Summary
Detta protokoll beskriver en ny rAAV-baserad övergående förstärkare-reporteranalys. Denna analys kan användas för att inducera förstärkardrivet uttryck in vivo i mushjärnan.
Abstract
Förstärkare är bindande plattformar för en mängd olika transkriptionsfaktorer som driver specifika uttrycksmönster för vävnads- och celltypspecifika gener. Flera sätt att bedöma icke-kodande DNA och olika kromatintillstånd har visat sig vara användbara för att förutsäga närvaron av förstärkarsekvenser i genomet, men att validera aktiviteten hos dessa sekvenser och hitta de organ och utvecklingsstadier de är aktiva i är en arbetsintensiv process. De senaste framstegen inom adenoassocierade virusvektorer (AAV) har möjliggjort utbredd leverans av transgener till musvävnader, vilket möjliggör in vivo-förstärkartestning utan att kräva ett transgent djur. Detta protokoll visar hur en reporterkonstruktion som uttrycker EGFP under kontroll av en minimal promotor, som inte driver betydande uttryck på egen hand, kan användas för att studera aktivitetsmönstren för kandidatförstärkare sekvenser i mushjärnan. En AAV-förpackad reporterkonstruktion levereras till mushjärnan och inkuberas i 1-4 veckor, varefter djuret offras och hjärnsektioner observeras under ett mikroskop. EGFP förekommer i celler där den testade förstärkaren är tillräcklig för att initiera genuttryck, vilket pekar på platsen och utvecklingsstadiet där förstärkaren är aktiv i hjärnan. Standardkloningsmetoder, billiga AAV-förpackningar och expanderande AAV-serotyper och metoder för in vivo-leverans och standardavbildningsavläsning gör detta till ett tillgängligt tillvägagångssätt för studier av hur genuttryck regleras i hjärnan.
Introduction
Förstärkare är genomiska cis-reglerande element som fungerar som transkriptionsfaktorbindningsställen och kan driva uttrycket av en målgen på ett spatiotemporalt specifikt sätt 1,2. De är differentiellt aktiva i olika celltyper, vävnader och utvecklingsstadier och kan vara substrat för sjukdomsriskrelaterad genomisk variation 3,4. Således är behovet av att förstå dynamiken i förstärkarfunktionen avgörande för framsteg i både translationella och grundläggande vetenskapliga tillämpningar inom genomik. In silico förutsägelser av förstärkare aktivitet kan fungera som utmärkta resurser för att generera hypoteser om att förbättra förmågan 5,6. Sådan förutsagd förstärkaraktivitet kan kräva ytterligare validering och förhör för en fullständig förståelse av den funktionella aktiviteten. Enhancer reporter analyser har visat sig vara värdefulla för detta ändamål i en mängd olika system, från celler till djur 7,8,9. För att utöka dessa studier i ett flexibelt och kostnadseffektivt övergående in vivo-sammanhang beskriver detta protokoll användningen av in vivo AAV-baserade metoder för att testa förmodade förstärkarsekvenser för deras förmåga att driva uttrycket av en ektopisk reportergen i den postnatala mushjärnan. Denna familj av metoder har nytta för att förhöra enstaka kandidatsekvenser eller parallell biblioteksscreening och är relevant för grundläggande och translationell forskning.
Denna metod kombinerar i en enda plasmid en förmodad förstärkarkandidat-DNA-sekvens med en reportergen (här EGFP), under kontroll av en minimal promotor som ensam inte driver signifikant uttryck. Plasmiden förpackas i rekombinant AAV (rAAV) och injiceras i en djurmodell. Medan applikationen här är till hjärnan, möjliggör olika rAAV-serotyper infektion över olika vävnadstyper så att detta tillvägagångssätt kan utvidgas till andra system10. Efter en tid kan hjärnan samlas in och analyseras för uttrycket av reportergenen. Starkt uttryck, jämfört med kontroller, indikerar att den testade kandidatsekvensen kunde "förbättra" uttrycket av genen (figur 1). Denna enkla design erbjuder ett enkelt och tydligt tillvägagångssätt för att testa en sekvens för att förbättra aktiviteten in vivo i hjärnan.
Förutom att testa för att förbättra förmågan hos en sekvens kan denna metod kombineras med tekniker för att bestämma cellförstärkande aktivitet. I sekvensbaserade metoder för att bestämma differentiell förstärkaraktivitet kan sortering av celler på celltypspecifika markörer före DNA- och RNA-sekvensering göra det möjligt för forskare att avgöra om olika celltyper visar differentiell förstärkaraktivitet, vilket beskrevs i Gisselbrecht et al.11. I avbildningsbaserade tillvägagångssätt möjliggör sammärkning av bilder med celltypspecifika markörer undersökning av om celler som uppvisar förstärkardriven fluorescens också visar celltypmarkörer av intresse 12,13,14,15,16. Enhancer reporter analyser möjliggör direkt testning av risk-associerad allelisk variation i förstärkare för effekter på förstärkare kapacitet. Den stora majoriteten av de riskloki som identifierats i genomomfattande associeringsstudier (GWAS) ligger i icke-kodande regioner i genomet17. Funktionella annoteringsstudier av dessa riskloci indikerar att en stor del sannolikt fungerar som förstärkare18,19,20. MPRA-distribution in vivo kan möjliggöra testning av dessa riskassocierade varianter för förstärkaraktivitet i hjärnan12,21. Slutligen kan leverans och insamling vid olika tidpunkter ge insikter i de utvecklingsstadier under vilka en förstärkare är aktiv.
Förstärkare-reporter plasmiddesign är olika och kan anpassas för att passa experimentella mål. Det finns flera alternativ för minimala promotorer som har använts i förstärkarforskning, såsom den mänskliga β-globin minimala promotorn22 och musen Hsp68 minimal promotor23. Dessa promotorer är kända för att driva låga uttrycksnivåer om de inte kombineras med ett förstärkarelement för att aktivera dem. Däremot driver konstitutiva promotorelement starkt uttryck av transgenen, användbart för positiv kontroll eller för att testa för förstärkarfunktion mot en bakgrund av robust uttryck. Vanliga val för konstitutiva promotorer inkluderar CAG, en hybridpromotor som härrör från kyckling β-aktinpromotorn och cytomegaloviruset omedelbart tidigt förstärkare24, eller human EF1α25. Eftersom förstärkare är kända för att fungera dubbelriktat26 är förstärkarens orientering och placering i förhållande till den minimala promotorn flexibel (figur 2A). Traditionella förstärkare-reporteranalyser placerar förstärkaren uppströms promotorn och inkluderar i biblioteksleveranser en streckkodssekvens nedströms reportergenen för att associera sekvenseringsläsningar med den testade förstärkaren27. Men förstärkare kan också placeras i reportergenens öppna läsram och fungera som en egen streckkodssekvens, vilket görs i STARR-seq28. Protokollet som beskrivs här använder STARR-seq-analysdesignen och placerar kandidatförstärkarsekvensen i 3 'UTR för reportergenen. Medan STARR-seq-orienteringen erbjuder fördelen med mer strömlinjeformad kloning, är den mindre väl förstådd än det konventionella tillvägagångssättet och kan inducera variabel RNA-stabilitet mellan konstruktioner. De beskrivna metoderna kan enkelt anpassas till antingen STARR-seq eller konventionell orientering med mindre förändringar i kloningsprocessen som har beskrivits någon annanstans27,29.
