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Genetics

Triagem Cromossômica de Embriões Humanos Pré-implantacionais Utilizando Meio de Cultura Usado: Coleta de Amostras e Análise de Ploidia Cromossômica

Published: September 7, 2021 doi: 10.3791/62619
Automatic Translation
*1,2,3,4, *5, 1,2,3,4, 1,2,3,4, 5, 5, 1,2,3,4, 5
1Centre for Reproductive Medicine, Department of Obstetrics and Gynecology, Peking University Third Hospital, 2National Clinical Research Center for Obstetrics and Gynecology(Peking University Third Hospital), 3Ministry of Education, Key Laboratory of Assisted Reproduction (Peking University), 4Beijing Key Laboratory of Reproductive Endocrinology and Assisted Reproductive Technology, 5Department of Clinical Research, Yikon Genomics Co. Ltd.
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

O presente estudo relata um protocolo de triagem cromossômica de embriões humanos que utiliza meio de cultura usado, o que evita a biópsia embrionária e permite a identificação de ploidia cromossômica usando NGS. O presente artigo apresenta o procedimento detalhado, incluindo a preparação do meio de cultura, amplificação do genoma completo (WGA), preparação da biblioteca de sequenciamento de próxima geração (NGS) e análise dos dados.

Abstract

Na fertilização clínica in vitro (FIV), o método predominante para PGT-A requer biópsia de algumas células do trofectoderma (TE). Esta é a linhagem que forma a placenta. Esse método, no entanto, requer habilidades especializadas, é invasivo e sofre de falsos positivos e negativos porque os números cromossômicos no ET e a massa celular interna (MCI), que se desenvolve no feto, nem sempre são os mesmos. O NICS, uma tecnologia que requer o sequenciamento do DNA liberado no meio de cultura tanto do TE quanto do ICM, pode oferecer uma saída para esses problemas, mas já demonstrou ter eficácia limitada. O presente estudo relata o protocolo completo do NICS, que inclui métodos de amostragem em meio de cultura, amplificação do genoma completo (WGA) e preparação de bibliotecas, e análise de dados NGS por software de análise. Considerando os diferentes tempos de criopreservação em diferentes laboratórios de embriões, os embriologistas possuem dois métodos de coleta de meio de cultura embrionário que podem ser selecionados de acordo com as condições reais do laboratório de FIV.

Introduction

As tecnologias de reprodução assistida (TARA) têm sido cada vez mais utilizadas para o tratamento da infertilidade. No entanto, a taxa de sucesso da TARV, como a FIV, tem sido limitada, e a taxa de perda gestacional é significativamente maior do que a da população normal1. A principal causa desses problemas são as anormalidades cromossômicas, comumente existentes em embriões humanos pré-implantacionais2. A PGT-A é um método eficaz de triagem de embriões para equilíbrio cromossômico antes da implantação 3,4. Alguns estudos comprovaram que a PGT-A pode reduzir a taxa de aborto e melhorar a taxa de gravidez 5,6,7,8. No entanto, a PGT-A requer conhecimentos técnicos complexos que exigem treinamento e experiência específicos. O procedimento de biópsia invasiva de embriões também poderia potencialmente causar danos aos embriões9. Estudos têm demonstrado que a biópsia de blastômeros pode dificultar o desenvolvimento subsequente, e o número de TEs biopsiados pode afetar as taxas de implante10. Embora a questão da biossegurança a longo prazo da biópsia embrionária ainda não tenha sido completamente avaliada em humanos, estudos em animais têm mostrado suas influências negativas no desenvolvimento embrionário11,12,13.

Relatos anteriores indicaram que traços de materiais de DNA foram secretados para o meio de cultura durante o desenvolvimento embrionário, e esforços têm sido feitos para realizar triagem cromossômica abrangente (CCS) usando meio de cultura embrionário usado 14,15,16,17,18. No entanto, as taxas de detecção e a acurácia dos testes não atenderam aos requisitos para uso clínico extensivo. O presente estudo relatou uma melhora no ensaio NICS para aumentar as taxas de detecção, bem como a acurácia do teste NICS19. Nos últimos anos, o líquido blastocelêmico (BF) tem sido estudado como uma amostra analítica de PGT-A minimamente invasiva. No entanto, a proporção de sucesso na amplificação do genoma amplo e no DNA detectável em amostras de fluido de blastocisto varia de 34,8% a 82%20,21,22. O volume de AM relatado em vários estudos varia de 0,3 nL a 1 μL. Tendo em vista a baixa quantidade de DNA no FS, é possível aumentar a quantidade de DNA livre de células misturando fluido de blastocisto e meio de cultura para melhorar a taxa de sucesso e a consistência da detecção. Kuznyetsov et al.23 e Li et al.24 trataram a zona pelúcida com laser e liberaram líquido blastocisto no meio de cultura para melhorar a quantidade total de DNA embrionário, e a taxa de amplificação das amostras combinadas meio/FS após WGA foi de 100% e 97,5%, respectivamente. Jiao et al.25 também obtiveram 100% de sucesso na amplificação utilizando o mesmo método.

