Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

AAV-implementering af forstærkerbaserede ekspressionskonstruktioner in vivo i musehjerne

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/62650
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

Summary

Denne protokol beskriver et nyt rAAV-baseret forbigående forstærker-reporter-assay. Dette assay kan bruges til at inducere forstærkerdrevet udtryk in vivo i musehjernen.

Abstract

Enhancers er bindende platforme for en bred vifte af transkriptionsfaktorer, der driver specifikke ekspressionsmønstre af vævs- og celletypespecifikke gener. Flere midler til vurdering af ikke-kodende DNA og forskellige kromatintilstande har vist sig nyttige til at forudsige tilstedeværelsen af forstærkersekvenser i genomet, men validering af aktiviteten af disse sekvenser og at finde de organer og udviklingsstadier, de er aktive i, er en arbejdskrævende proces. De seneste fremskridt inden for adeno-associerede virusvektorer (AAV) har muliggjort udbredt levering af transgener til musevæv, hvilket muliggør in vivo-forstærkertest uden at kræve et transgent dyr. Denne protokol viser, hvordan en reporterkonstruktion, der udtrykker EGFP under kontrol af en minimal promotor, som ikke driver signifikant udtryk alene, kan bruges til at studere aktivitetsmønstrene for kandidatforstærkersekvenser i musehjernen. En AAV-pakket reporterkonstruktion leveres til musehjernen og inkuberes i 1-4 uger, hvorefter dyret ofres, og hjerneafsnit observeres under et mikroskop. EGFP forekommer i celler, hvor den testede forstærker er tilstrækkelig til at initiere genekspression, der lokaliserer placeringen og udviklingsstadiet, hvor forstærkeren er aktiv i hjernen. Standard kloningsmetoder, billig AAV-emballage og udvidelse af AAV-serotyper og metoder til in vivo-levering og standardbilleddannelsesaflæsning gør dette til en tilgængelig tilgang til undersøgelse af, hvordan genekspression reguleres i hjernen.

Introduction

Enhancers er genomiske cis-regulatoriske elementer, der tjener som transkriptionsfaktorbindingssteder og kan drive ekspressionen af et målgen på en spatiotemporalt specifik måde 1,2. De er forskelligt aktive i forskellige celletyper, væv og udviklingsstadier og kan være substrater for sygdomsrisikorelateret genomisk variation 3,4. Behovet for at forstå dynamikken i forstærkerfunktionen er således afgørende for fremskridt inden for både translationelle og grundlæggende videnskabelige applikationer inden for genomik. In silico forudsigelser af forstærkeraktivitet kan tjene som fremragende ressourcer til at generere hypoteser om forstærkerkapacitet 5,6. En sådan forudsagt forstærkeraktivitet kan kræve yderligere validering og forhør for en fuld forståelse af den funktionelle aktivitet. Enhancer reporter-assays har vist sig værdifulde til dette formål på tværs af en række systemer, fra celler til dyr 7,8,9. Mod at udvide disse undersøgelser i en fleksibel og omkostningseffektiv forbigående in vivo-sammenhæng beskriver denne protokol brugen af in vivo AAV-baserede metoder til at teste formodede forstærkersekvenser for deres evne til at drive ekspressionen af et ektopisk reportergen i den postnatale musehjerne. Denne familie af metoder har nytte til at forhøre enkeltkandidatsekvenser eller parallel biblioteksscreening og er relevant for grundlæggende og translationel forskning.

Denne metode kombinerer i et enkelt plasmid en formodet forstærkerkandidat-DNA-sekvens med et reportergen (her EGFP) under kontrol af en minimal promotor, der alene ikke driver signifikant ekspression. Plasmidet pakkes i rekombinant AAV (rAAV) og injiceres i en dyremodel. Mens applikationen her er til hjernen, muliggør forskellige rAAV-serotyper infektion på tværs af forskellige vævstyper, så denne tilgang kan udvides til andre systemer10. Efter en periode kan hjernen indsamles og analyseres til ekspression af reportergenet. Stærk ekspression sammenlignet med kontroller indikerer, at den testede kandidatsekvens var i stand til at "forbedre" ekspressionen af genet (figur 1). Dette enkle design tilbyder en nem og klar tilgang til at teste en sekvens for forstærkeraktivitet in vivo i hjernen.

Ud over at teste for forstærkerens evne til en sekvens kan denne metode kombineres med teknikker til bestemmelse af celletypeforstærkeraktivitet. I sekvensbaserede tilgange til bestemmelse af differentiel forstærkeraktivitet kan sortering af celler på celletypespecifikke markører forud for DNA- og RNA-sekventering give forskere mulighed for at bestemme, om forskellige celletyper viser differentiel forstærkeraktivitet, som det blev beskrevet i Gisselbrecht et al.11. I billeddannelsesbaserede tilgange tillader co-mærkning af billeder med celletypespecifikke markører undersøgelse af, om celler, der udviser forstærkerdrevet fluorescens, også viser celletypemarkører af interesse 12,13,14,15,16. Enhancer reporter-assays muliggør direkte test af risikoassocieret allelvariation i forstærkere for effekter på forstærkerens kapacitet. Langt størstedelen af de risikoområder, der er identificeret i genom-dækkende associeringsundersøgelser (GWAS), ligger i ikke-kodende regioner i genomet17. Funktionelle annotationsundersøgelser af disse risikosteder indikerer, at en stor del sandsynligvis fungerer som forstærkere18,19,20. MPRA-implementering in vivo kan muliggøre test af disse risikoassocierede varianter for forstærkeraktivitet i hjernen12,21. Endelig kan levering og afhentning på forskellige tidspunkter give indsigt i de udviklingsstadier, hvor en forstærker er aktiv.

Enhancer-reporter plasmid design er forskellige og kan tilpasses til at passe til eksperimentelle mål. Der er flere muligheder for minimale promotorer, der er blevet brugt i forstærkerforskning, såsom den menneskelige β-globin minimal promotor22 og musen Hsp68 minimal promotor23. Disse promotorer er kendt for at drive lave udtryksniveauer, medmindre de kombineres med et forstærkerelement for at aktivere dem. I modsætning hertil driver konstitutive promotorelementer stærk ekspression af transgenet, nyttigt til positiv kontrol eller til at teste for forstærkerfunktion på baggrund af robust ekspression. Almindelige valg for konstitutive promotorer omfatter CAG, en hybridpromotor afledt af kylling β-actin-promotoren og cytomegalovirus øjeblikkelig-tidlig forstærker24 eller human EF1α25. Da forstærkere vides at arbejde tovejs26, er forstærkerens orientering og placering i forhold til den minimale promotor fleksibel (figur 2A). Traditionelle forstærker-reporter-assays placerer forstærkeren opstrøms for promotoren og inkluderer i biblioteksleverancer en stregkodesekvens nedstrøms for reportergenet for at forbinde sekventeringslæsninger med den testede forstærker27. Forstærkere kan dog også placeres i den åbne læseramme af reportergenet og fungere som deres egen stregkodesekvens, som det gøres i STARR-seq28. Protokollen, der er beskrevet her, anvender STARR-seq-analysedesignet og placerer kandidatforstærkersekvensen i 3 'UTR af reportergenet. Mens STARR-seq-orienteringen giver fordelen ved mere strømlinet kloning, er den mindre godt forstået end den konventionelle tilgang og kan inducere variabel RNA-stabilitet mellem konstruktioner. De beskrevne metoder kan let tilpasses enten STARR-seq eller konventionel orientering med mindre ændringer i kloningsprocessen, der er beskrevet andetsteds27,29.