Olika metoder för AAV-leverans kan användas för att ytterligare anpassa denna teknik för att passa experimentella mål (figur 2B). Direkta intrakraniella injektioner, som beskrivs vidare i detta protokoll, levererar en hög koncentration av virus direkt till hjärnan30. Detta ger en hög transduktionseffektivitet centrerad vid injektionsstället, vilket gör detta till en utmärkt teknik för experiment som vill maximera densiteten hos transducerade celler över ett vävnadsområde. Stereotaktisk injektion kan hjälpa till att standardisera injektionsstället över djur för reproducerbar lokaliserad transduktion. Intrakraniella injektioner är enklast hos tidiga postnatala djur. Som en alternativ teknik kan systemiska injektioner leverera transgener med hjälp av AAV med serotyper som kan korsa blod-hjärnbarriären31. Tail-ven-injektioner tillåter viruset att cirkulera i hela kroppen, vilket möjliggör generaliserad leverans över många vävnader10. Retro-orbitala injektioner är en annan systemisk injektionsteknik som levererar viruset bakom ögat till retro-orbital sinus32. Detta erbjuder en mer direkt väg för AAV från det venösa systemet till hjärnan, vilket resulterar i en högre koncentration av transducerade celler i hjärnan än injektioner i mer perifera blodkärl33.
En annan flexibel aspekt av denna teknik är metoden för avläsning. I stort sett kan alternativ beskrivas som reporterbaserade eller sekvenseringsbaserade (figur 2C). Att införliva en fluorescerande reporter som GFP i konstruktionens öppna läsram resulterar i uttrycket av det fluorescerande proteinet i alla transducerade celler där kandidatförstärkaren drev uttryck. Märknings- och avbildningstekniker som immunohistokemi möjliggör signalförstärkning. Sekvenseringsbaserade avläsningstekniker involverar identifiering av sekvenser från den levererade konstruktionen i RNA som samlats in från vävnaden. Genom att kvantifiera mängden viralt DNA som ursprungligen levererades kan jämförelsen av uttryckt RNA kontra levererat DNA användas för att bestämma i vilken grad en testad förstärkarsekvens kunde driva ökat uttryck av transgenen, till exempel i samband med en massivt parallell reporteranalys (MPRA). MPRA erbjuder en kraftfull utvidgning av dessa tekniker för att testa upp till tusentals kandidatförstärkare för aktivitet samtidigt och har beskrivits utförligt i genomikforskning 12,27,34,35,36. Screening av högre genomströmning uppnås genom att utföra klonings-, förpacknings-, leverans- och sekvenseringssteg för kandidatförstärkare i batch snarare än individuellt.
Val av kandidatförstärkare ger ytterligare en möjlighet till flexibilitet (figur 2D). Till exempel kan denna analys användas för att identifiera förstärkare av en specifik gen, för att fastställa funktionen hos icke-kodande DNA-regioner av intresse eller för att bestämma specifika celltyper eller utvecklingsstadier under vilka en förstärkare är aktiv - som alla tjänar mål både i grundvetenskap och i sjukdomsforskning. I allmänhet drivs valet av kandidatförstärkare av in silico-förutsägelser om förbättringsaktivitet. Vanligtvis inkluderar förutsägelser i silico ChIP-seq för histonmodifieringar som indikerar sannolika förstärkare, såsom H3K27ac37 och kromatin tillgänglighetskartläggning38. Slutligen är ett växande forskningsområde funktionsbaserad screening av syntetiskt utformade förstärkarelement, vilket möjliggör studier av hur förstärkarsekvensen styr funktion39 och design av förstärkare med specifika egenskaper40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll har godkänts av UC Davis Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll #22339) och UC Davis Institutional Biosafety Committee (BUA-R1903). Detta protokoll har testats på C57BL/6J-möss av båda könen vid postnatal dag 0-1.
1. Klona förstärkarkandidatsekvensen i AAV-vektorplasmiden.
OBS: De representativa protokollen ges, men kloningsstrategin har en hög grad av flexibilitet.
- Välj eller designa en reporterkonstruktion. Här sätts förstärkarkandidaten in i 3'-oöversatt region (UTR) i EGFP-reportergenen, som uttrycks under kontroll av Hsp68-minimalpromotorn.
OBS: Många MPRA-plasmidkonstruktioner som är lämpliga för denna analys har deponerats till Addgene41 och är tillgängliga för forskningsanvändning. - Designa PCR-primers för att förstärka en sekvens av intresse. Lägg till 5'-änden av primers lämplig homologiarm för Gibson-kloning (~ 35 bp motsvarande sekvens 5 ' uppströms om insättningsplatsen, toppsträngen för den främre primern och bottensträngen för den bakre primern).
OBS: Se till att basprimersekvensen är ~ 18-24 bp lång och ~ 50% -60% GC-innehåll med en smälttemperatur på cirka 57-59 ° C. - Utför PCR från ett DNA-prov med hjälp av de designade primersna.
- Montera PCR-reaktionsblandningen i 0,2 ml PCR-rör enligt beskrivningen i tabell 1.
- Placera PCR-reaktionsblandningen (erna) på en termisk cykler och cykla enligt programmet som nämns i tabell 1.
- Bekräfta framgången med PCR genom att köra 5 μL PCR-produkt på en 0,7% -1% agarosgel vid 100 V i 30-60 min. Sök efter fragmentet med förutsagd längd.
- Rengör PCR-produkten med hjälp av ett kommersiellt enzymatiskt reaktionsrengöringskolonnsats. Det slutliga eluatet är kloningsinsatsen.
- Utför restriktionsrötning för att linjärisera AAV-vektorn på den unika kloningsplatsen för att sätta in förstärkaren i vektorn.
- Kloningsplatsen i 3 'UTR för enhancer reporter-konstruktionen som används här är avgränsad av unika PacI- och AscI-begränsningsplatser. Utför en sammanfattning för att linjärisera plasmiden på denna plats enligt följande parametrar (steg 1.4.2-1.4.4).
- Smält 1-10 μg vektor-DNA med PacI och AscI, beroende på hur många kloningsreaktioner som behövs. Förbered reaktionerna med den medföljande bufferten enligt tillverkarens instruktioner.
- Inkubera vid 37 °C i 1–2 timmar för att smälta vektor-DNA. (Om man smälter mer än 5 μg i en reaktion på 50 μl kan längre inkubation vara nödvändig.)
- Efter 1-2 timmars inkubation inaktiverar du enzymet genom att inkubera vid 65 °C i 20 minuter.
- Separera restriktionssmältfragmenten med gelelektrofores med användning av en 0,7% -1% agarosgel, kör vid 100 V i 30-60 min.
- Skär ut bandet för den linjäriserade vektorn och rena med hjälp av ett kommersiellt gelextraktionssats.
- Utför Gibson-kloningsreaktioner och transformera
- Bestäm koncentrationen av den renade vektorn och kloningsinsatsen med hjälp av en spektrofotometer.
OBS: DNA absorberar ljus vid 260 nm, medan föroreningar absorberar ljus vid 230 nm och 280 nm. Höga förhållanden (>1,8) på 260/230 och 260/280 indikerar högrenat DNA. - Montera Gibson-kloningsreaktioner i 0,2 ml PCR-rör: 5 μL 2x Gibson-masterblandning, 0,02-0,5 pmol-DNA-fragment i ett förhållande av 3: 1-insats till vektor (optimal DNA-koncentration för reaktionen bör bestämmas empiriskt) och Nukleasfritt vatten (ta upp volymen till 10 μL).
