Summary
Denne protokol beskriver ekstraktion og visualisering af aggregerede og opløselige proteiner fra Escherichia coli efter behandling med en proteotoxisk antimikrobiel. Efter denne procedure giver mulighed for en kvalitativ sammenligning af proteinaggregatdannelse in vivo i forskellige bakteriestammer og/eller mellem behandlinger.
Abstract
Eksponeringen af levende organismer for miljømæssige og cellulære belastninger forårsager ofte forstyrrelser i protein homøostase og kan resultere i protein aggregering. Ophobning af protein aggregater i bakterieceller kan føre til betydelige ændringer i cellulære fænotypiske adfærd, herunder en reduktion i vækstrater, stressresistens, og virulens. Der findes flere forsøgsprocedurer til undersøgelse af disse stressormedierede fænotyper. Dette papir beskriver en optimeret analyse til ekstraktion og visualisering af aggregerede og opløselige proteiner fra forskellige Escherichia coli stammer efter behandling med en sølv-ruthenium-holdige antimikrobielle. Denne forbindelse er kendt for at generere reaktive iltarter og forårsager udbredt proteinsammenlægning.
Metoden kombinerer en centrifugeringsbaseret adskillelse af proteinaggregater og opløselige proteiner fra behandlede og ubehandlede celler med efterfølgende adskillelse og visualisering af natrium dodecyl sulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og Coomassie farvning. Denne tilgang er enkel, hurtig og giver mulighed for en kvalitativ sammenligning af proteinaggregatdannelse i forskellige E. coli-stammer. Metoden har en bred vifte af anvendelser, herunder muligheden for at undersøge virkningen af andre proteotoksiske antimikrobielle stoffer på in vivoprotein aggregering i en lang række bakterier. Desuden kan protokollen bruges til at identificere gener, der bidrager til øget resistens over for proteotoksiske stoffer. Gelbånd kan bruges til efterfølgende identifikation af proteiner, der er særligt tilbøjelige til sammenlægning.
Introduction
Bakterier udsættes uundgåeligt for et utal af miljømæssige belastninger, herunder lav pH (f.eks. i pattedyrs mave)1,2, reaktiv ilt- og klorart (ROS/RCS) (f.eks. under oxidativ burst i fagocytter)3,4,5, forhøjede temperaturer (f.eks. i varme kilder eller under varmechok)6,7og flere potente antimikrobielle stoffer (f.eks. AGXX anvendes i denne protokol)8. Proteiner er særligt sårbare over for nogen af disse stressorer, og eksponering kan provokere protein un-/misfolding at så frø sammenlægning. Alle organismer anvender beskyttelsessystemer, der giver dem mulighed for at klare proteinfoldning9. Alvorlig stress kan dog overvælde proteinets kvalitetskontrolmaskineri og forstyrre proteinernes sekundære og/eller tertiære struktur, som i sidste ende inaktiverer proteiner. Som følge heraf kan proteinaggregater alvorligt forringe kritiske cellulære funktioner, der kræves for bakterievækst og overlevelse, stressresistens og virulens10. Derfor er forskning med fokus på protein aggregering og dens konsekvenser i bakterier et relevant emne på grund af dets potentielle indvirkning på infektionssygdomsbekæmpelse.
Varmeinduceret protein, der udfolder sig og aggregering, er ofte reversibelt7. I modsætning hertil kan andre proteotoxiske belastninger, såsom oxidativ stress, forårsage irreversible proteinmodifikationer gennem oxidation af specifikke aminosyre sidekæder, hvilket resulterer i protein un-/misfolding og i sidste ende proteinaggregation4. Stressinduceret dannelse af uopløselige proteinaggregater er blevet grundigt undersøgt i forbindelse med molekylære chaperoner og deres beskyttende funktioner i gær og bakterier11,12,13. Der er offentliggjort flere protokoller , der anvender en række biokemiske teknikker til isolering og analyse af uopløselige proteinaggregater14,15,16,17. De eksisterende protokoller er hovedsageligt blevet anvendt til at studere bakterieprotein aggregering ved varmechok og/eller identifikation af molekylære chaperoner. Mens disse protokoller har helt sikkert været et fremskridt på området, der er nogle store ulemper i de eksperimentelle procedurer, fordi de kræver (i) en stor bakteriel kultur volumen på op til 10 L14,17, (ii) komplicerede fysiske forstyrrelser processer, herunder brugen af celleforstyrrende stoffer, fransk presse, og / eller sonikering14,15,17, eller (iii) tidskrævende gentagne vaske- og inkubation trin15,16,17.