O presente estudo relata um protocolo detalhado que inclui a preparação de amostras de mídia gasta, preparação de NGS e análise de dados. Ao remover cuidadosamente as células do cumulus dos ovócitos, o presente estudo realizou injeção intracitoplasmática de espermatozoides únicos (ICSI) e cultura de blastocisto. O meio gasto do dia 4 ao dia 5/dia 6 foi coletado para a preparação da biblioteca WGA e NGS. Usando a tecnologia NICS, o presente estudo simplificou as etapas de preparação da biblioteca WGA e NGS em aproximadamente 3 h e obteve resultados de ECC de forma não invasiva em aproximadamente 9 h.

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Protocol

A permissão ética foi obtida do Comitê de Ética do Terceiro Hospital da Universidade de Pequim.

1. Preparo

NOTA: Os materiais e equipamentos necessários estão listados na Tabela de Materiais.

  1. Reagentes
    1. Pré-aquecer e equilibrar (balanceado) 20-30 μL de meio gameta/meio de fertilização e meio de cultura de clivagem/blastocisto (coberto com óleo mineral) e hialuronidase (em um tubo bem tampado) a 37 °C, 5% CO 2 e 5% O2 em uma incubadora Tri-gás durante a noite antes do uso.
    2. Pré-aqueça a hialuronidase a 37 °C numa superfície de trabalho num exaustor.
    3. Preparar tampão de vitrificação e reagentes de coleta de amostras de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Ferramentas
    1. Prepare pipetas de coleta e transferência de amostras (diâmetro interno de ~200 a 250 μm), pipetas de desnudamento/stripper (diâmetro interno de ≥150 μm, ~130-140 μm e ~120 μm) e pipetas para lavagem (diâmetro interno de ~150 μm) puxando pipetas de vidro Pasteur para gerar pontas finas abertas polidas a fogo.
      NOTA: As pipetas utilizadas para coleta/transferência de amostras, desnudamento e lavagem podem ser adquiridas diretamente. As agulhas de retenção e as agulhas de injeção também podem ser compradas diretamente.