- Inkubera Gibson-reaktioner vid 50 °C i 20 minuter i en termisk cykler.
- Bestäm koncentrationen av den renade vektorn och kloningsinsatsen med hjälp av en spektrofotometer.
- Transformera rekombinationsbrist (recA-) kompetent Escherichia coli (E. coli).
- Sätt ett vattenbad på 42 °C och tina de kommersiellt tillgängliga kompetenta cellerna på is.
OBS: Detta steg kan göras före steg 1.4, och cellerna kan tina medan de förbereder och inkuberar Gibson-reaktionen. - Alikvotera 30-50 μL celler i 2,0 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 2 μl Gibson-reaktion på en alikvot och märk röret med Gibsons identitet. Inkubera cellerna på is i 30 minuter.
OBS: Använd 5-10 ng osmält tom vektor som en positiv kontroll och vatten som en negativ kontroll. - Värmechocka cellerna i 42 °C vattenbad i 30-45 s, återför omedelbart rören till is och låt dem återhämta sig i 5 min.
- När du är på is, tillsätt 400-950 μL av det kommersiellt tillgängliga återställningsmediet.
OBS: Återvinningsmediet som används i dessa experiment innehåller 2% vegetabilisk pepton, 0,5% jästextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 och 20 mM glukos. - Efter återhämtning på is, återvinn cellerna helt genom att inkubera vid 37 ° C med mild omrörning av 250 RPM i 30-60 min.
- Pellera cellerna genom centrifugering vid 5 000 x g i 5 minuter och avlägsna 400 μl av supernatanten och lämna ~50 μl bakterier till plattan.
- Plåta på selektiva medier och inkubera vid 37 °C över natten.
OBS: Det selektiva mediet som används i dessa experiment innehåller 1,0% trypton, 0,5% jästextrakt, 1,0% natriumklorid, 1-2% agar, 96-97% vatten och karbenicillin i en koncentration av 100 μg / ml. Använd alltid rekombinationsbristiga bakteriestammar för kloning av virala plasmider eftersom de virala inverterade terminala upprepningarna (ITR) har matchande sekvenser och kan genomgå homolog rekombination. RecA- stammar av bakterier genomgår dock fortfarande låga nivåer av rekombination. Reporterplasmiden som används här är en självkompletterande AAV, där sekvensen för en av ITR: erna har ändrats och inte längre matchar den andra ITR perfekt. Att odla bakterierna vid 30 °C rekommenderas också för att ytterligare bromsa hastigheten för homolog rekombination.
- Sätt ett vattenbad på 42 °C och tina de kommersiellt tillgängliga kompetenta cellerna på is.
- Verifiera kloner och återställ plasmider.
- Förbered en PCR-masterblandning med hjälp av framåt- och bakåtprimrar (materialtabell) som glödgas till vektorn och flankerar insatsplatsen. Alikvotera 10 μL volymer i 0,2 ml PCR-bandrör.
- I 14 ml rundbottnade rör, bered 5 ml alikvoter av antibiotikaselektiv LB-buljong, en för varje koloni som testas via PCR och negativ kontroll.
- Använd en steril tandpetare eller pipettspets för att plocka en enskild koloni och skrapa kolonin grovt ner i botten av ett PCR-rör.
- När kolonin har dissocierats i PCR-masterblandningen, släpp tandpetaren eller spetsen i en av LB-alikvoterna och märk 14 ml röret med Gibson-reaktionen och PCR-rörnumret.
- Placera kolonins PCR-reaktioner på en termisk cykler och cykla med programmet som beskrivs i tabell 2.
- Inkubera de 5 ml flytande kulturer som inokulerats med tandpetare eller pipettspetsar i en skakningsinkubator inställd på 37 °C och 180 rpm.
- Kör kolonins PCR-reaktioner på en 0,7% -1% agarosgel vid 100 V i 30-60 min och visualisera banden i ett gel doc-bildsystem.
- Kassera de 5 ml kulturer som inte visar det förutsagda PCR-bandet.
- För varje framgångsrikt integrerad klon, låt 5 ml kulturerna växa över natten och utför sedan en plasmid mini prep från 4,5 ml med hjälp av ett kommersiellt kit. Reservera 0,5 ml av den flytande kulturen och spara vid -80 °C som en glycerolstam.
- Bekräfta att transgenerna i plasmiderna är fria från oönskade mutationer med hjälp av Sanger-sekvensering42.
- Efter att reporterkonstruktionen har bekräftats vara framgångsrikt klonad, använd det sparade glycerolbeståndet för att inokulera en 5 ml startkultur och växa i 8-16 timmar i en skakande inkubator vid 30 ° C och 180 varv / min.
- När buljongen är grumlig, späd startkulturen 1 000 gånger i 250-300 ml färsk selektiv LB-buljong och inkubera åtminstone över natten i en skakande inkubator vid 30 °C och 180 rpm. Rena sedan plasmiden med hjälp av ett kommersiellt plasmid maxi-kit.
OBS: Bakterier kommer att växa långsammare vid 30 ° C jämfört med 37 ° C, men detta är den bästa temperaturen för att bromsa hastigheten för spontan rekombination vid odling av stora kulturer. - Utför en XmaI-sammanfattning för att testa för rekombination av ITR med hjälp av steg 1.4.2-1.4.5, och ersätt XmaI istället för PacI och AscI. Visualisera banden på ett gel doc-bildsystem.
OBS: En rAAV-plasmid med båda ITR: erna närvarande kommer att ge två band på en gel efter denna sammanfattning: en längden på rAAV-genomet och den andra längden på resten av plasmid-ryggraden. Om det bara finns ett band har ITR: erna genomgått homolog rekombination, och rAAV-plasmiden kommer inte att kunna förpacka virala partiklar. RAAV-plasmidstamnätet som beskrivs här har utformats så att XmaI-platser endast förekommer i ITR: erna. Om enhancer-kandidatinsatsen också innehåller några XmaI-platser, uppdatera de förutsagda bandresultaten och analysen i enlighet därmed.
2. Skaffa förpackad rAAV.
- Använd förpackad rAAV (professionellt eller internt) för experimenten i denna studie.
OBS: Det finns många alternativ för att förpacka en rAAV. En rAAV kan förpackas professionellt på ett företag eller en universitetskärna. rAAV kan också förpackas internt med olika tekniker som sträcker sig i komplexitet och behov av specialutrustning43,44. Det primära problemet är att få en vektor som är av hög kvalitet och att den infektiösa titern har bestämts med hög grad av säkerhet. Både professionellt förpackade och internt förpackade rAAV användes för olika experiment som beskrivs i denna studie.
3. Injicera intrakraniellt rAAV-förpackad plasmid i neonatala mus.
- Förbered rAAV-blandningen för leverans.
- Om avsikten är att jämföra uttrycksmönstren mellan olika förstärkarreportervirus, utjämna titrarna för alla virus som ska jämföras genom att späda ut alla för att matcha det minst koncentrerade viruset.
- Blanda ihop ett 2: 1 eller 3: 1-förhållande mellan förstärkarreportervirus och konstitutivt uttryckt kontrollreportervirus och tillsätt en liten mängd (0,06% slutlig koncentration) av Fast Green-färgämnet.
