Summary
Dit protocol beschrijft de extractie en visualisatie van geaggregeerde en oplosbare eiwitten uit Escherichia coli na behandeling met een proteotoxisch antimicrobieel middel. Het volgen van deze procedure maakt een kwalitatieve vergelijking mogelijk van de vorming van eiwitaggregaten in vivo in verschillende bacteriestammen en/of tussen behandelingen.
Abstract
De blootstelling van levende organismen aan omgevings- en cellulaire stress veroorzaakt vaak verstoringen in eiwithomeostase en kan resulteren in eiwitaggregatie. De accumulatie van eiwitaggregaten in bacteriële cellen kan leiden tot significante veranderingen in het cellulaire fenotypische gedrag, waaronder een vermindering van groeisnelheden, stressbestendigheid en virulentie. Er bestaan verschillende experimentele procedures voor het onderzoek van deze stressor-gemedieerde fenotypen. Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerde test voor de extractie en visualisatie van geaggregeerde en oplosbare eiwitten uit verschillende Escherichia coli-stammen na behandeling met een zilver-ruthenium-bevattende antimicrobiële stof. Van deze verbinding is bekend dat het reactieve zuurstofsoorten genereert en wijdverspreide eiwitaggregatie veroorzaakt.
De methode combineert een op centrifugatie gebaseerde scheiding van eiwitaggregaten en oplosbare eiwitten uit behandelde en onbehandelde cellen met daaropvolgende scheiding en visualisatie door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en Coomassie-kleuring. Deze aanpak is eenvoudig, snel en maakt een kwalitatieve vergelijking mogelijk van de vorming van eiwitaggregaten in verschillende E. coli-stammen. De methodologie heeft een breed scala aan toepassingen, waaronder de mogelijkheid om de impact van andere proteotoxische antimicrobiële stoffen op in vivo eiwitaggregatie in een breed scala aan bacteriën te onderzoeken. Bovendien kan het protocol worden gebruikt om genen te identificeren die bijdragen aan een verhoogde resistentie tegen proteotoxische stoffen. Gelbanden kunnen worden gebruikt voor de daaropvolgende identificatie van eiwitten die bijzonder gevoelig zijn voor aggregatie.
Introduction
Bacteriën worden onvermijdelijk blootgesteld aan een groot aantal omgevingsstressen, waaronder een lage pH (bijvoorbeeld in de maag van zoogdieren)1,2,reactieve zuurstof- en chloorsoorten (ROS / RCS) (bijvoorbeeld tijdens oxidatieve uitbarsting in fagocyten)3,4,5,verhoogde temperaturen (bijvoorbeeld in warmwaterbronnen of tijdens hitteschok)6,7en verschillende krachtige antimicrobiële stoffen (bijv. AGXX gebruikt in dit protocol)8. Eiwitten zijn bijzonder kwetsbaar voor een van deze stressoren en blootstelling kan leiden tot het ontvouwen van eiwitten die vervolgens zadenaggregatie veroorzaken. Alle organismen maken gebruik van beschermende systemen die hen in staat stellen om te gaan met eiwit misfolding9. Ernstige stress kan echter de eiwitkwaliteitscontrolemachines overweldigen en de secundaire en / of tertiaire structuur van eiwitten verstoren, wat uiteindelijk eiwitten inactiveert. Als gevolg hiervan kunnen eiwitaggregaten ernstige afbreuk doen aan kritieke cellulaire functies die nodig zijn voor bacteriële groei en overleving, stressbestendigheid en virulentie10. Daarom is onderzoek gericht op eiwitaggregatie en de gevolgen ervan in bacteriën een relevant onderwerp vanwege de potentiële impact op de bestrijding van infectieziekten.