Dette papir beskriver en modificeret protokol, der har til formål at løse begrænsningerne af de tidligere tilgange og tillader analyse af mængden af protein aggregater dannet i to forskellige Escherichia coli stammer efter behandling med en proteotoxisk antimikrobiel overfladebelægning. Belægningen består af metal-sølv (Ag) og ruthenium (Ru)-konditioneret med ascorbinsyre, og dens antimikrobielle aktivitet opnås ved generering af reaktive iltarter8,18. Heri er en detaljeret beskrivelse af præparatet af bakteriekulturen efter behandling med antimikrobiel forbindelse og en sammenligning af proteinaggregationsstatus ved eksponering af to E. coli-stammer med forskellige følsomhedsprofiler for stigende koncentration af det antimikrobielle stof. Den beskrevne metode er billig, hurtig og reproducerbar og kan bruges til at studere protein aggregering i nærværelse af andre proteotoxiske forbindelser. Derudover kan protokollen ændres for at analysere den indvirkning, som specifikke gensletninger har på proteinaggregation i en række forskellige bakterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stressbehandling af E. coli stammer MG1655 og CFT073
- Pode 5 mL lysogeny bouillon (LB) medium med en enkelt koloni af commensal E. coli stamme MG1655 og uropathogenic E. coli (UPEC) stamme CFT073, henholdsvis og inkubere i 14-16 h (natten) ved 37 °C og 300 rpm.
BEMÆRK: Escherichia coli CFT073 er et humant patogen. Håndtering af CFT073 skal udføres med passende biosikkerhedsforanstaltninger i et Biosafety Level-2 certificeret laboratorium. - Hver stamme fortyndes til en 500 mL kolbe indeholdende70 mL 3(N -morpholino)propansulfonsyre (MOPS)-glukose (MOPS-g) (tabel 1) medium til en optisk tæthed ved 600 nm (OD600)værdi af 0,1. Inkuberes ved 37 °C og 300 omdr./min, indtil midterlogsfasen er nået (OD600 = 0,5-0,55).
- Overfør 20 mL af hver kultur til tre præwarmede 125 mL kolber og inkuberes ved 37 °C og 300 rpm i 2 min.
BEMÆRK: Da rettidig behandling af prøverne er påkrævet, skal du ikke håndtere mere end 6 kulturer ad gangen. - Der fremstilles en antimikrobiel sammensat opløsning i MOPS-g medium i en koncentration på 2 mg/mL. Tilsæt antimikrobielle til hver kultur for at nå de angivne koncentrationer. For ubehandlet kontrol, tilføje den nødvendige mængde AF MOPS-g medium.
BEMÆRK: Vortex den 2 mg/mL antimikrobielle opløsning for at muliggøre en jævn fordeling af de sammensatte partikler og undgå sedimentering. - Inkuberes i 45 min ved 37 °C og 300 omdrejninger pr. minut.
Figur 1: Escherichia coli stress behandling. Bakteriekulturer dyrkes i MOPS-g og behandles med de angivne koncentrationer af det sølv-rutheniumholdige antimikrobielle, når midt-log-fasen er nået. Forkortelser: LB = lysogen bouillon; Ag-Ru = sølv ruthenium; MOPS-g = 3-(N-morpholino)propansulfonsyre (MOPS)-glukose. Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Indsamling af bakteriecelleprøver
- Efter 45 minutters stressbehandling bestemmes OD600 i hver kultur. For hver prøve høstes celler svarende til 4 mL OD600 = 1 ud af 15 mL centrifugerør ved centrifugering i 15 min ved 3.000 × g og 4 °C.