Forskellige metoder til AAV-levering kan anvendes til yderligere at tilpasse denne teknik, så den passer til eksperimentelle mål (figur 2B). Direkte intrakranielle injektioner, beskrevet yderligere i denne protokol, leverer en høj koncentration af virus direkte til hjernen30. Dette giver en høj transduktionseffektivitet centreret på injektionsstedet, hvilket gør dette til en fremragende teknik til eksperimenter, der søger at maksimere tætheden af transducerede celler over et vævsområde. Stereotaktisk injektion kan hjælpe med at standardisere injektionsstedet på tværs af dyr til reproducerbar lokaliseret transduktion. Intrakranielle injektioner er mest ligetil hos tidlige postnatale dyr. Som en alternativ teknik kan systemiske injektioner levere transgener ved hjælp af AAV'er med serotyper, der er i stand til at krydse blod-hjerne-barrieren31. Hale-vene injektioner tillader virus at cirkulere i hele kroppen, hvilket muliggør generaliseret levering på tværs af mange væv10. Retro-orbitale injektioner er en anden systemisk injektionsteknik, der leverer virussen bag øjet ind i retro-orbital sinus32. Dette giver en mere direkte rute for AAV fra det venøse system til hjernen, hvilket resulterer i en højere koncentration af transducerede celler i hjernen end injektioner i mere perifere blodkar33.

Et andet fleksibelt aspekt af denne teknik er metoden til udlæsning. Generelt kan optioner beskrives som reporterbaserede eller sekventeringsbaserede (figur 2C). Inkorporering af en fluorescerende reporter som GFP i konstruktionens åbne læseramme resulterer i ekspression af det fluorescerende protein i alle transducerede celler, hvor kandidatforstærkeren drev udtryk. Mærkning og billeddannelsesteknikker såsom immunhistokemi muliggør signalforstærkning. Sekventering baseret udlæsning teknikker involverer identifikation af sekvenser fra den leverede konstruktion i RNA indsamlet fra vævet. Ved at kvantificere mængden af viralt DNA, der oprindeligt blev leveret, kan sammenligningen af udtrykt RNA versus leveret DNA bruges til at bestemme, i hvilken grad en testet forstærkersekvens var i stand til at drive øget ekspression af transgenet, for eksempel i forbindelse med et massivt parallelt reporterassay (MPRA). MPRA'er tilbyder en kraftig udvidelse af disse teknikker til at teste op til tusindvis af kandidatforstærkere for aktivitet samtidigt og er blevet beskrevet udførligt i genomforskning 12,27,34,35,36. Højere gennemløbsscreening opnås ved at udføre klonings-, emballerings-, leverings- og sekventeringstrin for kandidatforstærkere i batch snarere end individuelt.

Valg af kandidatforstærker giver endnu en mulighed for fleksibilitet (figur 2D). For eksempel kan dette assay bruges til at identificere forstærkere af et specifikt gen, til at fastslå funktionen af ikke-kodende DNA-regioner af interesse eller til at bestemme specifikke celletyper eller udviklingsstadier, hvor en forstærker er aktiv - som alle tjener mål både inden for grundvidenskab og sygdomsforskning. Generelt er valg af kandidatforstærker drevet af in silico-forudsigelser af forstærkeraktivitet. Almindeligvis inkluderer in silico-forudsigelser ChIP-seq for histonmodifikationer, der indikerer sandsynlige forstærkere, såsom H3K27ac37 og chromatintilgængelighedskortlægning38. Endelig er et voksende forskningsområde den funktionsbaserede screening af syntetisk designede forstærkerelementer, der muliggør undersøgelser af, hvordan forstærkersekvensen styrer funktion39 og design af forstærkere med specifikke egenskaber40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol er godkendt af UC Davis Institutional Animal Care and Use Committee (protokol #22339) og UC Davis Institutional Biosafety Committee (BUA-R1903). Denne protokol er blevet testet på C57BL/6J mus af begge køn på postnatal dag 0-1.

1. Klon forstærkerkandidatsekvensen ind i AAV-vektorplasmidet.

BEMÆRK: De repræsentative protokoller er angivet, men kloningsstrategien har en høj grad af fleksibilitet.