Warmte-geïnduceerde eiwit ontvouwen en aggregatie zijn vaak omkeerbaar7. Daarentegen kunnen andere proteotoxische spanningen, zoals oxidatieve stress, onomkeerbare eiwitmodificaties veroorzaken door de oxidatie van specifieke aminozuurzijketens, wat resulteert in eiwitont-/misvouwen en uiteindelijk eiwitaggregatie4. Stress-geïnduceerde vorming van onoplosbare eiwitaggregaten is uitgebreid bestudeerd in de context van moleculaire chaperonnes en hun beschermende functies in gist en bacteriën11,12,13. Er zijn verschillende protocollen gepubliceerd die een verscheidenheid aan biochemische technieken gebruiken voor de isolatie en analyse van onoplosbare eiwitaggregaten14,15,16,17. De bestaande protocollen zijn voornamelijk gebruikt om bacteriële eiwitaggregatie te bestuderen bij hitteschok en /of identificatie van moleculaire chaperones. Hoewel deze protocollen zeker een vooruitgang in het veld zijn geweest, zijn er enkele grote ongemakken in de experimentele procedures omdat ze (i) een groot bacteriekweekvolume van maximaal 10 L14,17, (ii) gecompliceerde fysieke verstoringsprocessen vereisen, waaronder het gebruik van celverstoorders, Franse pers en / of ultrasoonapparaat14,15,17of (iii) tijdrovende herhaalde herhaalde wassen en incubatie stappen15,16,17.
Dit artikel beschrijft een aangepast protocol dat gericht is op het aanpakken van de beperkingen van de vorige benaderingen en maakt de analyse mogelijk van de hoeveelheid eiwitaggregaten gevormd in twee verschillende Escherichia coli-stammen na behandeling met een proteotoxische antimicrobiële oppervlaktecoating. De coating bestaat uit metaal-zilver (Ag) en ruthenium (Ru) -geconditioneerd met ascorbinezuur, en de antimicrobiële activiteit wordt bereikt door het genereren van reactieve zuurstofsoorten8,18. Hierin is een gedetailleerde beschrijving van de bereiding van de bacteriecultuur na behandeling met de antimicrobiële verbinding en een vergelijking van de eiwitaggregatiestatus bij blootstelling van twee E. coli-stammen met verschillende gevoeligheidsprofielen aan toenemende concentratie van de antimicrobiële stof. De beschreven methode is goedkoop, snel en reproduceerbaar en kan worden gebruikt om eiwitaggregatie te bestuderen in aanwezigheid van andere proteotoxische verbindingen. Bovendien kan het protocol worden aangepast om de impact te analyseren die specifieke gendeleties hebben op eiwitaggregatie in een verscheidenheid aan verschillende bacteriën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stressbehandeling van E. coli stammen MG1655 en CFT073
- Ent 5 ml lysogeniebouillon (LB) medium met een enkele kolonie commensale E. coli stam MG1655 en uropathogene E. coli (UPEC) stam CFT073, respectievelijk, en incubeer gedurende 14-16 uur ('s nachts) bij 37 °C en 300 tpm.
OPMERKING: Escherichia coli CFT073 is een menselijke ziekteverwekker. De behandeling van CFT073 moet worden uitgevoerd met passende bioveiligheidsmaatregelen in een bioveiligheidsniveau 2-gecertificeerd laboratorium. - Verdun elke stam in een kolf van 500 ml met 70 ml 3-(N-morfolino)propaansulfonzuur (MOPS)-glucose (MOPS-g) (tabel 1) medium tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van 0,1. Incubeer bij 37 °C en 300 tpm tot het midden van de logfase is bereikt (OD600 = 0,5-0,55).
- Breng 20 ml van elke cultuur over in drie voorgewarmde kolven van 125 ml en incubeer bij 37 °C en 300 tpm gedurende 2 minuten.
OPMERKING: Aangezien tijdige verwerking van de monsters vereist is, moet u niet meer dan 6 culturen tegelijk verwerken. - Bereid een antimicrobiële samengestelde oplossing in MOPS-g medium in een concentratie van 2 mg/ml. Voeg de antimicrobiële stof toe aan elke cultuur om de aangegeven concentraties te bereiken. Voeg voor de onbehandelde regeling het vereiste volume MOPS-g medium toe.
OPMERKING: Vortex de antimicrobiële oplossing van 2 mg/ml om een gelijkmatige verdeling van de samengestelde deeltjes mogelijk te maken en sedimentatie te voorkomen. - Incubeer de culturen gedurende 45 minuten bij 37 °C en 300 tpm.
