Summary
Detta protokoll beskriver extraktion och visualisering av aggregerade och lösliga proteiner från Escherichia coli efter behandling med en proteotoxisk antimikrobiell. Enligt detta förfarande möjliggör en kvalitativ jämförelse av proteinaggregatbildning in vivo i olika bakteriestammar och/eller mellan behandlingar.
Abstract
Exponeringen av levande organismer för miljömässiga och cellulära påfrestningar orsakar ofta störningar i proteinhomeostas och kan leda till proteinaggregering. Ackumulering av proteinaggregat i bakterieceller kan leda till betydande förändringar i det cellulära fenotypiska beteendet, inklusive en minskning av tillväxthastigheter, stressresistens och virulens. Flera experimentella förfaranden finns för undersökning av dessa stressor-medierade fenotyper. Detta dokument beskriver en optimerad analys för extraktion och visualisering av aggregerade och lösliga proteiner från olika Escherichia coli stammar efter behandling med en silver-ruthenium-innehållande antimikrobiell. Denna förening är känd för att generera reaktiva syrearter och orsakar utbredd proteinaggregering.
Metoden kombinerar en centrifugeringsbaserad separation av proteinaggregat och lösliga proteiner från behandlade och obehandlade celler med efterföljande separation och visualisering genom natriumdidcylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och Coomassie färgning. Detta tillvägagångssätt är enkelt, snabbt och möjliggör en kvalitativ jämförelse av proteinaggregatbildning i olika E. coli-stammar. Metoden har ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive möjligheten att undersöka effekten av andra proteotoxiska antimikrobiella medel på in vivo-proteinaggregering i ett brett spektrum av bakterier. Dessutom kan protokollet användas för att identifiera gener som bidrar till ökad resistens mot proteotoxiska ämnen. Gelband kan användas för efterföljande identifiering av proteiner som är särskilt benägna att aggregering.
Introduction
Bakterier utsätts oundvikligen för en myriad av miljöbelastningar, inklusive lågt pH-kort (t.ex. i däggdjursmagen)1,2,reaktivt syre och klorarter (ROS/RCS) (t.ex. under oxidativ bristning i fagocyter)3,4,5, förhöjda temperaturer (t.ex. i varma källor eller under värmechock)6,7och potenta antimikrobiella medel (t.ex. AGXX som används i detta protokoll)8. Proteiner är särskilt sårbara för någon av dessa stressfaktorer, och exponering kan prova protein som inte/felveckas som sedan frön aggregering. Alla organismer använder skyddssystem som gör det möjligt för dem att klara av protein felvecka9. Allvarlig stress kan dock överväldiga proteinkvalitetskontrollmaskineriet och störa proteinstrukturen och/eller tertiärstrukturen hos proteiner, vilket i slutändan inaktiverar proteiner. Som en följd av detta kan proteinaggregat allvarligt försämra kritiska cellulära funktioner som krävs för bakterietillväxt och överlevnad, stressresistens och virulens10. Därför är forskning med fokus på proteinaggregering och dess konsekvenser i bakterier ett relevant ämne på grund av dess potentiella inverkan på infektionssjukdomsbekämpning.
Värmeinducerat protein som utvecklas och aggregering är ofta reversibla7. Däremot kan andra proteotoxiska påfrestningar, såsom oxidativ stress, orsaka irreversibla proteinmodifieringar genom oxidation av specifika aminosyra sidokedjor som resulterar i protein un-/felfolding och så småningom proteinaggregering4. Stressinducerad bildning av olösliga proteinaggregat har studerats utförligt i samband med molekylära förkläde och deras skyddande funktioner i jäst och bakterier11,12,13. Flera protokoll har publicerats som använder en mängd biokemiska tekniker för isolering och analys av olösliga proteinaggregat14,15,16,17. De befintliga protokollen har huvudsakligen använts för att studera bakteriell proteinaggregering vid värmechock och/eller identifiering av molekylära förkläde. Även om dessa protokoll verkligen har varit ett framsteg på fältet, finns det några stora olägenheter i de experimentella förfarandena eftersom de kräver (i) en stor bakteriekulturell volym på upp till 10 L14,17, (ii) komplicerade fysiska störningsprocesser, inklusive användning av cellstörare, fransk press och / eller ultraljudsbehandling14,15,17eller iii) tidskrävande upprepade tvätt- och inkubationssteg15,16,17.