  1. Vælg eller design en reporterkonstruktion. Her indsættes forstærkerkandidaten i 3's uoversatte region (UTR) af EGFP-reportergenet, som udtrykkes under kontrol af Hsp68 minimal promotor.
    BEMÆRK: Mange MPRA-plasmidkonstruktioner, der er egnede til dette assay, er blevet deponeret til Addgene41 og er tilgængelige til forskningsbrug.
  2. Design PCR-primere for at forstærke en sekvens af interesse. Tilføj til 5'-enden af primerne den passende homologiarm til Gibson-kloning (~ 35 bp svarende til sekvens 5' opstrøms for indsættelsesstedet, øverste streng til den forreste primer og nederste streng til den omvendte primer).
    BEMÆRK: Sørg for, at basisprimersekvensen er ~ 18-24 bp lang og ~ 50% -60% GC-indhold med en smeltetemperatur på ca. 57-59 ° C.
  3. Udfør PCR fra en DNA-prøve ved hjælp af de designede primere.
    1. PCR-reaktionsblandingen samles i 0,2 ml PCR-rør som beskrevet i tabel 1.
    2. PCR-reaktionsblandingen (-blandingerne) anbringes på en termisk cykler, og cyklussen anbringes i overensstemmelse med det program, der er nævnt i tabel 1.
    3. Bekræft succesen med PCR ved at køre 5 μL PCR-produkt på en 0,7% -1% agarosegel ved 100 V i 30-60 min. Kontroller for fragmentet af forudsagt længde.
    4. Ryd op i PCR-produktet ved hjælp af et kommercielt enzymatisk reaktionsoprydningskolonnesæt. Det sidste eluat er kloningsindsatsen.
  4. Udfør begrænsningsfordøjelse for at linearisere AAV-vektoren på det unikke kloningssted for at indsætte forstærkeren i vektoren.
    1. Kloningsstedet i 3 'UTR af forstærkerreporterkonstruktionen, der bruges her, er afgrænset af unikke PacI- og AscI-begrænsningssteder. Udfør en fordøjelse for at linearisere plasmidet på dette sted i henhold til følgende parametre (trin 1.4.2-1.4.4).
    2. Fordøje 1-10 μg vektor-DNA ved hjælp af PacI og AscI, afhængigt af hvor mange kloningsreaktioner der er behov for. Forbered reaktionerne ved hjælp af den medfølgende buffer i henhold til producentens anvisninger.
    3. Inkuberes ved 37 °C i 1-2 timer for at fordøje vektor-DNA'et. (Hvis fordøjelse af mere end 5 μg i en 50 μL reaktion, kan længere inkubation være nødvendig.)
    4. Efter 1-2 timers inkubation inaktiveres enzymet ved at inkubere ved 65 °C i 20 min.
    5. Adskil begrænsningsfordøjelsesfragmenterne ved gelelektroforese ved hjælp af en 0,7% -1% agarosegel, kør ved 100 V i 30-60 min.
    6. Skær båndet til den lineariserede vektor og rens ved hjælp af et kommercielt gelekstraktionssæt.
  5. Udfør Gibson kloningsreaktioner og transformer
    1. Koncentrationen af den rensede vektor og kloningsindsatsen bestemmes ved hjælp af et spektrofotometer.
      BEMÆRK: DNA absorberer lys ved 260 nm, mens forurenende stoffer absorberer lys ved 230 nm og 280 nm. Høje forhold (>1,8) på 260/230 og 260/280 indikerer stærkt oprenset DNA.
    2. Saml Gibson-kloningsreaktioner i 0,2 ml PCR-rør: 5 μL 2x Gibson-masterblanding, 0,02-0,5 pmol-DNA-fragmenter i et forhold på 3: 1-indsats til vektor (optimal DNA-koncentration for reaktionen skal bestemmes empirisk) og Nukleasefrit vand (bring volumenet op til 10 μL).
    3. Inkuber Gibson-reaktioner ved 50 °C i 20 minutter i en termisk cykler.
  6. Transform rekombination mangelfuld (recA-) kompetent Escherichia coli (E. coli).
    1. Sæt et vandbad til 42 °C og tø de kommercielt tilgængelige kompetente celler op på is.
      BEMÆRK: Dette trin kan udføres før trin 1.4, og cellerne kan tø op, mens de forbereder og inkuberer Gibson-reaktionen.
    2. Aliquot 30-50 μL celler i 2,0 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 2 μL Gibson-reaktion på en aliquot og mærk røret med Gibsons identitet. Inkuber cellerne på is i 30 min.
      BEMÆRK: Brug 5-10 ng ufordøjet tom vektor som en positiv kontrol og vand som en negativ kontrol.
    3. Varmechok cellerne i 42 °C vandbadet i 30-45 s, sæt straks rørene tilbage til is, og lad dem komme sig i 5 min.
    4. Mens du er på is, skal du tilføje 400-950 μL af de kommercielt tilgængelige genvindingsmedier.
      BEMÆRK: Gendannelsesmediet, der anvendes i disse forsøg, indeholder 2% vegetabilsk pepton, 0,5% gærekstrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 og 20 mM glucose.
    5. Efter genopretning på is genvinder cellerne fuldt ud ved at inkubere ved 37 ° C med blid omrøring på 250 o / min i 30-60 min.
    6. Pellet cellerne ved centrifugering ved 5.000 x g i 5 minutter og fjern 400 μL af supernatanten, hvilket efterlader ~ 50 μL bakterier til pladen.
    7. Plade på selektive medier og inkuberes ved 37 °C natten over.
      BEMÆRK: Det selektive medie, der anvendes i disse forsøg, indeholder 1,0% tryptone, 0,5% gærekstrakt, 1,0% natriumchlorid, 1-2% agar, 96-97% vand og carbenicillin i en koncentration på 100 μg / ml. Brug altid rekombinationsdefekte bakteriestammer til kloning af virale plasmider, fordi de virale inverterede terminale gentagelser (ITR'er) har matchende sekvenser og kan gennemgå homolog rekombination. Imidlertid gennemgår recA- stammer af bakterier stadig lave niveauer af rekombination. Reporterplasmidet, der bruges her, er en selvsupplerende AAV, hvor sekvensen af en af ITR'erne er blevet ændret og ikke længere passer perfekt til den anden ITR. Dyrkning af bakterierne ved 30 °C anbefales også for yderligere at bremse hastigheden af homolog rekombination.
  7. Bekræft kloner og gendan plasmider.
    1. Forbered en PCR-masterblanding ved hjælp af fremadgående og omvendte primere (materialetabel), der udgløder vektoren og flankerer indsatsplaceringen. Aliquot 10 μL volumener i 0,2 ml PCR-strimmelrør.
    2. I 14 ml rundbundede rør skal du forberede 5 ml alikvoter af antibiotikaselektiv LB bouillon, en for hver koloni testes via PCR og negativ kontrol.
    3. Brug en steril tandstikker eller pipettespids til at vælge en individuel koloni og skrab kolonien groft ned i bunden af et PCR-rør.
    4. Når kolonien er dissocieret i PCR-masterblandingen, skal du slippe tandstikkeren eller spidsen i en af LB-aliquoterne og mærke 14 ml røret med Gibson-reaktionen og PCR-rørnummeret.
    5. Placer koloniens PCR-reaktioner på en termisk cyklist og cyklus med programmet beskrevet i tabel 2.
    6. De 5 ml flydende kulturer, der podes med tandstikkere eller pipettespidser, inkuberes i en rystende inkubator, der er indstillet til 37 °C og 180 o/min.
    7. Kør koloniens PCR-reaktioner på en 0,7% -1% agarosegel ved 100 V i 30-60 minutter og visualiser båndene i et gel doc-billeddannelsessystem.
    8. Kassér de 5 ml kulturer, der ikke viser det forudsagte PCR-bånd.
    9. For hver vellykket integreret klon skal du lade 5 ml kulturer vokse natten over og derefter udføre en plasmid mini prep fra 4,5 ml ved hjælp af et kommercielt sæt. Der reserveres 0,5 ml væskekultur, og der spares ved -80 °C som glycerolbestand.
    10. Bekræft, at transgenerne indeholdt i plasmider er fri for uønskede mutationer ved hjælp af Sanger-sekventering42.
    11. Når reporterkonstruktionen er blevet bekræftet at være klonet med succes, skal du bruge den gemte glycerolbestand til at inokulere en 5 ml startkultur og vokse i 8-16 timer i en rystende inkubator ved 30 ° C og 180 o / min.
    12. Når bouillonen er overskyet, fortyndes startkulturen 1.000x i 250-300 ml frisk selektiv LB bouillon og inkuberes mindst natten over i en rystende inkubator ved 30 ° C og 180 o / min. Rens derefter plasmidet ved hjælp af et kommercielt plasmid maxi-sæt.
      BEMÆRK: Bakterier vil vokse langsommere ved 30 °C sammenlignet med 37 °C, men dette er den bedste temperatur til at bremse hastigheden af spontan rekombination, når der dyrkes store kulturer.
    13. Udfør en XmaI-fordøjelse for at teste for rekombination af ITR'erne ved hjælp af trin 1.4.2-1.4.5, der erstatter XmaI i stedet for PacI og AscI. Visualiser båndene på et gel doc billeddannelsessystem.
      BEMÆRK: Et rAAV-plasmid med begge ITR'er til stede vil give to bånd på en gel efter denne fordøjelse: den ene længden af rAAV-genomet og den anden længden af resten af plasmidets rygrad. Hvis der kun er et bånd, har ITR'erne gennemgået homolog rekombination, og rAAV-plasmidet vil ikke være i stand til at emballere virale partikler. RAAV-plasmidet beskrevet her er designet således, at XmaI-steder kun forekommer i ITR'erne. Hvis forstærkerkandidatindsatsen også indeholder XmaI-steder, skal du opdatere de forudsagte båndresultater og analyser i overensstemmelse hermed.

2. Få pakket rAAV.

  1. Brug pakket rAAV (professionelt eller internt) til eksperimenterne i denne undersøgelse.
    BEMÆRK: Der er mange muligheder for emballering af en rAAV. En rAAV kan pakkes professionelt på en virksomhed eller et universitets kernefacilitet. RAAV kan også pakkes internt ved hjælp af forskellige teknikker, der spænder i kompleksitet og behov for specialudstyr43,44. Den primære bekymring er at opnå en vektor, der er af høj kvalitet, og at den infektiøse titer er blevet bestemt med en høj grad af sikkerhed. Både professionelt emballerede og internt emballerede rAAV'er blev brugt til forskellige eksperimenter beskrevet i denne undersøgelse.

