Reconstrueer humaan retinoblastoom in vitro
Summary
We beschrijven een methode voor het genereren van humaan retinoblastoom (RB) door biallelische RB1-mutaties in menselijke embryonale stamcellen (hESC) te introduceren. RB-cellijnen kunnen ook met succes worden gekweekt met behulp van de geïsoleerde RB in een schaal.
Abstract
Menselijke RB is kinderkanker, die dodelijk is als er geen behandeling wordt toegediend. Aangezien RB afkomstig is van kegelvoorlopers, wat relatief zeldzaam is in knaagdiermodellen, is een ziektemodel dat is afgeleid van mensen en knaagdieren, wat betreft de interspecies-verschillen tussen mensen, gunstiger voor het blootleggen van de mechanismen van menselijke RB en het zoeken naar de doelen van therapie. Hierin beschrijft het protocol de generatie van twee gen-bewerkte hESC-lijnen met respectievelijk een biallelische RB1-puntmutatie (RB1Mut/Mut) en een RB1 knock-outmutatie (RB1-/-). Tijdens het proces van retinale ontwikkeling wordt de vorming van RB waargenomen. De RB-cellijnen worden ook vastgesteld door te scheiden van de RB-organoïden. Al met al, door de gen-bewerkte hESC-lijnen te differentiëren in de retinale organoïden met behulp van een 2D- en 3D-gecombineerd differentiatieprotocol, hebben we met succes de menselijke RB in een schotel gereconstrueerd en de oorsprong van de kegelvoorloper geïdentificeerd. Het zou een nuttig ziektemodel bieden voor het observeren van de genese, proliferatie en groei van retinoblastoom, evenals het verder ontwikkelen van nieuwe therapeutische middelen.
Introduction
Humaan retinoblastoom (RB) is een zeldzame, fatale tumor afgeleid van de retinale kegel-precursoren 1,2,3, is het meest voorkomende type intraoculaire maligniteit in de kindertijd4. Homozygote inactivatie van het RB1-gen is de initiërende genetische laesie in RB5. Muizen met RB1-mutaties slagen er echter niet in om de retinale tumor te vormen2. Hoewel de muistumoren kunnen worden gegenereerd met de combinatie van Rb1-mutaties en andere genetische modificaties, missen ze nog steeds de kenmerken van menselijke RB6. Dankzij de ontwikkeling van retinale organoïde differentiatie kon de hESC-afgeleide RB worden verkregen, met de karakters van menselijke RB1.
Talrijke protocollen voor retinale organoïde differentiatie zijn in het afgelopen decennium vastgesteld, waaronder 2D7, 3D8 en een combinatie van 2D en 3D9. De methode die hier wordt gebruikt om de menselijke RB te genereren, is de consolidatie van de aanhankelijke cultuur en de zwevende cultuur9. Door de RB1 gemuteerde hESC te differentiëren in retinale organoïden, wordt de vorming van RB gedetecteerd rond dag 45 en vervolgens prolifereert het snel rond dag 60. Op dag 90 is isolatie van KB’s en generatie van de RB-cellijn mogelijk; bovendien omringt RB bijna alle retinale organoïden op dag 120.
hESC-afgeleide RB is een innovatief model voor het onderzoeken van de oorsprong, tumorigenese en behandelingen voor RB. In dit protocol worden de generatie van genbewerking hESC, de differentiatie van RB en karakterisering voor RB in detail beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Humaan retinoblastoom (RB) wordt veroorzaakt door de inactivatie van RB1 en de disfunctie van Rb-eiwit. In dit protocol is de RB1-KO hESC de cruciale stap voor het genereren van RB in een gerecht. Terwijl het zelfs met RB1-/- hESC mogelijk is dat er geen RB-vorming is als gevolg van de methoden van retinale organoïde differentiatie10. In dit protocol is de overgang van hechte cultuur naar zwevende cultuur essentieel in het proces van differentiatie. De dichth…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken het 502-team voor alle hulp. Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door de Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) en het National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Antibody |
| Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Antibody |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Antibody |
| Anti-Syk (D3Z1E) | Cell Signaling Technology | 13198 | Antibody |
| BbsI | NEB | R3539S | Restriction enzymes |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Glutamine | Gibco | 35050-061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) | Gibco | 11765-054 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | Sigma | M7145 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection kit |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Puromycin | Gene Operation | ISY1130- 0025MG | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiPSC/hESC culture medium | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1 |
| Growth factor reduced basement membrane matrix | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
| Cell dissociation enzyme | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I |
| Supplement B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III |
| T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
References
- Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).
- Xu, X. L., et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).
- Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E. The biology of retinoblastoma. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 503-516 (2015).
- Benavente, C. A., Dyer, M. A. Genetics and epigenetics of human retinoblastoma. Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).
- Wu, N., et al. A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence. The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).
- Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Developmental Biology. 462 (2), 197-207 (2020).
- Dimaras, H., Corson, T. W. Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review. Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).
- Xu, X. L., et al. Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling. Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).
- Qi, D. L., Cobrinik, D. MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation. Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).