Detta dokument beskriver ett modifierat protokoll som syftar till att ta itu med begränsningarna i tidigare metoder och möjliggör analys av mängden proteinaggregat som bildas i två olika Escherichia coli-stammar efter behandling med en proteotoxisk antimikrobiell ytbeläggning. Beläggningen består av metall-silver (Ag) och ruthenium (Ru)-konditionerad med askorbinsyra, och dess antimikrobiella aktivitet uppnås genom generering av reaktiva syrearter8,18. Häri är en detaljerad beskrivning av beredningen av bakteriekulturen efter behandling med den antimikrobiella föreningen och en jämförelse av proteinaggregeringsstatus vid exponering av två E. coli-stammar med distinkta känslighetsprofiler för att öka koncentrationen av antimikrobiell. Den beskrivna metoden är billig, snabb och reproducerbar och kan användas för att studera proteinaggregering i närvaro av andra proteotoxiska föreningar. Dessutom kan protokollet modifieras för att analysera den inverkan som specifika genborttagningar har på proteinaggregering i en mängd olika bakterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stressbehandling av E. coli-stammar MG1655 och CFT073
- Inokulera 5 ml lysogenbuljong (LB) medium med en enda koloni av kommensal E. coli stam MG1655 och uropathogenic E. coli (UPEC) stam CFT073, respektive, och inkubera för 14-16 h (över natten) vid 37 °C och 300 rpm.
OBS: Escherichia coli CFT073 är en human patogen. Hantering av CFT073 måste utföras med lämpliga biosäkerhetsåtgärder i ett Biosafety Level-2-certifierat labb. - Späd varje stam i en 500 ml kolv sominnehåller 70 ml 3-( N-morpholino)propansulfonsyra (MOPS)-glukos (MOPS-g)(tabell 1)medium till en optisk densitet vid 600 nm (OD600)värde av 0,1. Inkubera vid 37 °C och 300 varv/min tills mitt i stockfasen uppnås (OD600 = 0,5-0,55).
- Överför 20 ml av varje kultur till tre förvärmda 125 ml flaskor och inkubera vid 37 °C och 300 varv/min i 2 minuter.
OBS: Eftersom proverna bearbetas i rätt tid ska du inte hantera mer än 6 kulturer åt gången. - Bered en antimikrobiell föreningslösning i MOPS- g medium vid en koncentration av 2 mg/ml. Tillsätt det antimikrobiella till varje kultur för att nå de angivna koncentrationerna. För obehandlad kontroll, tillsätt önskad volym MOPS-g medium.
OBS: Virvel 2 mg/ml antimikrobiell lösning för att möjliggöra en jämn fördelning av de sammansatta partiklarna och undvika sedimentering. - Inkubera kulturerna i 45 minuter vid 37 °C och 300 varv/min.
Figur 1: Stressbehandling med Escherichia coli. Bakteriekulturer odlas i MOPS-g och behandlas med de angivna koncentrationerna av det silver-rutheniuminnehållande antimikrobiella när mittloggfasen uppnås. Förkortningar: LB = lysogeny buljong; Ag-Ru = silver-ruthenium; MOPS-g = 3-( N-morpholino)propansulfonsyra (MOPS)-glukos. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
2. Insamling av bakteriecellsprover
- Efter 45 minuters stressbehandling, bestäm OD600 av varje kultur. För varje prov, skörda celler motsvarande 4 ml OD600 = 1 i 15 ml centrifugeringsrör genom centrifugering i 15 minuter vid 3 000 × g och 4 °C.
- Avlägsna supernatanten helt och återanvänd cellpelletsen i 50 μL iskyl lysbuffert (Tabell 1). Inkubera proverna i 30 minuter på is.
OBS: Detta lyssteg försämrar peptidoglykanskiktet. Använd alltid nylagad lysbuffert. - Överför proverna till 1,7 ml mikrocentrifugrör. Frys vid -80 °C tills den används vidare.
