 | scavenging cube, "vacuum" | ||
| 921616 | nose cone, non-rebreathing |
References
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