Ricostruire il retinoblastoma umano in vitro
Summary
Descriviamo un metodo per generare retinoblastoma umano (RB) introducendo mutazioni bialleliche RB1 nelle cellule staminali embrionali umane (hESC). Le linee cellulari RB potrebbero anche essere coltivate con successo usando l’RB isolato in un piatto.
Abstract
La RB umana è un cancro pediatrico, che è letale se non viene somministrato alcun trattamento. Poiché RB proviene da precursori dei coni, che è relativamente raro nei modelli di roditori, nel frattempo per quanto riguarda le differenze interspecie tra esseri umani e roditori, un modello di malattia derivato dagli esseri umani è più vantaggioso per scoprire i meccanismi della RB umana e cercare gli obiettivi della terapia. Qui, il protocollo descrive la generazione di due linee hESC geneticamente modificate con una mutazione puntiforme RB1 biallelica (RB1 Mut/Mut) e una mutazione knockout RB1 (RB1–/-), rispettivamente. Durante il processo di sviluppo della retina, si osserva la formazione di RB. Le linee cellulari RB sono anche stabilite segregando dagli organoidi RB. Complessivamente, differenziando le linee hESC geneticamente modificate negli organoidi retinici utilizzando un protocollo di differenziazione combinato 2D e 3D, abbiamo ricostruito con successo il RB umano in un piatto e identificato la sua origine cono-precursore. Fornirebbe un utile modello di malattia per osservare la genesi, la proliferazione e la crescita del retinoblastoma, nonché per sviluppare ulteriormente nuovi agenti terapeutici.
Introduction
Il retinoblastoma umano (RB) è un tumore raro e fatale derivato dai precursori dei coni retinici 1,2,3, è il tipo più comune di neoplasia intraoculare nell’infanzia4. L’inattivazione omozigote del gene RB1 è la lesione genetica iniziale in RB5. Tuttavia, i topi con mutazioni RB1 non riescono a formare il tumore retinico2. Sebbene i tumori del topo possano essere generati con la combinazione di mutazioni di Rb1 e altre modificazioni genetiche, mancano ancora delle caratteristiche di RB 6umano. Grazie allo sviluppo della differenziazione organoide retinica, è stato possibile ottenere il RB derivato da hESC, che mostra i caratteri dell’RB umano1.
Negli ultimi dieci anni sono stati stabiliti numerosi protocolli per la differenziazione degli organoidi retinici, tra cui 2D7, 3D8 e una combinazione di 2D e 3D9. Il metodo utilizzato qui per generare il RB umano è il consolidamento della cultura aderente e della cultura fluttuante9. Differenziando l’hESC mutato RB1 in organoidi retinici, la formazione di RB viene rilevata intorno al giorno 45, e quindi prolifera rapidamente intorno al giorno 60. Il giorno 90, è possibile l’isolamento dei RB e la generazione della linea cellulare RB; inoltre, RB circonda quasi tutti gli organoidi retinici al giorno 120.
La RB derivata da hESC è un modello innovativo per esplorare l’origine, la tumorigenesi e i trattamenti per la RB. In questo protocollo, la generazione di hESC di editing genetico, la differenziazione di RB e la caratterizzazione per RB sono descritte in dettaglio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il retinoblastoma umano (RB) è causato dall’inattivazione di RB1 e dalla disfunzione della proteina Rb. In questo protocollo, l’hESC RB1-KO è il passo fondamentale per la generazione di RB in un piatto. Mentre anche con RB1–/- hESC, è possibile che non vi sia formazione di RB a causa dei metodi di differenziazione organoide retinica10. In questo protocollo, il trasferimento dalla coltura aderente alla coltura galleggiante è essenziale nel processo di diffe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il team 502 per tutto l’aiuto. Questo lavoro è in parte supportato dalla Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) e dal National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Antibody |
| Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Antibody |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Antibody |
| Anti-Syk (D3Z1E) | Cell Signaling Technology | 13198 | Antibody |
| BbsI | NEB | R3539S | Restriction enzymes |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Glutamine | Gibco | 35050-061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) | Gibco | 11765-054 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | Sigma | M7145 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection kit |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Puromycin | Gene Operation | ISY1130- 0025MG | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiPSC/hESC culture medium | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1 |
| Growth factor reduced basement membrane matrix | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
| Cell dissociation enzyme | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I |
| Supplement B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III |
| T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
References
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