2. Protocolo 1: Coleta de amostras

  1. Pré-tratamento do complexo oócito-corona-cumulus (CCOC) antes da digestão com hialuronidase
    1. Conseguir a estimulação ovariana com preparações de hormônio folículo estimulante (FSH) e gonadotrofina menopausal humana (hMG). Quando o folículo condutor estiver >18 mm, use 10.000 UI de gonadotrofina coriônica (hCG) para maturação final do ovócito.
    2. Realizar a recuperação do ovócito 36 h após o disparo do gatilho. Captar e transferir ovócitos para placas de cultura de tecidos com 2,5 mL de m-HTF pré-aquecido coberto por óleo mineral.
    3. Transferir rapidamente os CCOCs para o poço central de uma placa de cultura de órgãos contendo 1 mL de meio de fertilização usando uma pipeta de transferência e, em seguida, incubar com os ovócitos a 37 °C em uma estufa de 5% CO 2 e 5% O 2 por2-4 h.
  2. Digerir OCCCs com hialuronidase adicionando 1 mL de hialuronidase pré-aquecida a 37 °C (80 UI/mL) ao poço central de uma placa de cultura de órgãos contendo OCCC (etapa 2.1.3). Manter a concentração final de hialuronidase a 40 UI/ml e misturar bem.
    1. Incubar os CCOC numa plataforma térmica a 37 °C durante 2 minutos. Observe as mudanças ao microscópio a cada 30 s até restarem apenas 1-2 camadas de células da granulosa.
  3. Denudação de células da granulosa
    1. Transfira rapidamente os OCCCs digeridos na placa de cultura para manuseio de ovócitos e cubra com óleo mineral em cada poço.
    2. Observe as células da granulosa separadas ao microscópio. Aspirar suavemente e liberar os ovócitos 5 vezes para remover as células residuais da granulosa ao redor dos ovócitos.
    3. Repita o passo anterior nos 3 poços restantes para remover completamente as células da granulosa.
      NOTA: As etapas acima (2.1-2.3) podem ser realizadas de acordo com a operação de rotina de cada laboratório.
  4. Avaliação do ovócito
    1. Avaliar a completude da remoção de células da granulosa utilizando um microscópio. Se as células não puderam ser completamente removidas, então a retenção de 5 ou menos células da granulosa é aceitável neste momento.
      NOTA: Se as células do cumulus ainda estiverem aderidas ao ovócito, o remanescente pode ser removido mais tarde no dia 3 antes que o embrião seja transferido do meio de cultura em estágio de clivagem para o meio de cultura em estágio de blastocisto.
  5. Após a realização da injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)26, transferir os ovócitos para microgotículas de meio de cultura embrionário de clivagem de 20-30 μL (um ovócito corresponde a uma microgota) usando pipetas de transferência e incubar em estufa a 37 °C, 5% CO 2 e 5% O2.
    1. Registre o dia da ICSI como dia 0. Verifique os embriões e a pontuação de acordo com o workshop de consenso de Istambul sobre avaliação embrionária do dia 1 para fertilização (aproximadamente 18 h), dia 2 (aproximadamente 45 h) e dia 3 (aproximadamente 68 h) para clivagem embrionária27.
  6. Lavagem de embriões
    1. Preparar 20-30 μL de microgotículas de meio de cultura de blastocisto para cada embrião coberto com óleo mineral em placas de cultura de tecidos no dia 2 em estufa a 37 °C, 5% CO 2 e 5% O2.
    2. Prepare mais três microgotículas cobertas com óleo mineral e rotule as novas placas de cultura de tecidos para lavagem nº 1-3.
    3. Transfira os embriões do dia 3 para as microgotículas de lavagem. Aspirar suavemente e liberar os embriões 3 vezes em cada gota usando pipetas de desnudamento.
      NOTA: Este procedimento também pode ajudar a remover as células granulares residuais ligadas ao embrião.
    4. Observar e avaliar os embriões ao microscópio no 3º dia antes da troca do meio de cultura em estágio de clivagem para o meio de cultura de blastocisto para escore morfológico. Se as células do cumulus ainda estivessem aderidas ao embrião, pipetar apropriadamente para cima e para baixo em outra gota de meio de cultura de blastocisto pré-aquecido e equilibrado coberta com óleo mineral com uma pipeta stripper até que as células do cumulus fossem completamente removidas.
      NOTA: Todas as células do cumulus anexadas tiveram que ser removidas completamente no dia 3 antes que o embrião fosse transferido da placa do meio de cultura em estágio de clivagem para a placa do meio de cultura em estágio de blastocisto. Quaisquer células cumulus remanescentes interferirão na análise final e darão resultados falsos negativos.
  7. Duas opções de coleta de meio de cultura
    NOTA: O centro de fertilização in vitro pode escolher um dos dois métodos para coleta de mídia de cultura com base nos recursos, demandas e preferências do centro.
    1. Opção 1: Lavagem e cultura de embriões
      NOTA: Esta opção é para laboratórios de fertilização in vitro que realizam vitrificação na manhã do dia 5.
      1. Transferir o embrião para microgotículas pré-aquecidas (37 °C) de meio de cultura e lavar suavemente cada embrião em série em 3 microgotículas por pipetagem no dia 4 à tarde.
      2. Transferir cada embrião para uma única microgota pré-aquecida (37 °C) de meio de cultura para coleta de amostras. O volume de uma única gota de meio de cultura não pode exceder 25 μL.
      3. Realizar cultura de embriões de blastocisto no dia 5/dia 6 a 37 °C, 5% CO 2 e 5% O2.
    2. Opção 2: Lavagem e cultura de embriões
      NOTA: Esta opção é para laboratórios de fertilização in vitro que realizam vitrificação no dia 5 à tarde ou dia 6.
      1. Transferir o embrião para microgotículas pré-aquecidas (37 °C) de 10-15 μL de meio de cultura e lavar suavemente cada embrião em série em 3 microgotículas por pipetagem no dia 5.
      2. Transferir cada embrião para uma única microgota pré-aquecida (37 °C) de meio de cultura para coleta de amostras. O volume de uma única gota de meio de cultura não pode exceder 15 μL.
      3. Realizar cultura embrionária de blastocisto no dia 5/dia 6 a 37 °C e 5% CO2.
  8. Coleta de amostras
    1. Ajuste suavemente o MCI a uma distância considerável do ponto alvo do feixe de laser, que se concentra na junção celular do trofectoderma para gerar um pequeno orifício no trofectoderma para liberar o fluido da cavidade do blastocoel. Em seguida, os embriões são movidos para solução de congelamento para criopreservação de acordo com o processo convencional.
    2. Transferir o meio de cultura de cada embrião cultivado para um tubo de PCR livre de RNase/DNase contendo 5 μL de tampão de lise celular.
    3. Coletar a mesma quantidade de meio de cultura sem ser utilizado para cultura de embriões como controle negativo. Congelar imediatamente todas as amostras coletadas em nitrogênio líquido e, em seguida, armazenar a -80 °C após serem coletadas até serem submetidas ao ensaio NICS.
  9. Realizar vitrificação conforme descrito no protocolo.