- Supernatanten fjernes helt, og cellpillerne tages helt ud i 50 μL iskold lysisbuffer (tabel 1). Inkuber prøverne i 30 minutter på is.
BEMÆRK: Dette lysistrin nedbryder det peptidoglyklag. Brug altid frisklavet lysis buffer. - Prøverne overføres til 1,7 mL mikrocentrifugrør. Frys ved -80 °C, indtil den er yderligere brugt.
Figur 2: Indsamling af bakteriel prøve. Celleprøver høstes ved centrifugering og suspenderes i lysisbuffer efterfulgt af opbevaring ved -80 °C. Klik her for at se en større version af dette tal.
3. Udvinding af de uopløselige proteinaggregater
- Optø prøver på is.
BEMÆRK: Fryse-optøningscyklussen bidrager til cellelys. - Tilsæt 360 μL iskold buffer A (tabel 1) og blandes forsigtigt ved pipettering.
BEMÆRK: Det osmotiske stød vil også bidrage til celle lysis. - Prøven overføres til et 2 mL mikrocentrifugerør, der indeholder ~200 μL 0,5 mm glasperler. Inkuberes i 30 min ved 8 °C i en termomixer med rysten ved 1.400 omdrejninger.
BEMÆRK: Dette trin resulterer i fysisk forstyrrelse af cellen. En proteasehæmmer kan bruges til at minimere proteinforringelse. Afbrydelsen kan udføres ved 4 °C. Bemærk, at brugen af glasperler er blevet rapporteret at fremkalde sammenlægning af en lille delmængde af proteiner i gær19. - Inkuber i 5 minutter på is uden at ryste for at bosætte glasperlerne. 200 μL af cellelyset overføres til 1,7 mL mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Undgå overførsel af glasperlerne. - Centrifuge ved 16.000 × g og 4 °C i 20 min. Saml supernatanten, som indeholder opløselige proteiner, og fortsæt til afsnit 4.
- Brug pillet i 200 μL iskold buffer A (tabel 1) ved hjælp af pipetten. Centrifuge ved 16.000 × g og 4 °C i 20 min. Fjern forsigtigt supernatanten helt.
- Der tilsættes 200 μL iskold buffer B (se tabel 1 og materialetabellen) og genbruges forsigtigt ved pipettering.
BEMÆRK: Det ikke-ioniske vaskemiddel opløser membranprotein. - Centrifugeringen gentages ved 16.000 × g og 4 °C i 20 min. Fjern forsigtigt supernatanten.
- Ved pipettering skal pellet genbruges i 200 μL koldbuffer A (tabel 1). Centrifuge ved 16.000 × g og 4 °C i 20 min. Fjern supernatanten helt.
- Pjehælen genbruges i 100 μL på 1x, hvilket reducerer SDS-prøvebufferen (tabel 1) og koges i 5 min ved 95 °C i en termomixer.
- Prøven opbevares ved -20 °C for at fortsætte senere eller straks lægge på en SDS-polyacrylamidgel til separation.
Figur 3: Udvinding af uopløselige proteinaggregater. Ekstraktionen af protein aggregater indebærer en række trin, herunder celleforstyrrelser, adskillelse af protein aggregater fra opløselige proteiner, opløselse af membranproteiner, og vask. Forkortelse: SDS = natrium dodecyl sulfat. Klik her for at se en større version af dette tal.
4. Opløseligt proteinprøvepræparat
- Bland 1 volumen 100% trichloreddikesyre (TCA) med 4 volumener af opløselig proteinprøve fra trin 3.6.
BEMÆRK: Håndtering af TCA kræver røghætte og personlige værnemidler og en godkendt affaldsbortskaffelsesprocedure. - Inkuber i 10 min ved 4 °C for at give mulighed for proteinudfældning.
