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Neuroscience

Déploiement AAV de constructions d’expression basées sur des amplificateurs in vivo dans le cerveau de souris

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/62650
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

Summary

Ce protocole décrit un nouveau test d’amplificateur-rapporteur transitoire basé sur le rAAV. Ce test peut être utilisé pour induire une expression pilotée par l’amplificateur in vivo dans le cerveau de la souris.

Abstract

Les amplificateurs sont des plates-formes de liaison pour un large éventail de facteurs de transcription qui conduisent à des modèles d’expression spécifiques de gènes spécifiques aux tissus et aux types cellulaires. De multiples moyens d’évaluer l’ADN non codant et divers états de chromatine se sont révélés utiles pour prédire la présence de séquences d’amplificateurs dans le génome, mais valider l’activité de ces séquences et trouver les organes et les stades de développement dans lesquels elles sont actives est un processus à forte intensité de main-d’œuvre. Les progrès récents dans les vecteurs de virus adéno-associés (AAV) ont permis la livraison généralisée de transgènes aux tissus de souris, permettant des tests d’amplificateur in vivo sans nécessiter un animal transgénique. Ce protocole montre comment une construction rapporteur qui exprime l’EGFP sous le contrôle d’un promoteur minimal, qui ne conduit pas d’expression significative par elle-même, peut être utilisée pour étudier les modèles d’activité des séquences d’amplificateurs candidats dans le cerveau de la souris. Une construction de rapporteur emballée AAV est livrée au cerveau de la souris et incubée pendant 1 à 4 semaines, après quoi l’animal est sacrifié et des sections de cerveau sont observées au microscope. L’EGFP apparaît dans les cellules dans lesquelles l’amplificateur testé est suffisant pour initier l’expression génique, en localisant l’emplacement et le stade de développement dans lequel l’amplificateur est actif dans le cerveau. Les méthodes de clonage standard, l’emballage AAV à faible coût, les sérotypes AAV en expansion et les méthodes d’administration in vivo et de lecture d’imagerie standard en font une approche accessible pour l’étude de la régulation de l’expression génique dans le cerveau.

Introduction

Les amplificateurs sont des éléments cis-régulateurs génomiques qui servent de sites de liaison au facteur de transcription et peuvent conduire l’expression d’un gène cible d’une manière spatio-temporellement spécifique 1,2. Ils sont différentiellement actifs dans différents types de cellules, tissus et stades de développement et peuvent être des substrats de variation génomique liée au risque de maladie 3,4. Ainsi, la nécessité de comprendre la dynamique de la fonction de l’amplificateur est essentielle pour progresser dans les applications scientifiques translationnelles et fondamentales en génomique. Les prédictions in silico de l’activité de l’amplificateur peuvent constituer d’excellentes ressources pour générer des hypothèses quant à la capacité de l’amplificateur 5,6. Une telle activité d’amplificateur prévue peut nécessiter une validation et une interrogation supplémentaires pour une compréhension complète de l’activité fonctionnelle. Les tests de rapporteurs Enhancer se sont révélés utiles à cette fin dans une variété de systèmes, des cellules aux animaux 7,8,9. Afin d’étendre ces études dans un contexte transitoire in vivo flexible et rentable, ce protocole décrit l’utilisation de méthodes in vivo basées sur l’AAV pour tester des séquences d’amplificateurs putatifs pour leur capacité à conduire l’expression d’un gène rapporteur ectopique dans le cerveau postnatal de la souris. Cette famille de méthodes est utile pour interroger des séquences candidates uniques ou un criblage parallèle en bibliothèque et est pertinente pour la recherche fondamentale et translationnelle.

Cette méthode combine dans un seul plasmide une séquence d’ADN candidate amplificateur putative avec un gène rapporteur (ici EGFP), sous le contrôle d’un promoteur minimal qui seul ne conduit pas à une expression significative. Le plasmide est emballé dans un AAV recombinant (rAAV) et injecté dans un modèle animal. Bien que l’application ici soit au cerveau, divers sérotypes rAAV permettent l’infection à travers différents types de tissus afin que cette approche puisse être étendue à d’autres systèmes10. Après un certain temps, le cerveau peut être recueilli et analysé pour l’expression du gène rapporteur. Une forte expression, comparée à celle des témoins, indique que la séquence candidate testée a pu « améliorer » l’expression du gène (Figure 1). Cette conception simple offre une approche simple et claire pour tester une séquence d’activité d’amplificateur in vivo dans le cerveau.

En plus de tester la capacité d’amplificateur d’une séquence, cette méthode peut être combinée avec des techniques pour déterminer l’activité de l’amplificateur de type cellulaire. Dans les approches basées sur la séquence pour déterminer l’activité différentielle de l’amplificateur, le tri des cellules sur des marqueurs spécifiques au type cellulaire avant le séquençage de l’ADN et de l’ARN peut permettre aux chercheurs de déterminer si différents types de cellules montrent une activité d’amplificateur différentiel, comme cela a été décrit dans Gisselbrecht et coll.11. Dans les approches basées sur l’imagerie, le comarquage d’images avec des marqueurs spécifiques au type cellulaire permet d’examiner si les cellules présentant une fluorescence enhancer-driven présentent également des marqueurs de type cellulaire d’intérêt 12,13,14,15,16. Les tests de rapporteur d’amplificateur permettent de tester directement la variation allélique associée au risque dans les amplificateurs pour les effets sur la capacité de l’amplificateur. La grande majorité des loci de risque identifiés dans les études d’association pangénomique (GWAS) se trouvent dans des régions non codantes du génome17. Les études d’annotation fonctionnelle de ces loci de risque indiquent qu’une grande partie agit probablement comme amplificateurs18,19,20. Le déploiement de la MPRA in vivo peut permettre de tester ces variantes associées au risque pour l’activité d’amplificateur dans le cerveau12,21. Enfin, la livraison et la collecte à différents moments peuvent donner un aperçu des stades de développement au cours desquels un amplificateur est actif.

Les conceptions de plasmides amplificateurs-rapporteurs sont diverses et peuvent être personnalisées pour répondre aux objectifs expérimentaux. Il existe plusieurs options pour les promoteurs minimaux qui ont été utilisées dans la recherche sur les amplificateurs, telles que le promoteur minimal de la β-globinehumaine 22 et le promoteur minimal Hsp6823 de souris. Ces promoteurs sont connus pour conduire de faibles niveaux d’expression à moins qu’ils ne soient couplés à un élément amplificateur pour les activer. En revanche, les éléments promoteurs constitutifs entraînent une forte expression du transgène, utile pour le contrôle positif ou pour tester la fonction d’amplificateur dans un contexte d’expression robuste. Les choix courants pour les promoteurs constitutifs comprennent CAG, un promoteur hybride dérivé du promoteur de la β-actine de poulet et de l’amplificateur immédiat-précoce du cytomégalovirus24, ou EF1α25 humain. Étant donné que les amplificateurs sont connus pour fonctionner de manière bidirectionnelle26, l’orientation et l’emplacement de l’amplificateur par rapport au promoteur minimal sont flexibles (Figure 2A). Les tests traditionnels d’amplificateur-rapporteur placent l’amplificateur en amont du promoteur et, dans les livraisons en bibliothèque, incluent une séquence de codes-barres en aval du gène rapporteur pour associer les lectures de séquençage à l’amplificateurtesté 27. Cependant, les amplificateurs peuvent également être placés dans le cadre de lecture ouvert du gène rapporteur et servir de séquence de codes à barres, comme cela se fait dans STARR-seq28. Le protocole décrit ici utilise la conception du test STARR-seq, plaçant la séquence d’amplificateur candidat dans l’UTR 3' du gène rapporteur. Bien que l’orientation STARR-seq offre l’avantage d’un clonage plus rationalisé, elle est moins bien comprise que l’approche conventionnelle et peut induire une stabilité variable de l’ARN entre les constructions. Les méthodes décrites peuvent être facilement adaptées à l’orientation STARR-seq ou conventionnelle avec des modifications mineures au processus de clonage qui ont été décrites ailleurs27,29.