3. Protocolo 2: Construção de bibliotecas

  1. Lise do meio de cultura
    1. Diluir 1 μL de controle positivo (10 ng de gDNA humano) com 199 μL de meio de cultura fresco. Misture bem e centrifugar o tubo brevemente (200 x g por 5 s).
    2. Transferir 10 μL do meio de cultura de blastocisto dia 5 dias 6, controle positivo diluído e meio de cultura fresco para novos tubos de PCR de 0,2 mL.
    3. Adicionar 1 μL de MT Enzyme Mix a cada tubo de PCR e misturar cuidadosamente por pipetagem e centrifugação imediatamente por 2-3 s a 200 x g.
    4. Coloque o(s) tubo(s) de PCR da etapa 3.1.3 em uma estação de preparação de amostra NICS pré-aquecida e execute o programa de lise da seguinte forma: 10 min a 75 °C; 4 min a 95 °C; manter a 22 °C.
      NOTA: A estação de preparação de amostras é comparável a uma máquina de PCR padrão.
      1. Clique no ícone Lysis para entrar na tela de configuração.
      2. Selecione Tubo para o modo de controle; entrada de 10 μL para o volume da amostra; selecione Ativado para controle Hotlid e insira 105 °C para a temperatura. Selecione Não para Pausar no primeiro seg. Clique em OK para continuar.
      3. Aguarde até que Remain time mostre --:-- :--, que indica o final do programa e, em seguida, clique em Parar para encerrar o programa.
    5. Pare o programa após a conclusão do processo. Prossiga para a próxima etapa imediatamente.
  2. Preparação Pré-Biblioteca
    1. Descongele o buffer pré-lib para RT. Misture completamente pipetando e centrifugando imediatamente por 2-3 s a 200 x g.
    2. Prepare uma mistura mestra para a reação pré-biblioteca da seguinte forma: adicione 2 μL de Pre-Lib Enzyme Mix a 60 μL de Pre-Lib Buffer, misture a reação completamente e centrifugue brevemente.
    3. Adicionar 60 μL de mistura de reacção pré-biblioteca em cada amostra de meio pré-tratado do passo anterior. Misture bem por pipetagem e centrifugação imediatamente por 2-3 s a 200 x g.
    4. Coloque o(s) tubo(s) de PCR da etapa 3.2.3 na Estação de Preparação de Amostra e execute o programa de pré-biblioteca da seguinte maneira: 95 °C por 2 min; 12 ciclos de 15 °C por 40 s, 22 °C por 40 s, 33 °C por 30 s, 65 °C por 30 s, 72 °C por 40 s, 95 °C por 10 s e 63 °C por 10 s; e manter a 4 °C.
      1. Clique no ícone Pre_Lib para entrar na tela de configuração.
      2. Selecione Tubo para o modo de controle; entrada de 70 μL para o volume da amostra; selecione Ativado para controle da tampa quente e insira 105 °C para a temperatura. Selecione Não para Pausar no primeiro seg. Clique em OK para continuar.
      3. Aguarde até que Remain time mostre --:-- :--, que indica o final do programa, e clique em Parar para encerrar o programa.
    5. Pare o programa quando o processo estiver concluído. Prossiga para a próxima etapa imediatamente.
  3. Preparação da Biblioteca
    1. Misture bem pipetando e centrifugando imediatamente por 2-3 s a 200 x g.
    2. Prepare uma mistura mestra para a reação da biblioteca da seguinte forma: adicione 1,6 μL de mistura enzimática de biblioteca a 60 μL de tampão de biblioteca, misture a reação completamente e centrifuja brevemente.
    3. Adicionar 60 μL de mistura de reação de biblioteca e 2 μL de Primer de código de barras a cada produto de pré-biblioteca a partir da etapa 3.2.3. Misture bem a reação e centrifugue brevemente.
    4. Colocar o(s) tubo(s) de PCR do passo 3.2.3 no termociclador e executar o programa de preparação da biblioteca da seguinte forma: 94 °C durante 30 s; 17 ciclos de 94 °C por 25 s, 62 °C por 30 s e 72 °C por 45 s); e depois segure a 4 °C.
      1. Clique no ícone Lib_Prep para entrar na tela de configuração.
      2. Selecione Tubo para o modo de controle; entrada de 130 μL para o volume da amostra; selecione Ativado para controle Hotlid e insira 105 °C para a temperatura correspondente. Selecione Não para Pausar no primeiro seg. Clique em OK para continuar.
      3. Aguarde até que Remain time mostre --:-- :--, que indica o final do programa, e clique em Parar para encerrar o programa.
  4. Purificação da Biblioteca
    1. Remova as magbeads do armazenamento a 2-8 °C durante pelo menos 20 minutos antes da etapa de purificação. Vórtice e misture os Magbeads por 20 s. Distribua contas suficientes para a etapa de purificação em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e contas quentes para RT.
    2. Adicione 1x Magbeads em cada biblioteca. Misture pipetando para cima e para baixo ≥10 vezes e incube em TR por 5 min.
      Observação : por exemplo, adicione 100 μL de Magbeads a 100 μL de amostra de biblioteca.
    3. Após a incubação, centrifugar brevemente o tubo e colocar em um suporte magnético.
    4. Aguarde aproximadamente 5 min até que a solução fique clara. Ao manter o tubo no suporte magnético, aspirar cuidadosamente a solução e descartar.
    5. Adicionar 200 μL de etanol 80% recém-preparado ao tubo. Incubar em RT por 30 s e remover cuidadosamente o sobrenadante. Repita mais uma vez.
    6. Retire o etanol o mais completamente possível. Seque ao ar as contas no suporte magnético por aproximadamente 5-10 min no RT.
    7. Retire o tubo do suporte magnético, adicione 17,5 μL de tampão de eluição e vomite o tubo para ressuspender as contas. Centrifugar brevemente o tubo e incubar em TR por 5 min.
    8. Coloque o tubo no suporte magnético e aguarde até que a solução fique clara. Transfira cuidadosamente o sobrenadante de 15 μL para um novo tubo.
  5. Quantificação da biblioteca
    1. Quantificar bibliotecas purificadas usando o fluorômetro de acordo com o guia do usuário dos kits de ensaio qubit dsDNA HS28. O rendimento das bibliotecas varia de ~15 a 300 ng.
  6. Agrupamento de bibliotecas
    1. Use 10 nanogramas de cada amostra de biblioteca para agrupamento.
  7. Seqüenciamento
    1. Consulte o guia do usuário de sequenciamento (15027617 v01)29.
    2. Sequências de bibliotecas purificadas de 50 pb em uma única extremidade na plataforma produziram aproximadamente 2 milhões de leituras para cada amostra, e uma profundidade de sequenciamento de 0,03 × foi recomendada.
  8. Análise de dados
    1. Digite o nome e a senha dos usuários na página de login
    2. Depois de fazer login no sistema, clique em Análise e uma nova página aparecerá. Clique em Criar envio na guia NICS-A. Em seguida, escolha NGS para a plataforma, selecione corporação, escolha NICSInst para o reagente, insira as informações do projeto na caixa em ID do projeto, defina as preferências de análise e carregue os arquivos. Depois que todos os arquivos de sequenciamento forem carregados com êxito, clique em Enviar para iniciar a análise (Figura 3A).
    3. Clique em Exibir envios para mostrar a lista de projetos enviados. Quando a análise estiver concluída, o status de um projeto se tornará Concluído e um botão Mostrar aparecerá no campo de relatório. Clique no botão Mostrar para exibir a tabela de resumo da análise NICS (Figura 3B).
    4. Clique no botão Exportar relatório para salvar os relatórios (Figura 3C).
      Observação : três tipos de arquivos serão exportados para cada análise. Um arquivo gráfico que inclui todos os gráficos de variação do número de cópias (CNV) para cada cromossomo e genoma inteiro, que serão armazenados na pasta "gráfico"; uma planilha que contém os detalhes do QC de exemplo dessa execução de análise; um arquivo de documento que contém os relatórios NICS personalizados pelo usuário; e uma planilha que contém as informações de resumo de exemplo dessa execução de análise.