3. Indsprøjt intrakranielt rAAV-pakket plasmid i neonatale mus.

  1. Forbered rAAV-blanding til levering.
    1. Hvis hensigten er at sammenligne udtryksmønstrene mellem forskellige forstærkerreportervirus, skal du udligne titerne for alle vira, der skal sammenlignes, ved at fortynde alle for at matche den mindst koncentrerede virus.
    2. Bland et 2: 1 eller 3: 1-forhold mellem forstærkerreportervirus og konstitutivt udtrykt kontrolreportervirus sammen, og tilsæt en lille mængde (0,06% endelig koncentration) Fast Green-farvestof.
      BEMÆRK: Fast Green er et farvestof, der bruges i vid udstrækning i injektioner af forsøgsdyr, herunder med AAV, for at visualisere injektionsstedet under og umiddelbart efter proceduren45,46,47,48. Selvom dette er et vigtigt kvalitetssikringstrin, er det muligt, at tilsætning af farvestof kan forstyrre transduktion. Genovervejelse af brugen af injektionsfarvestof kan være vigtigt for protokoloptimering i visse tilfælde. Den konstitutivt drevne kontrolvirus er absolut kritisk for sammenligning af uafhængige injektioner. Virusinjektioner vil variere i sted og omfang af transduktion fra dyr til dyr. Den konstitutive kontrol vil gøre det muligt at udelukke mislykkede injektioner fra analyse og give en standard for normalisering af variation i viruslevering.
    3. Bryd spidsen af en steril trukket glaspipette lavet af et μL-gradueret kapillarrør ved forsigtigt at gennembore det gennem en delikat klud steriliseret ved at lægge den i blød i 70% ethanol og få lov til at tørre helt. Indsæt derefter den trukne glaspipette i aspiratorenheden, der består af en enhed til påføring af tryk forbundet til 15 tommer lang gummislange, der slutter med en gummipakning til at holde en mikrokapillærpipette.
      BEMÆRK: "Anordningen til trykpåføring" kan være en sprøjte eller et mundstykke. Hvis der skal anvendes en sprøjte, skal en anden person lægge tryk gennem sprøjten, mens forsøgslederen manipulerer pipetten i den ene hånd og dyret i den anden. Hvis der anvendes et mundstykke, der giver forsøgslederen fin kontrol over både dyrets og pipettens positioner og det tryk, der påføres sprøjten, kræves der ekstra omhu for at undgå virusforurening.
    4. Påfør negativt tryk gennem aspiratorenheden for at trække et lille volumen (~ 0,2-0,5 μL) mineralolie ind i glaspipetten.
      BEMÆRK: Dette trin er meget vigtigt for at tilvejebringe en barriere for at forhindre aerosoliserede virale partikler i at forurene aspiratorenheden.
    5. Sæt den forberedte aspiratorsamling til side, og hold virussen på is, indtil den er klar til at injicere.
  2. Cryo-bedøvelse af neonatale mus i en tør plastskål delvist nedsænket i is indtil ophør af pedaludtagningsrefleksen (~ 5 min). Sørg for, at musene ikke er i direkte kontakt med isen.
  3. Brug undertryk gennem aspiratorenheden til at trække virusblandingen ind i den trukne glaspipette, indtil menisken passerer 2 μL fluebenet.
  4. Fjern musen fra kølekammeret og placer den på bordpladen. Find de bilaterale injektionssteder midtvejs mellem lambda og bregma og midtvejs mellem sagittal suturen og hvert øje. Desinficer begge områder med en alkoholserviet.
  5. Brug den trukne glaspipette til at gennembore kraniet på de neonatale mus og påfør forsigtigt positivt tryk gennem aspiratorenheden, når nålen kommer ind i hjernen. Se menisken af virusblandingen. Modstanden mod det påførte tryk vil falde, når pipettens spids når den laterale ventrikel. Dispenser 1 μL af virussen, træk pipetten ud, og gentag for den anden laterale ventrikel.
  6. Placer musen på en varmepude eller et varmekammer for at komme sig. Når du er vågen og aktiv, skal du returnere dyret til sit hjemmebur.