BEMÆRK: Hvid bundfald vises meget snart. - Centrifuge til bundfald ved 21.000 × g og 4 °C i 5 min og fjerne supernatanten. Vask pellet med 200 μL iskold acetone for at fjerne cellulære snavs. Centrifuge ved 21.000 × g og 4 °C i 5 min og fjern supernatanten. Gentag disse handlinger i trin 4.3 i alt tre gange.
- Mikrocentrifugrørene placeres med åbne låg i en termomixer ved 37 °C for at fjerne den resterende acetone fra pelleten.
BEMÆRK: Inkubation på mere end 5 min kan reducere proteinpillen. - Der tilsættes 100 μL 1x, hvilket reducerer SDS-bufferen (tabel 1), og pillet opløses fuldstændigt. Kog prøven i 5 min ved 95 °C.
- Prøven opbevares ved -20 °C for at fortsætte senere eller straks lægge på en SDS-polyacrylamidgel til separation.
Figur 4: Tilberedning af opløselige proteiner. Forberedelsen af opløseligt protein indebærer et nedbørstrin med trichloreddikesyre og gentagen vask med iskold acetone. Forkortelser: TCA = trichloreddikesyre; SDS = natrium dodecyl sulfat. Klik her for at se en større version af dette tal.
5. Adskillelse og visualisering af udvundet protein aggregater ved hjælp af SDS-PAGE
- Forbered en 12% SDS-polyacrylamidgel.
- For to skillegeler, pipette 5,1 mL dobbeltdestilleret vand (ddH2O), 3,75 mL Tris-HCl (pH 8,8), 7,5 mL på 20% (w/v) SDS 6 mL 30% acrylamid/bisacrylamidopløsning (29:1) opløsning, 75 mL 10% w/v ammoniumpersulfat og 10 mL tetramethylethylendiamin (TEMED) i et 15 mL centrifugerør og blandes forsigtigt uden at indføre luftbobler. Hæld gelen ved hjælp af en 1 mL pipet i glaspladerne, så de øverste 2 cm fri af blandingen. Tilsæt 70% ethanol på toppen af skillegelen og tillad en jævn grænseflade mellem de to lag.
- Efter polymerisering af skillegelen skal stablingsgelen forberedes ved pipettering 1,535 mL ddH2O, 625 mL Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mL af 20% (w/v) SDS, 335 mL 30% acrylamid/bisacrylamid (29:1) opløsning, 12,5 mL på 10% w/v ammonium persulfat og 2,5 mL TEMED. Fjern ethanol fra skillegelerne og tilsæt stablingsgelopløsningen. Indsæt en kam med det ønskede antal lommer uden at introducere luftbobler. Tillad polymerisering i 20-30 min.
- 4 μL af hver prøve og protein stige i separate brønde og køre gel(r) i Tris-Glycin løbebuffer (tabel 1) ved 144 V i 45 min ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Stop gelen, når bromophenolbåndet er ved at migrere ud af gelen. - Plette gel (r) i en prewarmed Fairbanks løsning A (Tabel 1) i 30 minutter på en rocker.
- Decolor gel (r) i en prewarmed Fairbanks løsning D (Tabel 1) indtil den ønskede baggrund (f.eks natten) på en rocker.