Figuur 1: Escherichia coli stressbehandeling. Bacterieculturen worden gekweekt in MOPS-g en behandeld met de aangegeven concentraties van de zilver-ruthenium-bevattende antimicrobiële wanneer de mid-log fase wordt bereikt. Afkortingen: LB = lysogeny bouillon; Ag-Ru = zilver-ruthenium; MOPS-g = 3-(N-morfolino)propaansulfonzuur (MOPS)-glucose. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Verzamelen van bacteriële celmonsters
- Bepaal na 45 minuten stressbehandeling de OD600 van elke cultuur. Oogst voor elk monster cellen gelijk aan 4 ml OD600 = 1 op de 15 ml centrifugebuizen door centrifugeren gedurende 15 minuten bij 3.000 × g en 4 °C.
- Verwijder het supernatant volledig en resuspend de celkorrels in 50 μL ijskoude lysisbuffer(tabel 1). Incubeer de monsters gedurende 30 minuten op ijs.
OPMERKING: Deze lysisstap degradeert de peptidoglycanlaag. Gebruik altijd vers bereide lysisbuffer. - Breng de monsters over in microcentrifugebuizen van 1,7 ml. Invriezen bij -80 °C tot verder gebruik.
Figuur 2: Verzameling van bacteriële monsters. Celmonsters worden geoogst door centrifugering en geresuspendeerd in lysisbuffer gevolgd door opslag bij -80 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Extractie van de onoplosbare eiwitaggregaten
- Ontdooi monsters op ijs.
OPMERKING: De vries-dooicyclus draagt bij aan de cellysis. - Voeg 360 μL ijskoude buffer A(tabel 1)toe en meng voorzichtig door te pipetteren.
OPMERKING: De osmotische shock zal ook bijdragen aan cellysis. - Breng het monster over in een microcentrifugebuis van 2 ml met ~200 μL glasparels van 0,5 mm. Incubeer gedurende 30 min bij 8 °C in een thermomixer met schudden bij 1.400 tpm.
OPMERKING: Deze stap resulteert in de fysieke verstoring van de cel. Een proteaseremmer kan worden gebruikt om eiwitafbraak te minimaliseren. De storing kan worden uitgevoerd bij 4 °C. Merk op dat het gebruik van glaskralen is gemeld om aggregatie van een kleine subset van eiwitten in gist te induceren19. - Incubeer gedurende 5 minuten op ijs zonder te schudden om de glaskralen te laten bezinken. Breng 200 μL van het cellysaat over in microcentrifugebuizen van 1,7 ml.
OPMERKING: Vermijd de overdracht van de glaskralen. - Centrifugeer bij 16.000 × g en 4 °C gedurende 20 minuten. Verzamel het supernatant, dat oplosbare eiwitten bevat, en ga verder met sectie 4.
- Resuspend de pellet in 200 μL ijskoude buffer A (tabel 1) met behulp van de pipet. Centrifugeer bij 16.000 × g en 4 °C gedurende 20 minuten. Verwijder het supernatant voorzichtig helemaal.
- Voeg 200 μL ijskoude buffer B (zie tabel 1 en de tabel met materialen) toe en pipetteer de pellet voorzichtig opnieuw door pipetteren.
OPMERKING: Het niet-ionische wasmiddel solubilizeert membraaneiwit. - Herhaal de centrifugatie bij 16.000 × g en 4 °C gedurende 20 minuten. Verwijder het supernatant voorzichtig.
- Resuspend de pellet in 200 μL koudebuffer A (tabel 1) door pipetteren. Centrifugeer bij 16.000 × g en 4 °C gedurende 20 minuten. Verwijder het supernatant volledig.
- Resuspend de pellet in 100 μL van 1x reducerende SDS-monsterbuffer(tabel 1)en kook gedurende 5 minuten bij 95 °C in een thermomixer.
- Bewaar het monster bij -20 °C om later verder te gaan of laad het onmiddellijk op een SDS-polyacrylamidegel voor scheiding.
Figuur 3: Extractie van onoplosbare eiwitaggregaten. De extractie van eiwitaggregaten omvat een reeks stappen, waaronder celverstoring, de scheiding van eiwitaggregaten van oplosbare eiwitten, de oplosbaarheid van membraaneiwitten en wassen. Afkorting: SDS = natriumdodecylsulfaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Bereiding van oplosbare eiwitmonsters
- Meng 1 volume 100% trichloorazijnzuur (TCA) met 4 volumes oplosbaar eiwitmonster uit stap 3.6.