4. Saml væv og udfør immunhistokemi.

  1. Efter tilstrækkelig tid efter virustransduktion bedøves musene og ofres ved transkardial perfusion.
    BEMÆRK: Mange eksperimenter, herunder de repræsentative resultater vist her, tillader en periode på 4 uger eller længere for virussen at transducere. Imidlertid kan selvkomplementære AAV'er vise stærkt udtryk så tidligt som 7 dage12. Den ønskede inkubationsperiode skal muligvis optimeres afhængigt af specifikke eksperimentelle teknikker og mål.
    1. Forbered en peristaltisk pumpe med intravenøs infusionsslange og en 25 G nål.
    2. Forbered 1x PBS og 4% paraformaldehyd (PFA) og læg dem på is.
    3. Placer indsugningsenden af slangen i den iskolde 1x PBS. Indstil strømningshastigheden (2,5 ml/min for P7-mus, 3,5 ml/min for P28-mus), og kør pumpen, indtil bufferen trækkes hele vejen gennem slangen og er renset for bobler. Sæt nålen til side, indtil den er klar til perfusion.
    4. Inde i en stinkhætte pipetteres en lille mængde isofluran på et køkkenrulle i bunden af et dråbekrukkekammer. Placer den tidligere injicerede mus på en rist over køkkenrullen, og sørg for, at den ikke kommer i direkte kontakt med isofluranen. Forsegl kammeret for at bedøve musen. Vent i ~ 5 minutter, og åbn derefter kammeret og kontroller, om der er en pedaludtagningsrefleks. Fortsæt, når dyret er bevidstløst.
      BEMÆRK: Under hele perfusionen skal musen opretholdes på isofluran med en næsekegle for at forhindre generhvervelse af bevidsthed.
    5. Brug kirurgisk saks til at åbne musens mave og bryst, fjerne brystkassen og udsætte hjertet.
    6. Brug en irismikrosaks til at lave et lille snit i musens højre atrium, indsæt IV-nålen i venstre ventrikel og aktiver den peristaltiske pumpe.
    7. Perfuse dyret med iskold 1x PBS, indtil blodet, der skyller ud af snittet i højre atrium, løber klart. Rydning af blodvæv er meget vigtigt, fordi røde blodlegemer har autofluorescens, og blodkar kan forringe evnen til at afbilde reporter-ekspressive celler.
    8. Sæt peristalticpumpen på pause, og flyt indsugningsslangen fra PBS til 4% PFA. Genaktiver pumpen, og perfuse 1 ml / g kropsvægt, ~ 25 ml for en voksen mus.
      BEMÆRK: Fikseringsrystelser skal kunne observeres, og musens krop skal stivne.
  2. Dissekere og efterfikse hjernen.
    1. Fjern musens hoved med kirurgisk saks.
    2. Brug en lille kirurgisk saks til at starte ved bunden af kraniet og lave et snit langs hovedets midterlinje og trække huden og det underliggende væv tilbage for at udsætte kraniet.
    3. Brug irissaksen til forsigtigt at skære bagsiden af kraniet, startende ved foramen magnum og fortsæt op mod og langs sagittal suturen, indtil de olfaktoriske pærer er passeret.
    4. Indsæt saksen i kraniet over de olfaktoriske pærer og lav to vandrette snit i kraniet. Lav et lignende par vandrette snit i den occipitale knogle. De vandrette og midterste snit skaber et par dørlignende klapper i toppen af kraniet.
    5. Skræl klapperne på kraniet tilbage for at udsætte hjernen fuldt ud. Brug en pincet til at skære de olfaktoriske pærer fra kraniet og til at skære kraniale nerver og frigøre hjernen fra kraniet.
    6. Slip hjernen i et 15 ml konisk rør med 3-5 ml 4% PFA i PBS. Post-fix 6 timer til natten. Fastgør ikke vævet for meget.
  3. Forbered hjernen til kryosektion.
    1. Overfør den faste hjerne til et nyt 15 ml konisk rør med 12-14 ml 30% saccharose i PBS til dehydrering. Inkuberes ved 4 °C, indtil hjernen synker til bunden af røret (2-3 dage).
    2. Nedsænk den faste og dehydrerede hjerne i optimal skæretemperatur (OCT) forbindelse i en 15 mm x 15 mm x 5 mm cryomold. Tilsæt OCT, indtil hjernen er helt dækket.
    3. Læg cryomold på en blok tøris og frys prøven i en fast blok af OCT (~ 5 min).
      BEMÆRK: OCT-blokke kan opbevares ved -80 ° C i måneder til år.
    4. Mærk cryomolden med prøvenavnet og hjernens orientering.
  4. Få koronale sektioner ved hjælp af et kryostatmikrotom.
    1. Marker hjernens orientering på OCT-blokken med blyant, og fjern blokken fra cryomolden inde i kryostaten.
    2. Placer OCT-blokken, så hjernen er orienteret med de olfaktoriske pærer vendt mod kryostatens blad, og fastgør blokken til objektholderen af kryostaten med noget frisk OCT.
    3. Når den er frosset på plads, skal du begynde at skære 50 μm sektioner gennem blokken ved at følge trin 4.4.4-4.4.6.
    4. Brug ikke anti-rullepladen. Sektioner krølles i stramme ruller, når de skæres, og samles enten oven på blokken eller falder nedenunder i en indsamlingsbakke.
    5. Se formen på blokken i de første par snit, der er lavet. Lav lodrette snit gennem blokken, hvilket giver et jævnt ansigt, når du begynder at skære. Juster vinklen ved hjælp af prøvejusteringsarmene, hvis det er nødvendigt.
    6. Når de olfaktoriske pærer er synlige, skal du være meget opmærksom på sektionernes form. Hvis den ene ser større ud end den anden, er snittene i en vinkel i forhold til hjernen, og det er nødvendigt at rette hjernens orientering mod bladet ved hjælp af prøvejusteringsarmene.
      BEMÆRK: Hvis du skærer lige, skal cortex begynde at vises over hver olfaktorisk pære på samme tid.
    7. Når den olfaktoriske pære er blevet sektioneret, og rostral hjernevæv er synligt, reduceres skæretykkelsen til 30-35 μm og begynder at samle de flydende sektioner. Følg trin 4.4.8-4.4.13 for at sektionere hjernen.
    8. Børst alle tidligere sektioner af blokken og genstandsholderen, så de falder ned i opsamlingsbakken. Børst dem af på den ene side af bakken, og hold dem adskilt. Hvis bunken er for stor, skal du tømme bakken.
    9. Der dispenseres 1 ml PBS i hver brønd på en 24 brøndplade. Mærk 1 række for hver hjerne.
    10. Skær 6 koronale sektioner. Hent sektionerne ved hjælp af kold pincet og arranger dem på kryostatstadiet. Gentag dette trin 2 eller 3 gange, og hold grupperne på 6 sektioner adskilt.
    11. Fugt en pensel i størrelse 000 med PBS og dup overskydende væske væk på en fnugfri serviet eller køkkenrulle. Brug penslen til forsigtigt at samle hver sektion op, en ad gangen, og læg den i de relevante brønde på 24-brøndpladen.
    12. Placer en af de 6 sektioner fra gruppen af skiver i hver af de 6 brønde i træk af de 24 brøndplader. Dette sikrer, at hver brønd indeholder repræsentative sektioner, der spænder over det sektionerede område af hjernen.
    13. Fortsæt sektionering i grupper på 6, indtil den kaudale ende af hjernebarken er blevet sektioneret.
    14. Til opbevaring forsegles 24-brøndpladen med parafilm og opbevares ved 4 °C.
      BEMÆRK: Sektioner er stabile i 1-2 måneder ved 4 °C. En PBS-opløsning med 0,1% natriumazid kan anvendes til at hæmme bakterievækst og forlænge sektionernes holdbarhed. Hvis sektionerne skal opbevares i mere end 2 måneder, skal de dog anbringes i kryoprotektantopløsning og fryses ved -20 °C for at opnå de bedste resultater.
  5. Udfør immunhistokemi til reporter gensignalforstærkning.
    BEMÆRK: Alle trin undtagen antigenhentning skal udføres ved hjælp af skånsom til moderat omrøring (~ 100 RPM) på en orbital shaker. For at bevare indbygget fluorescens af kontrolreporteren (mRuby3) skal alle trin beskyttes mod lys så meget som muligt.
    1. Der skal udarbejdes nødvendige buffere som beskrevet i tabel 3.
    2. Forbered en ny 24 brøndplade med en række til hver hjerne, der farves. I den første kolonne af brønde tilsættes 1 ml PBS til hver brønd.
    3. Brug en pensel i størrelse 000 til forsigtigt at overføre 1 brønd sektioner fra den originale samlingsbrønd til den friske PBS i den nye 24 brøndplade for en hurtig skylning for at fjerne resterende OCT-forbindelse.
    4. Tilsæt 1 ml ARB til den næste brønd i 24 brøndpladen og overfør sektioner til denne brønd. Inkuberes i en ovn ved 60 °C i 1 time.
    5. Lad pladen køle af ved stuetemperatur (RT) i 20 min.
    6. Tilføj 1 ml PB til den næste brønd, og overfør sektionerne til denne brønd. Inkuberes ved RT i 20 min.
    7. Tilsæt 500 μL BB til den næste brønd, og overfør sektionerne til denne brønd. Inkuberes ved RT i 1 time.
    8. Tilsæt 2 ml WB til BB, og pipetter derefter ~ 2 ml opløsning og kassér, og efterlad en fortyndet BB-opløsning i brønden. Gentag, indtil sektionerne er tydeligt synlige.
    9. Fortynd det primære antistof (Kylling IgY anti-GFP, 1:1000) i BB. Tilsæt 350-500 μL primær antistofopløsning til den næste brønd og overfør sektionerne til denne brønd. Pladen forsegles med parafilm, og den inkuberes ved 4 °C natten over.
    10. Fortynd BB med WB som tidligere gjort, indtil sektionerne er tydeligt synlige.
    11. Tilføj 1 ml WB til den næste brønd, og overfør sektionerne til denne brønd. Inkuberes ved RT i 20 min.
    12. Fjern ~ 800-900 μL buffer og kassér. Tilsæt 1 ml frisk WB og inkuber 20 min. Udskift 1 ml WB 4 gange mere til i alt 5 vaske, 20 min hver.
    13. Fortynd det sekundære antistof (æsel anti-kylling Alexa Fluor 488 konjugeret, 1:500) i BB. Der tilsættes 350-500 μL af den sekundære antistofopløsning til en ny brønd. Inkuberes ved RT i 45 minutter til 1 time.
      BEMÆRK: Dette er den syvende brønd, så hvis farvning af sektioner fra mere end 2 hjerner, vil der være behov for en ny plade på dette tidspunkt.
    14. Fortynd BB med WB som tidligere og overfør sektionerne til en ny brønd fyldt med 1 ml WB. Vask sektionerne som tidligere gjort i 20 minutter 3 gange.
    15. Der fremstilles en arbejdsløsning af DAPI i PBS (slutkoncentration 0,04-0,8 μg/ml). Beskyt opløsningen mod lys.
    16. Tilføj 1 ml DAPI-løsning til den næste brønd, og overfør sektionerne til denne brønd. Inkuberes ved RT i ~ 5 min.
    17. Overfør sektionerne tilbage til WB, og monter forsigtigt mikroskopdias på mikroskope ved hjælp af en pensel i størrelse 000. Lad lysbillederne lufttørre.
    18. Påfør dækssedler med et passende monteringsmedie. Lad dias hærde ved RT i mørket natten over.