OBS: Fast Green är ett färgämne som används i stor utsträckning vid injektioner av försöksdjur, inklusive med AAV, för att visualisera injektionsstället under och omedelbart efter proceduren45,46,47,48. Även om detta är ett viktigt kvalitetssäkringssteg är det möjligt att tillsatsen av färgämne kan störa transduktionen. Att ompröva användningen av injektionsfärg kan vara viktigt för protokolloptimering i vissa fall. Det konstitutivt drivna kontrollviruset är helt avgörande för att jämföra oberoende injektioner. Virusinjektioner varierar i plats och omfattning av transduktion från djur till djur. Den konstitutiva kontrollen gör det möjligt att utesluta misslyckade injektioner från analys och ge en standard för normalisering av variation i virusleverans. - Bryt spetsen på en steril dragen glaspipett gjord av ett μL-graderat kapillärrör genom att försiktigt genomborra det genom en känslig torkduk som steriliserats genom att blötlägga den i 70% etanol och får torka helt. Sätt sedan in den dragna glaspipetten i aspiratorenheten bestående av en anordning för applicering av tryck anslutet till 15-tums långa gummirör som slutar med en gummipackning för att hålla en mikrokapillärpipett.
OBS: "Anordningen för applicering av tryck" kan vara en spruta eller ett munstycke. Om en spruta ska användas måste en andra person applicera tryck genom sprutan medan experimenten manipulerar pipetten i ena handen och djuret i den andra. Om du använder ett munstycke, vilket gör det möjligt för experimentören att få fin kontroll över både djurets och pipettens positioner och trycket som appliceras på sprutan, krävs extra försiktighet för att undvika viruskontaminering. - Applicera undertryck genom aspiratorenheten för att dra en liten volym (~ 0,2-0,5 μL) mineralolja i glaspipetten.
OBS: Detta steg är mycket viktigt för att tillhandahålla en barriär för att förhindra att aerosoliserade viruspartiklar förorenar aspiratorenheten. - Lägg den förberedda aspiratorenheten åt sidan och håll viruset på is tills det är klart att injicera.
- Kryo-bedöva neonatalmössen i en torr plastskål delvis nedsänkt i is tills pedalabstinensreflexen upphör (~ 5 min). Se till att mössen inte är i direkt kontakt med isen.
- Använd undertryck genom aspiratorenheten för att dra virusblandningen i den dragna glaspipetten tills menisken passerar 2 μL tick-märket.
- Ta bort musen från kylkammaren och placera den på bänkskivan. Leta reda på de bilaterala injektionsställena mitt emellan lambda och bregma och halvvägs mellan sagittal sutur och varje öga. Sanera båda områdena med en alkoholtork.
- Använd den dragna glaspipetten för att genomborra skallen på neonatalmössen och applicera försiktigt positivt tryck genom aspiratorenheten när nålen kommer in i hjärnan. Titta på menisken av virusblandningen. Motståndet mot det applicerade trycket minskar när pipettens spets når sidokammaren. Dispensera 1 μL av viruset, dra tillbaka pipetten och upprepa för den andra laterala ventrikeln.
- Placera musen på en värmedyna eller en uppvärmningskammare för att återhämta sig. När du är vaken och aktiv, återför djuret till sin hembur.
4. Samla vävnad och utför immunhistokemi.
- Efter tillräcklig tid efter virustransduktion, bedöva mössen och offra genom transkardiell perfusion.
OBS: Många experiment, inklusive de representativa resultaten som visas här, tillåter en period på 4 veckor eller längre för viruset att transducera. Självkompletterande AAV kan dock visa starkt uttryck så tidigt som 7 dagar12. Den önskade inkubationstiden kan behöva optimeras beroende på specifika experimentella tekniker och mål.- Förbered en peristaltisk pump med intravenös infusionsslang och en 25 G nål.
- Förbered 1x PBS och 4% paraformaldehyd (PFA) och lägg dem på is.
- Placera slangens insugsände i den iskalla 1x PBS. Ställ in flödeshastigheten (2,5 ml/min för P7-möss, 3,5 ml/min för P28-möss) och kör pumpen tills bufferten dras hela vägen genom slangen och rensas från bubblor. Ställ nålen åt sidan tills den är klar för perfusion.
- Inuti en dragskåpa, pipettera en liten volym isofluran på en pappershandduk i botten av en droppburkkammare. Placera den tidigare injicerade musen på ett galler ovanför pappershandduken och se till att den inte kommer i direkt kontakt med isofluranen. Försegla kammaren för att bedöva musen. Vänta i ~ 5 min och öppna sedan kammaren och kontrollera om det finns en pedaluttagsreflex. Fortsätt när djuret är medvetslöst.
OBS: Under hela perfusionen bör musen hållas på isofluran med en näskotte för att förhindra att medvetandet återfårs. - Använd kirurgisk sax för att öppna buken och bröstet på musen, ta bort bröstkorgen och exponera hjärtat.
- Använd en iris mikrosax för att göra ett litet snitt i musens högra förmak, sätt in IV-nålen i vänster kammare och aktivera den peristaltiska pumpen.
- Genomskåda djuret med iskalla 1x PBS tills blodet som spolas ut ur snittet i höger förmak rinner klart. Att rensa vävnaden från blod är mycket viktigt eftersom röda blodkroppar har autofluorescens och blodkärl kan försämra förmågan att avbilda reporteruttryckande celler.
- Pausa den peristaltiska pumpen och flytta insugningsslangen från PBS till 4% PFA. Återaktivera pumpen och perfusa 1 ml/g kroppsvikt, ~25 ml för en vuxen mus.
OBS: Fixeringsskakningar bör vara observerbara och musens kropp ska stelna.
- Dissekera och postfixa hjärnan.
- Ta bort musens huvud med kirurgisk sax.
- Använd en liten kirurgisk sax, börja vid basen av skallen och gör ett snitt längs huvudets mittlinje och dra tillbaka huden och underliggande vävnad för att exponera skallen.
- Använd irisax och skär försiktigt baksidan av skallen, börja vid foramen magnum och fortsätt upp mot och längs sagittal sutur tills luktlökarna passeras.
- Sätt in saxen i skallen över luktlökarna och gör två horisontella snitt i skallen. Gör ett liknande par horisontella snitt i det occipitala benet. De horisontella och mittlinjeskärningarna skapar ett par dörrliknande flikar i toppen av skallen.
- Skala tillbaka flikarna på skallen för att helt exponera hjärnan. Använd en pincett för att skära luktlökarna från skallen och för att skära kranialnerven och frigöra hjärnan från skallen.
- Släpp hjärnan i ett 15 ml koniskt rör med 3-5 ml 4% PFA i PBS. Post-fix 6 h till över natten. Överfixera inte vävnaden.
- Förbered hjärnorna för kryosektion.
- Överför den fasta hjärnan till ett nytt 15 ml koniskt rör med 12-14 ml 30% sackaros i PBS för uttorkning. Inkubera vid 4 °C tills hjärnan sjunker till botten av röret (2-3 dagar).
- Sänk ner den fasta och uttorkade hjärnan i optimal skärtemperatur (OCT) i en 15 mm x 15 mm x 5 mm kryomold. Lägg till OCT tills hjärnan är helt täckt.
- Placera kryomold på ett block av torris och frys provet i ett fast block av OCT (~ 5 min).
OBS: OCT-block kan förvaras vid -80 ° C i månader till år. - Märk kryomolden med provnamnet och hjärnans orientering.
- Skaffa koronala sektioner med hjälp av ett kryostatmikrotom.