OPMERKING: Het hanteren van TCA vereist een zuurkast en persoonlijke beschermingsmiddelen en een goedgekeurde afvalverwijderingsprocedure. - Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C om eiwitneerslag mogelijk te maken.
OPMERKING: Wit neerslag zal zeer binnenkort verschijnen. - Centrifugeer om neer te slaan bij 21.000 × g en 4 °C gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Was de pellet met 200 μL ijskoude aceton om celresten te verwijderen. Centrifugeer bij 21.000 × g en 4 °C gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Herhaal deze acties in stap 4.3 in totaal drie keer.
- Plaats de microcentrifugebuizen met open deksels in een thermomixer bij 37 °C om de resterende aceton uit de pellet te verwijderen.
OPMERKING: Incubatie van meer dan 5 minuten kan de oplosbaarheid van de eiwitkorrel verminderen. - Voeg 100 μL 1x reducerende SDS-buffer(tabel 1)toe en los de pellet volledig op. Kook het monster gedurende 5 minuten bij 95 °C.
- Bewaar het monster bij -20 °C om later verder te gaan of laad het onmiddellijk op een SDS-polyacrylamidegel voor scheiding.
Figuur 4: Bereiding van oplosbare eiwitten. De bereiding van oplosbaar eiwit omvat een precipitatiestap met trichloorazijnzuur en herhaald wassen met ijskoude aceton. Afkortingen: TCA = trichloorazijnzuur; SDS = natriumdodecylsulfaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Scheiding en visualisatie van geëxtraheerde eiwitaggregaten met behulp van SDS-PAGE
- Bereid een 12% SDS-polyacrylamide gel.
- Pipetteer voor twee scheidingsgels 5,1 ml dubbel gedestilleerd water (ddH2O), 3,75 ml Tris-HCl (pH 8,8), 7,5 ml 20% (w/v) SDS, 6 ml 30% acrylamide/bisacrylamide (29:1) oplossing, 75 ml 10% w/v ammoniumperssulfaat en 10 ml tetramethylethyleendiamine (TEMED) in een centrifugebuis van 15 ml en meng voorzichtig zonder luchtbellen in te brengen. Giet de gel met een pipet van 1 ml in de glasplaten, waarbij de bovenste 2 cm vrij blijft van het mengsel. Voeg 70% ethanol toe aan de bovenkant van de scheidingsgel en zorg voor een gelijkmatige interface tussen de twee lagen.
- Na polymerisatie van de scheidende gel, bereidt u de stapelgel door 1,535 ml ddH2O, 625 ml Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 ml van 20% (w / v) SDS, 335 ml van 30% acrylamide / bisacrylamide (29:1) oplossing, 12,5 ml van 10% w / v ammoniumpersulfaat en 2,5 ml TEMED te pipetteren. Verwijder de ethanol uit de scheidingsgels en voeg de stapelgeloplossing toe. Plaats een kam met het gewenste aantal zakken zonder luchtbellen te introduceren. Laat polymerisatie 20-30 min.
- Laad 4 μL van elk monster en eiwitladder in afzonderlijke putten en laat de gel(en) in Tris-Glycine-loopbuffer(tabel 1)gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur op 144 V lopen.
OPMERKING: Stop de gel wanneer de broomfenolband op het punt staat uit de gel te migreren. - Kleur de gel(en) in een voorverwarmde Fairbanks-oplossing A (tabel 1) gedurende 30 minuten op een wip.
- Ontkleur de gel(en) in een voorverwarmde Fairbanks-oplossing D (tabel 1) tot de gewenste achtergrond (bijv. 's nachts) op een wip.