Différentes méthodes d’administration d’AAV peuvent être utilisées pour personnaliser davantage cette technique afin qu’elle corresponde aux objectifs expérimentaux (Figure 2B). Les injections intracrâniennes directes, décrites plus loin dans ce protocole, délivrent une forte concentration de virus directement dans le cerveau30. Cela donne une efficacité de transduction élevée centrée sur le site d’injection, ce qui en fait une excellente technique pour les expériences cherchant à maximiser la densité des cellules transduites sur une zone de tissu. L’injection stéréotaxique peut aider à normaliser le site d’injection chez les animaux pour une transduction localisée reproductible. Les injections intracrâniennes sont plus simples chez les animaux postnataux précoces. Comme technique alternative, les injections systémiques peuvent délivrer des transgènes en utilisant des AAV avec des sérotypes capables de traverser la barrière hémato-encéphalique31. Les injections de veines de queue permettent au virus de circuler dans tout le corps, permettant une administration généralisée dans de nombreux tissus10. Les injections rétro-orbitales sont une autre technique d’injection systémique qui délivre le virus derrière l’œil dans le sinus rétro-orbitaire32. Cela offre une voie plus directe pour l’AAV du système veineux au cerveau, ce qui entraîne une concentration plus élevée de cellules transduites dans le cerveau que les injections dans des vaisseaux sanguins plus périphériques33.

Un autre aspect flexible de cette technique est la méthode de lecture. De façon générale, les options peuvent être décrites comme étant fondées sur le déclarant ou le séquençage (figure 2C). L’incorporation d’un rapporteur fluorescent tel que GFP dans le cadre de lecture ouvert de la construction entraîne l’expression de la protéine fluorescente dans toutes les cellules transduites où l’amplificateur candidat a entraîné l’expression. Les techniques de marquage et d’imagerie telles que l’immunohistochimie permettent l’amplification du signal. Les techniques de lecture basées sur le séquençage impliquent l’identification de séquences de la construction délivrée dans l’ARN prélevé dans le tissu. En quantifiant la quantité d’ADN viral initialement délivrée, la comparaison de l’ARN exprimé par rapport à l’ADN délivré peut être utilisée pour déterminer dans quelle mesure une séquence d’amplificateur testée était capable de conduire à une expression accrue du transgène, par exemple, dans le contexte d’un test de rapporteur massivement parallèle (MPRA). Les MPRA offrent une puissante expansion de ces techniques pour tester simultanément jusqu’à des milliers d’amplificateurs candidats et ont été largement décrits dans la recherche en génomique 12,27,34,35,36. Un criblage à débit plus élevé est obtenu en exécutant des étapes de clonage, d’empaquetage, de livraison et de séquençage pour les améliorateurs candidats par lots plutôt qu’individuellement.

La sélection d’un candidat amplificateur offre une autre possibilité de flexibilité (Figure 2D). Par exemple, ce test peut être utilisé pour identifier les amplificateurs d’un gène spécifique, pour déterminer la fonction des régions d’intérêt de l’ADN non codantes, ou pour déterminer des types de cellules spécifiques ou des stades de développement au cours desquels un amplificateur est actif - qui servent tous des objectifs à la fois en science fondamentale et en recherche sur les maladies. En général, la sélection des amplificateurs candidats est motivée par les prédictions in silico de l’activité de l’amplificateur. Généralement, les prédictions in silico incluent ChIP-seq pour les modifications des histones qui indiquent des amplificateurs probables, tels que H3K27ac37 et la cartographie de l’accessibilité de la chromatine38. Enfin, un domaine de recherche croissant est le criblage basé sur la fonction d’éléments amplificateurs synthétiques, permettant des études sur la façon dont la séquence d’amplificateurs dirige la fonction39 et la conception d’amplificateurs ayant des propriétés spécifiques40.

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Protocol

Ce protocole a été approuvé par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de UC Davis (protocole #22339) et le comité de biosécurité institutionnel de UC Davis (BUA-R1903). Ce protocole a été testé sur des souris C57BL/6J des deux sexes au jour postnatal 0-1.

1. Cloner la séquence candidate amplificateur dans le plasmide vecteur AAV.

REMARQUE : Les protocoles représentatifs sont donnés, mais la stratégie de clonage a un degré élevé de flexibilité.