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Representative Results

O presente estudo aplicou o método proposto em um paciente. A aprovação do IRB e o consentimento informado foram obtidos antes da aplicação da análise NICS. O presente estudo obteve 6 blastocistos de pacientes e realizou NICS em todos os 6 embriões no meio do dia 4 ao dia 5. Anormalidades cromossômicas causadas pela translocação balanceada dos pais foram detectadas em cinco cromossomos com o ensaio NICS; portanto, não puderam ser utilizados para transferência (Figura 4A-E). Os resultados da NICS dos dois embriões mostraram o mesmo cariótipo 45, sendo XN e -18 (×1) deleções do cromossomo 18 (Figura 4A, B). O cariótipo 46, XN, -1p (pter→p21.1, ×1) é apenas o braço curto da deleção da região pter→p21.1 do cromossomo 1 (Figura 4D).

Os resultados da NICS mostraram cariótipo 46, XN, +1p (pter→p21.2, ×3) e -18(q21.32→qter, ×1), o que indicou que tanto o braço longo do cromossomo 18 q21.32→qter quanto o braço curto da região pter→p21.2 do cromossomo 1 estavam duplicados (Figura 4E). Embora os cariótipos 46, XN, +5q (×4) e -8 (×1, mos) sejam duplicações do cromossomo 5 e mostrem 8 diferenças em mosaico, o ensaio NICS pode rastrear todos os 24 cromossomos para aneuploidia. Este processo fornece um novo método para a transferência de blastocistos de cariótipo normal único.