- Markera hjärnans orientering på OCT-blocket med penna och ta bort blocket från kryomolden inuti kryostaten.
- Placera OCT-blocket så att hjärnan är orienterad med luktlökarna mot kryostatbladet och fäst blocket på kryostatens objekthållare med lite färsk OCT.
- När du har fryst på plats börjar du skära 50 μm sektioner genom blocket genom att följa stegen 4.4.4-4.4.6.
- Använd inte anti-rullplattan. Sektioner kommer att krulla i täta rullar när de skärs och samlas antingen ovanpå blocket eller falla under i en uppsamlingsbricka.
- Titta på blockets form i de första snitten som görs. Gör vertikala snitt genom blocket, vilket ger ett jämnt ansikte när du börjar klippa. Justera vinkeln med hjälp av provjusteringsarmarna om det behövs.
- När de olfaktoriska glödlamporna är synliga, var noga med formen på sektionerna. Om den ena verkar större än den andra är skärningarna i en vinkel i förhållande till hjärnan, och det är nödvändigt att räta ut hjärnans orientering mot bladet med hjälp av provjusteringsarmarna.
OBS: Om du skär rakt bör cortex börja dyka upp ovanför varje luktlampa samtidigt. - När luktlampan har snittats och rostral hjärnvävnad är synlig, minska skärtjockleken till 30-35 μm och börja samla de flytande sektionerna. Följ steg 4.4.8-4.4.13 för sektionering av hjärnan.
- Borsta bort alla tidigare sektioner från blocket och objekthållaren så att de faller i uppsamlingsfacket. Borsta av dem till ena sidan av brickan och håll dem åtskilda. Om högen är för stor, töm sedan brickan.
- Fördela 1 ml PBS i varje brunn på en 24-brunnsplatta. Märk 1 rad för varje hjärna.
- Skär 6 koronala sektioner. Hämta sektionerna med kall pincett och ordna dem på kryostatstadiet. Upprepa detta steg 2 eller 3 gånger och håll grupperna med 6 sektioner åtskilda.
- Våt en pensel i storlek 000 med PBS och dutta bort överflödig vätska på en luddfri mjukpapper eller pappershandduk. Använd penseln för att försiktigt plocka upp varje sektion, en i taget, och placera den i lämpliga brunnar på 24-brunnsplattan.
- Placera en av de 6 sektionerna från gruppen av skivor i var och en av de 6 brunnarna i rad på 24-brunnsplattan. Detta säkerställer att varje brunn innehåller representativa sektioner som sträcker sig över hjärnans sektionsområde.
- Fortsätt sektionering i grupper om 6 tills den kaudala änden av hjärnbarken har delats upp.
- För förvaring, försegla 24-brunnsplattan med parafilm och förvara vid 4 °C.
OBS: Sektionerna är stabila i 1-2 månader vid 4 °C. En PBS-lösning med 0,1% natriumazid kan användas för att hämma bakterietillväxt och förlänga sektionernas hållbarhet. Om sektionerna ska förvaras längre än 2 månader bör de dock placeras i kryoskyddande lösning och frysas vid -20 °C för bästa resultat.
- Utföra immunhistokemi för reportergensignalförstärkning.
OBS: Alla steg utom antigenhämtning bör utföras med hjälp av mild till måttlig omrörning (~ 100 RPM) på en orbital shaker. För att bevara kontrollreporterns inbyggda fluorescens (mRuby3) bör alla steg skyddas mot ljus så mycket som möjligt.- Förbered nödvändiga buffertar enligt beskrivningen i tabell 3.
- Förbered en ny 24-brunnsplatta med en rad för varje hjärna som färgas. I den första kolumnen med brunnar, tillsätt 1 ml PBS till varje brunn.
- Använd en pensel i storlek 000 och överför försiktigt 1 brunn sektioner från den ursprungliga uppsamlingsbrunnen till den färska PBS i den nya 24-brunnsplattan för en snabb sköljning för att ta bort kvarvarande OCT-förening.
- Tillsätt 1 ml ARB till nästa brunn i 24-brunnsplattan och överför sektionerna till denna brunn. Inkubera i ugn vid 60 °C i 1 timme.
- Låt plattan svalna i rumstemperatur (RT) i 20 min.
- Lägg till 1 ml PB till nästa brunn och överför sektionerna till denna brunn. Inkubera vid RT i 20 min.
- Tillsätt 500 μL BB till nästa brunn och överför sektionerna till denna brunn. Inkubera vid RT i 1 h.
- Tillsätt 2 ml WB till BB och pipettera sedan ut ~ 2 ml lösning och kassera och lämna en utspädd BB-lösning i brunnen. Upprepa tills avsnitten är tydligt synliga.
- Späd den primära antikroppen (Chicken IgY anti-GFP, 1:1000) i BB. Tillsätt 350-500 μL primär antikroppslösning till nästa brunn och överför sektionerna till denna brunn. Försegla plattan med parafilm och inkubera vid 4 °C över natten.
- Späd BB med WB som gjorts tidigare tills sektionerna är tydligt synliga.
- Lägg till 1 ml WB till nästa brunn och överför sektionerna till denna brunn. Inkubera vid RT i 20 min.
- Ta bort ~ 800-900 μL buffert och kassera. Tillsätt 1 ml färsk WB och inkubera 20 min. Byt ut 1 ml WB 4 gånger till för totalt 5 tvättar, 20 min vardera.
- Späd den sekundära antikroppen (Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 konjugerad, 1:500) i BB. Tillsätt 350-500 μl av den sekundära antikroppslösningen till en ny brunn. Inkubera vid RT i 45 minuter till 1 h.
OBS: Detta är den sjunde brunnen, så om färgningssektioner från mer än 2 hjärnor behövs en ny platta vid denna tidpunkt. - Späd BB med WB som tidigare och överför sektionerna till en ny brunn fylld med 1 ml WB. Tvätta sektionerna som tidigare gjorts i 20 min 3 gånger.
- Förbered en arbetslösning av DAPI i PBS (slutlig koncentration 0,04-0,8 μg / ml). Skydda lösningen från ljus.
- Lägg till 1 ml DAPI-lösning till nästa brunn och överför sektionerna till denna brunn. Inkubera vid RT i ~ 5 min.
- Överför sektionerna tillbaka till WB och montera försiktigt på mikroskopglas med en pensel i storlek 000. Låt rutschkanorna lufttorka.
- Applicera täckglas med lämpligt monteringsmedium. Låt rutschkanorna härda vid RT i mörkret över natten.
5. Bild och analysera hjärnvävnadssektioner för förstärkaraktivitet.
- Använd en objektivlins med låg förstoring (5x) för att spela in fluorescensbilder som sträcker sig över hjärnsektionen.
- Lokalisera injektionsstället och utvärdera omfattningen av virustransduktionen baserat på densiteten och intensiteten hos röda fluorescerande celler. Var noga med att jämföra djur som transducerades på samma sätt.
- Spela in detaljerade fluorescerande bilder med en objektiv med högre förstoringsmål (≥25x) om så önskas.
OBS: Se alltid till att använda samma inställningar för förvärvsparametrar som excitationsljusintensitet, filter och exponeringstid mellan prover som ska jämföras. - Bearbeta bilderna med hjälp av bildanalysprogramvara.