Figur 2: Insamling av bakterieprover. Cellprover skördas genom centrifugering och återanvänds i lysbuffert följt av lagring vid -80 °C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. Extrahera de olösliga proteinaggregaten
- Tina prover på is.
OBS: Frys-töcykeln bidrar till celllys. - Tillsätt 360 μL iskall buffert A (tabell 1) och blanda försiktigt genom pipetting.
OBS: Osmotisk chock kommer också att bidra till celllys. - Överför provet till ett 2 ml mikrocentrifugrör på 2 ml som innehåller ~200 μL 0,5 mm glaspärlor. Inkubera i 30 min vid 8 °C i en termomixer med skakningar vid 1 400 varv/min.
OBS: Det här steget resulterar i fysiska störningar i cellen. En proteashämmare kan användas för att minimera proteinnedbrytning. Störningen kan utföras vid 4 °C. Observera att användningen av glaspärlor har rapporterats inducera aggregering av en liten delmängd proteiner i jäst19. - Inkubera i 5 minuter på is utan att skaka för att sätta glaspärlorna. Överför 200 μL av celllyaten till 1,7 ml mikrocentrifugrör.
OBS: Undvik överföring av glaspärlor. - Centrifug vid 16 000 × g och 4 °C i 20 min. Samla supernatanten, som innehåller lösliga proteiner, och fortsätt till avsnitt 4.
- Återanvänd pelleten i 200 μL iskall buffert A (tabell 1) med pipetten. Centrifug vid 16 000 × g och 4 °C i 20 min. Ta försiktigt bort supernaten helt och hållet.
- Tillsätt 200 μL iskall buffert B (se tabell 1 och materialförteckningen)och återanvänd försiktigt pelleten genom rörledning.
OBS: Det icke-joniska tvättmedlet lösligar membranprotein. - Upprepa centrifugering vid 16 000 × g och 4 °C i 20 minuter. Ta försiktigt bort supernaten.
- Återanvänd pelleten i 200 μL kallbuffert A (tabell 1) genom pipetting. Centrifug vid 16 000 × g och 4 °C i 20 min. Ta bort supernaten helt.
- Återanvänd pelleten i 100 μL 1x reducerande SDS-provbuffert(tabell 1)och koka i 5 min vid 95 °C i en termomixer.
- Förvara provet vid -20 °C för att senare eller omedelbart lasta på en SDS polyakrylamidgel för separation.
Figur 3: Utvinning av olösliga proteinaggregat. Utvinningen av proteinaggregat innebär en rad steg, inklusive cellstörningar, separation av proteinaggregat från lösliga proteiner, löslighet av membranproteiner och tvättning. Förkortning: SDS = natriumdcylsulfat. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
4. Beredning av lösligt proteinprov
- Blanda 1 volym 100% triklorättiksyra (TCA) med 4 volymer lösligt proteinprov från steg 3.6.
OBS: Hantering av TCA kräver en rökhuv och personlig skyddsutrustning och ett godkänt avfallshanteringsförfarande. - Inkubera i 10 min vid 4 °C för att möjliggöra proteinutfällning.
OBS: Vit fällning kommer att visas mycket snart. - Centrifugera för att fälla ut vid 21 000 × g och 4 °C i 5 minuter och ta bort supernaten. Tvätta pelleten med 200 μL iskallt aceton för att avlägsna cellulärt skräp. Centrifug vid 21 000 × g och 4 °C i 5 min och ta bort supernaten. Upprepa dessa åtgärder i steg 4.3 totalt tre gånger.
- Placera mikrocentrifugrören med öppna lock i en termomixer vid 37 °C för att avlägsna resterande aceton från pelleten.
OBS: Inkubation på mer än 5 min kan minska proteinpellets löslighet. - Tillsätt 100 μL 1x reducerande SDS-buffert (tabell 1) och lös upp pelleten helt. Koka provet i 5 minuter vid 95 °C.
- Förvara provet vid -20 °C för att senare eller omedelbart lasta på en SDS-polyakrylamidgel för separation.