Figur 5: Proteinadskillelse og visualisering. Prøverne er adskilt af SDS-PAGE og visualiseret af Coomassie farvning. Forkortelse: SDS-PAGE = natrium dodecyl sulfat-polyacrylamidgel elektroforese. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6: Repræsentative resultater af antimikrobiel induceret proteinsammenlægning i commensal Escherichia coli stamme MG1655 og UPEC stamme CFT073. E. colistammerne MG1655 og CFT073 blev dyrket ved 37 °C og 300 rpm til OD600= 0,5-0,55 i MOPS-g medier, før de blev behandlet med de angivne koncentrationer (-, 0 mg/mL; +, 175 mg/mL; ++, 200 mg/mL) af antimikrobielle i 45 min. Opløselige og uopløselige proteinprøver blev fremstillet som beskrevet i protokollen og figur 1, figur 2, figur 3og figur 4 og visualiseret på en 12 % SDS-polyacrylamidgel (figur 5). Proteinaggregatdannelse (uopløselig fraktion) blev øget i begge stammer i nærværelse af det antimikrobielle, mens mængden af opløselige proteiner blev reduceret. Samlet set havde antimikrobielle en langt mere potent effekt på MG1655 end på CFT073. Forkortelser: M= Proteinmarkør; UPEC = uropatogene E. coli; MOPS-g = 3-(N-morpholino)propansulfonsyre (MOPS)-glukose; SDS = natrium dodecyl sulfat. Klik her for at se en større version af dette tal.
Her blev der brugt to E. coli-stammer, der adskiller sig i deres modtagelighed for et proteotoksisk sølv rutheniumholdigt antimikrobielt for at demonstrere denne protokol. Foreløbige overlevelsesdata viste, at den commensale E. coli-stamme MG1655 er betydeligt mere følsom over for den ROS-genererende antimikrobielle end UPEC-stammen CFT073 (data, der ikke er vist). Begge stammer blev dyrket i MOPS-g medier ved 37 °C og 300 rpm. I midten af logfasen blev cellerne enten ubehandlet eller behandlet med henholdsvis 175 μg/mL og 200 μg/mL af antimikrobielle stoffer og inkuberet i 45 min. Efterfølgende blev cellerne lys, og cellulære proteinaggregater adskilt fra de opløselige proteiner. Proteiner i begge fraktioner blev derefter adskilt af SDS-PAGE og visualiseret af Coomassie farvning. Den uopløselige fraktion, der er vist i figur 6, repræsenterer mængden af proteinaggregater, der dannes, hvilket blev forøget, da cellerne blev inkuberet i nærværelse af antimikrobielle sammenlignet med ubehandlede celler. Stigningen i proteinaggregatdannelsen var uafhængig af stammebaggrunden, selv om der blev påvist en langt mere udtalt stigning i den samlede dannelse i den mere følsomme stamme MG1655. Omvendt blev der observeret lavere mængder opløselige proteiner (opløselig fraktion) efter antimikrobiel behandling af cellerne sammenlignet med det ubehandlede modstykke. Dette resultat var forventet i betragtning af de foreløbige data, der viste en betydeligt højere tolerance over for antimikrobielle i CFT073 end MG1655.
| Løsninger | Opskrifter |
| Buffer A | 10 mM kaliumphosphat (pH 6,5), 1 mM EDTA |
| Buffer B | Buffer A indeholdende 2% Nonidet P-40. Kan opbevares i stuetemperatur til senere brug. |
| Fairbanks A (Farvningsløsning) | 25% isopropanol, 10% istidseddikesyre, 1,4 g Coommassie R-250 |
| Fairbanks D (Afstaining løsning) | 10% Glacial eddikesyreopløsning |
| Lysis buffer | 10 mM kaliumphosphat (pH 6.5), 1 mM EDTA, 20% saccharose kan fremstilles og opbevares ved stuetemperatur til langvarig brug. Der tilsættes 1 mg/mL lysozym og 50 u/mL Benzonase frisk før brug. |