OBS: Bearbetning kan göras i alla programvarupaket för bildanalys. Följande steg är förslag för att avgöra om en sekvens fungerar som en förstärkare i reporterkonstruktionskontexten (en ja- eller nej-fråga) med hjälp av FIJI-distributionen med öppen källkod av ImageJ. Mer djupgående fotometri kan vara lämpligt när man jämför aktivitetsgrader mellan förstärkarvarianter. Bilder från olika prover bör alltid bearbetas konsekvent för att kunna jämföras.- Använd filter för att minska bruset. I Fiji väljer du alternativet Despeckle under menyn Process > Noise .
OBS: Detta är ett 3 x 3 medianfilter. - Subtrahera bakgrundsfluorescens enligt steg 5.4.3-5.4.6.
- Separera kanalerna i en flerkanalig bild. I Fiji väljer du alternativet Dela kanaler under menyn Bild > färg .
- Använd rektangel- eller cirkelmarkeringsverktyget för att rita en liten form i ett område i bilden som inte har några fluorescerande celler och mät bakgrundens genomsnittliga pixelintensitet med hjälp av Analysera > mått. Upprepa för att ta prov på flera områden.
OBS: Se till att Genomsnittligt grått värde är valt i menyn Analysera > ställa in mätningar . - Medelvärdet av gråvärdet i genomsnitt från 5–8 bakgrundsområden och minska decimalkommat. Subtrahera det här värdet från varje pixel i bilden med hjälp av Process > Math > Subtrahera.
OBS: Avrundning till närmaste heltal kan överskatta bakgrunden för att subtrahera. Det är mer konservativt att helt enkelt släppa decimalpunkten. Till exempel skulle 6,4 avrundas nedåt till 6, men 6,5 bör också avrundas nedåt till 6 för att undvika risken att subtrahera 0,5 enheter verklig signal från varje pixel. - Om så önskas, slå samman kanalerna tillbaka till en flerkanalig bild. I Fiji använder du Bild > färg > Slå samman kanaler.
- Sy ihop eventuella överlappande bilder. I Fiji använder du Plugins > Stitching > Grid / Collection stitching.
- Justera ljusstyrka och kontrast. I Fiji använder du Bild > Justera > ljusstyrka/kontrast.
Använd alltid samma minimi- och maximivärden för varje bild som ska jämföras. - Räkna antalet gröna fluorescerande celler enligt steg 5.4.10-5.4.12. Det här är cellerna där kandidatförstärkarsekvensen kunde driva reporteruttryck.
- Börja med att dölja den gröna kanalen och använd friformsmarkeringsverktyget för att rita en form runt hjärnans område som uttrycker röd fluorescens. Använd mätfunktionen i Fiji för att mäta området, den integrerade densiteten och det genomsnittliga gråvärdet för den röda kanalen i den här zonen.
- Använd flerpunktsmarkeringsverktyget och räkna antalet gröna celler i den här zonen.
- Normalisera antalet gröna celler med den integrerade densiteten hos den röda kanalen. Den lokala röda kanalens ljusstyrka är ett proxymått för storleken på virusexponeringen, vilket möjliggör jämförelse av förstärkaraktivitet mellan olika transducerade djur.
- Använd filter för att minska bruset. I Fiji väljer du alternativet Despeckle under menyn Process > Noise .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av dessa metoder testades en 915 bp-sekvens i den psykiatriska riskassocierade tredje intronen av genen CACNA1C19,49,50 för förstärkande aktivitet i den postnatala mushjärnan. Denna sekvens upptäcktes i en MPRA av 345 kandidatförstärkarsekvenser centrerade på psykiatrisk och neurologisk risk SNPs12 och karakteriseringsexperiment beskrivs här som ett allmänt exempel. C57BL/6-möss injicerades vid P0 med en AAV9-konstruktion förpackad som en självkomplementär vektor51 innehållande EGFP under kontroll av Hsp68 minimal promotor och en enda kandidatförstärkarsekvens (figur 3A). Ytterligare möss injicerades med konstruktioner som innehöll en negativ kontrollsekvens som förutspåddes inte ha någon reglerande aktivitet (figur 3B). Virala titrar för dessa konstruktioner normaliserades till 6,85 x 1010 vg/ml. Alla injicerade möss injicerades tillsammans med en AAV9-förpackad konstruktion innehållande mRuby3 under kontroll av den konstitutiva CAG-promotorn för att visualisera det område som framgångsrikt transducerades och kontrollera för potentiell variation i stället och smittspridning. Hjärnor samlades in vid postnatal dag (P)28 för immunhistokemi och avbildning. Dessa experiment bekräftade att denna kandidatförstärkarregion i CACNA1C drev uttryck av EGFP i P28-mushjärnan (figur 3A), medan en negativ kontrollsekvens inte gjorde det (figur 3B). Dessa resultat visar tillämpningen av förstärkare-reporter-analyser i mushjärnan, vilket möjliggör in vivo studie av förstärkare under förhållanden som inte kan rekapituleras med traditionella in vitro-modeller.
Dessa metoder kan också användas för att testa bibliotek med kandidatförstärkarsekvenser för aktivitet med AAV-baserade leveransmetoder, till exempel i MPRA. Representativa bilder av biblioteksbaserat reporteruttryck vid olika titrar visar flexibiliteten i denna analys och effekten av viral titer på transduktionseffektiviteten. Viruspreparat med hög titer (figur 4A) kontra lågtiter (figur 4B) resulterar i skillnader i mängden transducerade celler, vilket framgår av både positivt kontroll-mRuby3-uttryck som drivs av en CAG-promotor och EGFP-uttryck som produceras från kandidatförstärkarbiblioteken i postnatal mushjärna. Det finns situationer där antingen hög titer och bred transduktion eller låg titer och gles transduktion kan vara att föredra.