  1. Sélectionnez ou concevez une construction de rapporteur. Ici, le candidat amplificateur est inséré dans la région 3' non traduite (UTR) du gène rapporteur EGFP, qui est exprimé sous le contrôle du promoteur minimal Hsp68.
    NOTE: De nombreuses constructions plasmidiques MPRA appropriées pour ce test ont été déposées à Addgene41 et sont disponibles pour la recherche.
  2. Concevoir des amorces de PCR pour amplifier une séquence d’intérêt. Ajouter à l’extrémité 5' des amorces le bras d’homologie approprié pour le clonage de Gibson (~35 pb correspondant à la séquence 5' en amont de l’emplacement d’insertion, brin supérieur pour l’amorce avant et brin inférieur pour l’amorce inverse).
    REMARQUE : Assurez-vous que la séquence d’amorce de base a une longueur de ~18-24 pb et une teneur en GC de ~50 % à 60 % avec une température de fusion d’environ 57-59 °C.
  3. Effectuer la PCR à partir d’un échantillon d’ADN à l’aide des amorces conçues.
    1. Assembler le mélange réactionnel PCR dans des tubes PCR de 0,2 mL comme décrit dans le tableau 1.
    2. Placer le(s) mélange(s) réactionnel PCR sur un thermocycleur et effectuer un cycle selon le programme mentionné dans le tableau 1.
    3. Confirmez le succès de la PCR en administrant 5 μL de produit de PCR sur un gel d’agarose à 0,7%-1% à 100 V pendant 30-60 min. Vérifiez le fragment de longueur prévue.
    4. Nettoyer le produit PCR à l’aide d’un kit de colonne de nettoyage de réaction enzymatique commercial. L’éluat final est l’insert de clonage.
  4. Effectuer une digestion de restriction pour linéariser le vecteur AAV sur le site de clonage unique afin d’insérer l’amplificateur dans le vecteur.
    1. Le site de clonage dans l’UTR 3' de la construction de rapporteur d’amplificateur utilisée ici est délimité par des sites de restriction PacI et AscI uniques. Effectuer un condensé pour linéariser le plasmide à cet endroit selon les paramètres suivants (étapes 1.4.2-1.4.4).
    2. Digérer 1 à 10 μg d’ADN vectoriel à l’aide de PacI et d’AscI, en fonction du nombre de réactions de clonage nécessaires. Préparer les réactions à l’aide du tampon fourni conformément aux instructions du fabricant.
    3. Incuber à 37 °C pendant 1-2 h pour digérer l’ADN vecteur. (Si vous digérez plus de 5 μg dans une réaction de 50 μL, une incubation plus longue peut être nécessaire.)
    4. Après 1-2 h d’incubation, inactiver l’enzyme en incubant à 65 °C pendant 20 min.
    5. Séparer les fragments de condensation de restriction par électrophorèse sur gel à l’aide d’un gel d’agarose à 0,7 %-1 %, à 100 V pendant 30 à 60 min.
    6. Écuser la bande pour le vecteur linéarisé et purifier à l’aide d’un kit d’extraction de gel commercial.
  5. Effectuer des réactions de clonage Gibson et transformer
    1. Déterminer la concentration du vecteur purifié et de l’insert de clonage à l’aide d’un spectrophotomètre.
      REMARQUE : L’ADN absorbe la lumière à 260 nm, tandis que les contaminants absorbent la lumière à 230 nm et 280 nm. Des ratios élevés (>1,8) de 260/230 et 260/280 indiquent un ADN hautement purifié.
    2. Assembler les réactions de clonage de Gibson dans des tubes PCR de 0,2 mL : 5 μL de 2x mélanges maîtres Gibson, des fragments d’ADN de 0,02 à 0,5 pmol dans un rapport de 3:1 insert au vecteur (la concentration optimale d’ADN pour la réaction doit être déterminée empiriquement) et de l’eau sans nucléase (porter le volume à 10 μL).
    3. Incuber les réactions de Gibson à 50 °C pendant 20 min dans un cycleur thermique.
  6. Transformer Escherichia coli (E. coli) déficient en recombinaison (recA-) compétent.
    1. Régler un bain-marie à 42 °C et décongeler sur glace les cellules compétentes disponibles dans le commerce.
      REMARQUE: Cette étape peut être effectuée avant l’étape 1.4, et les cellules peuvent dégeler pendant la préparation et l’incubation de la réaction de Gibson.
    2. Aliquote 30-50 μL de cellules dans des tubes microcentrifugés de 2,0 mL. Ajouter 2 μL de réaction Gibson à une partie aliquote et étiqueter le tube avec l’identité de la Gibson. Incuber les cellules sur la glace pendant 30 min.
      NOTE: Utilisez 5-10 ng de vecteur vide non digéré comme témoin positif et de l’eau comme témoin négatif.
    3. Choc thermique des cellules au bain-marie à 42 °C pendant 30-45 s, remise immédiatement les tubes à la glace et laissez-les récupérer pendant 5 min.
    4. Sur la glace, ajouter de 400 à 950 μL du milieu de récupération disponible sur le marché.
      NOTE: Le milieu de récupération utilisé dans ces expériences contient 2% de peptone végétale, 0,5% d’extrait de levure, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 et 20 mM de glucose.
    5. Après récupération sur glace, récupérer complètement les cellules en les incubant à 37 °C avec une agitation douce de 250 tr/min pendant 30 à 60 min.
    6. Enduire les cellules par centrifugation à 5 000 x g pendant 5 min et retirer 400 μL du surnageant, en laissant ~50 μL de bactéries dans la plaque.
    7. Plaquer sur milieu sélectif et incuber à 37 °C pendant une nuit.
      REMARQUE : Le milieu sélectif utilisé dans ces expériences contient 1,0 % de tryptone, 0,5 % d’extrait de levure, 1,0 % de chlorure de sodium, 1 à 2 % d’agar, 96 à 97 % d’eau et de carbénicilline à une concentration de 100 μg/mL. Utilisez toujours des souches de bactéries déficientes en recombinaison pour cloner des plasmides viraux, car les répétitions terminales inversées virales (RTI) ont des séquences correspondantes et peuvent subir une recombinaison homologue. Cependant, les souches recA- de bactéries subissent encore de faibles niveaux de recombinaison. Le plasmide rapporteur utilisé ici est un AAV auto-complémentaire, où la séquence de l’un des RTI a été modifiée et ne correspond plus parfaitement à l’autre RTI. La culture des bactéries à 30 °C est également recommandée pour ralentir davantage le taux de recombinaison homologue.
  7. Vérifiez les clones et récupérez les plasmides.
    1. Préparer un mélange maître PCR à l’aide d’amorces avant et arrière (table des matériaux) qui recuisent le vecteur, flanquant l’emplacement de l’insert. Aliquote 10 μL volumes dans des tubes en bandelettes PCR de 0,2 mL.
    2. Dans des tubes à fond rond de 14 mL, préparer 5 mL d’aliquotes de bouillon LB sélectif antibiotique, un pour chaque colonie testée par PCR et témoin négatif.
    3. Utilisez un cure-dent stérile ou une pointe de pipette pour choisir une colonie individuelle et gratter grossièrement la colonie dans le fond d’un tube de PCR.
    4. Lorsque la colonie s’est dissociée dans le mélange principal de PCR, déposer le cure-dent ou l’embout dans l’une des aliquotes LB et étiqueter le tube de 14 ml avec la réaction de Gibson et le numéro du tube PCR.
    5. Placer les réactions PCR de la colonie sur un thermocycleur et effectuer le cycle suivant le programme décrit dans le tableau 2.
    6. Incuber les cultures liquides de 5 mL inoculées avec des cure-dents ou des pointes de pipette dans un incubateur à agitation réglé à 37 °C et 180 tr/min.
    7. Exécutez les réactions PCR de la colonie sur un gel d’agarose à 0,7%-1% à 100 V pendant 30-60 min et visualisez les bandes dans un système d’imagerie gel doc.
    8. Jetez les cultures de 5 mL qui n’affichent pas la bande PCR prévue.
    9. Pour chaque clone intégré avec succès, laisser les cultures de 5 mL pousser pendant la nuit, puis effectuer une mini préparation plasmidique à partir de 4,5 mL à l’aide d’une trousse commerciale. Réserver 0,5 mL de culture liquide et économiser à -80 °C comme stock de glycérol.
    10. Confirmer que les transgènes contenus dans les plasmides sont exempts de mutations indésirables en utilisant le séquençage de Sanger42.
    11. Une fois que la construction du rapporteur a été confirmée pour être clonée avec succès, utiliser le stock de glycérol conservé pour inoculer une culture de démarrage de 5 ml et cultiver pendant 8-16 h dans un incubateur à agitation à 30 ° C et 180 RPM.
    12. Une fois que le bouillon est trouble, diluer la culture de démarrage 1 000x dans 250-300 ml de bouillon LB sélectif frais et incuber au moins toute la nuit dans un incubateur à agitation à 30 °C et 180 RPM. Ensuite, purifiez le plasmide à l’aide d’un kit maxi plasmidique commercial.
      REMARQUE: Les bactéries se développent plus lentement à 30 ° C par rapport à 37 ° C, mais c’est la meilleure température pour ralentir le taux de recombinaison spontanée lors de la culture de grandes cultures.
    13. Effectuer un condensé XmaI pour tester la recombinaison des RTI en utilisant les étapes 1.4.2-1.4.5, en remplaçant XmaI par PacI et AscI. Visualisez les bandes sur un système d’imagerie gel doc.
      NOTE: Un plasmide rAAV avec les deux ITR présents donnera deux bandes sur un gel après ce digeste: l’une la longueur du génome rAAV et l’autre la longueur du reste du squelette plasmidique. S’il n’y a qu’une seule bande, les RTI ont subi une recombinaison homologue et le plasmide rAAV ne sera pas capable d’emballer les particules virales. Le squelette plasmidique rAAV décrit ici a été conçu de manière à ce que les sites XmaI ne se produisent que dans les RTI. Si l’encart candidat amplificateur contient également des sites XmaI, mettez à jour les résultats de bande prévus et l’analyse en conséquence.