| MOPS-g medier | 100 mL 10x MOPS, 10 mL 0,132 M K2HPO4, 10 mL 20% glukose, 0,5 mL 20 mM thiamin. Fyld op til 1 L med ddH2O og sterilt filter |
| 1x SDS-eksempelbuffer | 6,5 mM Tris-HCl (pH 7), 10% glycerol, 2% SDS, 0,05% bromophenol blå og 2,5% β-mercaptoethanol. Opbevares ved -20 °C. |
| 12% SDS polyacrylamid gel forberedelse (for 2 geler) | Adskillelse gel: 5,1 mL ddH2O, 3,75 mL Tris-HCl (pH 8,8), 75 mL 20% w/v SDS, 6 mL 30% Acrylamid/Bisacrylamidopløsning 29:1 opløsning, 75 mL 10% w/v ammonium persulfat, 10 mL TEMED |
| Stablingsgel: 1.535 mL ddH2O, 625 mL Tris-HCl (pH 6.8), 12,5 mL 20% w/v SDS, 335 mL 30% Acrylamid/Bisacrylamidopløsning 29:1 opløsning, 12,5 mL 10% w/v ammonium persulfat, 2,5 mL TEMED | |
| SDS-kørende buffer | 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS i ddH2O. Butik i stuetemperatur. |
Tabel 1: Buffer, medier og løsninger. Opskrifter på buffer, medier og løsninger, der bruges i denne protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en optimeret metode til analyse af proteinaggregatdannelse efter behandling af forskellige E. coli-stammer med en proteotoxisk antimikrobiel. Protokollen tillader samtidig udvinding af uopløselige og opløselige proteinfraktioner fra behandlede og ubehandlede E. coli-celler. Sammenlignet med eksisterende protokoller for proteinaggregatisolation fra cellerne14,15,16,20har denne metode flere fordele: (i) kun små kulturmængder (4-8 mL) er nødvendige; ii) celleafbrydelsesprocessen ikke er afhængig af særligt udstyr såsom en fransk presse, celleforstyrrende eller soniker og iii) protokollen er let at følge selv for relativt tidlige karriereforskere på området.
Bakterier støder på et utal af belastninger i deres naturlige miljø, og mange af dem udgør en trussel, især mod proteiner, den mest rigelige makromolekyle i cellen21. Den beskrevne metode tilbyder mange potentielle anvendelser. En af dem er muligheden for at undersøge effekten, hvormed en lang række belastninger (f.eks. forhøjede temperaturer, reaktive iltarter, reaktive klorarter) og kemiske forbindelser påvirker protein homøostase hos bakterier, archaea og endda eukaryote celler5,12,22,23. Vores udvinding blev udført med de to fjernt beslægtede E. coli stammer, MG1655 og CFT073. Det er dog også blevet anvendt med succes til at studere specifikke genprodukters rolle for protein homøostase ved at sammenligne proteinaggregatdannelse i vilde og mutantstammer11,12.
Efter at have overvejet passende ændringer og fejlfinding af vækstbetingelser og stressorkoncentrationer kan denne protokol også bruges til at bestemme proteinaggregatdannelse i andre Gram-negative5- og Gram-positive bakterier8. Især gelbånd adskilt efter SDS-PAGE kan densitometrisk analyseres (dvs. ved hjælp af ImageJ). Denne tilgang kan også bruges til at analysere virkningen af yderligere terapeutiske forbindelser såsom hæmmere af molekylære chaperoner24. Mest spændende kan det kombineres med massespektrometriske tilgange til at give oplysninger om den type proteinarter, der er aggregeringsfølsomme under en bestemt stresstilstand, blot ved at bestemme deres tilstedeværelse eller fravær i den uopløselige proteinfraktion5,15.