Figure 1
Gráfico 1. A completude da remoção das células do cumulus. (A) Os ovócitos com células do cumulus. (B) Os ovócitos sem células do cumulus ligadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Gráfico 2. As células do cumulus são removidas de um embrião em D3 antes de serem transferidas para a BM. Todas as células do cumulus anexadas devem ser removidas antes que o meio mude da placa inicial do meio de cultura de clivagem do embrião para a placa do meio de cultura de blastocisto, que é no Dia 3 após os embriões atingirem o estágio de 8 células. Quaisquer células do cumulus que não forem removidas interferirão na análise final, dando resultados falsos negativos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Gráfico 3. Análise de dados. (A) Existem diferentes opções para o aplicativo do usuário. Para a plataforma de sequenciamento corporation, os usuários podem escolher Illumina, Ion Torrent ou MGI. Os usuários podem escolher se as informações de gênero são relatadas. Concluída a configuração de parâmetro acima, clique na caixa em Upload de arquivos e escolha os arquivos de sequenciamento apropriados para carregar. Para o Illumina, escolha os arquivos com uma extensão de fastq.gz. Clique em Enviar para iniciar a análise após o carregamento bem-sucedido. (B) A visão do quadro resumo. A tabela de resumo consiste nas seguintes informações: Nome do exemplo: O nome de cada exemplo de NICS é listado; CQ de dados: indica se o arquivo de sequenciamento passa no CQ para análise NICS; AI Rating: A classificação (A, B ou C) para cada amostra de NICS; AI_Rating Interpretação: Avaliação do potencial de implantação embrionária; AI Grading: A pontuação para cada amostra do NICS; CNV plot (Genoma Inteiro): Visualize os perfis CNV de todos os cromossomos; (C) A página Salvar relatório. Clique no botão Exportar relatório ao lado do Resumo dos Resultados. Selecione as informações que deseja mostrar no relatório final e clique em Exportar. Os relatórios serão salvos na pasta Download do seu computador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Gráfico 4. Triagem e seleção de embriões usando NICS de uma paciente. Um total de seis embriões desenvolveu-se com sucesso para o estágio de blastocisto, e meio de cultura Day4-Day5 de cada embrião foi coletado para o ensaio NICS. (A) e (B) são os resultados da NICS dos dois embriões blastocisto que mostraram o mesmo cariótipo 45, XN, -18(×1) são ambos deleção do cromossomo 18. (C) apresentou cariótipo 46, XN, +5q (×4), -8(×1, mos) é duplicação do cromossomo 5 e mosaico 8. (D) apresentou cariótipo 46, XN, -1p (pter→p21.1, ×1) é apenas o braço curto da região do cromossomo 1 pter→p21.1, enquanto (E) apresentou cariótipo 46, XN, +1p (pter→p21.2, ×3), -18(q21.32→qter, ×1) é braço curto do cromossomo 1 duplicação da região pter→p21.2 e braço longo do cromossomo 18 q21.32 → região qter (F) apresentou composição cromossômica balanceada. O eixo x significa 22 autossomos em vermelho e azul, o eixo y indica o número de cópia de cada autossomo. Os pontos cinzas são a escala de régua da resposta do número de cópia de cada janela do compartimento e o cariótipo normal do número da cópia deve ser 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela S1. As taxas de sucesso da detecção de DNA Opção 1 e Opção 2. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela S2. A concordância entre NICS e PGT-A em diferentes opções. Clique aqui para baixar esta tabela.

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Discussion

Modificações e solução de problemas

Se os resultados do NICS estiverem contaminados com materiais genéticos parentais, certifique-se de que todas as células cumulus-corona radiata sejam removidas e certifique-se de que a ICSI seja realizada para fertilização. Evitam-se processos inadequados de armazenamento de meios ou preparação de moldes, o que pode degradar o DNA. O espaço de trabalho foi cuidadosamente purificado com reagentes de descontaminação DNase e RNase. Para evitar contaminação de outros embriões, um embrião foi sempre cultivado em uma única gota de meio para evitar contaminação cruzada a partir do 4º dia. O fenômeno da contaminação é minimizado quando se retarda a colocação dos embriões na gota final de cultura30,31,32,33. Para minimizar a contaminação materna, Kuznyetsov34 modificou os procedimentos de cultura de embriões do dia 0 ao dia 4, incluindo a remoção cuidadosa de células residuais da coroa por pipetagem e flushing.

Lane et al.30 mostram que, ao tomar o meio de cultura embrionário do 4º ao 5º dia, a acurácia da detecção de euploidia é melhorada, a consistência da ploidia embrionária é superior a 95% e a consistência do cromossomo sexual chega a 100%. Lledo et al.33 verificaram que a taxa de coincidência entre o meio de cultura do dia 3 e o 5º dia das amostras foi de 74,6% e 92,0% quando os embriões foram cultivados do 4º ao 6º dia.

Nossos dados internos também corroboram essa conclusão, como mostra a Tabela S1. Em comparação com o método de cultura convencional dia 3 dia 5, as células da granulosa foram removidas devido a mais uma mudança no meio de cultura no dia 4 ou dia 5. Fornecemos dados internos (Tabela S1) mostrando que nossos dois métodos (opção 1 e opção 2) têm boa consistência em comparação com a PGT-A, que é melhor do que o método de amostragem sem a remoção completa do CC.

Produtos amplificados por FI apareceram no controle negativo, e materiais externos de DNA podem ter contaminado o reagente ou o espaço de trabalho. O espaço de trabalho deve ser limpo por reagentes removedores de DNA/RNA, materiais livres de nucleases devem ser usados e os reagentes devem ser aliquotados após o primeiro uso.

As diferenças nas taxas de sucesso entre a Opção 1 e a Opção 2 são discutidas na Tabela S1 e na Tabela S2.

Limitações do ensaio NICS

Existem duas limitações principais da NICS. 1) Antes da ICSI, todas as células do cumulus (geralmente de origem materna, geralmente composição cromossômica normal) devem ser removidas. Se a remoção for incompleta, as células do cumulus podem liberar DNA durante o desenvolvimento do embrião e o DNA externo é amplificado, o que pode ser a causa da detecção de falsos negativos. 2) É difícil remover os espermatozoides aderidos à zona pelúcida, e o procedimento NICS é altamente recomendado para ser realizado com ICSI. Embora a substituição regular do meio de clivagem no 3º dia possa reduzir a possibilidade de contaminação por células do cumulus e espermatozoides redundantes, essa contaminação deve ser minimizada se a NICS for usada na FIV clínica. No entanto, um método para detecção de NICS em embriões de FIV foi desenvolvido, incluindo a função de reconhecer DNA exógeno, que será demonstrada em um futuro próximo.