Figuur 5: Eiwitscheiding en visualisatie. De monsters worden gescheiden door SDS-PAGE en gevisualiseerd door Coomassie kleuring. Afkorting: SDS-PAGE = natrium dodecylsulfaat-polyacrylamide gel elektroforese. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 6: Representatieve resultaten van antimicrobieel geïnduceerde eiwitaggregatie in commensale Escherichia coli stam MG1655 en UPEC stam CFT073. E. coli stammen MG1655 en CFT073 werden gekweekt bij 37 °C en 300 rpm tot OD600= 0,5-0,55 in MOPS-g media voordat ze werden behandeld met de aangegeven concentraties (-, 0 mg/ml; +, 175 mg/ml; ++, 200 mg/ml) van de antimicrobiële stof gedurende 45 minuten. Oplosbare en onoplosbare eiwitmonsters werden bereid zoals beschreven in het protocol en figuur 1, figuur 2, figuur 3 en figuur 4 en gevisualiseerd op een 12% SDS polyacrylamide-gel(figuur 5). De vorming van eiwitaggregaten (onoplosbare fractie) was in beide stammen verhoogd in aanwezigheid van de antimicrobiële stof, terwijl de hoeveelheden oplosbare eiwitten werden verminderd. Over het algemeen had de antimicrobiële stof een veel krachtiger effect op MG1655 dan op CFT073. Afkortingen: M= Protein marker; UPEC = uropathogene E. coli; MOPS-g = 3-(N-morfolino)propaansulfonzuur (MOPS)-glucose; SDS = natriumdodecylsulfaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Hier werden twee E. coli-stammen gebruikt die verschillen in hun gevoeligheid voor een proteotoxisch zilver-ruthenium-bevattende antimicrobiële stof om dit protocol aan te tonen. Voorlopige overlevingsgegevens toonden aan dat de commensale E. coli-stam MG1655 significant gevoeliger is voor de ROS-genererende antimicrobiële stof dan de UPEC-stam CFT073 (gegevens niet weergegeven). Beide soorten werden gekweekt in MOPS-g media bij 37 °C en 300 rpm. In de midlogfase werden de cellen onbehandeld gelaten of behandeld met respectievelijk 175 μg/ml en 200 μg/ml van de antimicrobiële stof en gedurende 45 minuten geïncubeerd. Vervolgens werden de cellen gelyseerd en cellulaire eiwitaggregaten gescheiden van de oplosbare eiwitten. Eiwitten in beide fracties werden vervolgens gescheiden door SDS-PAGE en gevisualiseerd door Coomassie-kleuring. De onoplosbare fractie in figuur 6 geeft de hoeveelheid gevormde eiwitaggregaten weer, die werd verhoogd wanneer cellen werden geïncubeerd in aanwezigheid van de antimicrobiële stof in vergelijking met onbehandelde cellen. De toename van de vorming van eiwitaggregaten was onafhankelijk van de stamachtergrond, hoewel een veel meer uitgesproken toename van de geaggregeerde vorming werd gedetecteerd in de meer gevoelige stam MG1655. Omgekeerd werden lagere hoeveelheden oplosbare eiwitten (oplosbare fractie) waargenomen na antimicrobiële behandeling van de cellen in vergelijking met de onbehandelde tegenhanger. Dit resultaat werd verwacht gezien de voorlopige gegevens die een aanzienlijk hogere tolerantie van de antimicrobiële stof in CFT073 lieten zien dan MG1655.
| Oplossingen | Recepten |
| Buffer A | 10 mM kaliumfosfaat (pH 6,5), 1 mM EDTA |
| Buffer B | Buffer A met 2% niet-idet P-40. Kan bij kamertemperatuur worden bewaard voor later gebruik. |
| Fairbanks A (Kleuroplossing) | 25% isopropanol, 10% ijsazijn, 1,4 g Coommassie R-250 |
| Fairbanks D (Destaining oplossing) | 10% glaciale azijnzuuroplossing |
| Lysisbuffer | 10 mM kaliumfosfaat (pH 6,5), 1 mM EDTA, 20% sucrose kan worden bereid en bewaard bij kamertemperatuur voor langdurig gebruik. Voeg voor gebruik 1 mg/ml lysozym en 50 u/ml benzonase vers toe. |