Bild 1: Översikt över protokollet. Viktiga element i denna analys inkluderar ett kandidatförstärkarelement, en minimal promotor, en reportergen och, beroende på analysdesign, en streckkodssekvens för unik märkning. Dessa element klonas till en AAV-plasmidstamnät och förpackas i AAV. Viruset levereras till djuret och lämnas för att inkubera i ett antal dagar eller veckor. Slutligen samlas vävnaden av intresse och förstärkaraktiviteten fastställs via avbildning eller sekvensering. Förstärkardrivet transgenuttryck kan producera uttryck med celltyp, regional och tidsmässig specificitet, i motsats till konstitutiva drivkrafter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Flexibilitet i analysdesign . (A) Plasmidorientering kan placera förstärkaren uppströms den minimala promotorn eller nedströms reportergenen, som i STARR-seq28. För sekvensbaserade avläsningar ingår en streckkod nedströms reportergenen, eller så kan förstärkaren fungera som en egen streckkod i den andra orienteringen. (B) Vanliga virala leveranstekniker till hjärnan inkluderar intrakraniella injektioner, retro-orbitala injektioner eller svans-veninjektioner, vilket kan resultera i olika densiteter av transducerade celler i olika vävnader. (C) Avläsningar kan vara sekvenseringsbaserade eller avbildningsbaserade. I sekvenseringsbaserade avläsningar definieras förstärkaraktiviteten av en relativ ökning av RNA-sekvensen jämfört med inmatad DNA-sekvens (kontroll för AAV-leverans). Vid avbildningsavläsningar ökar uttrycket av reportergenen där förstärkaren är aktiv. (D) Potentiella introniska förstärkare i den psykiatriska riskassocierade genen CACNA1C lyfts fram. I den översta bilden väljs en bred region som visar starka associationer till GWAS-testade egenskaper och interaktioner med CACNA1C-promotorn via PLAC-seq20. I insatsen identifieras mindre kandidatregioner som är evolutionärt bevarade på sekvensnivå, ligger i områden med öppet kromatin och visar epigenetiska märken som indikerar förstärkare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Förstärkare i CACNA1C driver EGFP-uttryck i P28-mushjärnan. (A) En mus som injiceras intrakraniellt vid P0 med en förstärkare-reporter-konstruktion (scAAV9-Hsp68-EGFP-CACNA1C_3) och konstitutivt uttryckt injektionskontroll (AAV9-CAG-mRuby3) visar förstärkardrivet EGFP-uttryck i de mellersta nedre skikten av cortex vid P28. (B) En mus som injiceras vid P0 med en negativ kontrollkonstruktion (scAAV9-Hsp68-EGFP-NEG_4) och injektionskontroll visar inte uttryck för EGFP vid P28. Hela hjärnbilder togs med 5x förstoring och infällningar visar inzoomad vy över det boxade området. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: AAV-levererade förstärkar-reporterbibliotek med olika titrar visar aktivitet i mushjärnan. (A) Kommersiellt förpackat, högtiterat AAV-PHP.eB-bibliotek med kandidatförstärkare driver brett EGFP-uttryck i P7-mushjärnan. (B) AAV9-bibliotek med lägre titer av kandidatförstärkare utfällda från konditionerade medier i förpackningscellerna driver gles EGFP-uttryck i P7-mushjärnan. Bilderna togs med 5x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| PCR-reaktionsblandning | |
| 5x reaktionsbuffert | 10 μl |
| dNTP:er | slutlig koncentration på 200 μM vardera |
| Kloning av primers | slutlig koncentration på 0,2 μM vardera |
| Mall DNA | 50 ng |
| Polymeras med hög trohet | slutlig koncentration på 0,02 U/μl |
| Nukleasfritt vatten | för att nå 50 μl slutlig reaktionsvolym |
| Termocykling förhållanden | |||
| 30 cykler av följande: | Anteckningar | ||
| Steg | Temperatur | Tid | |
| Denaturera | 98 °C | 10 sekunder | |
| Härda | 60 °C | 20 sekunder | Optimal temperatur kan variera beroende på primers. |
| Förlänga | 72 °C | 30 sekunder | Optimal temperatur och varaktighet kan variera beroende på polymeras. |
| Slutlig förlängning | 72 °C | 2 minuter | Optimal temperatur och varaktighet kan variera beroende på polymeras. |
| Hålla | 4 °C | ||
Tabell 1: PCR-reaktionsblandning och termocyklingsförhållanden.
| Termocykling förhållanden | |||
| 30 cykler av följande: | Anteckningar | ||
| Steg | Temperatur | Tid | |
| Cell Lys | 98 °C | 5 minuter | |
| Denaturera | 98 °C | 10 sekunder | |
| Härda | 55 °C | 15 sekunder | Optimal temperatur kan variera beroende på primers. |
| Förlänga | 72 °C | 30 sekunder | Optimal temperatur och varaktighet kan variera beroende på polymeras. |
| Hålla | 4 °C | ||
Tabell 2: Termocyklingsförhållanden för koloni-PCR.
| Buffertar för immunhistokemi | |
| Buffert | Sammansättning |
| 1x PBS | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 |
| 1x Citratantigen Retrieval Buffer (ARB), pH 6.0 | Proprietär, se materialförteckning |
| Permeabilisering buffert (PB) | 1x PBS + 0,5% Triton X100 |
| Tvättbuffert (WB) | 1x PBS + 0,1% Triton X100 |
| Blockerande buffert (BB) | WB + 5% mjölk |
Tabell 3: Buffertar för immunhistokemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en rAAV-baserad metod för distribution av förstärkardrivna transgener i den postnatala mushjärnan. I detta generaliserade protokoll klonas en kandidatförstärkare, en minimal promotor, en reportergen och en valfri streckkodssekvens till en AAV-plasmidstamnät. Dessa experiment kan göras med en enda kandidatförstärkarsekvens eller med många sekvenser parallellt. Plasmiden förpackas i en rAAV och levereras till den postnatala mushjärnan. Efter en tid för att möjliggöra virustransduktion samlas hjärnan in och avbildas för reportergenuttryck. Ett konstitutivt uttryckt reportervirus (CAG-mRuby3) ingår som injektionskontroll. Med hjälp av denna analys visas förstärkarelement för att driva transkription av EGFP i mushjärnan, vilket visar förstärkaraktivitet in vivo.
De primära målen för felsökning och optimering av denna analys inkluderar viral titer, injektionsteknik och transduktionstidsram. Olika virala titrar kan ha en stark effekt på densiteten hos transducerade celler. Medan en högre transduktionseffektivitet sannolikt är att föredra för de flesta forskningar, är den optimala transduktionsnivån mycket beroende av experimentella mål. Intrakraniella injektioner erbjuder en hög densitet av transducerade celler, men kommer sannolikt att vara mer fokala vid injektionsstället, även om smittspridningen kan bero på viral serotyp och djurets ålder52. Retro-orbital injektioner kan visa jämnare fördelning av transducerade celler i hela hjärnan men är mindre benägna att ge något område med hög infektion. Tail-vein injektioner kan mer effektivt transducera andra vävnader utöver hjärnan men kommer sannolikt att ge ännu lägre densiteter av transducerade celler i hjärnan. På samma sätt kan en mängd olika tidsramar för virustransduktion i hjärnan tjäna olika syften. Robust scAAV-uttryck kan förekomma i hjärnan så tidigt som sju dagar efter intrakraniell injektion, även om perioder på 28 dagar eller längre vanligtvis används och ger starkt uttryck. Eftersom förstärkare kan vara tidsspecifika i sin aktivitet är det viktigt att ta hänsyn till den förutsagda aktiviteten hos de testade förstärkarna när man bestämmer studiedesignen.
Det finns vissa begränsningar förknippade med dessa metoder som kan göra andra alternativ till ett mer lämpligt val, beroende på experimentella mål. Eftersom AAV uppvisar låg integration i genomet, transduceras vävnader mest effektivt när de är mogna och det finns en hög densitet av postmitotiska celler, eftersom en stor mängd fortsatta celldelningar kommer att sänka densiteten hos transgenuttryckande celler. För viral leverans av en transgen till en mindre mogen modell, såsom vävnader som fortfarande växer, kan lentivirus vara ett lämpligare val, eftersom de integreras i genomet och kommer att ärvas av alla dotterceller i en transducerad prolifererande cell. Dessutom, medan reporteranalysen som beskrivs här är en allmänt använd teknik för funktionell studie av cis-reglerande aktivitet, kan den inte ge en fullständig bild av hur regleringselementet fungerar inom sitt ursprungliga sammanhang. Till exempel ger denna analys inte information om vilka gener som kan riktas mot det reglerande elementet i genomet. Men om förstärkarens målgener är kända kan denna information utnyttjas för att avgöra om celltyperna som visar uttryck i denna analys är desamma som de som är kända för att uttrycka förstärkarens riktade gener, vilket skulle ge hög biologisk validitet till tolkningen av resultat. Analysen kan inte heller helt rekapitulera de effekter som den omgivande genomiska sekvensen eller djurets normala biologiska och beteendemässiga aktivitet kan ha på aktiviteten hos det testade regleringselementet. Slutligen beskriver detta protokoll STARR-seq-reporteranalysdesignen, där kandidatförstärkarelementet klonas nedströms reportergenen i ORF, i motsats till uppströms promotorn, som i den konventionella reporteranalysens kloningsorientering. Inklusive långa variabla sekvenser i ORF för reportergenen kan orsaka minskad RNA-stabilitet på grund av faktorer som RNA-bindande proteinmotiv, alternativa skarvställen eller variabelt GC-innehåll 36,53, och statistiska metoder har utvecklats för att ta hänsyn till sekvensbaserade fördomar vid analys av STARR-seq-data54,55. Trots dessa överväganden har STARR-seq MPRA använts i stor utsträckning de senaste åren för att framgångsrikt identifiera cis-reglerande element56,57,58,59. Metoderna som beskrivs här kan enkelt anpassas för användning med den konventionella MPRA-orienteringen.