Este estudo não comparou as diferenças entre diferentes meios, uma vez que ensaios clínicos em larga escala compararam meios de cultura. Oito centros utilizaram 4 diferentes meios de cultura, sequenciais e contínuos, e 2 diferentes porcentagens de suplementação de albumina (5% e 10%), e essas diferenças não tiveram efeitos significativos na acurácia dos resultados embrionários do cfDNA31. Esses achados suportam a potencial aplicabilidade da análise embrionária de cfDNA em todos os laboratórios de FIV quando se trabalha sob o protocolo específico.

Importância em relação aos métodos existentes

O método NICS evita a biópsia embrionária e, portanto, melhora muito a segurança do uso. Comparada aos blastocistos, a NICS é uma técnica de triagem pré-implante simples, econômica, sensível e reprodutível, adequada para populações de reprodução assistida com alta probabilidade de aneuploidia. Ao contrário da biópsia invasiva, que requer considerável e profissional conhecimento para o procedimento de biópsia de blastocisto, a NICS pode ser aplicada extensivamente, uma vez que sua simples coleta de meio gasto segue apenas o funcionamento regular da FIV19 e não requer qualificação PGS/PGD em alguns países.

Aplicações futuras

A NICS tem o potencial de ampla aplicabilidade para triagem cromossômica na FIV clínica, não apenas para ICSI, mas também para embriões de FIV. Embora a ICSI seja altamente recomendada, métodos de remoção dos espermatozoides ligados à zona pelúcida são necessários para evitar a influência dos espermatozoides.

A avaliação morfológica é um método tradicional de avaliação embrionária, mas, na maioria dos casos, embriões cromossomicamente anormais podem parecer morfologicamente semelhantes a embriões cromossomicamente normais (euplóides). A combinação da avaliação morfológica com o ensaio NICS ao transferir embriões plóides com boa morfologia para o útero pode melhorar as taxas de gravidez e a taxa de nascidos vivos. Um ensaio clínico randomizado será conduzido para avaliar a eficácia clínica da transferência de embriões isolados utilizando a tecnologia NICS.

Etapas críticas do protocolo

Todas as células do cumulus-corona radiata devem ser removidas dos ovócitos antes da fecundação. Os ovócitos foram fertilizados por injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). Evitou-se a adição de proteínas/suplementos derivados de humanos ao meio de cultura. O meio de cultura foi trocado no dia 4 e coletado no dia 5 e no dia 6, quando os blastocistos se expandiram completamente. Os embriões foram cultivados em gotículas individuais de meio de cultura a partir do 4º dia. Durante a coleta do meio de cultura, pipetas de transferência entre as amostras foram trocadas para evitar contaminação.

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Disclosures

Yaxin Yao, Jieliang Ma, Jing Wang e Sijia Lu são funcionários da Yikon Genomics Co., Ltd.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Shiping Bo e Shujie Ma por sua assistência na análise de dados NGS. Financiamento: este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (Processo Nº 2018YFC1003100).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL EP tube, 0.2 mL PCR tube Axygen MCT-150-C, PCR-02-C DNase/RNase free, Low Binding PCR tubes and 1.5 mL micro-centrifuge tubes are recommended.
10 µL, 200 µL, 1000 µL DNase /RNase Free Tips Axygen T-300-R-S, T-200-Y-R-S, T-1000-B-R-S This can be replaced by other brand/For sample transfer
100 % ethanol Sinopharm Chemical 10009218 This can be replaced by other brand/For DNA library purification
Barcode Primer1-48 Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
BD Falcon Organ Culture Dish, Sterile BD Bioscience 363037 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes (Easy Grip) , Sterile BD Bioscience 353001 This can be replaced by other brand/For embryo culture
BD Falcon Tissue culture Dishes, Sterile BD Bioscience 353002 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Cell Lysis Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
Cell Lysis Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
ChromGo software Yikon Genomics Data analysis
CMPure Magbeads Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library purification
Cryotop open systerm  KITAZATO BioPharma 81110 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Distill water Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit To dissolve DNA
ES (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
HOLDNIG ORIGIO MPH-MED-35 This can be replaced by other
brand/For ICSI
Hyaluronidase solution, 80 U/mL SAGE ART4007-A This can be replaced by other brand/Digest oocyte-corona-cumulus complex
ICSI ORIGIO MPH-35-35 This can be replaced by other brand/For ICSI
Illumina MiSeq® System Illumina SY-410-1001 For library sequencing
Incubator Labotect Inkubator C16 This can be replaced by other brand/For embryo culture
Library buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Library Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For library amplificaton
Magnetic Stand DynaMagTM-2 12321D For library purification
Microscope OLYMPUS 1X71 This can be replaced by other brand/For embryo observation
Mini-centrifuge ESSENSCIEN ELF6 For separation
MT Enzyme Mix Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit For culture medium pre-treatment
NICSInst library preparation kit Yikon Genomics KT1000800324 Whole genome amplification and library construction
NICSInst Sample Prep Station Yikon Genomics  ME1001003 Amplificate DNA
Nunc IVF 4-Well Dish Thermo Scientific 144444 This can be replaced by other brand/For embryo washing and blastocyst culture
Pasteur Pipette Oirgio  MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For embryo tansfer
Pasteur pipettes ORIGIO PP-9-1000 This can be replaced by other brand/For IVF laboratory
Pre-Lib Buffer Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Pre-Lib Enzyme Yikon Genomics Reagent in NICSInst library preparation kit Pre-library preparation
Qubit® 3.0 Fluorometer Thermo Scientific Q33216 For library quantification
Quinn's Advantage Blastocyst Medium SAGE ART-1029 For embryo blastocyst stage culture
Quinn's Advantage Cleavage Medium SAGE ART-1026 This can be replaced by other brand/For embryo cleavage stage culture
Quinn's Advantage Fertilization Medium SAGE ART-1020 This can be replaced by other brand/For oocyte and sperm fertilization
Quinn's Advantage m-HTF Medium with HEPES SAGE ART-1023 This can be replaced by other brand/For embryo clutrure
Quinn's Advantage SPS Serum protein Substitute Kit SAGE ART-3010 This can be replaced by other brand/To denude the oocyte
Quinn's Advantage Tissue culture mineral oil SAGE ART-4008P This can be replaced by other brand/To cover the culture medium
STRIPPER TIPS ORIGIO MXL3-IND-135 This can be replaced by other brand/For denudating granulosa cells
Vitrification Cryotop Open systerm KIZTAZATO 81111 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vitrification kit  KITAZATO BioPharma VT101 This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
Vortexer Qilinbeier DNYS8 Sample mix
VS (Vitrification kit)  KITAZATO BioPharma Reagent inVitrification kit This can be replaced by other brand/For embryo vitrification
ZILOS-tk Laser System Hamilton Thorne CLASS 1 laser This can be replaced by other brand/For artificial blastocoele collapse