5. Billede og analyser hjernevævssektioner for forstærkeraktivitet.

  1. Brug et objektivt objektiv med lav forstørrelse (5x) til at optage fluorescensbilleder, der spænder over hjernesektionen.
  2. Find injektionsstedet, og vurder omfanget af virustransduktionen baseret på tætheden og intensiteten af røde fluorescerende celler. Pas på at sammenligne dyr, der blev transduceret på samme måde.
  3. Optag detaljerede fluorescerende billeder med et objektiv med højere forstørrelsesmål (≥25x), hvis det ønskes.
    BEMÆRK: Sørg altid for at bruge de samme indstillinger til anskaffelsesparametre såsom excitationslysintensitet, filtre og eksponeringstid mellem prøver, der skal sammenlignes.
  4. Behandl billederne ved hjælp af billedanalysesoftware.
    BEMÆRK: Behandling kan udføres i enhver billedanalysesoftwarepakke. Følgende trin er forslag til bestemmelse af, om en sekvens fungerer som en forstærker i reporterkonstruktionskonteksten (et ja eller nej-spørgsmål) ved hjælp af open source FIJI-distributionen af ImageJ. Mere dybdegående fotometri kan være passende, når man sammenligner aktivitetsgrader mellem forstærkervarianter. Billeder fra forskellige prøver skal altid behandles konsekvent for at blive sammenlignet.
    1. Anvend filtre for at reducere støj. I Fiji skal du vælge indstillingen Despeckle under menuen Process > Noise .
      BEMÆRK: Dette er et 3 x 3 medianfilter.
    2. Baggrundsfluorescens trækkes fra i trin 5.4.3-5.4.6.
    3. Adskil kanalerne i et multikanalbillede. I Fiji skal du vælge indstillingen Opdel kanaler under menuen Billede > farve .
    4. Brug rektangel- eller cirkelmarkeringsværktøjet til at tegne en lille form i et område af billedet, der ikke har fluorescerende celler, og mål den gennemsnitlige pixelintensitet i baggrunden ved hjælp af Analysér > måling. Gentag for at prøve flere områder.
      BEMÆRK: Sørg for, at Gennemsnitlig grå værdi er valgt i menuen Analysér > Indstil målinger .
    5. Gennemsnit den gennemsnitlige grå værdi fra 5-8 baggrundsområder og slip decimaltegnet. Træk denne værdi fra hver pixel i billedet ved hjælp af Proces > matematik > Subtraher.
      BEMÆRK: Afrunding til nærmeste hele tal kan overvurdere baggrunden for at trække fra. Det er mere konservativt blot at droppe decimaltegnet. For eksempel ville 6,4 blive afrundet ned til 6, men 6,5 skal også afrundes ned til 6 for at undgå risikoen for at trække 0,5 enheder reelt signal fra hver pixel.
    6. Hvis det ønskes, kan du flette kanalerne tilbage til et multikanalbillede. I Fiji skal du bruge Image > Color > Merge Channels.
    7. Sy eventuelle overlappende billeder sammen. I Fiji skal du bruge plugins > syning > gitter / samlingssyninger.
    8. Juster lysstyrke og kontrast. I Fiji skal du bruge Image > justere > lysstyrke / kontrast.
      BEMÆRK: Brug altid de samme minimums- og maksimumværdier for hvert billede, der skal sammenlignes.
    9. Antallet af grønne fluorescerende celler tælles ved at følge trin 5.4.10-5.4.12. Dette er de celler, hvor kandidatforstærkersekvensen var i stand til at drive reporterens udtryk.
    10. Start med at skjule den grønne kanal, og brug værktøjet til valg af freeform til at tegne en form omkring det område af hjernen, der udtrykker rød fluorescens. Brug målingsfunktionen i Fiji til at måle området, den integrerede tæthed og den gennemsnitlige grå værdi af den røde kanal i denne zone.
    11. Brug multipunktsmarkeringsværktøjet til at tælle antallet af grønne celler i denne zone.
    12. Normaliser antallet af grønne celler ved den integrerede tæthed af den røde kanal. Den lokale røde kanals lysstyrke er et proxymål for størrelsen af viruseksponering, hvilket gør det muligt at sammenligne forstærkeraktivitet mellem forskellige transducerede dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af disse metoder blev en 915 bp-sekvens i den psykiatriske risikoassocierede tredje intron af genet CACNA1C19,49,50 testet for forstærkeraktivitet i den postnatale musehjerne. Denne sekvens blev opdaget i en MPRA af 345 kandidatforstærkersekvenser centreret om psykiatriske og neurologiske risiko SNP'er12, og karakteriseringseksperimenter beskrives her som et generelt eksempel. C57BL/6-mus blev injiceret ved P0 med en AAV9-konstruktion pakket som en selvkomplementær vektor51 indeholdende EGFP under kontrol af Hsp68 minimal promotor og en enkelt kandidatforstærkersekvens (figur 3A). Yderligere mus blev injiceret med konstruktioner, der indeholdt en negativ kontrolsekvens, der blev forudsagt ikke at have nogen regulatorisk aktivitet (figur 3B). Virale titere til disse konstruktioner blev normaliseret til 6,85 x 1010 vg/ml. Alle injicerede mus blev injiceret sammen med en AAV9-pakket konstruktion indeholdende mRuby3 under kontrol af den konstitutive CAG-promotor for at visualisere det område, der med succes blev transduceret og kontrollere for potentiel variabilitet på stedet og spredning af infektion. Hjerner blev indsamlet på postnatal dag (P) 28 til immunhistokemi og billeddannelse. Disse eksperimenter bekræftede, at denne kandidatforstærkerregion i CACNA1C drev ekspression af EGFP i P28 musehjerne (figur 3A), mens en negativ kontrolsekvens ikke gjorde det (figur 3B). Disse resultater viser anvendelsen af forstærker-reporter-assays i musehjernen, hvilket muliggør in vivo undersøgelse af forstærkere under forhold, der ikke kan rekapituleres ved hjælp af traditionelle in vitro-modeller.