Celltypsspecificiteten hos förstärkare gör denna analys till ett kraftfullt verktyg för att driva det celltypspecifika uttrycket av gener av intresse in vivo. Nuvarande tekniker för celltypspecifikt uttryck av en önskad gen kan begränsas av tillgången på villkorliga uttryckskonstruktioner eller kräva generering av nya transgena muslinjer. Med hjälp av ett rAAV-baserat förstärkardrivet system kan en gen av intresse uttryckas på ett spatiotemporalt specifikt sätt genom att använda validerade celltypspecifika förstärkare eller promotorer för att driva uttryck13,14,15. Den senaste utvecklingen inom denna teknik har visat att kombinationen av celltypspecifika förstärkare med rAAV-serotyper med tropismer för celler eller vävnader av intresse kan visa liknande specificitet av transgenuttryck som i transgena djurmodeller60. Detta erbjuder en billig, snabb och potentiellt hög genomströmningsmetod för sekvensscreening och specifik induktion av transgenuttryck in vivo i djurmodeller.
Denna teknik har också terapeutisk potential. Kliniska studier har visat att rAAV-baserad leverans av en transgen in vivo kan inducera uttrycket av friska kopior av en gen i fall där endast en defekt kopia finns, eller genen transkriberas med tillräcklig hastighet61,62,63. Valet av ett drivande förstärkarelement har potential att möjliggöra generaliserad leverans men uttrycksinduktion på ett celltypspecifikt sätt. Slutligen ger leverans av transgenen via rAAV också betydande fördelar; AAV har lägre immunogenicitet än andra virus som ofta används vid transgenleverans64, vilket gör detta till en potentiellt säker virusvektor som ska användas för klinisk användning.
Specifik distribution av in vivo rAAV-baserade förstärkare-reporteranalyser är anpassningsbar och kan modifieras för att passa en rad experimentella mål. Olika vävnader och celler kan riktas genom att välja AAV-serotyper eller förstärkare som har celltyp eller spatiotemporal specificitet. Var som helst från en till tusentals förstärkare-reporter-konstruktioner kan levereras in vivo, och aktivitet kan analyseras med hjälp av ett antal bild- och sekvenseringsbaserade avläsningar, vilket har visats i en framväxande uppsättning studier med detta tillvägagångssätt 15,16,65,66,67,68 . Utbudet av alternativ för konstruktionsdesign och leverans gör det möjligt att modifiera denna teknik för en mängd olika användningsområden inom både translationell och grundläggande vetenskap, vilket gör detta till ett kraftfullt nytt verktyg för genomik och neurovetenskaplig forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Sekvensering utfördes vid UC Davis DNA Technologies Core. Vi tackar Lin Tians laboratorium vid UC Davis för utbildning i rAAV-förpackningar och generöst gav oss AAV-hjälpare och rep / cap-plasmider. Detta arbete stöddes av NIH/NIGMS R35GM119831.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | C9999-1000ML | |
| 5'-gatcactctcggcatggac-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: Custom designed | Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments. |
| 5'-gatggctggcaactagaagg-3' | Integrated DNA Technologies | N/A: Custom designed | Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments. |
| Agarose | VWR | VWRVN605-500G | |
| Aspirator tube assemblies | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | for mouth-driven delivery of rAAV |
| Bacteriological petri dishes | Thermo Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Carbenicillin | Sigma-Aldrich | C1389-5G | |
| Chicken IgY anti-GFP | Thermo Fisher Scientific | A10262 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM900 | The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800. |
| Conical centrifuge tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Cryomolds | Thermo Fisher Scientific | NC9806558 | These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues. |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dissecting scissors, 4.5" | VWR | 82027-578 | |
| Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | |
| Dulbecco's PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | MT21031CV | |
| Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 22431048 | |
| Falcon round-bottom tubes 14 mL | Thermo Fisher Scientific | 352059 | |
| Fast Green dye | Grainger | F0099-1G | |
| Fine detail paint brush set | Artbrush Tower | B014GWCLFO | |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass capillary tubes | Drummond Scientific Company | 5-000-2005 | |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12663 | Commercial plasmid maxi prep kit |
| HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water | VWR | SH30538.03 | |
| IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle | Thermo Fisher Scientific | 26708 | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | Lint-free wipe |
| LB Agar | Thermo Fisher Scientific | BP1425-500 | LB agar pre-mix for selective media |
| McPherson Vannas iris scissor | Integra LifeSciences | 360-215 | |
| Mineral oil | Sigma Life Science | 69794-500ML | |
| NEB Stable Competent E. coli | NEB | C3040I | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up | Takara | 740609.5 | Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction |
| OCT medium | VWR | 25608-930 | |
| Orbital shaker | Cole Parmer | 60-100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| PCR strip tubes 0.2 mL | VWR | 490003-692 | |
| Peristaltic pump | Gilson | F155005 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10x | Thermo Fisher Scientific | 70011044 | |
| Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F549L | |
| Powdered milk | Sunny Select | ||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28106 | |
| rCutSmart Buffer | NEB | B6004S | Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI |
| Restriction enzyme: AscI | NEB | R0558L | |
| Restriction enzyme: PacI | NEB | R0547L | |
| Restriction enzyme: XmaI | NEB | R0180L | |
| SOC outgrowth medium | NEB | B0920S | Recovery medium after transformation |
| Sucrose (RNase/DNase free) | Millipore Sigma | 033522.5KG | |
| TAE buffer | Apex | 20-194 | |
| Transfer tubing | Gilson | F1179941 | For peristaltic pump |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Thermo Fisher Scientific | A1460 | Plasmid mini prep kit |
References
- Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
- Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
- Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
- Nord, A. S., West, A. E.
- Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
- Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020 (2010).
- Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
- Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
- Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
- Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
- Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479 (2021).
- Chen, Y. -J. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956 (2013).
- Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014 (2019).
- Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
- Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
- Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
- Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
- Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
- Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
- DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
- Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
- Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
- Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
- Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
- Kim, J. -Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
- Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
- Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
- Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
- Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
- Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
- Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384 (2010).
- King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279 (2020).
- Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
- Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877 (2005).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
- Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. Parrot, S., Denoroy, L. 130, Springer. New York. 117-153 (2018).
- Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56 (2018).
- He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56 (2018).
- Chen, S. -Y., Kuo, H. -Y., Liu, F. -C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270 (2018).
- Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
- Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628 (2016).
- Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
- Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
- McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
- Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
- Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
- Kim, Y. -S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
- Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298 (2020).
- Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061 (2020).
- Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
- Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380 (2018).
- Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243 (2020).
- Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
- Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
- Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
- Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
- Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
- Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
- Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
- Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089 (2019).