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References

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Tags

Triagem Cromossômica Embriões Pré-implantacionais Humanos Meio de Cultura Usado Coleta de Amostras Análise de Ploidia Cromossômica Fertilização In Vitro (FIV) Teste Genético Pré-implantacional para Aneuploidia (PGT-A) Trofetoderma (TE) Massa Celular Interna (MCI) Falsos Positivos e Negativos Tecnologia NICS Sequenciamento de DNA Amostragem de Meio de Cultura Amplificação do Genoma Completo (WGA) Preparação de Biblioteca Análise de Dados NGS Criopreservadora Laboratório de FIV

Erratum

Formal Correction: Erratum: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis
Posted by JoVE Editors on 10/01/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. The Protocol and Representaive Results sections were updated.

In the Protocol, step 3.8.2 was updated from:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS tab. Then, select the sequencing platform, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

to:

After logging into the system, click Create Submission under the NICS-A tab. Then, choose NGS for the platform, select corporation, choose ChromInst for the reagent, enter the project information in the box under Project ID, set the analysis preferences and upload the files. Once all sequencing files are successfully uploaded, click Submit to start the analysis (Figure 3A).

In the Representative Results, Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3. Data Analysis. (A) The page of Create Submission. There are different options for the user application. For sequencing platform, users can choose Illumina or Ion Torrent. For analysis criterion, there are two length detection resolution for selection, the whole chromosome and whole arm level. The users also can choose whether the mosaicism or gender information is reported. Finished the above parameter setting,click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. For Ion Torrent platform, choose files with an extension of bam. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; Conclusion: Indicates whether the NICS analysis is normal or abnormal, "N/A" indicates no conclusive result is available; Gender: If the user chooses to report the sex information, this column will appear in the summary table; Karyotype: Shows the analysis results; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; CNV plot (By Chromosome): View the CNV profiles of each chromosome. (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. Select Save File in the appearing dialog window and then click OK. The reports will be saved to the Download folder of the computer. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3. Data Analysis. (A) There are different options for the user application. For sequencing platform corporation, users can choose Illumina, Ion Torrent or MGI. The users can choose whether the gender information is reported. Finished the above parameter setting, click on the box under File upload and choose the appropriate sequencing files to upload. For Illumina, choose the files with an extension of fastq.gz. Click Submit to start the analysis after successfully upload. (B) The view of summary table. The summary table consists of following information: Sample Name: The name of each NICS sample is listed; Data QC: Indicates whether the sequencing file passes the QC for NICS analysis; AI Rating: The rating (A, B or C) for each NICS sample; AI_Rating Interpretation: Evaluation of embryo implantation potential; AI Grading: The score for each NICS sample; CNV plot (Whole Genome): View the CNV profiles of all chromosomes; (C) The Save Report Page. Click Export report button next to the Summary of Results. Select the information you want to show on the final report and click Export. The reports will be saved to the Download folder of your computer. Please click here to view a larger version of this figure.

Triagem Cromossômica de Embriões Humanos Pré-implantacionais Utilizando Meio de Cultura Usado: Coleta de Amostras e Análise de Ploidia Cromossômica
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Huang, J., Yao, Y., Jia, J., Zhu,… More

Huang, J., Yao, Y., Jia, J., Zhu, X., Ma, J., Wang, J., Liu, P., Lu, S. Chromosome Screening of Human Preimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium: Sample Collection and Chromosomal Ploidy Analysis. J. Vis. Exp. (175), e62619, doi:10.3791/62619 (2021).

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