Figur 4: Beredning av lösliga proteiner. Beredningen av lösligt protein innebär ett nederbördssteg med triklorättiksyra och upprepad tvättning med iskall aceton. Förkortningar: TCA = triklorättiksyra; SDS = natrium dodecylsulfat. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
5. Separation och visualisering av extraherade proteinaggregat med HJÄLP AV SDS-PAGE
- Förbered en 12% SDS-polyakrylamidgel.
- För två avskiljande geler, pipett 5,1 ml dubbeldestillerat vatten (ddH2O), 3,75 ml Tris-HCl (pH 8,8), 7,5 ml 20 % (w/v) SDS, 6 ml 30% akrylamid/bisakrylamidlösning (29:1), 75 ml 10% w/v ammoniumpersulfat och 10 ml tetramethylethyendiamin (TEMED) i ett 15 ml centrifugeringsrör och blanda försiktigt utan att införa luftbubblor. Häll gelén med en 1 ml rörledning i glasplattorna och lämna den övre 2 cm fri från blandningen. Tillsätt 70% etanol på toppen av avskiljgelen och låt ett jämnt gränssnitt mellan de två lagren.
- Efter polymerisation av avskiljande gel, förbered staplingsgelen genom att pipetting 1.535 mL ddH2O, 625 mL Tris-HCl (pH 6.8), 12.5 mL av 20% (w/v) SDS, 335 ml 30% akrylamid/bisakrylamidlösning (29:1), 12,5 ml 10% w/v ammoniumpersulfat och 2,5 ml TEMED. Ta bort etanolen från separerande geler och tillsätt staplingsgellösningen. Sätt i en kam med önskat antal fickor utan att införa luftbubblor. Tillåt polymerisation i 20-30 min.
- Ladda 4 μL av varje prov och proteinstege i separata brunnar och kör gelerna i Tris-Glycine löpbuffert(tabell 1)vid 144 V i 45 min vid rumstemperatur.
OBS: Stoppa gelén när bromophenolbandet är på väg att migrera ut ur gelén. - Färga gelen/gelerna i en förvärmd Fairbanks-lösning A (Tabell 1) i 30 min på en rocker.
- Avfärga gelen/gelerna i en förvärmd Fairbanks-lösning D(tabell 1)tills önskad bakgrund (t.ex. över natten) på en rocker.
Figur 5:Proteinseparation och visualisering. Exemplen separeras av SDS-PAGE och visualiseras av Coomassie-färgning. Förkortning: SDS-PAGE = natriumdcylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6: Representativa resultat av antimikrobiell inducerad proteinaggregering i kommensala Escherichia coli-stammar MG1655 och UPEC-stam CFT073. E. coli-stammarna MG1655 och CFT073 odlades vid 37 °C och 300 varv/min till OD600= 0, 5– 0,55 i MOPS- g-media innan de behandlades med de angivna koncentrationerna (-, 0 mg/ml; +, 175 mg/ml; ++, 200 mg/ml) av antimikrobiellt i 45 min. Lösliga och olösliga proteinprover utarbetades enligt beskrivningen i protokollet och figur 1, figur 2, figur 3och figur 4 och visualiserades på en 12 % SDS-polyakrylamidgel (figur 5). Proteinsammansamlande bildandet (olöslig fraktion) ökade i båda stammarna i närvaro av antimikrobiella medan mängden lösliga proteiner minskade. Sammantaget hade antimikrobiell en mycket mer potent effekt på MG1655 än på CFT073. Förkortningar: M= Proteinmarkör; UPEC = uropapatigen E. coli; MOPS-g = 3-( N-morpholino)propansulfonsyra (MOPS)-glukos; SDS = natrium dodecylsulfat. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Här användes två E. coli stammar som skiljer sig åt i deras mottaglighet för en proteotoxic silver-ruthenium-innehållande antimikrobiell för att visa detta protokoll. Preliminära överlevnadsdata visade att commensal E. coli-stammen MG1655 är betydligt känsligare för den ROS-genererande antimikrobiella än UPEC-stammen CFT073 (data som inte visas). Båda stammarna odlades i MOPS-g media vid 37 °C och 300 varv/min. I mitten av loggfasen lämnades cellerna antingen obehandlade eller behandlade med 175 μg/ml respektive 200 μg/ml av antimikrobiellt och inkuberades i 45 minuter. Därefter lysades cellerna och cellulära proteinaggregat separerades från lösliga proteiner. Proteiner i båda fraktionerna separerades sedan av SDS-PAGE och visualiserades av Coomassie färgning. Den olösliga fraktionen i figur 6 representerar den mängd proteinaggregat som bildades, vilket ökades när cellerna inkuberades i närvaro av antimikrobiella jämfört med obehandlade celler. Ökningen av proteinaggregatbildningen var oberoende av stambakgrunden, även om en mycket mer uttalad ökning av aggregerad bildning upptäcktes i den känsligare stammen MG1655. Omvänt observerades lägre mängder lösliga proteiner (löslig fraktion) efter antimikrobiell behandling av cellerna jämfört med den obehandlade motsvarigheten. Detta resultat förväntades med tanke på de preliminära uppgifter som visade en betydligt högre tolerans för antimikrobiell resistens i CFT073 än MG1655.