| MOPS-g media | 100 ml 10x MOPS, 10 ml 0,132 M K2HPO4, 10 ml 20% glucose, 0,5 ml 20 mM thiamine. Vul tot 1 L met ddH2O en steriel filter |
| 1x SDS monsterbuffer | 6,5 mM Tris-HCl (pH 7), 10% glycerol, 2% SDS, 0,05% broomfenolblauw en 2,5% β-mercaptoethanol. Bewaard bij -20 °C. |
| 12% SDS polyacrylamide gelpreparaat (voor 2 gels) | Scheidingsgel: 5,1 ml ddH2O, 3,75 ml Tris-HCl (pH 8,8), 75 ml 20% w/v SDS, 6 ml 30% acrylamide/bisacrylamideoplossing 29:1 oplossing, 75 ml 10% w/v ammoniumsulfaat, 10 ml TEMED |
| Stapelgel: 1,535 ml ddH2O, 625 ml Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 ml 20% w/v SDS, 335 ml 30% acrylamide/bisacrylamideoplossing 29:1 oplossing, 12,5 ml 10% w/v ammoniumpersulfaat, 2,5 ml TEMED | |
| SDS-buffer | 25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0,1% SDS in ddH2O. Bewaren bij kamertemperatuur. |
Tabel 1: Buffer, media en oplossingen. Recepten voor buffer, media en oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methodologie voor de analyse van eiwitaggregatievorming na behandeling van verschillende E. coli-stammen met een proteotoxisch antimicrobieel middel. Het protocol maakt de gelijktijdige extractie van onoplosbare en oplosbare eiwitfracties uit behandelde en onbehandelde E. coli-cellen mogelijk. In vergelijking met bestaande protocollen voor eiwitaggregatie-isolatie uit cellen14,15,16,20heeft deze methode verschillende voordelen: (i) er zijn slechts kleine kweekvolumes (4-8 ml) nodig; ii) het celverstoringsproces is niet afhankelijk van speciale apparatuur zoals een Franse pers, celverstoorder of sonicator; en (iii) het protocol is gemakkelijk te volgen, zelfs voor relatief vroege wetenschappers in het veld.
Bacteriën ondervinden een groot aantal stress in hun natuurlijke omgeving, en velen van hen vormen een bedreiging, met name voor eiwitten, het meest voorkomende macromolecuul in de cel21. De beschreven methodiek biedt veel mogelijke toepassingen. Een daarvan is de mogelijkheid om de werkzaamheid te onderzoeken waarmee een breed scala aan spanningen (bijv. Verhoogde temperaturen, reactieve zuurstofsoorten, reactieve chloorsoorten) en chemische verbindingen de eiwithomeostase in bacteriën, archaea en zelfs eukaryote cellenbeïnvloeden 5,12,22,23. Onze extractie werd uitgevoerd met de twee ver verwante E. coli stammen, MG1655 en CFT073. Het is echter ook met succes toegepast om de rol van specifieke genproducten voor eiwithomeostase te bestuderen door eiwitaggregatievorming in wildtype en mutante stammen te vergelijken11,12.
Na het overwegen van geschikte aanpassingen en het oplossen van groeiomstandigheden en stressorconcentraties, kan dit protocol ook worden gebruikt om de vorming van eiwitaggregaten in andere Gram-negatieve5- en Gram-positieve bacteriën8te bepalen . Met name de gelbanden gescheiden na SDS-PAGE kunnen densitometrisch worden geanalyseerd (d.w.z. met behulp van ImageJ). Deze aanpak kan ook worden gebruikt om de impact van aanvullende therapeutische verbindingen zoals remmers van moleculaire chaperones te analyseren24. Het meest intrigerend is dat het kan worden gecombineerd met massaspectrometrische benaderingen om informatie te verstrekken over het type eiwitsoort dat aggregatiegevoelig is onder een specifieke stressconditie, simpelweg door hun aan- of afwezigheid in de onoplosbare eiwitfractie te bepalen5,15.