Succesen af denne protokol kræver nøje overvejelse af stressor koncentrationer, at cellerne er udsat for og eksponering. Vi anbefaler derfor at udføre en foreløbig overlevelsesanalyse med stigende stressorkoncentrationer for at bestemme den proteotoksiske koncentration. Desuden skal stressoropløsningerne fremstilles frisk før hvert forsøg, og prøveindsamlingstiderne skal holdes konsistente. En begrænsning af denne metode er det lave antal prøver, der samtidig kan behandles. Dette skyldes hovedsageligt den tidsfølsomme håndtering af prøver i afsnit 1, som indebærer betydelige hvirvler trin i den antimikrobielle opløsning i mellem tilsætning af forbindelsen til kulturerne for at undgå sedimentering. Dette kan dog ikke være et sådant problem, når forskellige opløselige stressorer anvendes. Desuden giver den beskrevne procedure ingen tidsfor løste oplysninger om proteinaggregatets placering og bane, hvilket ville kræve mere avancerede teknikker såsom fluorescensmikroskopi i kombination med time-lapse mikroskopi25. Sammenfattende er den forbedrede metode enkel, let at følge, billig og giver mulighed for yderligere modifikation, der giver mulighed for en skræddersyet tilgang til identifikation af proteotoksiske forbindelser eller bakterielle stressresponsgener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Illinois State University School of Biological Sciences start midler, Illinois State University New Faculty Initiative Grant, og NIAID tilskud R15AI164585 (til J.-U. D.). G.M.A. blev støttet af Illinois State University Undergraduate Research Support Program (til G.M.A.). K.P.H. blev støttet af et RISE-stipendium fra den tyske akademiske udvekslingstjeneste (DAAD). Forfatterne takker Dr. Uwe Landau og Dr. Carsten Meyer fra Largentech Vertriebs GmbH for at levere AGXX pulver. Figur 1, Figur 2, Figur 3, Figur 4og Figur 5 blev genereret med Biorender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/Reagents | |||
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
| 30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
| Ammonium persulfate | Millipore Sigma | A3678-100G | |
| Benzonase nuclease | Sigma | E1014-5KU | |
| Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
| Bromophenol blue | GoldBio | B-092-25 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
| D-Glucose | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
| D-Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
| Glacial Acetic acid | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
| Glycerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
| Glycine | GoldBio | G-630-1 | |
| Hydrochloric acid, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
| Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
| LB broth (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
| LB broth with agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
| Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
| 10x MOPS Buffer | Teknova | M2101 | |
| Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
| Potassium phosphate, monobasic | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
| 100% Trichloroacetic acid | Millipore Sigma | T6399-100G | |
| Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
| Material/Equipment | |||
| Centrifuge tubes (15 mL) | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
| Erlenmeyer flask (125 mL) | Carolina | 726686 | |
| Erlenmeyer flask (500 mL) | Carolina | 726694 | |
| Freezer: -80 °C | Fisher Scientific | ||
| Glass beads (0.5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
| Microcentrifuge | Hermle | Z216MK | |
| Microcentriguge tubes (1.7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
| Microcentriguge tubes (2.0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
| Plastic cuvettes | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
| Power supply | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
| Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
| Shaking incubator (37 °C) | Benchmark Scientific | ||
| Small glass plate | Bio-Rad | 1653311 | |
| Spacer plates (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
| Spectrophotometer | Thermoscientific | 3339053 | |
| Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes | Beckman-Coulter | ||
| Vertical gel electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1658004 | |
| Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
| Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| 10 well comb | Bio-Rad | 1653359 |
References
- Dahl, J. -U., et al. HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).
- Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A.
- Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -U. Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid. Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).
- Dahl, J. -U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
- Groitl, B., Dahl, J. -U., Schroeder, J. W., Jakob, U. Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants. Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).
- Casadevall, A. Thermal restriction as an antimicrobial function of fever. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).
- Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. The heat shock response: life on the verge of death. Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).
- Van Loi, V., Busche, T., Preuß, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. The AGXX ® antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus. Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).
- Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. Experimental and theoretical aspects of protein folding. Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).
- Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K.
- Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).
- Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
- Weids, A. J., Ibstedt, S., Tamás, M. J., Grant, C. M. Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties. Scientific Reports. 6, 24554 (2016).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Fay, A., Glickman, M. S. An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding. PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).
- Schramm, F. D., Heinrich, K., Thüring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus. PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).
- Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells. Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).
- Heiss, A., Freisinger, B., Held-Föhn, E. Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles. Biointerphases. 12 (5), (2017).
- Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast. Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).
- Chuang, S. E., Blattner, F. R. Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).
- Imlay, J. A. The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).
- Mühlhofer, M., et al. The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins. Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).
- Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. Metal homeostasis and resistance in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).
- Stevens, M., et al. HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).
- Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus. Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).