| Lösningar | Recept |
| Buffert A | 10 mM kaliumfosfat (pH 6,5), 1 mM EDTA |
| Buffert B | Buffert A som innehåller 2% Nonidet P-40. Kan förvaras i rumstemperatur för senare användning. |
| Fairbanks A (Färgningslösning) | 25% isopropanol, 10% glacial ättiksyra, 1,4 g Coommassie R-250 |
| Fairbanks D (Staining lösning) | 10% Glacial ättiksyralösning |
| Lysis buffert | 10 mM kaliumfosfat (pH 6,5), 1 mM EDTA, 20% sackaros kan beredas och förvaras vid rumstemperatur för långvarig användning. Tillsätt 1 mg/mL lysozyme och 50 u/mL Benzonase färsk före användning. |
| MOPS-g-media | 100 ml 10x MOPS, 10 ml 0,132 M K2HPO4, 10 ml 20% glukos, 0,5 ml 20 mM tiamin. Fyll upp till 1 L med ddH2O och sterilfilter |
| 1x SDS-provbuffert | 6,5 mM Tris-HCl (pH 7), 10% glycerol, 2% SDS, 0,05% bromophenol blå och 2,5% β-mercaptoethanol. Förvaras vid -20 °C. |
| 12% SDS polyakrylamidgelberedning (för 2 geler) | Avskiljande gel: 5,1 ml ddH2O, 3,75 ml Tris-HCl (pH 8,8), 75 ml 20 % w/v SDS, 6 ml 30 % akrylamid/bisakrylamidlösning 29:1 lösning, 75 ml 10 % w/v ammoniumpersulfat, 10 ml TEMED |
| Staplingsgel: 1.535 mL ddH2O, 625 ml Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 ml 20% w/v SDS, 335 ml 30% akrylamid/bisakrylamidlösning 29:1 lösning, 12,5 ml 10% w/v ammoniumpersulfat, 2,5 mL TEMED | |
| SDS-buffert som körs | 25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% SDS i ddH2O. Förvara i rumstemperatur. |
Tabell 1: Buffert, Media och Lösningar. Recept för buffert, media och lösningar som används i det här protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en optimerad metodik för analys av proteinaggregatbildning efter behandling av olika E. coli stammar med en proteotoxic antimikrobiell. Protokollet tillåter samtidig extraktion av olösliga och lösliga proteinfraktioner från behandlade och obehandlade E. coli-celler. Jämfört med befintliga protokoll för proteinaggregatisolering fråncellerna 14,15,16,20, har denna metod flera fördelar: i) endast små odlingsvolymer (4-8 mL) behövs; ii) Cellstörningsprocessen är inte beroende av särskild utrustning, t.ex. och iii) protokollet är lätt att följa även för relativt tidiga forskare inom området.
