インビトロでのヒト網膜芽細胞腫の再構築
Summary
ヒト胚性幹細胞に二対立遺伝子RB1変異を導入することによるヒト網膜芽細胞腫(RB)(RB)の生成方法について述べる。RB細胞株は、ディッシュ中で単離されたRBを用いて培養することもできた。
Abstract
ヒトRBは小児がんであり、治療を行わないと致命的です。RBは齧歯類モデルでは比較的稀な錐体前駆体に由来するため、ヒトとげっ歯類の種間差については、ヒト由来の疾患モデルの方がヒトRBのメカニズムの解明や治療対象探索に有益です。本明細書では、プロトコルは、それぞれ二対立遺伝子RB1点突然変異(RB1 Mut/Mut)およびRB1ノックアウト変異(RB1–/-)を有する2つの遺伝子編集hESC株の生成を記載する。網膜発達の過程で、RBの形成が観察される。RB細胞株はまた、RBオルガノイドから分離することによっても確立される。全体として、遺伝子編集されたhESC株を2Dおよび3D複合分化プロトコルを使用して網膜オルガノイドに分化させることにより、ディッシュ内でヒトRBを再構築し、その錐体前駆体の起源を特定することに成功しました。網膜芽細胞腫の発生、増殖、増殖を観察し、新規治療薬をさらに開発するための有用な疾患モデルを提供します。
Introduction
ヒト網膜芽細胞腫(RB)は、網膜錐体前駆体1,2,3に由来するまれで致命的な腫瘍であり、小児期の眼内悪性腫瘍の最も一般的なタイプです4。RB1遺伝子のホモ接合型不活性化は、RB5における開始遺伝子病変である。しかし、RB1変異を有するマウスは網膜腫瘍2を形成することができない。マウス腫瘍は、Rb1変異と他の遺伝子改変の組み合わせで生成される可能性がありますが、それでもヒトRB6の特徴が欠けています。網膜オルガノイド分化の発達により、ヒトRB1の特徴を示すhESC由来のRBを得ることができました。
網膜オルガノイド分化のための多数のプロトコルが過去10年間で確立されており、2D7、3D8、および2Dと3D9の組み合わせが含まれています。ヒトRBを生成するためにここで用いられる方法は、付着培養と浮遊培養9の連結である。RB1変異hESCを網膜オルガノイドに分化させることで、45日目頃に RB の形成が検出され、60日目頃に急速に増殖します。90日目に、RBの単離、およびRB細胞株の生成が可能です。さらに、RBは120日目にほぼすべての網膜オルガノイドを取り囲んでいます。
hESC由来のRBは、RBの起源、腫瘍形成、および治療法を探索するための革新的なモデルです。このプロトコルでは、遺伝子編集hESCの生成、RBの分化、およびRBの特性評価について詳しく説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒト網膜芽細胞腫(RB)は、RB1の不活性化とRbタンパク質の機能不全によって引き起こされます。このプロトコルでは、RB1-KO hESCは、ディッシュ中のRBを生成するための極めて重要なステップです。RB1-/-hESCを用いても、網膜オルガノイド分化の方法に起因してRB形成がない可能性がある10。このプロトコルでは、付着培養から浮遊培養への移行が分化?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
すべての助けをしてくれた502チームに感謝します。この研究の一部は、北京市自然科学基金会(Z200014)および中国国家重点研究開発プログラム(2017YFA0105300)の支援を受けています。
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Antibody |
| Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Antibody |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Antibody |
| Anti-Syk (D3Z1E) | Cell Signaling Technology | 13198 | Antibody |
| BbsI | NEB | R3539S | Restriction enzymes |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Glutamine | Gibco | 35050-061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) | Gibco | 11765-054 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | Sigma | M7145 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection kit |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Puromycin | Gene Operation | ISY1130- 0025MG | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiPSC/hESC culture medium | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1 |
| Growth factor reduced basement membrane matrix | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
| Cell dissociation enzyme | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I |
| Supplement B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III |
| T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
References
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