Disse metoder kan også bruges til at teste biblioteker med kandidatforstærkersekvenser for aktivitet ved hjælp af AAV-baserede leveringsmetoder, f.eks. i MPRA'er. Repræsentative billeder af biblioteksbaseret reporterudtryk ved forskellige titere demonstrerer fleksibiliteten i dette assay og effekten af viral titer på transduktionseffektiviteten. Virale præparater med høj titer (figur 4A) versus lav titer (figur 4B) resulterer i forskelle i mængden af transducerede celler, hvilket fremgår af både positiv kontrol mRuby3-ekspression drevet af en CAG-promotor og EGFP-ekspression produceret fra kandidatforstærkerbibliotekerne i postnatal musehjerne. Der er situationer, hvor enten høj titer og bred transduktion eller lav titer og sparsom transduktion kan foretrækkes.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over protokollen. Nøgleelementer i dette assay inkluderer et kandidatforstærkerelement, en minimal promotor, et reportergen og, afhængigt af analysedesign, en stregkodesekvens til unik tagging. Disse elementer klones i en AAV-plasmidrygrad og pakkes i AAV. Viruset leveres til dyret og efterlades til inkubation i et antal dage eller uger. Endelig indsamles vævet af interesse, og forstærkeraktiviteten konstateres via billeddannelse eller sekventering. Forstærkerdrevet transgenekspression kan producere ekspression med celletype, regional og tidsmæssig specificitet i modsætning til konstitutive drivere. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Fleksibilitet i analysedesign . (A) Plasmidorientering kan placere forstærkeren opstrøms for den minimale promotor eller nedstrøms for reportergenet, som i STARR-seq28. For sekvensbaserede udlæsninger er en stregkode inkluderet nedstrøms for reportergenet, eller forstærkeren kan fungere som sin egen stregkode i den anden orientering. (B) Almindelige virale leveringsteknikker til hjernen omfatter intrakranielle injektioner, retro-orbitale injektioner eller hale-veneinjektioner, som kan resultere i forskellige tætheder af transducerede celler i forskellige væv. (C) Aflæsninger kan være sekventeringsbaserede eller billeddannelsesbaserede. I sekventeringsbaserede udlæsninger defineres forstærkeraktivitet ved en relativ stigning i RNA-sekvens versus input-DNA-sekvens (kontrol for AAV-levering). Ved billeddannelsesaflæsninger øges ekspressionen af reportergenet, hvor forstærkeren er aktiv. (D) Potentielle introniske forstærkere i det psykiatriske risikoassocierede gen CACNA1C fremhæves. På det øverste billede er der valgt en bred region, der viser stærke associationer til GWAS-testede træk og interaktioner med CACNA1C-promotoren via PLAC-seq20. I indsatsen identificeres mindre kandidatregioner, der er evolutionært bevaret på sekvensniveau, er i områder med åben kromatin og viser epigenetiske mærker, der indikerer forstærkere. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Forstærker i CACNA1C driver EGFP-ekspression i P28-musehjerne. (A) En mus injiceret intrakranielt ved P0 med en forstærker-reporter-konstruktion (scAAV9-Hsp68-EGFP-CACNA1C_3) og konstitutivt udtrykt injektionskontrol (AAV9-CAG-mRuby3) viser forstærkerdrevet EGFP-ekspression i de midterste nedre lag af cortex ved P28. (B) En mus injiceret ved P0 med en negativ kontrolkonstruktion (scAAV9-Hsp68-EGFP-NEG_4) og injektionskontrol viser ikke udtryk for EGFP ved P28. Helhjernebilleder blev taget ved 5x forstørrelse, og indsatser viser zoomet ind over boksområdet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: AAV-leverede forstærker-reporterbiblioteker med forskellige titere viser aktivitet i musehjerne. (A) Kommercielt pakket, high-titer AAV-PHP.eB bibliotek af kandidatforstærkere driver bred EGFP-ekspression i P7 musehjerne. (B) AAV9-bibliotek med lavere titer af kandidatforstærkere, der er udfældet fra konditionerede medier i emballagecellerne, driver sparsom EGFP-ekspression i P7-musehjerne. Billeder blev taget ved 5x forstørrelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

PCR-reaktionsblanding
5x reaktionsbuffer 10 μL
dNTP'er endelig koncentration på 200 μM hver
Kloning primere endelig koncentration på 0,2 μM hver
Skabelon-DNA 50 ng
Polymerase med høj kvalitet endelig koncentration på 0,02 E/μL
Nukleasefrit vand for at nå 50 μL slutreaktionsvolumen
Termocykling betingelser
30 cyklusser af følgende: Noter
Skridt Temperatur Tidspunkt
Denaturering 98 °C 10 sek.
Anneal 60 °C 20 sek. Optimal temperatur kan variere afhængigt af primere.
Udvide 72 °C 30 s Optimal temperatur og varighed kan variere afhængigt af polymerase.
Endelig forlængelse 72 °C 2 minutter Optimal temperatur og varighed kan variere afhængigt af polymerase.
Holde 4 °C

Tabel 1: PCR-reaktionsblanding og termocyklingsforhold.

Termocykling betingelser
30 cyklusser af følgende: Noter
Skridt Temperatur Tidspunkt
Celle lysis 98 °C 5 minutter
Denaturering 98 °C 10 sek.
Anneal 55 °C 15 sek. Optimal temperatur kan variere afhængigt af primere.
Udvide 72 °C 30 s Optimal temperatur og varighed kan variere afhængigt af polymerase.
Holde 4 °C

Tabel 2: Termocyklingsforhold for koloni-PCR.

Buffere til immunhistokemi
Buffer Sammensætning
1x PBS 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4
1x Citrat-antigenhentningsbuffer (ARB), pH 6,0 Proprietær, se materialeoversigt
Permeabiliseringsbuffer (PB) 1x PBS + 0,5% Triton X100
Vaskebuffer (WB) 1x PBS + 0,1% Triton X100
Blokerende buffer (BB) WB + 5% mælk

Tabel 3: Buffere til immunhistokemi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en rAAV-baseret metode til implementering af forstærkerdrevne transgener i den postnatale musehjerne. I denne generaliserede protokol klones en kandidatforstærker, en minimal promotor, et reportergen og en valgfri stregkodesekvens til en AAV-plasmidrygrad. Disse eksperimenter kan udføres med en enkelt kandidatforstærkersekvens eller med mange sekvenser parallelt. Plamidlet pakkes i en rAAV og leveres til den postnatale musehjerne. Efter en periode for at muliggøre virustransduktion indsamles og afbildes hjernen til reportergenekspression. En konstitutivt udtrykt reportervirus (CAG-mRuby3) er inkluderet som en injektionskontrol. Ved hjælp af dette assay vises forstærkerelementer at drive transkription af EGFP i musehjernen, hvilket demonstrerer forstærkeraktivitet in vivo.

De primære mål for fejlfinding og optimering af dette assay inkluderer viral titer, injektionsteknik og transduktionstidsramme. Forskellige virale titere kan have en stærk effekt på tætheden af transducerede celler. Mens en højere transduktionseffektivitet sandsynligvis er at foretrække for de fleste undersøgelser, er det optimale transduktionsniveau meget afhængigt af eksperimentelle mål. Intrakranielle injektioner tilbyder en høj tæthed af transducerede celler, men vil sandsynligvis være mere fokale på injektionsstedet, selvom spredningen af infektion kan afhænge af viral serotype og dyrets alder52. Retro-orbitale injektioner kan vise mere jævn fordeling af transducerede celler i hele hjernen, men er mindre tilbøjelige til at give noget område med høj infektion. Hale-veneinjektioner kan mere effektivt transducere andre væv ud over hjernen, men vil sandsynligvis give endnu lavere tætheder af transducerede celler i hjernen. På samme måde kan en række tidsrammer for virustransduktion i hjernen tjene forskellige formål. Robust scAAV-ekspression kan forekomme i hjernen så tidligt som syv dage efter intrakraniel injektion, selvom perioder på 28 dage eller længere bruges mere typisk og giver stærk ekspression. Da forstærkere kan være tidsmæssigt specifikke i deres aktivitet, er det vigtigt at overveje den forudsagte aktivitet af de testede forstærkere, når de bestemmer studiedesign.