2. Procurez-vous du rAAV emballé.

  1. Utilisez rAAV emballé (professionnellement ou en interne) pour les expériences de cette étude.
    REMARQUE: Il existe de nombreuses options pour l’emballage d’un rAAV. Un rAAV peut être emballé professionnellement dans une entreprise ou une installation centrale universitaire. Le rAAV peut également être emballé à l’interne à l’aide de différentes techniques dont la complexité varie et le besoin d’équipement spécialisé43,44. La principale préoccupation est d’obtenir un vecteur de haute qualité et que le titre infectieux ait été déterminé avec un degré élevé de certitude. Des rAAV emballés professionnellement et en interne ont été utilisés pour différentes expériences décrites dans cette étude.

3. Injecter par voie intracrânienne du plasmide emballé rAAV à des souris néonatales.

  1. Préparer le mélange rAAV pour la livraison.
    1. Si l’intention est de comparer les profils d’expression entre différents virus rapporteurs amplificateurs, égaliser les titres de tous les virus à comparer en diluant tous pour correspondre au virus le moins concentré.
    2. Mélanger ensemble un rapport de 2:1 ou 3:1 de virus rapporteur amplificateur et de virus rapporteur témoin exprimé de manière constitutive et ajouter une petite quantité (concentration finale de 0,06 %) de colorant vert rapide.
      REMARQUE: Fast Green est un colorant largement utilisé dans les injections d’animaux de laboratoire, y compris avec AAV, pour visualiser le site d’injection pendant et immédiatement après la procédure45,46,47,48. Bien qu’il s’agisse d’une étape importante de l’assurance de la qualité, il est possible que l’ajout de colorant interfère avec la transduction. Reconsidérer l’utilisation du colorant injectable peut être important pour l’optimisation du protocole dans certains cas. Le virus de contrôle constitutive est absolument essentiel pour comparer les injections indépendantes. Les injections virales varient en termes d’emplacement et d’étendue de la transduction d’un animal à l’autre. Le contrôle constitutif permettra d’exclure les injections échouées de l’analyse et fournira une norme pour la normalisation de la variation de l’administration du virus.
    3. Casser l’embout d’une pipette en verre étiré stérile fabriquée à partir d’un tube capillaire gradué μL en la perçant doucement à travers une lingette délicate stérilisée en la trempant dans de l’éthanol à 70% et en la laissant sécher complètement. Insérez ensuite la pipette en verre tiré dans l’ensemble aspirateur consistant en un dispositif d’application de pression relié à un tube en caoutchouc de 15 pouces de long se terminant par un joint en caoutchouc pour maintenir une pipette microcapillaire.
      NOTA : Le « dispositif d’application de pression » peut être une seringue ou un embout buccal. Si une seringue doit être utilisée, une deuxième personne devra appliquer une pression à travers la seringue pendant que l’expérimentateur manipule la pipette dans une main et l’animal dans l’autre. Si vous utilisez un embout buccal permettant à l’expérimentateur de contrôler finement les positions de l’animal et de la pipette et la pression appliquée à la seringue, des précautions supplémentaires sont nécessaires pour éviter la contamination virale.
    4. Appliquez une pression négative à travers l’aspirateur pour aspirer un petit volume (~0,2-0,5 μL) d’huile minérale dans la pipette en verre.
      REMARQUE: Cette étape est très importante pour fournir une barrière afin d’empêcher les particules virales aérosolisées de contaminer l’assemblage de l’aspirateur.
    5. Mettez de côté l’aspirateur préparé et gardez le virus sur la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à être injecté.
  2. Cryo-anesthésier les souris néonatales dans un plat en plastique sec partiellement immergé dans la glace jusqu’à l’arrêt du réflexe de retrait de la pédale (~5 min). Assurez-vous que les souris ne sont pas en contact direct avec la glace.
  3. Utilisez une pression négative à travers l’aspirateur pour aspirer le mélange de virus dans la pipette en verre tiré jusqu’à ce que le ménisque dépasse la graduation de 2 μL.
  4. Retirez la souris de la chambre froide et placez-la sur la paillasse. Situez les sites d’injection bilatérale à mi-chemin entre lambda et bregma et à mi-chemin entre la suture sagittale et chaque œil. Désinfectez les deux zones avec une lingette imbibée d’alcool.
  5. Utilisez la pipette en verre tiré pour percer le crâne des souris néonatales et appliquez doucement une pression positive à travers l’ensemble de l’aspirateur lorsque l’aiguille pénètre dans le cerveau. Observez le ménisque du mélange de virus. La résistance à la pression appliquée diminuera lorsque l’extrémité de la pipette atteindra le ventricule latéral. Distribuer 1 μL du virus, retirer la pipette et répéter pour l’autre ventricule latéral.
  6. Placez la souris sur un coussin chauffant ou une chambre chauffante pour récupérer. Une fois éveillé et actif, retournez l’animal dans sa cage d’origine.