Het succes van dit protocol vereist een zorgvuldige afweging van de stressorconcentraties waaraan cellen worden blootgesteld en de blootstelling. We raden daarom aan om een voorlopige overlevingstest uit te voeren met toenemende stressorconcentraties om de proteotoxische concentratie te bepalen. Bovendien moeten de stressoroplossingen vóór elk experiment vers worden bereid en moeten de bemonsteringstijden consistent worden gehouden. Een beperking van deze methode is het lage aantal monsters dat tegelijkertijd kan worden verwerkt. Dit is voornamelijk te wijten aan de tijdgevoelige behandeling van monsters in sectie 1, waarbij aanzienlijke vortexstappen van de antimicrobiële oplossing worden uitgevoerd tussen de toevoeging van de verbinding aan de culturen om sedimentatie te voorkomen. Dit is echter mogelijk niet zo'n probleem wanneer verschillende oplosbare stressoren worden toegepast. Bovendien biedt de beschreven procedure geen tijdsgeoemde informatie over de locatie en het traject van eiwitaggregatie, wat meer geavanceerde technieken zou vereisen, zoals fluorescentiemicroscopie in combinatie met time-lapse-microscopie25. Kortom, de verbeterde methodologie is eenvoudig, gemakkelijk te volgen, goedkoop en biedt het potentieel voor extra modificatie die een op maat gemaakte aanpak mogelijk maakt voor het identificeren van proteotoxische verbindingen of bacteriële stressresponsgenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door illinois state university school of biological sciences startup fondsen, Illinois State University New Faculty Initiative Grant, en de NIAID grant R15AI164585 (aan J.-U. D.). G.M.A. werd ondersteund door het Illinois State University Undergraduate Research Support Program (aan G.M.A.). K.P.H. werd ondersteund door een RISE-beurs van de Duitse Academische Uitwisselingsdienst (DAAD). De auteurs bedanken Dr. Uwe Landau en Dr. Carsten Meyer van Largentech Vertriebs GmbH voor het leveren van het AGXX poeder. Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3, Figuur 4en Figuur 5 zijn gegenereerd met Biorender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/Reagents | |||
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
| 30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
| Ammonium persulfate | Millipore Sigma | A3678-100G | |
| Benzonase nuclease | Sigma | E1014-5KU | |
| Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
| Bromophenol blue | GoldBio | B-092-25 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
| D-Glucose | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
| D-Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
| Glacial Acetic acid | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
| Glycerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
| Glycine | GoldBio | G-630-1 | |
| Hydrochloric acid, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
| Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
| LB broth (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
| LB broth with agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
| Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
| 10x MOPS Buffer | Teknova | M2101 | |
| Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
| Potassium phosphate, monobasic | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
| 100% Trichloroacetic acid | Millipore Sigma | T6399-100G | |
| Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
| Material/Equipment | |||
| Centrifuge tubes (15 mL) | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
| Erlenmeyer flask (125 mL) | Carolina | 726686 | |
| Erlenmeyer flask (500 mL) | Carolina | 726694 | |
| Freezer: -80 °C | Fisher Scientific | ||
| Glass beads (0.5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
| Microcentrifuge | Hermle | Z216MK | |
| Microcentriguge tubes (1.7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
| Microcentriguge tubes (2.0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
| Plastic cuvettes | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
| Power supply | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
| Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
| Shaking incubator (37 °C) | Benchmark Scientific | ||
| Small glass plate | Bio-Rad | 1653311 | |
| Spacer plates (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
| Spectrophotometer | Thermoscientific | 3339053 | |
| Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes | Beckman-Coulter | ||
| Vertical gel electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1658004 | |
| Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
| Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| 10 well comb | Bio-Rad | 1653359 |
References
- Dahl, J. -U., et al. HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).
- Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A.
- Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -U. Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid. Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).
- Dahl, J. -U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
- Groitl, B., Dahl, J. -U., Schroeder, J. W., Jakob, U. Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants. Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).
- Casadevall, A. Thermal restriction as an antimicrobial function of fever. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).
- Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. The heat shock response: life on the verge of death. Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).
- Van Loi, V., Busche, T., Preuß, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. The AGXX ® antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus. Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).
- Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. Experimental and theoretical aspects of protein folding. Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).
- Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K.
- Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).
- Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
- Weids, A. J., Ibstedt, S., Tamás, M. J., Grant, C. M. Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties. Scientific Reports. 6, 24554 (2016).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Fay, A., Glickman, M. S. An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding. PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).
- Schramm, F. D., Heinrich, K., Thüring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus. PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).
- Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells. Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).
- Heiss, A., Freisinger, B., Held-Föhn, E. Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles. Biointerphases. 12 (5), (2017).
- Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast. Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).
- Chuang, S. E., Blattner, F. R. Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).
- Imlay, J. A. The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).
- Mühlhofer, M., et al. The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins. Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).
- Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. Metal homeostasis and resistance in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).
- Stevens, M., et al. HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).
- Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus. Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).