Bakterier möter en myriad av påfrestningar i sin naturliga miljö, och många av dem utgör ett hot, särskilt mot proteiner, den mest rikliga makromolekylen icellen 21. Den beskrivna metoden erbjuder många potentiella tillämpningar. En av dem är möjligheten att undersöka effekten genom vilken ett brett spektrum av påfrestningar (t.ex. förhöjda temperaturer, reaktiva syrearter, reaktiva klorarter) och kemiska föreningar påverkar proteinhomeostas hos bakterier, arkéer och till och med eukaryota celler5,12,22,23. Vår extraktion utfördes med de två avlägset relaterade E. coli stammar, MG1655 och CFT073. Men det har också framgångsrikt tillämpats för att studera rollen av specifika genprodukter för proteinhomeostas genom att jämföra proteinaggregatbildning i vilda och mutantastammar 11,12.
Efter att ha övervägt lämpliga modifieringar och felsökning av tillväxtförhållanden och stressorkoncentrationer kan detta protokoll också användas för att bestämma proteinaggregatbildning i andra Gramnegativa5 och Grampositiva bakterier8. Noterbart är att gelbanden separerade efter SDS-PAGE kan analyseras densitometriskt (dvs. med ImageJ). Detta tillvägagångssätt kan också användas för att analysera effekten av ytterligare terapeutiska föreningar såsom hämmare av molekylära förkläden24. Mest intressant kan det kombineras med masspektrometriska metoder för att ge information om vilken typ av proteinarter som är aggregeringskänsliga under ett specifikt stresstillstånd, helt enkelt genom att bestämma deras närvaro eller frånvaro i den olösliga proteinfraktionen5,15.
Framgången med detta protokoll kräver noggrann hänsyn till de stressorkoncentrationer som celler utsätts för och exponeringen. Vi rekommenderar därför att du utför en preliminär överlevnadsanalys med ökande stressorkoncentrationer för att bestämma den proteotoxiska koncentrationen. Dessutom bör stressorlösningarna beredas ny inför varje experiment, och provtagningstiderna bör hållas konsekventa. En begränsning av den här metoden är det låga antalet prover som samtidigt kan bearbetas. Detta beror främst på den tidskänsliga hanteringen av prover i avsnitt 1, vilket innebär betydande virvlande steg i den antimikrobiella lösningen mellan tillsats av föreningen till odlingarna för att undvika sedimentering. Detta kanske dock inte är en sådan fråga när olika lösliga stressfaktorer tillämpas. Dessutom ger det beskrivna förfarandet ingen tidsupplyst information om proteinaggregatens placering och bana, vilket skulle kräva mer avancerade tekniker såsom fluorescensmikroskopi i kombination med tidsfördröjningsmikroskopi25. Sammanfattningsvis är den förbättrade metoden enkel, lätt att följa, billig och erbjuder potential för ytterligare modifiering som möjliggör ett skräddarsytt tillvägagångssätt för att identifiera proteotoxiska föreningar eller bakteriella stressresponsgener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Illinois State University School of Biological Sciences startfonder, Illinois State University New Faculty Initiative Grant och NIAID-bidraget R15AI164585 (till J.-U. D.). G.M.A. stöddes av Illinois State University Undergraduate Research Support Program (till G.M.A.). K. P. H. stöttades av ett RISE-stipendium från den tyska akademiska växlingstjänsten (DAAD). Författarna tackar Dr. Uwe Landau och Dr. Carsten Meyer från Largentech Vertriebs GmbH för att tillhandahålla AGXX pulver. Figur 1, Figur 2, Figur 3, Figur 4och Figur 5 genererades med Biorender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals/Reagents | |||
| Acetone | Fisher Scientific | 67-64-1 | |
| 30% Acrylamide/Bisacrylamide solution 29:1 | Bio-Rad | 1610156 | |
| Ammonium persulfate | Millipore Sigma | A3678-100G | |
| Benzonase nuclease | Sigma | E1014-5KU | |
| Bluestain 2 Protein ladder, 5-245 kDa | GoldBio | P008-500 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M6250-100ML | |
| Bromophenol blue | GoldBio | B-092-25 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | MP Biomedicals LLC | 821616 | |
| D-Glucose | Millipore Sigma | G8270-1KG | |
| D-Sucrose | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | SLBT9686 | |
| Glacial Acetic acid | Millipore Sigma | ARK2183-1L | |
| Glycerol, 99% | Sigma-Aldrich | G5516-1L | |
| Glycine | GoldBio | G-630-1 | |
| Hydrochloric acid, ACS reagent | Sigma-Aldrich | 320331-2.5L | |
| Isopropanol (2-Propanol) | Sigma | 402893-2.5L | |
| LB broth (Miller) | Millipore Sigma | L3522-1KG | |
| LB broth with agar (Miller) | Millipore Sigma | L2897-1KG | |
| Lysozyme | GoldBio | L-040-25 | |
| 10x MOPS Buffer | Teknova | M2101 | |
| Nonidet P-40 | Thomas Scientific | 9036-19-5 | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma-Aldrich | P3786-1KG | |
| Potassium phosphate, monobasic | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-500G | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Millipore Sigma | T9281-50ML | |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T4625-100G | |
| 100% Trichloroacetic acid | Millipore Sigma | T6399-100G | |
| Tris base | GoldBio | T-400-1 | |
| Material/Equipment | |||
| Centrifuge tubes (15 mL) | Alkali Scientific | JABG-1019 | |
| Erlenmeyer flask (125 mL) | Carolina | 726686 | |
| Erlenmeyer flask (500 mL) | Carolina | 726694 | |
| Freezer: -80 °C | Fisher Scientific | ||
| Glass beads (0.5 mm) | BioSpec Products | 1107-9105 | |
| Microcentrifuge | Hermle | Z216MK | |
| Microcentriguge tubes (1.7 mL) | VWR International | 87003-294 | |
| Microcentriguge tubes (2.0 mL) | Axygen Maxiclear Microtubes | MCT-200-C | |
| Plastic cuvettes | Fischer Scientific | 14-377-012 | |
| Power supply | ThermoFisher Scientific | EC105 | |
| Rocker | Alkali Scientific | RS7235 | |
| Shaking incubator (37 °C) | Benchmark Scientific | ||
| Small glass plate | Bio-Rad | 1653311 | |
| Spacer plates (1 mm) | Bio-Rad | 1653308 | |
| Spectrophotometer | Thermoscientific | 3339053 | |
| Tabletop centrifuge for 15 mL centrifuge tubes | Beckman-Coulter | ||
| Vertical gel electrophoresis chamber | Bio-Rad | 1658004 | |
| Vortexer | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 | |
| Thermomixer | Benchmark Scientific | H5000-HC | |
| 10 well comb | Bio-Rad | 1653359 |
References
- Dahl, J. -U., et al. HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria. Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).
- Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A.
- Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -U. Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid. Infection and Immunity. 88 (7), 00964 (2020).
- Dahl, J. -U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
- Groitl, B., Dahl, J. -U., Schroeder, J. W., Jakob, U. Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants. Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).
- Casadevall, A. Thermal restriction as an antimicrobial function of fever. PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577 (2016).
- Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. The heat shock response: life on the verge of death. Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).
- Van Loi, V., Busche, T., Preuß, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. The AGXX ® antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus. Frontiers in Microbiology. 9, 3037 (2018).
- Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. Experimental and theoretical aspects of protein folding. Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).
- Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K.
- Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).
- Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
- Weids, A. J., Ibstedt, S., Tamás, M. J., Grant, C. M. Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties. Scientific Reports. 6, 24554 (2016).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Fay, A., Glickman, M. S. An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding. PLoS Genetics. 10 (7), 1004516 (2014).
- Schramm, F. D., Heinrich, K., Thüring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus. PLoS Genetics. 13 (12), 1007148 (2017).
- Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells. Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).
- Heiss, A., Freisinger, B., Held-Föhn, E. Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles. Biointerphases. 12 (5), (2017).
- Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast. Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).
- Chuang, S. E., Blattner, F. R. Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).
- Imlay, J. A. The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).
- Mühlhofer, M., et al. The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins. Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).
- Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. Metal homeostasis and resistance in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).
- Stevens, M., et al. HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).
- Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus. Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).