4. Prélever des tissus et effectuer l’immunohistochimie.

  1. Après un laps de temps suffisant après la transduction du virus, anesthésier les souris et sacrifier par perfusion transcardique.
    REMARQUE: De nombreuses expériences, y compris les résultats représentatifs présentés ici, permettent une période de 4 semaines ou plus pour que le virus transduise. Cependant, les AAV autocomplémentaires peuvent montrer une forte expression dès 7 jours12. La période d’incubation souhaitée peut devoir être optimisée en fonction de techniques et d’objectifs expérimentaux spécifiques.
    1. Préparez une pompe péristaltique avec un tube de perfusion intraveineuse et une aiguille de 25 G.
    2. Préparez 1x PBS et 4% de paraformaldéhyde (PFA) et placez-les sur de la glace.
    3. Placez l’extrémité d’admission du tube dans le 1x PBS glacé. Réglez le débit (2,5 mL/min pour les souris P7, 3,5 mL/min pour les souris P28) et faites fonctionner la pompe jusqu’à ce que le tampon soit aspiré jusqu’à ce que le tampon soit aspiré à travers le tube et débarrassé des bulles. Mettez l’aiguille de côté jusqu’à ce qu’elle soit prête pour la perfusion.
    4. À l’intérieur d’une hotte, pipeter un petit volume d’isoflurane sur une serviette en papier au fond d’une chambre de pot de dépôt. Placez la souris précédemment injectée sur une grille au-dessus de la serviette en papier, en veillant à ce qu’elle n’entre pas en contact direct avec l’isoflurane. Scellez la chambre pour anesthésier la souris. Attendez ~5 min, puis ouvrez la chambre et vérifiez s’il y a un réflexe de retrait de la pédale. Procédez une fois que l’animal est inconscient.
      REMARQUE: Tout au long de la perfusion, la souris doit être maintenue sur l’isoflurane avec un cône nasal pour éviter de reprendre conscience.
    5. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir l’abdomen et la poitrine de la souris, retirer la cage thoracique et exposer le cœur.
    6. Utilisez une paire de micro-ciseaux à iris pour faire une petite incision dans l’oreillette droite de la souris, insérez l’aiguille intraveineuse dans le ventricule gauche et activez la pompe péristaltique.
    7. Perfuser l’animal avec 1x PBS glacé jusqu’à ce que le sang qui s’échappe de l’incision dans l’oreillette droite soit clair. Il est très important de nettoyer les tissus sanguins parce que les globules rouges ont une autofluorescence et les vaisseaux sanguins peuvent nuire à la capacité d’imager les cellules exprimant le rapporteur.
    8. Mettez la pompe péristaltique en pause et déplacez le tube d’admission du PBS vers le PFA à 4%. Réactiver la pompe et perfuser 1 mL/g de poids corporel, ~25 mL pour une souris adulte.
      REMARQUE: Les tremblements de fixation doivent être observables et le corps de la souris doit se raidir.
  2. Disséquer et post-réparer le cerveau.
    1. Retirez la tête de la souris avec des ciseaux chirurgicaux.
    2. À l’aide de petits ciseaux chirurgicaux, commencez à la base du crâne et faites une incision le long de la ligne médiane de la tête et tirez vers l’arrière la peau et les tissus sous-jacents pour exposer le crâne.
    3. À l’aide de ciseaux à iris, coupez soigneusement l’arrière du crâne, en commençant par le foramen magnum et en continuant vers et le long de la suture sagittale jusqu’à ce que les bulbes olfactifs soient passés.
    4. Insérez les ciseaux dans le crâne sur les bulbes olfactifs et faites deux coupes horizontales dans le crâne. Faites une paire similaire de coupes horizontales dans l’os occipital. Les coupes horizontales et médianes créent une paire de rabats en forme de porte dans le haut du crâne.
    5. Décollez les volets du crâne pour exposer complètement le cerveau. Utilisez une pince à épiler pour couper les bulbes olfactifs du crâne et couper les nerfs crâniens, libérant ainsi le cerveau du crâne.
    6. Plongez le cerveau dans un tube conique de 15 mL avec 3-5 mL de PFA à 4% dans PBS. Post-fix 6 h à la nuit. Ne fixez pas trop le tissu.
  3. Préparez les cerveaux à la cryosection.
    1. Transférer le cerveau fixe dans un nouveau tube conique de 15 ml contenant 12 à 14 ml de saccharose à 30 % dans du PBS pour la déshydratation. Incuber à 4 °C jusqu’à ce que le cerveau s’enfonce au fond du tube (2-3 jours).
    2. Immergez le cerveau fixe et déshydraté dans un composé à température de coupe optimale (OCT) dans un cryomoule de 15 mm x 15 mm x 5 mm. Ajouter la TCO jusqu’à ce que le cerveau soit complètement couvert.
    3. Placer le cryomoule sur un bloc de glace sèche et congeler l’échantillon dans un bloc solide d’OCT (~ 5 min).
      REMARQUE: Les blocs OCT peuvent être stockés à -80 ° C pendant des mois ou des années.
    4. Étiquetez le cryomoule avec le nom de l’échantillon et l’orientation du cerveau.
  4. Obtenir des coupes coronales à l’aide d’un microtome cryostat.
    1. Marquez l’orientation du cerveau sur le bloc OCT au crayon et retirez le bloc du cryomoule à l’intérieur du cryostat.
    2. Positionnez le bloc OCT de manière à ce que le cerveau soit orienté avec les bulbes olfactifs face à la lame du cryostat et collez le bloc au détenteur de l’objet du cryostat avec un peu d’OCT frais.
    3. Une fois congelé en place, commencez à couper des sections de 50 μm à travers le bloc en suivant les étapes 4.4.4-4.4.6.
    4. N’utilisez pas la plaque antiroulis. Les sections s’enrouleront en rouleaux serrés au fur et à mesure qu’elles seront coupées et s’accumuleront soit sur le dessus du bloc, soit tomberont en dessous dans un bac de collecte.
    5. Observez la forme du bloc dans les premières coupes qui sont faites. Faites des coupes verticales à travers le bloc, produisant un visage uniforme lorsque vous commencez à couper. Ajustez l’angle à l’aide des bras de réglage de l’échantillon si nécessaire.
    6. Lorsque les bulbes olfactifs sont visibles, portez une attention particulière à la forme des sections. Si l’un semble plus grand que l’autre, les coupes sont à un angle par rapport au cerveau, et il est nécessaire de redresser l’orientation du cerveau contre la lame à l’aide des bras de réglage de l’échantillon.
      REMARQUE: Si vous coupez droit, le cortex devrait commencer à apparaître au-dessus de chaque bulbe olfactif en même temps.
    7. Une fois que le bulbe olfactif a été sectionné et que le tissu cérébral rostral est visible, réduisez l’épaisseur de coupe à 30-35 μm et commencez à recueillir les sections flottantes. Suivez les étapes 4.4.8-4.4.13 pour sectionner le cerveau.
    8. Brossez toutes les sections précédentes du bloc et du porte-objet afin qu’elles tombent dans le bac collecteur. Brossez-les d’un côté du plateau et gardez-les séparés. Si la pile est trop grande, videz le plateau.
    9. Distribuer 1 mL de PBS dans chaque puits d’une plaque de 24 puits. Étiquetez 1 rangée pour chaque cerveau.
    10. Couper 6 sections coronales. Récupérez les sections à l’aide d’une pince à épiler froide et disposez-les sur l’étage cryostat. Répétez cette étape 2 ou 3 fois, en gardant les groupes de 6 sections séparés.
    11. Mouillez un pinceau de taille 000 avec du PBS et tamponnez l’excès de liquide sur un mouchoir non pelucheux ou une serviette en papier. Utilisez le pinceau pour ramasser délicatement chaque section, une à la fois, et placez-la dans les puits appropriés de la plaque de 24 puits.
    12. Placez l’une des 6 sections du groupe de tranches dans chacun des 6 puits d’une rangée de la plaque de 24 puits. Cela garantit que chaque puits contient des sections représentatives qui couvrent la zone sectionnée du cerveau.
    13. Continuez la section par groupes de 6 jusqu’à ce que l’extrémité caudale du cortex cérébral ait été sectionnée.
    14. Pour le stockage, sceller la plaque de 24 puits avec du parafilm et conserver à 4 °C.
      NOTE: Les sections sont stables pendant 1-2 mois à 4 °C. Une solution de PBS avec de l’azoture de sodium à 0,1% peut être utilisée pour inhiber la croissance bactérienne et prolonger la durée de conservation des sections. Toutefois, si les sections doivent être conservées pendant plus de 2 mois, elles doivent être placées dans une solution cryoprotectrice et congelées à -20 °C pour de meilleurs résultats.
  5. Effectuer une immunohistochimie pour l’amplification du signal du gène rapporteur.
    REMARQUE: Toutes les étapes, à l’exception de la récupération de l’antigène, doivent être effectuées en utilisant une agitation légère à modérée (~ 100 tr / min) sur un agitateur orbital. Pour préserver la fluorescence native du rapporteur de contrôle (mRuby3), toutes les étapes doivent être protégées de la lumière autant que possible.
    1. Préparer les tampons nécessaires comme décrit dans le tableau 3.
    2. Préparez une nouvelle plaque de 24 puits avec une rangée pour chaque cerveau coloré. Dans la première colonne de puits, ajouter 1 mL de PBS à chaque puits.
    3. À l’aide d’un pinceau de taille 000, transférer délicatement 1 puits de sections du puits de collection d’origine sur le PBS frais dans la nouvelle plaque de 24 puits pour un rinçage rapide afin d’éliminer le composé OCT résiduel.
    4. Ajouter 1 mL d’ARB au puits suivant dans la plaque de 24 puits et transférer les sections à ce puits. Incuber dans une étuve à 60 °C pendant 1 h.
    5. Laisser refroidir la plaque à température ambiante (RT) pendant 20 min.
    6. Ajouter 1 mL de PB au puits suivant et transférer les sections dans ce puits. Incuber à TA pendant 20 min.
    7. Ajouter 500 μL de BB au puits suivant et transférer les sections dans ce puits. Incuber à TA pendant 1 h.
    8. Ajouter 2 mL de WB au BB, puis pipeter ~2 mL de solution et jeter, en laissant une solution BB diluée dans le puits. Répétez l’opération jusqu’à ce que les sections soient clairement visibles.
    9. Diluer l’anticorps primaire (Chicken IgY anti-GFP, 1:1000) dans BB. Ajouter 350-500 μL de solution d’anticorps primaires au puits suivant et transférer les sections dans ce puits. Sceller la plaque avec du parafilm et incuber à 4 °C pendant une nuit.
    10. Diluer BB avec WB comme fait précédemment jusqu’à ce que les sections soient clairement visibles.
    11. Ajouter 1 mL de WB au puits suivant et transférer les sections dans ce puits. Incuber à TA pendant 20 min.
    12. Retirer ~800-900 μL de tampon et jeter. Ajouter 1 mL de WB fraîche et incuber 20 min. Remplacer 1 mL de WB 4 fois de plus pour un total de 5 lavages, 20 min chacun.
    13. Diluer l’anticorps secondaire (Donkey anti-poulet Alexa Fluor 488 conjugué, 1:500) dans BB. Ajouter 350-500 μL de la solution d’anticorps secondaires à un nouveau puits. Incuber à TA pendant 45 min à 1 h.
      REMARQUE: C’est le septième puits, donc si des sections de coloration de plus de 2 cerveaux, une nouvelle plaque sera nécessaire à ce stade.
    14. Diluer BB avec WB comme précédemment et transférer les sections dans un nouveau puits rempli de 1 mL de WB. Lavez les sections comme précédemment pendant 20 min 3 fois.
    15. Préparer une solution de travail de DAPI dans du PBS (concentration finale 0,04-0,8 μg/mL). Protéger la solution de la lumière.
    16. Ajouter une solution DAPI de 1 mL au puits suivant et transférer les sections dans ce puits. Incuber à TA pendant ~5 min.
    17. Transférez les sections sur WB et montez délicatement sur des lames de microscope à l’aide d’un pinceau de taille 000. Laissez les lames sécher à l’air.
    18. Appliquez les lamelles de couverture avec un support de montage approprié. Laissez les lames durcir à la RT dans l’obscurité pendant la nuit.

5. Imagez et analysez les sections de tissus cérébraux pour l’activité de l’amplificateur.

  1. Utilisez une lentille d’objectif à faible grossissement (5x) pour enregistrer des images de fluorescence qui couvrent la section du cerveau.
  2. Localiser le site d’injection et évaluer l’étendue de la transduction du virus en fonction de la densité et de l’intensité des cellules fluorescentes rouges. Prenez soin de comparer les animaux qui ont été transduits de la même manière.
  3. Enregistrez des images fluorescentes détaillées avec un objectif de grossissement plus élevé (≥25x) si vous le souhaitez.
    REMARQUE: Assurez-vous toujours d’utiliser les mêmes paramètres pour les paramètres d’acquisition tels que l’intensité lumineuse d’excitation, les filtres et le temps d’exposition entre les échantillons à comparer.
  4. Traitez les images à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.
    REMARQUE: Le traitement peut être effectué dans n’importe quel logiciel d’analyse d’image. Les étapes suivantes sont des suggestions pour déterminer si une séquence agit comme un amplificateur dans le contexte de construction du rapporteur (une question oui ou non) en utilisant la distribution FIJI open source d’ImageJ. Une photométrie plus approfondie peut être appropriée lors de la comparaison des degrés d’activité entre les variantes d’amplificateur. Les images provenant de différents échantillons doivent toujours être traitées de manière cohérente afin d’être comparées.
    1. Appliquez des filtres pour réduire le bruit. Aux Fidji, sélectionnez l’option Despeckle dans le menu Process > Noise (Processus bruit ).
      REMARQUE: Il s’agit d’un filtre médian 3 x 3.
    2. Soustrayez la fluorescence de fond en suivant les étapes 5.4.3-5.4.6.
    3. Séparez les canaux d’une image multicanal. Aux Fidji, sélectionnez l’option Diviser les canaux dans le menu Image > Couleur .
    4. Utilisez l’outil de sélection de rectangle ou de cercle pour dessiner une petite forme dans une zone de l’image qui ne comporte pas de cellules fluorescentes et mesurer l’intensité moyenne en pixels de l’arrière-plan à l’aide de l’option Analyser > mesurer. Répétez l’opération pour échantillonner plusieurs zones.
      REMARQUE : assurez-vous que l’option Valeur moyenne du gris est sélectionnée dans le menu Analyser > définir les mesures .
    5. Faites la moyenne de la valeur moyenne du gris de 5 à 8 zones d’arrière-plan et laissez tomber la virgule. Soustrayez cette valeur de chaque pixel de l’image à l’aide de Process > Math > Subtract.
      REMARQUE : L’arrondi au nombre entier le plus proche pourrait surestimer l’arrière-plan à soustraire. Il est plus prudent de simplement laisser tomber la virgule. Par exemple, 6,4 serait arrondi à 6, mais 6,5 devrait également être arrondi à 6 pour éviter le risque de soustraire 0,5 unité de signal réel de chaque pixel.
    6. Si vous le souhaitez, fusionnez les canaux dans une image multicanal. Aux Fidji, utilisez Image > Color > Fusionner les canaux.
    7. Assemblez toutes les images qui se chevauchent. Aux Fidji, utilisez des plugins > l’assemblage de grilles > de collections.
    8. Ajustez la luminosité et le contraste. Aux Fidji, utilisez Image > Ajuster > luminosité/contraste.
      Remarque : Utilisez toujours les mêmes valeurs minimales et maximales pour chaque image à comparer.
    9. Comptez le nombre de cellules fluorescentes vertes en suivant les étapes 5.4.10 à 5.4.12. Ce sont les cellules dans lesquelles la séquence d’amplificateur candidat a pu conduire l’expression du rapporteur.
    10. Commencez par cacher le canal vert et utilisez l’outil de sélection de forme libre pour dessiner une forme autour de la région du cerveau qui exprime la fluorescence rouge. À l’aide de la fonction Mesurer aux Fidji, mesurez la surface, la densité intégrée et la valeur grise moyenne du canal rouge dans cette zone.
    11. À l’aide de l’outil de sélection multipoint, comptez le nombre de cellules vertes dans cette zone.
    12. Normaliser le nombre de cellules vertes par la densité intégrée du canal rouge. La luminosité locale du canal rouge est une mesure indirecte de l’ampleur de l’exposition au virus, permettant de comparer l’activité de l’amplificateur entre différents animaux transducs.

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Representative Results

En utilisant ces méthodes, une séquence de 915 pb dans le troisième intron associé au risque psychiatrique du gène CACNA1C19,49,50 a été testée pour l’activité d’amplificateur dans le cerveau postnatal de la souris. Cette séquence a été découverte dans un MPRA de 345 séquences d’amplificateurs candidats centrées sur les SNP de risque psychiatrique et neurologique12 et les expériences de caractérisation sont décrites ici à titre d’exemple général. Des souris C57BL/6 ont été injectées à P0 avec une construction AAV9 emballée comme un vecteur auto-complémentaire51 contenant de l’EGFP sous le contrôle du promoteur minimal Hsp68 et d’une séquence d’amplificateur candidat unique (Figure 3A). D’autres souris ont reçu une injection de constructions contenant une séquence de contrôle négative qui ne devait pas avoir d’activité régulatrice (figure 3B). Les titres viraux de ces constructions ont été normalisés à 6,85 x 1010 vg/mL. Toutes les souris injectées ont été co-injectées avec une construction emballée AAV9 contenant mRuby3 sous le contrôle du promoteur constitutif CAG pour visualiser la zone qui a été transduite avec succès et contrôler la variabilité potentielle du site et la propagation de l’infection. Les cerveaux ont été prélevés au jour postnatal (P)28 pour l’immunohistochimie et l’imagerie. Ces expériences ont confirmé que cette région candidate amplificateur dans CACNA1C entraînait l’expression de l’EGFP dans le cerveau de souris P28 (Figure 3A), alors qu’une séquence de contrôle négative ne l’a pas fait (Figure 3B). Ces résultats démontrent l’application de tests amplificateur-rapporteur dans le cerveau de la souris, permettant l’étude in vivo des amplificateurs dans des conditions qui ne peuvent pas être récapitulées à l’aide de modèles in vitro traditionnels.

Ces méthodes peuvent également être utilisées pour tester des bibliothèques de séquences d’amplificateurs candidates pour l’activité à l’aide de méthodes d’administration basées sur AAV, telles que dans les MPRA. Des images représentatives de l’expression du rapporteur en bibliothèque à différents titres démontrent la flexibilité de ce test et l’effet du titre viral sur l’efficacité de la transduction. Les préparations virales à titre élevé (Figure 4A) et à faible titre (Figure 4B) entraînent des différences dans la quantité de cellules transduites, comme en témoignent à la fois l’expression de mRuby3 de contrôle positif pilotée par un promoteur CAG et l’expression EGFP produite à partir des bibliothèques d’amplificateurs candidats dans le cerveau postnatal de souris. Il existe des situations où un titre élevé et une transduction large ou un titre bas et une transduction clairsemée peuvent être préférés.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble du protocole. Les éléments clés de ce test comprennent un élément d’amplificateur candidat, un promoteur minimal, un gène rapporteur et, selon la conception du test, une séquence de codes à barres pour un marquage unique. Ces éléments sont clonés dans un squelette plasmidique AAV et emballés dans AAV. Le virus est livré à l’animal et laissé incuber pendant plusieurs jours ou semaines. Enfin, le tissu d’intérêt est recueilli et l’activité de l’amplificateur est déterminée par imagerie ou séquençage. L’expression transgénique pilotée par l’amplificateur peut produire une expression avec une spécificité cellulaire, régionale et temporelle, contrairement aux facteurs constitutifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Flexibilité dans la conception de l’essai. (A) L’orientation plasmidique peut placer l’amplificateur en amont du promoteur minimal ou en aval du gène rapporteur, comme dans STARR-seq28. Pour les lectures basées sur des séquences, un code-barres est inclus en aval du gène rapporteur, ou l’amplificateur peut servir de son propre code-barres dans la deuxième orientation. (B) Les techniques courantes d’administration virale au cerveau comprennent les injections intracrâniennes, les injections rétro-orbitales ou les injections de veines postérieures, qui peuvent entraîner différentes densités de cellules transduites dans différents tissus. (C) Les lectures peuvent être basées sur le séquençage ou l’imagerie. Dans les lectures basées sur le séquençage, l’activité de l’amplificateur est définie par une augmentation relative de la séquence d’ARN par rapport à la séquence d’ADN d’entrée (en contrôlant la livraison d’AAV). Dans les lectures d’imagerie, l’expression du gène rapporteur est augmentée là où l’amplificateur est actif. (D) Les amplificateurs introniques potentiels dans le gène CACNA1C associé au risque psychiatrique sont mis en évidence. Dans l’image du haut, une large région est sélectionnée qui montre de fortes associations avec les traits testés par GWAS et les interactions avec le promoteur CACNA1C via PLAC-seq20. Dans l’encart est identifié, des régions candidates plus petites sont identifiées qui sont conservées au niveau de l’évolution au niveau de la séquence, sont dans des zones de chromatine ouverte et montrent des marques épigénétiques indiquant des amplificateurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Enhancer dans CACNA1C entraîne l’expression de l’EGFP dans le cerveau de souris P28. (A) Une souris injectée par voie intracrânienne à P0 avec une construction amplificateur-rapporteur (scAAV9-Hsp68-EGFP-CACNA1C_3) et un contrôle d’injection exprimé de manière constitutive (AAV9-CAG-mRuby3) montre une expression EGFP enhancer-driven dans les couches moyennes-inférieures du cortex à P28. (B) Une souris injectée à P0 avec une construction de contrôle négatif (scAAV9-Hsp68-EGFP-NEG_4) et une commande d’injection ne montre pas d’expression de l’EGFP à P28. Les images du cerveau entier ont été prises à un grossissement de 5x et les encarts montrent une vue zoomée de la région en boîte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Les bibliothèques d’amplificateurs-rapporteurs AAV de différents titres montrent l’activité dans le cerveau de la souris. (A) La bibliothèque AAV-PHP.eB à titre élevé et commercialisée d’amplificateurs candidats entraîne une large expression de l’EGFP dans le cerveau de souris P7. (B) La bibliothèque AAV9 à faible titre d’amplificateurs candidats précipités à partir de milieux conditionnés des cellules d’emballage entraîne une expression clairsemée de l’EGFP dans le cerveau de souris P7. Les images ont été prises à un grossissement de 5x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Mélange réactionnel PCR
Tampon de réaction 5x 10 μL
dNTP concentration finale de 200 μM chacun
Amorces de clonage concentration finale de 0,2 μM chacun
Modèle ADN 50 ng
Polymérase haute fidélité concentration finale de 0,02 U/μL
Eau sans nucléase pour atteindre un volume de réaction final de 50 μL
Conditions de thermocyclage
30 cycles des cycles suivants : Notes
Pas Température Heure
Dénaturer 98 °C 10 s
Recuire 60 °C 20 s La température optimale peut varier en fonction des amorces.
Étendre 72 °C 30 s La température et la durée optimales peuvent varier en fonction de la polymérase.
Prolongation finale 72 °C 2 min La température et la durée optimales peuvent varier en fonction de la polymérase.
Tenir 4 °C

Tableau 1 : Mélange réactionnel PCR et conditions de thermocyclage.

Conditions de thermocyclage
30 cycles des cycles suivants : Notes
Pas Température Heure
Lyse cellulaire 98 °C 5 min
Dénaturer 98 °C 10 s
Recuire 55 °C 15 s La température optimale peut varier en fonction des apprêts.
Étendre 72 °C 30 s La température et la durée optimales peuvent varier en fonction de la polymérase.
Tenir 4 °C

Tableau 2 : Conditions de thermocyclage pour la PCR en colonie.

Tampons pour l’immunohistochimie
Tampon Composition
1x PBS 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4
1x tampon de récupération d’antigène de citrate (ARA), pH 6,0 Propriétaire, voir tableau des matériaux
Tampon de perméabilisation (PB) 1x PBS + 0,5% Triton X100
Tampon de lavage (WB) 1x PBS + 0,1% Triton X100
Tampon de blocage (BB) WB + 5% lait

Tableau 3 : Tampons pour l’immunohistochimie.

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Discussion

Ce protocole décrit une méthode basée sur rAAV pour le déploiement de transgènes pilotés par amplificateur dans le cerveau postnatal de la souris. Dans ce protocole généralisé, un amplificateur candidat, un promoteur minimal, un gène rapporteur et une séquence de codes-barres optionnelle sont clonés dans un squelette plasmidique AAV. Ces expériences peuvent être réalisées avec une seule séquence d’amplificateur candidat ou avec plusieurs séquences en parallèle. Le plasmide est emballé dans un rAAV et livré au cerveau postnatal de la souris. Après une période de temps pour permettre la transduction du virus, le cerveau est recueilli et imagé pour l’expression du gène rapporteur. Un virus rapporteur exprimé de manière constitutive (CAG-mRuby3) est inclus comme contrôle d’injection. En utilisant ce test, il est démontré que les éléments amplificateurs conduisent la transcription de l’EGFP dans le cerveau de la souris, démontrant l’activité de l’amplificateur in vivo.

Les principales cibles pour le dépannage et l’optimisation de ce test comprennent le titre viral, la technique d’injection et le délai de transduction. Différents titres viraux peuvent avoir un effet important sur la densité des cellules transduites. Bien qu’une efficacité de transduction plus élevée soit probablement préférable pour la plupart des recherches, le niveau optimal de transduction dépend fortement des objectifs expérimentaux. Les injections intracrâniennes offrent une forte densité de cellules transduites, mais sont susceptibles d’être plus focales au site d’injection, bien que la propagation de l’infection puisse dépendre du sérotype viral et de l’âge de l’animal52. Les injections rétro-orbitales peuvent montrer une distribution plus uniforme des cellules transduites dans tout le cerveau, mais sont moins susceptibles de donner une zone d’infection élevée. Les injections de veines de queue peuvent transduire plus efficacement d’autres tissus en plus du cerveau, mais donneront probablement des densités encore plus faibles de cellules transduites dans le cerveau. De même, une variété de délais pour la transduction du virus dans le cerveau peut servir à des fins différentes. Une expression robuste de scAAV peut se produire dans le cerveau dès sept jours après l’injection intracrânienne, bien que des périodes de 28 jours ou plus soient plus généralement utilisées et donnent une forte expression. Comme les amplificateurs peuvent être temporellement spécifiques dans leur activité, il est important de tenir compte de l’activité prévue des amplificateurs testés lors de la détermination de la conception de l’étude.

Certaines limites associées à ces méthodes pourraient faire d’autres options un choix plus approprié, en fonction des objectifs expérimentaux. Étant donné que les AAV présentent une faible intégration dans le génome, les tissus sont transduits plus efficacement lorsqu’ils sont matures et qu’il existe une forte densité de cellules postmitotiques, car une grande quantité de divisions cellulaires continues réduira la densité des cellules exprimant des transgènes. Pour l’administration virale d’un transgène à un modèle moins mature, comme les tissus qui sont encore en croissance, les lentivirus peuvent être un choix plus approprié, car ils s’intègrent dans le génome et seront hérités par toutes les cellules filles d’une cellule proliférante transduite. De plus, bien que le test rapporteur décrit ici soit une technique largement utilisée pour l’étude fonctionnelle de l’activité cis-régulatrice, il ne peut pas fournir une image complète de la façon dont l’élément régulateur agit dans son contexte d’origine. Par exemple, ce test ne fournit pas d’information sur les gènes qui peuvent être ciblés par l’élément régulateur dans le génome. Cependant, si les gènes cibles de l’amplificateur sont connus, cette information peut être exploitée pour déterminer si les types de cellules montrant l’expression dans ce test sont les mêmes que ceux connus pour exprimer les gènes ciblés de l’amplificateur, ce qui donnerait une validité biologique élevée à l’interprétation des résultats. Le test peut également ne pas récapituler complètement les effets que la séquence génomique environnante ou l’activité biologique et comportementale normale de l’animal peuvent avoir sur l’activité de l’élément régulateur testé. Enfin, ce protocole décrit la conception du test rapporteur STARR-seq, dans laquelle l’élément amplificateur candidat est cloné en aval du gène rapporteur dans l’ORF, contrairement à l’amont du promoteur, comme dans l’orientation conventionnelle du clonage du test rapporteur. L’inclusion de longues séquences variables dans l’ORF du gène rapporteur peut entraîner une réduction de la stabilité de l’ARN en raison de facteurs tels que les motifs de protéines de liaison à l’ARN, les sites d’épissage alternatifs ou la teneur variable en GC 36,53, et des méthodes statistiques ont été développées pour tenir compte des biais basés sur les séquences lors de l’analyse des données STARR-seq54,55. Malgré ces considérations, les AMPM STARR-seq ont été largement utilisés ces dernières années pour identifier avec succès les éléments cis-réglementaires56,57,58,59. Les méthodes décrites ici peuvent être facilement adaptées pour une utilisation avec l’orientation MPRA conventionnelle.

La spécificité du type cellulaire des amplificateurs fait de ce test un outil puissant pour conduire l’expression spécifique du type cellulaire des gènes d’intérêt in vivo. Les techniques actuelles d’expression spécifique au type cellulaire d’un gène désiré peuvent être limitées par la disponibilité de constructions d’expression conditionnelle ou nécessiter la génération de nouvelles lignées de souris transgéniques. En utilisant un système piloté par un amplificateur à base de rAAV, un gène d’intérêt peut être exprimé d’une manière spatio-temporellement spécifique en utilisant des amplificateurs ou des promoteurs validés spécifiques au type cellulaire pour stimuler l’expression13,14,15. Les développements récents de cette technologie ont montré que la combinaison d’amplificateurs spécifiques au type cellulaire avec des sérotypes rAAV avec des tropismes pour les cellules ou les tissus d’intérêt peut montrer une spécificité d’expression transgénique similaire à celle des modèles animaux transgéniques60. Cela offre une méthode peu coûteuse, rapide et potentiellement à haut débit pour le criblage de séquences et l’induction spécifique de l’expression transgénique in vivo dans des modèles animaux.

Cette technologie a également un potentiel thérapeutique. Des études cliniques ont montré que l’administration in vivo d’un transgène basée sur le rAAV peut induire l’expression de copies saines d’un gène dans les cas où seule une copie défectueuse est présente, ou si le gène n’est pas transcrit à un rythme suffisant61,62,63. La sélection d’un élément amplificateur d’entraînement a le potentiel de permettre une administration généralisée mais une induction d’expression d’une manière spécifique au type de cellule. Enfin, l’administration du transgène via rAAV confère également des avantages significatifs; Les AAV ont une immunogénicité plus faible que d’autres virus souvent utilisés dans l’administration de transgènes64, ce qui en fait un vecteur viral potentiellement sûr à utiliser pour un usage clinique.

Le déploiement spécifique de tests in vivo d’amplificateur-rapporteur à base de rAAV est personnalisable et peut être modifié pour répondre à une gamme d’objectifs expérimentaux. Différents tissus et cellules peuvent être ciblés en sélectionnant des sérotypes AAV ou des amplificateurs qui ont un type cellulaire ou une spécificité spatio-temporelle. De un à des milliers de constructions amplificateur-rapporteur peuvent être livrées in vivo, et l’activité peut être analysée à l’aide d’un certain nombre de lectures basées sur l’imagerie et le séquençage, comme l’ont montré une nouvelle série d’études utilisant cette approche 15,16,65,66,67,68 . La gamme d’options pour la conception et la livraison de constructions permet de modifier cette technique pour une variété d’utilisations en science translationnelle et fondamentale, ce qui en fait un nouvel outil puissant pour la recherche en génomique et en neurosciences.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Acknowledgments

Le séquençage a été effectué à l’UC Davis DNA Technologies Core. Nous remercions le laboratoire de Lin Tian à UC Davis pour la formation sur l’emballage rAAV et pour nous avoir généreusement offert des plasmides d’aide AAV et de rep/capuchon. Ce travail a été soutenu par NIH/NIGMS R35GM119831.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit

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Neurosciences numéro 181
Déploiement AAV de constructions d’expression basées sur des amplificateurs <em>in vivo</em> dans le cerveau de souris
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Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, … More

Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).

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