Der er nogle begrænsninger forbundet med disse metoder, der kan gøre andre muligheder til et mere passende valg afhængigt af eksperimentelle mål. Da AAV'er udviser lav integration i genomet, transduceres væv mest effektivt, når de er modne, og der er en høj densitet af postmitotiske celler, da en stor mængde fortsatte celledelinger vil sænke densiteten af transgenekspressive celler. Til viral levering af et transgen til en mindre moden model, såsom væv, der stadig vokser, kan lentivirus være et mere passende valg, da de integreres i genomet og vil blive arvet af alle datterceller i en transduceret prolifererende celle. Selvom reporteranalysen, der er beskrevet her, er en meget anvendt teknik til funktionel undersøgelse af cis-regulerende aktivitet, kan den ikke give et komplet billede af, hvordan reguleringselementet virker inden for dets oprindelige kontekst. For eksempel giver dette assay ikke information om, hvilke gener der kan målrettes af det regulerende element i genomet. Men hvis forstærkerens målgener er kendt, kan disse oplysninger udnyttes til at afgøre, om celletyperne, der viser ekspression i dette assay, er de samme som dem, der vides at udtrykke forstærkerens målrettede gener, hvilket ville give høj biologisk validitet til fortolkningen af resultater. Analysen må heller ikke fuldstændigt rekapitulere de virkninger, som den omgivende genomiske sekvens eller normal biologisk og adfærdsmæssig aktivitet af dyret kan have på aktiviteten af det testede reguleringselement. Endelig beskriver denne protokol STARR-seq reporterassaydesignet, hvor kandidatforstærkerelementet klones nedstrøms for reportergenet i ORF, i modsætning til opstrøms for promotoren, som i den konventionelle reporterassay kloningsorientering. Inkludering af lange variable sekvenser i ORF af reportergenet kan forårsage reduceret RNA-stabilitet på grund af faktorer som RNA-bindende proteinmotiver, alternative splejsningssteder eller variabelt GC-indhold 36,53, og statistiske metoder er udviklet til at tage højde for sekvensbaserede forstyrrelser ved analyse af STARR-seq-data54,55. På trods af disse overvejelser er STARR-seq MPRA'er blevet brugt i vid udstrækning i de senere år til med succes at identificere cis-regulatoriske elementer56,57,58,59. De her beskrevne metoder kan let tilpasses til brug med den konventionelle MPRA-orientering.

Celletypespecificiteten af forstærkere gør dette assay til et kraftfuldt værktøj til at drive det celletypespecifikke udtryk for gener af interesse in vivo. De nuværende teknikker til celletypespecifik ekspression af et ønsket gen kan begrænses af tilgængeligheden af betingede ekspressionskonstruktioner eller kræve generering af nye transgene muselinjer. Ved hjælp af et rAAV-baseret forstærkerdrevet system kan et gen af interesse udtrykkes på en spatiotemporalt specifik måde ved at bruge validerede celletypespecifikke forstærkere eller promotorer til at drive ekspression13,14,15. Den seneste udvikling inden for denne teknologi har vist, at kombination af celletypespecifikke forstærkere med rAAV-serotyper med tropismer for celler eller væv af interesse kan vise lignende specificitet af transgenekspression som i transgene dyremodeller60. Dette giver en billig, hurtig og potentielt høj kapacitet til sekvensscreening og specifik induktion af transgenekspression in vivo i dyremodeller.

Denne teknologi har også terapeutisk potentiale. Kliniske undersøgelser har vist, at rAAV-baseret levering af et transgen in vivo kan inducere ekspression af sunde kopier af et gen i tilfælde, hvor kun en defekt kopi er til stede, eller genet ikke transkriberes med en tilstrækkelig hastighed61,62,63. Valget af et køreforstærkerelement har potentialet til at muliggøre generaliseret levering, men udtryksinduktion på en celletypespecifik måde. Endelig giver levering af transgenet via rAAV også betydelige fordele; AAV'er har lavere immunogenicitet end andre vira, der ofte anvendes i transgenlevering64, hvilket gør dette til en potentielt sikker viral vektor, der skal anvendes til klinisk brug.

Specifik implementering af in vivo rAAV-baserede forstærker-reporter-assays kan tilpasses og kan ændres, så de passer til en række eksperimentelle mål. Forskellige væv og celler kan målrettes ved at vælge AAV-serotyper eller forstærkere, der har celletype eller spatiotemporal specificitet. Alt fra en til tusinder af forstærker-reporter-konstruktioner kan leveres in vivo, og aktivitet kan analyseres ved hjælp af en række billed- og sekventeringsbaserede udlæsninger, som det er blevet vist i et nyt sæt undersøgelser ved hjælp af denne tilgang 15,16,65,66,67,68 . Udvalget af muligheder for konstruktionsdesign og levering gør det muligt at ændre denne teknik til en række forskellige anvendelser inden for både translationel og grundlæggende videnskab, hvilket gør dette til et kraftfuldt nyt værktøj til genomforskning og neurovidenskabelig forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Sekventering blev udført på UC Davis DNA Technologies Core. Vi takker laboratoriet for Lin Tian på UC Davis for træning i rAAV-emballage og generøst forærende os AAV-hjælper og rep / cap-plasmider. Dette arbejde blev støttet af NIH/NIGMS R35GM119831.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  3. Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
  4. Nord, A. S., West, A. E. Neurobiological functions of transcriptional enhancers. Nature Neuroscience. 23 (1), 5-14 (2020).
  5. Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
  6. Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020 (2010).
  7. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
  9. Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
  10. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  11. Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
  12. Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479 (2021).
  13. Chen, Y. -J. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956 (2013).
  14. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014 (2019).
  15. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  16. Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
  17. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  18. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  19. Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  20. Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
  21. Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
  22. DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
  23. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  25. Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
  26. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  27. Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
  28. Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
  29. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
  30. Kim, J. -Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
  31. Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
  32. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
  33. Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
  34. Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
  35. Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
  36. Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
  37. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  38. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384 (2010).
  39. King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279 (2020).
  40. Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
  41. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877 (2005).
  42. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
  43. Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. Parrot, S., Denoroy, L. 130, Springer. New York. 117-153 (2018).
  44. Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56 (2018).
  45. He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56 (2018).
  46. Chen, S. -Y., Kuo, H. -Y., Liu, F. -C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270 (2018).
  47. Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  48. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628 (2016).
  49. Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
  50. Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
  51. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  52. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
  53. Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
  54. Kim, Y. -S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
  55. Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298 (2020).
  56. Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061 (2020).
  57. Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
  58. Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380 (2018).
  59. Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243 (2020).
  60. Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888 (2020).
  61. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  62. Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
  63. Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
  64. Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
  65. Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
  66. Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
  67. Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
  68. Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089 (2019).

Tags

Neurovidenskab udgave 181
AAV-implementering af forstærkerbaserede ekspressionskonstruktioner <em>in vivo</em> i musehjerne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, … More

Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter