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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Implantação de AAV de construções de expressão baseadas em potenciador in vivo no cérebro do rato

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/62650
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

Summary

Este protocolo descreve um novo ensaio de intensificador-repórter transitório baseado em rAAV. Este ensaio pode ser usado para induzir a expressão impulsionada por potenciadores in vivo no cérebro do rato.

Abstract

Os potenciadores são plataformas de ligação para uma gama diversificada de fatores de transcrição que impulsionam padrões de expressão específicos de genes específicos de tecidos e células. Múltiplos meios de avaliar o DNA não codificante e vários estados de cromatina provaram ser úteis para prever a presença de sequências potencializadoras no genoma, mas validar a atividade dessas sequências e encontrar os órgãos e estágios de desenvolvimento em que estão ativas é um processo trabalhoso. Avanços recentes em vetores de vírus adenoassociados (AAV) permitiram a entrega generalizada de transgenes aos tecidos de camundongos, permitindo testes de potenciadores in vivo sem a necessidade de um animal transgênico. Este protocolo mostra como um construto de repórter que expressa EGFP sob o controle de um promotor mínimo, que não conduz a expressão significativa por si só, pode ser usado para estudar os padrões de atividade de sequências de potenciadores candidatos no cérebro do rato. Uma construção de repórter embalada em AAV é entregue ao cérebro do rato e incubada por 1-4 semanas, após o que o animal é sacrificado e seções cerebrais são observadas sob um microscópio. O EGFP aparece em células nas quais o potenciador testado é suficiente para iniciar a expressão gênica, identificando a localização e o estágio de desenvolvimento em que o potenciador está ativo no cérebro. Métodos de clonagem padrão, embalagem de AAV de baixo custo e sorotipos e métodos de AAV em expansão para entrega in vivo e leitura de imagem padrão tornam esta uma abordagem acessível para o estudo de como a expressão gênica é regulada no cérebro.

Introduction

Os potenciadores são elementos cis-reguladores genômicos que servem como sítios de ligação do fator de transcrição e podem conduzir a expressão de um gene alvo de maneira espaço-temporalmente específica 1,2. Eles são diferencialmente ativos em diferentes tipos celulares, tecidos e estágios de desenvolvimento e podem ser substratos da variação genômica relacionada ao risco de doença 3,4. Assim, a necessidade de entender a dinâmica da função do potenciador é fundamental para o progresso em aplicações translacionais e científicas básicas dentro da genômica. Previsões in silico de atividade potenciadora podem servir como excelentes recursos para gerar hipóteses quanto à capacidade potencializadora 5,6. Tal atividade potenciadora prevista pode exigir validação e interrogação adicionais para uma compreensão completa da atividade funcional. Os ensaios do Enhancer Reporter têm se mostrado valiosos para esse fim em uma variedade de sistemas, de células a animais 7,8,9. No sentido de estender esses estudos em um contexto transiente in vivo flexível e econômico, este protocolo descreve o uso de métodos baseados em AAV in vivo para testar supostas sequências potenciadoras de sua capacidade de conduzir a expressão de um gene repórter ectópico no cérebro de camundongo pós-natal. Essa família de métodos tem utilidade para interrogar sequências candidatas únicas ou triagem paralela de bibliotecas e é relevante para pesquisas básicas e translacionais.

Este método combina em um único plasmídeo uma suposta sequência de DNA candidato a potenciador com um gene repórter (aqui EGFP), sob o controle de um promotor mínimo que por si só não conduz a expressão significativa. O plasmídeo é embalado em AAV recombinante (rAAV) e injetado em um modelo animal. Embora a aplicação aqui seja para o cérebro, vários sorotipos de rAAV permitem a infecção em diferentes tipos de tecidos, de modo que essa abordagem pode ser estendida a outros sistemas10. Após um período de tempo, o cérebro pode ser coletado e ensaiado para a expressão do gene repórter. A expressão forte, comparada aos controles, indica que a sequência candidata testada foi capaz de "aprimorar" a expressão do gene (Figura 1). Este design simples oferece uma abordagem fácil e clara para testar uma sequência de atividade potenciadora in vivo no cérebro.

Além de testar a capacidade de potenciador de uma sequência, este método pode ser combinado com técnicas para determinar a atividade do potenciador do tipo celular. Em abordagens baseadas em sequências para determinar a atividade diferencial do potenciador, a classificação de células em marcadores específicos do tipo celular antes do sequenciamento de DNA e RNA pode permitir que os pesquisadores determinem se diferentes tipos de células apresentam atividade diferencial do potenciador, como foi descrito em Gisselbrecht et al.11. Em abordagens baseadas em imagens, a co-marcação de imagens com marcadores específicos do tipo celular permite examinar se as células que exibem fluorescência impulsionada por potenciador também exibem marcadores do tipo celular de interesse 12,13,14,15,16. Os ensaios do repórter Enhancer permitem o teste direto da variação alélica associada ao risco em potenciadores para efeitos sobre a capacidade do potenciador. A grande maioria dos loci de risco identificados em estudos de associação genômica ampla (GWAS) encontra-se em regiões não codificantes do genoma17. Estudos de anotação funcional desses loci de risco indicam que uma grande parcela provavelmente atua como potenciadores18,19,20. A implantação in vivo do MPRA pode permitir o teste dessas variantes associadas ao risco para a atividade potencializadora no cérebro12,21. Finalmente, a entrega e a coleta em diferentes pontos de tempo podem oferecer insights sobre os estágios de desenvolvimento durante os quais um intensificador está ativo.

Os projetos de plasmídeos do Enhancer-reporter são diversos e podem ser personalizados para atender aos objetivos experimentais. Existem várias opções para promotores mínimos que têm sido utilizados na pesquisa de potenciadores, como o promotor mínimo de β-globina humana22 e o promotor mínimo Hsp68 do rato23. Esses promotores são conhecidos por conduzir baixos níveis de expressão, a menos que combinados com um elemento potenciador para ativá-los. Em contraste, os elementos promotores constitutivos impulsionam uma forte expressão do transgene, útil para o controle positivo ou para testar a função potenciadora em um contexto de expressão robusta. As escolhas comuns para promotores constitutivos incluem CAG, um promotor híbrido derivado do promotor de β-actina de frango e do potenciador imediato-precoce do citomegalovírus24, ou EF1α25 humano. Como os intensificadores são conhecidos por trabalhar bidirecionalmente26, a orientação e a localização do intensificador em relação ao promotor mínimo são flexíveis (Figura 2A). Os ensaios tradicionais de intensificador-repórter colocam o intensificador a montante do promotor e, nas entregas da biblioteca, incluem uma sequência de código de barras a jusante do gene do repórter para associar as leituras de sequenciamento ao intensificador testado27. No entanto, os intensificadores também podem ser colocados no quadro de leitura aberto do gene repórter e servir como sua própria sequência de código de barras, como é feito no STARR-seq28. O protocolo descrito aqui utiliza o desenho do ensaio STARR-seq, colocando a sequência de potenciadores candidatos na UTR de 3' do gene repórter. Embora a orientação STARR-seq ofereça o benefício de uma clonagem mais simplificada, ela é menos bem compreendida do que a abordagem convencional e pode induzir a estabilidade variável do RNA entre construtos. Os métodos descritos podem ser facilmente adaptados à orientação STARR-seq ou convencional com pequenas alterações no processo de clonagem descritas em outros lugares27,29.

Diferentes métodos de entrega de AAV podem ser empregados para personalizar ainda mais essa técnica para se adequar aos objetivos experimentais (Figura 2B). As injeções intracranianas diretas, descritas mais adiante neste protocolo, fornecem uma alta concentração de vírus diretamente ao cérebro30. Isso proporciona uma alta eficiência de transdução centrada no local da injeção, tornando esta uma excelente técnica para experimentos que procuram maximizar a densidade das células transduzidas sobre uma área de tecido. A injeção estereotáxica pode ajudar a padronizar o local de injeção em animais para transdução localizada reprodutível. As injeções intracranianas são mais simples em animais pós-natais precoces. Como técnica alternativa, as injeções sistêmicas podem fornecer transgenes usando AAVs com sorotipos capazes de atravessar a barreira hematoencefálica31. As injeções na veia caudal permitem que o vírus circule por todo o corpo, permitindo a entrega generalizada em muitos tecidos10. As injeções retroorbitais são outra técnica de injeção sistêmica que entrega o vírus atrás do olho no seio retroorbital32. Isso oferece uma rota mais direta para o AAV do sistema venoso para o cérebro, resultando em uma maior concentração de células transduzidas no cérebro do que injeções em vasos sanguíneos mais periféricos33.

Outro aspecto flexível dessa técnica é o método de leitura. Em termos gerais, as opções podem ser descritas como baseadas em repórter ou em sequenciamento (Figura 2C). A incorporação de um repórter fluorescente, como a GFP, no quadro de leitura aberto do construto resulta na expressão da proteína fluorescente em quaisquer células transduzidas em que o potenciador candidato impulsionou a expressão. Técnicas de marcação e imagem, como a imuno-histoquímica, permitem a amplificação do sinal. As técnicas de leitura baseadas em sequenciamento envolvem a identificação de sequências do construto entregue no RNA coletado do tecido. Ao quantificar a quantidade de DNA viral que foi inicialmente entregue, a comparação de RNA expresso versus DNA entregue pode ser usada para determinar o grau em que uma sequência de potenciador testada foi capaz de impulsionar o aumento da expressão do transgene, por exemplo, no contexto de um ensaio de repórter massivamente paralelo (MPRA). Os MPRAs oferecem uma poderosa expansão dessas técnicas para testar até milhares de potenciadores candidatos para atividade simultaneamente e têm sido amplamente descritos em pesquisas genômicas 12,27,34,35,36. A triagem de taxa de transferência mais alta é alcançada executando etapas de clonagem, empacotamento, entrega e sequenciamento para potenciadores candidatos em lote, em vez de individualmente.

A seleção do potencializador de candidatos oferece outra oportunidade de flexibilidade (Figura 2D). Por exemplo, este ensaio pode ser usado para identificar potenciadores de um gene específico, para determinar a função de regiões de DNA não codificantes de interesse, ou para determinar tipos específicos de células ou estágios de desenvolvimento durante os quais um potenciador está ativo - todos os quais servem a objetivos tanto na ciência básica quanto na pesquisa de doenças. Geralmente, a seleção do potenciador de candidatos é impulsionada por previsões in silico da atividade do potenciador. Comumente, as previsões in silico incluem ChIP-seq para modificações de histonas que indicam prováveis potenciadores, como H3K27ac37 e mapeamento de acessibilidade à cromatina38. Finalmente, uma área crescente de pesquisa é a triagem baseada em função de elementos potenciadores sinteticamente projetados, permitindo estudos de como a sequência do intensificador direciona a função39 e o projeto de intensificadores com propriedades específicas40.

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Protocol

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UC Davis (Protocolo #22339) e pelo Comitê de Biossegurança Institucional da UC Davis (BUA-R1903). Este protocolo foi testado em camundongos C57BL/6J de ambos os sexos no dia pós-natal 0-1.

1. Clone a sequência candidata potenciadora no plasmídeo vetorial AAV.

Observação : os protocolos representativos são fornecidos, mas a estratégia de clonagem tem um alto grau de flexibilidade.

  1. Selecione ou crie uma construção de repórter. Aqui, o candidato potenciador é inserido na região não traduzida (UTR) 3' do gene repórter do EGFP, que é expressa sob o controle do promotor mínimo Hsp68.
    NOTA: Muitas construções de plasmídeos MPRA apropriadas para este ensaio foram depositadas no Addgene41 e estão disponíveis para uso em pesquisa.
  2. Projete primers de PCR para amplificar uma sequência de interesse. Adicione à extremidade 5' dos primers o braço de homologia apropriado para clonagem de Gibson (~35 pb correspondentes à sequência 5' a montante do local de inserção, fita superior para o primer dianteiro e cadeia inferior para o primer reverso).
    NOTA: Certifique-se de que a sequência do primer de base tenha ~18-24 pb de comprimento e ~50%-60% de GC com uma temperatura de fusão de aproximadamente 57-59 °C.
  3. Execute a PCR a partir de uma amostra de DNA usando os primers projetados.
    1. Montar a mistura de reação de PCR em tubos de PCR de 0,2 mL, conforme descrito na Tabela 1.
    2. Coloque a(s) mistura(s) de reação de PCR em um termociclador e ciclo de acordo com o programa mencionado na Tabela 1.
    3. Confirme o sucesso da PCR executando 5 μL de produto de PCR em um gel de agarose a 0,7%-1% a 100 V por 30-60 min. Verifique o fragmento do comprimento previsto.
    4. Limpe o produto de PCR usando um kit de coluna de limpeza de reação enzimática comercial. O eluado final é a inserção de clonagem.
  4. Execute a digestão de restrição para linearizar o vetor AAV no local de clonagem exclusivo para inserir o intensificador no vetor.
    1. O site de clonagem na UTR de 3' da construção do repórter intensificador usado aqui é limitado por sites de restrição PacI e AscI exclusivos. Efectuar um resumo para linearizar o plasmídeo neste local de acordo com os seguintes parâmetros (passos 1.4.2-1.4.4).
    2. Digerir 1-10 μg de DNA vetorial usando PacI e AscI, dependendo de quantas reações de clonagem serão necessárias. Preparar as reacções utilizando a memória tampão fornecida de acordo com as instruções do fabricante.
    3. Incubar a 37 °C durante 1-2 h para digerir o ADN vector. (Se digerir mais de 5 μg numa reacção de 50 μL, pode ser necessária uma incubação mais longa.)
    4. Após 1-2 h de incubação, inactivar a enzima por incubação a 65 °C durante 20 min.
    5. Separe os fragmentos de digestão de restrição por eletroforese em gel usando um gel de agarose a 0,7%-1%, executado a 100 V por 30-60 min.
    6. Excise a banda para o vetor linearizado e purifique usando um kit de extração de gel comercial.
  5. Executar reações de clonagem Gibson e transformar
    1. Determine a concentração do vetor purificado e da inserção de clonagem usando um espectrofotômetro.
      NOTA: O ADN absorve a luz a 260 nm, enquanto os contaminantes absorvem a luz a 230 nm e 280 nm. Altas proporções (>1,8) de 260/230 e 260/280 indicam DNA altamente purificado.
    2. Monte as reações de clonagem de Gibson em tubos de PCR de 0,2 mL: 5 μL de 2x Gibson master mix, fragmentos de DNA de 0,02-0,5 pmol em uma proporção de 3:1 de inserção para vetor (a concentração ideal de DNA para a reação deve ser determinada empiricamente) e água livre de nuclease (aumente o volume para 10 μL).
    3. Incubar as reações de Gibson a 50 °C durante 20 minutos num termociclador.
  6. Transformar a recombinação deficiente (recA-) competente Escherichia coli (E. coli).
    1. Ponha banho-maria a 42 °C e descongele as células competentes comercialmente disponíveis no gelo.
      NOTA: Esta etapa pode ser feita antes da etapa 1.4, e as células podem descongelar durante a preparação e incubação da reação de Gibson.
    2. Aliquota 30-50 μL de células em tubos de microcentrífuga de 2,0 mL. Adicionar 2 μL de reação de Gibson a uma alíquota e rotular o tubo com a identidade do Gibson. Incubar as células no gelo por 30 min.
      NOTA: Use 5-10 ng de vetor vazio não digerido como um controle positivo e água como um controle negativo.
    3. Choque térmico das células no banho-maria de 42 °C durante 30-45 s, devolva imediatamente os tubos ao gelo e deixe-os recuperar durante 5 minutos.
    4. Enquanto estiver no gelo, adicione 400-950 μL do meio de recuperação comercialmente disponível.
      NOTA: O meio de recuperação usado nesses experimentos contém 2% de peptona vegetal, 0,5% de extrato de levedura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSO4 e 20 mM de glicose.
    5. Após a recuperação no gelo, recupere totalmente as células incubando a 37 °C com agitação suave de 250 RPM por 30-60 min.
    6. Pellet as células por centrifugação a 5.000 x g por 5 min e remover 400 μL do sobrenadante, deixando ~50 μL de bactérias para a placa.
    7. Placa em meio selectivo e incubar a 37 °C durante a noite.
      NOTA: O meio seletivo utilizado nestes experimentos contém 1,0% de triptona, 0,5% de extrato de levedura, 1,0% de cloreto de sódio, 1-2% de ágar, 96-97% de água e carbenicilina a uma concentração de 100 μg/mL. Sempre use cepas deficientes em recombinação de bactérias para clonar plasmídeos virais porque as repetições terminais invertidas virais (ITRs) têm sequências correspondentes e podem sofrer recombinação homóloga. No entanto, as cepas de bactérias recA- ainda sofrem baixos níveis de recombinação. O plasmídeo repórter usado aqui é um AAV auto-complementar, onde a sequência de um dos ITRs foi alterada e não corresponde mais perfeitamente ao outro ITR. O crescimento das bactérias a 30 °C também é recomendado para diminuir ainda mais a taxa de recombinação homóloga.
  7. Verifique clones e recupere plasmídeos.
    1. Prepare uma mistura mestre de PCR usando primers para frente e para trás (Tabela de Materiais) que recozidos para o vetor, flanqueando o local da inserção. Aliquota 10 μL de volumes em tubos de tira de PCR de 0,2 mL.
    2. Em tubos de fundo redondo de 14 mL, prepare alíquotas de 5 mL de caldo de LB seletivo de antibióticos, uma para cada colônia que está sendo testada via PCR e controle negativo.
    3. Use um palito de dente estéril ou ponta de pipeta para escolher uma colônia individual e raspe aproximadamente a colônia no fundo de um tubo de PCR.
    4. Quando a colônia tiver se dissociado na mistura mestra de PCR, solte o palito de dente ou a ponta em uma das alíquotas LB e rotule o tubo de 14 mL com a reação de Gibson e o número do tubo de PCR.
    5. Colocar as reações de PCR da colônia em um termociclador e ciclar com o programa descrito na Tabela 2.
    6. Incubar as culturas líquidas de 5 ml inoculadas com palitos de dente ou pontas de pipeta numa incubadora agitada a 37 °C e 180 RPM.
    7. Execute as reações de PCR da colônia em um gel de agarose a 0,7%-1% a 100 V por 30-60 min e visualize as bandas em um sistema de imagem doc em gel.
    8. Descarte as culturas de 5 mL que não apresentam a banda de PCR prevista.
    9. Para cada clone integrado com sucesso, permita que as culturas de 5 mL cresçam durante a noite e, em seguida, realize uma mini preparação de plasmídeo a partir de 4,5 mL usando um kit comercial. Reserve 0,5 mL da cultura líquida e economize a -80 °C como estoque de glicerol.
    10. Confirmar que os transgenes contidos nos plasmídeos estão livres de mutações indesejáveis usando o sequenciamento de Sanger42.
    11. Após a confirmação de que o construto do repórter foi clonado com sucesso, use o estoque de glicerol salvo para inocular uma cultura inicial de 5 mL e cresça por 8-16 h em uma incubadora de agitação a 30 °C e 180 RPM.
    12. Uma vez que o caldo esteja turvo, diluir a cultura inicial 1.000x em 250-300 mL de caldo fresco de LB seletivo e incubar pelo menos durante a noite em uma incubadora agitada a 30 °C e 180 RPM. Em seguida, purifique o plasmídeo usando um kit maxi de plasmídeo comercial.
      NOTA: As bactérias crescerão mais lentamente a 30 °C em comparação com 37 °C, mas esta é a melhor temperatura para diminuir a taxa de recombinação espontânea ao cultivar grandes culturas.
    13. Execute um resumo XmaI para testar a recombinação dos ITRs usando as etapas 1.4.2-1.4.5, substituindo XmaI em vez de PacI e AscI. Visualize as bandas em um sistema de imagem doc em gel.
      NOTA: Um plasmídeo rAAV com ambos os ITRs presentes produzirá duas bandas em um gel após este resumo: uma o comprimento do genoma do rAAV e a outra o comprimento do resto da espinha dorsal do plasmídeo. Se houver apenas uma banda, os ITRs sofreram recombinação homóloga e o plasmídeo rAAV não será capaz de embalar partículas virais. A espinha dorsal do plasmídeo rAAV descrita aqui foi projetada para que os sítios XmaI ocorram apenas nos ITRs. Se a inserção do candidato a intensificador também contiver sites XmaI, atualize os resultados da banda prevista e analise de acordo.

2. Obtenha o rAAV embalado.

  1. Use rAAV embalado (profissionalmente ou internamente) para os experimentos deste estudo.
    NOTA: Há muitas opções para empacotar um rAAV. Um rAAV pode ser embalado profissionalmente em uma empresa ou em uma instalação principal da universidade. O rAAV também pode ser embalado internamente utilizando diferentes técnicas que variam em complexidade e necessidade de equipamentos especializados43,44. A principal preocupação é a obtenção de um vetor que seja de alta qualidade e que o título infeccioso tenha sido determinado com um alto grau de certeza. Tanto os rAAVs embalados profissionalmente quanto os embalados internamente foram utilizados para diferentes experimentos descritos neste estudo.

3. Injetar plasmídeo embalado por rAAV por via intracraniana em camundongos neonatais.

  1. Prepare a mistura de rAAV para entrega.
    1. Se a intenção é comparar os padrões de expressão entre diferentes vírus do repórter potencializador, equalize os títulos de todos os vírus a serem comparados, diluindo todos para corresponder ao vírus menos concentrado.
    2. Misture uma proporção de 2:1 ou 3:1 de vírus repórter potenciador e vírus repórter de controle expresso constitutivamente e adicione uma pequena quantidade (concentração final de 0,06%) de corante Fast Green.
      NOTA: Fast Green é um corante que é amplamente utilizado em injeções de animais experimentais, inclusive com AAV, para visualizar o local da injeção durante e imediatamente após o procedimento45,46,47,48. Embora este seja um passo importante de garantia de qualidade, é possível que a adição de corante possa interferir na transdução. Reconsiderar o uso de corante injetável pode ser importante para a otimização do protocolo em certos casos. O vírus de controle constitutivamente conduzido é absolutamente crítico para comparar injeções independentes. As injeções de vírus variam em localização e extensão da transdução de animal para animal. O controle constitutivo permitirá excluir injeções com falha da análise e fornecerá um padrão para a normalização da variação na entrega do vírus.
    3. Quebre a ponta de uma pipeta de vidro puxada estéril feita de um tubo capilar graduado em μL, perfurando-a suavemente através de um delicado lenço esterilizado por imersão em etanol a 70% e deixado secar completamente. Em seguida, insira a pipeta de vidro puxada no conjunto do aspirador que consiste em um dispositivo para aplicar pressão conectado a tubos de borracha de 15 polegadas de comprimento que terminam com uma junta de borracha para segurar uma pipeta microcapilar.
      NOTA: O "dispositivo para aplicação de pressão" pode ser uma seringa ou um bocal. Se uma seringa for usada, uma segunda pessoa será obrigada a aplicar pressão através da seringa enquanto o experimentador manipula a pipeta em uma mão e o animal na outra. Se estiver a utilizar um bocal, permitindo ao experimentador um controlo fino sobre as posições do animal e da pipeta e a pressão aplicada à seringa, é necessário um cuidado extra para evitar a contaminação por vírus.
    4. Aplique pressão negativa através do conjunto do aspirador para desenhar um pequeno volume (~0,2-0,5 μL) de óleo mineral na pipeta de vidro.
      NOTA: Esta etapa é muito importante para fornecer uma barreira para evitar que partículas virais aerossolizadas contaminem o conjunto do aspirador.
    5. Deixe de lado o conjunto do aspirador preparado e mantenha o vírus no gelo até que esteja pronto para injetar.
  2. Crioanestesiar os ratos neonatais em um prato de plástico seco parcialmente submerso em gelo até a cessação do reflexo de retirada do pedal (~ 5 min). Certifique-se de que os ratos não estão em contato direto com o gelo.
  3. Use pressão negativa através do conjunto do aspirador para puxar a mistura de vírus para a pipeta de vidro puxada até que o menisco passe a marca de 2 μL.
  4. Retire o mouse da câmara fria e posicione-o na bancada. Localize os locais de injeção bilateral a meio caminho entre o lambda e o bregma e a meio caminho entre a sutura sagital e cada olho. Higienize ambas as áreas com um toalhete com álcool.
  5. Use a pipeta de vidro puxada para perfurar o crânio dos ratos neonatais e aplique suavemente pressão positiva através do conjunto do aspirador à medida que a agulha entra no cérebro. Observe o menisco da mistura de vírus. A resistência à pressão aplicada diminuirá quando a ponta da pipeta atingir o ventrículo lateral. Dispense 1 μL do vírus, retire a pipeta e repita para o outro ventrículo lateral.
  6. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento ou uma câmara de aquecimento para recuperar. Uma vez acordado e ativo, devolva o animal à sua gaiola de origem.

4. Coletar tecido e realizar imuno-histoquímica.

  1. Após tempo suficiente após a transdução do vírus, anestesiar os camundongos e sacrificar por perfusão transcárdica.
    NOTA: Muitos experimentos, incluindo os resultados representativos mostrados aqui, permitem um período de 4 semanas ou mais para o vírus transduzir. No entanto, os AAVs auto-complementares podem mostrar forte expressão já aos 7 dias12. O período de incubação desejado pode precisar ser otimizado dependendo de técnicas e objetivos experimentais específicos.
    1. Prepare uma bomba peristáltica com tubos de perfusão intravenosa e uma agulha de 25 G.
    2. Prepare 1x PBS e 4% de paraformaldeído (PFA) e coloque-os no gelo.
    3. Coloque a extremidade de entrada da tubulação no PBS gelado 1x. Defina a taxa de fluxo (2,5 mL/min para camundongos P7, 3,5 mL/min para camundongos P28) e execute a bomba até que o tampão seja puxado por todo o caminho através da tubulação e seja limpo de bolhas. Deixe a agulha de lado até ficar pronta para a perfusão.
    4. Dentro de um exaustor, pipete um pequeno volume de isoflurano em uma toalha de papel no fundo de uma câmara de frascos de gota. Coloque o rato previamente injetado numa grelha por cima do papel toalha, garantindo que não entra em contacto direto com o isoflurano. Sele a câmara para anestesiar o rato. Aguarde ~ 5 min e, em seguida, abra a câmara e verifique se há um reflexo de retirada do pedal. Prossiga quando o animal estiver inconsciente.
      NOTA: Durante toda a perfusão, o rato deve ser mantido com isoflurano com um cone nasal para evitar a recuperação da consciência.
    5. Use uma tesoura cirúrgica para abrir o abdômen e o peito do rato, remover a caixa torácica e expor o coração.
    6. Use um par de micro tesouras de íris para fazer uma pequena incisão no átrio direito do rato, insira a agulha IV no ventrículo esquerdo e ative a bomba peristáltica.
    7. Perfunda o animal com 1x PBS gelado até que o sangue que sai da incisão no átrio direito fique claro. Limpar o tecido do sangue é muito importante porque os glóbulos vermelhos têm autofluorescência, e os vasos sanguíneos podem prejudicar a capacidade de visualizar as células que expressam o repórter.
    8. Pause a bomba peristáltica e mova a tubulação de admissão do PBS para o PFA a 4%. Reative a bomba e perfunda 1 mL/g de peso corporal, ~25 mL para um rato adulto.
      NOTA: Os tremores de fixação devem ser observáveis e o corpo do rato deve endurecer.
  2. Dissecar e pós-consertar o cérebro.
    1. Remova a cabeça do rato com uma tesoura cirúrgica.
    2. Usando pequenas tesouras cirúrgicas, comece na base do crânio e faça uma incisão ao longo da linha média da cabeça e puxe para trás a pele e o tecido subjacente para expor o crânio.
    3. Usando uma tesoura de íris, corte cuidadosamente a parte de trás do crânio, começando no forame magno e continuando em direção e ao longo da sutura sagital até que os bulbos olfativos sejam passados.
    4. Insira a tesoura no crânio sobre os bulbos olfativos e faça dois cortes horizontais no crânio. Faça um par semelhante de cortes horizontais no osso occipital. Os cortes horizontais e da linha média criam um par de abas semelhantes a portas na parte superior do crânio.
    5. Descasque as abas do crânio para expor totalmente o cérebro. Use um par de pinças para cortar os bulbos olfativos do crânio e cortar os nervos cranianos, libertando o cérebro do crânio.
    6. Solte o cérebro em um tubo cônico de 15 mL com 3-5 mL de PFA a 4% em PBS. Pós-correção 6 h a noite. Não fixe excessivamente o tecido.
  3. Prepare os cérebros para a criossecção.
    1. Transfira o cérebro fixo para um novo tubo cônico de 15 mL com 12-14 mL de sacarose a 30% em PBS para desidratação. Incubar a 4 °C até que o cérebro afunde para o fundo do tubo (2-3 dias).
    2. Submergir o cérebro fixo e desidratado em um composto de temperatura de corte ideal (OCT) em um criomolde de 15 mm x 15 mm x 5 mm. Adicione OCT até que o cérebro esteja totalmente coberto.
    3. Coloque o criomuldo em um bloco de gelo seco e congele a amostra em um bloco sólido de OCT (~ 5 min).
      NOTA: Os blocos OCT podem ser armazenados a -80 °C durante meses a anos.
    4. Rotule o criomolde com o nome da amostra e a orientação do cérebro.
  4. Obter cortes coronais usando um micrótomo de criostato.
    1. Marque a orientação do cérebro no bloco OCT a lápis e remova o bloco do criomolde dentro do criostato.
    2. Posicione o bloco OCT de modo que o cérebro seja orientado com os bulbos olfativos voltados para a lâmina do criostato e cole o bloco ao suporte de objetos do criostato com um pouco de OCT fresco.
    3. Uma vez congelado no lugar, comece a cortar seções de 50 μm através do bloco seguindo as etapas 4.4.4-4.4.6.
    4. Não utilize a placa anti-rolo. As seções se enrolarão em rolos apertados à medida que forem cortadas e se acumularão em cima do bloco ou cairão abaixo em uma bandeja de coleta.
    5. Observe a forma do bloco nos primeiros cortes que são feitos. Faça cortes verticais através do bloco, produzindo uma face uniforme ao começar a cortar. Ajuste o ângulo usando os braços de ajuste da amostra, se necessário.
    6. Quando as lâmpadas olfativas estiverem visíveis, preste muita atenção à forma das seções. Se um parece maior que o outro, os cortes estão em um ângulo em relação ao cérebro, e é necessário endireitar a orientação do cérebro contra a lâmina usando os braços de ajuste da amostra.
      NOTA: Se cortar em linha reta, o córtex deve começar a aparecer acima de cada bulbo olfativo ao mesmo tempo.
    7. Uma vez que o bulbo olfatório tenha sido seccionado e o tecido cerebral rostral seja visível, reduza a espessura de corte para 30-35 μm e comece a coletar as seções flutuantes. Siga as etapas 4.4.8-4.4.13 para seccionar o cérebro.
    8. Escove todas as seções anteriores do bloco e do suporte de objetos para que elas caiam na bandeja de coleta. Escove-os para um lado da bandeja e mantenha-os separados. Se a pilha for muito grande, esvazie a bandeja.
    9. Dispense 1 mL de PBS em cada poço de uma placa de 24 poços. Rotule 1 linha para cada cérebro.
    10. Corte 6 seções coronais. Recupere as seções usando pinças frias e organize-as no estágio de criostato. Repita esta etapa 2 ou 3 vezes, mantendo os grupos de 6 seções separados.
    11. Molhe um pincel tamanho 000 com PBS e passe o excesso de líquido em um lenço de papel ou toalha de papel sem fiapos. Use o pincel para pegar suavemente cada seção, uma de cada vez, e colocá-la nos poços apropriados da placa de 24 poços.
    12. Coloque uma das 6 seções do grupo de fatias em cada um dos 6 poços em uma fileira da placa de 24 poços. Isso garante que cada poço contenha seções representativas que abrangem a área seccionada do cérebro.
    13. Continue a secção em grupos de 6 até que a extremidade caudal do córtex cerebral tenha sido seccionada.
    14. Para armazenamento, sele a placa de 24 poços com parafilme e armazene a 4 °C.
      NOTA: As secções são estáveis durante 1-2 meses a 4 °C. Uma solução de PBS com azida de sódio a 0,1% pode ser usada para inibir o crescimento bacteriano e prolongar a vida útil das seções. No entanto, se as secções forem armazenadas por mais de 2 meses, devem ser colocadas em solução crioprotetora e congeladas a -20 °C para obter melhores resultados.
  5. Realizar imuno-histoquímica para amplificação do sinal do gene repórter.
    NOTA: Todas as etapas, exceto a recuperação do antígeno, devem ser realizadas usando agitação suave a moderada (~ 100 RPM) em um agitador orbital. Para preservar a fluorescência nativa do repórter de controle (mRuby3), todas as etapas devem ser protegidas da luz, tanto quanto possível.
    1. Preparar os buffers necessários, conforme descrito na Tabela 3.
    2. Prepare uma nova placa de 24 poços com uma fileira para cada cérebro que está sendo manchado. Na primeira coluna de poços, adicione 1 mL de PBS a cada poço.
    3. Usando um pincel tamanho 000, transfira suavemente 1 poço de seções do poço de coleção original para o PBS fresco na nova placa de 24 poços para um enxágue rápido para remover o composto OCT residual.
    4. Adicione 1 mL de ARB ao próximo poço na placa de 24 poços e transfira seções para este poço. Incubar em estufa a 60 °C durante 1 h.
    5. Deixe a placa esfriar à temperatura ambiente (RT) por 20 min.
    6. Adicione 1 mL de PB ao próximo poço e transfira as seções para este poço. Incubar no RT por 20 min.
    7. Adicione 500 μL de BB ao próximo poço e transfira as seções para este poço. Incubar no RT por 1 h.
    8. Adicione 2 mL de WB ao BB e, em seguida, pipete ~2 mL de solução e descarregue, deixando uma solução BB diluída no poço. Repita até que as seções estejam claramente visíveis.
    9. Diluir o anticorpo primário (Chicken IgY anti-GFP, 1:1000) em BB. Adicione 350-500 μL de solução de anticorpos primários ao próximo poço e transfira as seções para este poço. Selar a placa com parafilme e incubar a 4 °C durante a noite.
    10. Diluir o BB com WB como feito anteriormente até que as seções estejam claramente visíveis.
    11. Adicione 1 mL de WB ao próximo poço e transfira as seções para este poço. Incubar no RT por 20 min.
    12. Remova ~800-900 μL de buffer e descarte. Adicione 1 mL de WB fresco e incube 20 min. Substitua 1 mL de WB mais 4 vezes para um total de 5 lavagens, 20 min cada.
    13. Diluir o anticorpo secundário (burro anti-frango Alexa Fluor 488 conjugado, 1:500) em BB. Adicione 350-500 μL da solução secundária de anticorpos a um novo poço. Incubar no RT por 45 min a 1 h.
      NOTA: Este é o sétimo poço, por isso, se as seções de coloração de mais de 2 cérebros, uma nova placa será necessária neste momento.
    14. Diluir o BB com WB como anteriormente e transferir as seções para um novo poço preenchido com 1 mL de WB. Lave as seções como feito anteriormente por 20 min 3 vezes.
    15. Preparar uma solução de trabalho de DAPI em PBS (concentração final 0,04-0,8 μg/mL). Proteja a solução da luz.
    16. Adicione 1 mL de solução DAPI ao próximo poço e transfira as seções para este poço. Incubar em RT por ~5 min.
    17. Transfira as seções de volta para a WB e monte suavemente em lâminas de microscópio usando um pincel tamanho 000. Deixe as lâminas secarem ao ar.
    18. Aplique as tampas com um meio de montagem apropriado. Permita que as lâminas curem no RT no escuro durante a noite.

5. Fotografe e analise seções de tecido cerebral para aumentar a atividade.

  1. Use uma lente objetiva de baixa ampliação (5x) para gravar imagens de fluorescência que abrangem a seção do cérebro.
  2. Localize o local de injeção e avalie a extensão da transdução do vírus com base na densidade e intensidade das células fluorescentes vermelhas. Tome cuidado para comparar os animais que foram transduzidos de forma semelhante.
  3. Grave imagens fluorescentes detalhadas com uma lente objetiva de ampliação mais alta (≥25x), se desejar.
    NOTA: Certifique-se sempre de usar as mesmas configurações para parâmetros de aquisição, como intensidade da luz de excitação, filtros e tempo de exposição entre amostras que devem ser comparadas.
  4. Processe as imagens usando um software de análise de imagens.
    NOTA: O processamento pode ser feito em qualquer pacote de software de análise de imagem. As etapas a seguir são sugestões para determinar se uma sequência atua como um potenciador no contexto da construção do repórter (uma pergunta sim ou não) usando a distribuição FIJI de código aberto do ImageJ. Fotometria mais aprofundada pode ser apropriada ao comparar graus de atividade entre variantes de potenciadores. Imagens de diferentes amostras devem sempre ser processadas de forma consistente para serem comparadas.
    1. Aplique filtros para reduzir o ruído. Em Fiji, selecione a opção Despeckle no menu Processo > ruído .
      NOTA: Este é um filtro de mediana 3 x 3.
    2. Subtraia a fluorescência de fundo seguindo as etapas 5.4.3-5.4.6.
    3. Separe os canais de uma imagem multicanal. Em Fiji, selecione a opção Dividir canais no menu Imagem > Cor .
    4. Use a ferramenta de seleção de retângulo ou círculo para desenhar uma forma pequena em uma área da imagem que não tenha células fluorescentes e medir a intensidade média de pixels do plano de fundo usando Analisar > Medir. Repita para amostrar várias áreas.
      Observação : Certifique-se de que o valor cinza médio está selecionado no menu Analisar > Definir medidas .
    5. Faça a média do valor cinza de 5 a 8 áreas de plano de fundo e solte o ponto decimal. Subtraia esse valor de cada pixel na imagem usando o Process > Math > Subtract.
      NOTA: Arredondar para o número inteiro mais próximo pode superestimar o plano de fundo a ser subtraído. É mais conservador simplesmente soltar o ponto decimal. Por exemplo, 6,4 seria arredondado para baixo para 6, mas 6,5 também deveria ser arredondado para baixo para 6 para evitar o risco de subtrair 0,5 unidades de sinal real de cada pixel.
    6. Se desejar, mescle os canais novamente em uma imagem multicanal. Em Fiji, use Canais de Mesclagem de > de Cores > de Imagem.
    7. Costurar quaisquer imagens sobrepostas juntas. Em Fiji, use Plugins > costura > costura Grade/Collection.
    8. Ajuste o brilho e o contraste. Em Fiji, use Imagem > Ajustar > Brilho/Contraste.
      Observação : use sempre os mesmos valores mínimo e máximo para cada imagem a ser comparada.
    9. Conte o número de células fluorescentes verdes seguindo as etapas 5.4.10-5.4.12. Essas são as células nas quais a sequência de potenciadores candidatos foi capaz de conduzir a expressão do repórter.
    10. Comece escondendo o canal verde e use a ferramenta de seleção de forma livre para desenhar uma forma ao redor da região do cérebro que expressa a fluorescência vermelha. Usando a função Medir em Fiji, meça a área, a densidade integrada e o valor cinza médio do canal vermelho nessa zona.
    11. Usando a ferramenta de seleção de vários pontos, conte o número de células verdes nessa zona.
    12. Normalize o número de células verdes pela densidade integrada do canal vermelho. O brilho do canal vermelho local é uma medida proxy para a magnitude da exposição ao vírus, permitindo a comparação da atividade do potenciador entre diferentes animais transduzidos.

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Representative Results

Usando esses métodos, uma sequência de 915 pb no terceiro íntron associado ao risco psiquiátrico do gene CACNA1C19,49,50 foi testada quanto à atividade potencializadora no cérebro de camundongos pós-natais. Esta sequência foi descoberta em um MPRA de 345 sequências de potenciadores candidatos centrados em SNPs de risco psiquiátrico e neurológico12 e os experimentos de caracterização são descritos aqui como um exemplo geral. Camundongos C57BL/6 foram injetados em P0 com um construto AAV9 embalado como um vetor autocomplementar51 contendo EGFP sob o controle do promotor mínimo Hsp68 e uma única sequência de potenciador candidato (Figura 3A). Camundongos adicionais foram injetados com construtos que continham uma sequência de controle negativo que foi prevista para não ter atividade regulatória (Figura 3B). Os títulos virais para esses construtos foram normalizados para 6,85 x 1010 vg/mL. Todos os camundongos injetados foram co-injetados com um construto embalado com AAV9 contendo mRuby3 sob o controle do promotor constitutivo CAG para visualizar a área que foi transduzida com sucesso e controlar a potencial variabilidade no local e a disseminação da infecção. Os cérebros foram coletados no dia pós-natal (P)28 para imuno-histoquímica e imagem. Esses experimentos confirmaram que essa região potencializadora candidata no CACNA1C impulsionou a expressão do EGFP no cérebro do camundongo P28 (Figura 3A), enquanto uma sequência de controle negativa não o fez (Figura 3B). Estes resultados demonstram a aplicação de ensaios de potenciador-repórter no cérebro de ratinhos, permitindo o estudo in vivo de potenciadores durante condições que não podem ser recapituladas utilizando modelos in vitro tradicionais.

Esses métodos também podem ser usados para testar bibliotecas de sequências de potencializadores candidatos para atividade usando métodos de entrega baseados em AAV, como em MPRAs. Imagens representativas da expressão do repórter baseado em biblioteca em diferentes títulos demonstram a flexibilidade deste ensaio e o efeito do título viral na eficiência da transdução. Preparações virais de alto título (Figura 4A) versus baixo título (Figura 4B) resultam em diferenças na quantidade de células transduzidas, como evidenciado tanto pela expressão de mRuby3 de controle positivo impulsionada por um promotor CAG quanto pela expressão EGFP produzida a partir das bibliotecas potenciadoras candidatas no cérebro de camundongos pós-natais. Há situações em que o título alto e a transdução ampla ou a transdução de título baixo e esparso podem ser preferidos.

Figure 1
Figura 1: Visão geral do protocolo. Os elementos-chave deste ensaio incluem um elemento potenciador candidato, um promotor mínimo, um gene repórter e, dependendo do design do ensaio, uma sequência de código de barras para marcação única. Esses elementos são clonados em um backbone de plasmídeo AAV e embalados em AAV. O vírus é entregue ao animal e deixado para incubar por vários dias ou semanas. Finalmente, o tecido de interesse é coletado e a atividade potencializadora é verificada por meio de imagens ou sequenciamento. A expressão transgênica impulsionada por potenciadores pode produzir expressão com especificidade do tipo celular, regional e temporal, em contraste com os fatores constitutivos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Flexibilidade no projeto do ensaio . (A) A orientação plasmídica pode colocar o potenciador a montante do promotor mínimo ou a jusante do gene repórter, como no STARR-seq28. Para leituras baseadas em sequência, um código de barras é incluído a jusante do gene repórter, ou o intensificador pode servir como seu próprio código de barras na segunda orientação. (B) Técnicas comuns de entrega viral ao cérebro incluem injeções intracranianas, injeções retroorbitais ou injeções na veia caudal, que podem resultar em diferentes densidades de células transduzidas em diferentes tecidos. (C) As leituras podem ser baseadas em sequenciamento ou em imagens. Em leituras baseadas em sequenciamento, a atividade do potenciador é definida por um aumento relativo da sequência de RNA versus sequência de DNA de entrada (controlando a entrega de AAV). Em leituras de imagem, a expressão do gene repórter é aumentada onde o potenciador está ativo. (D) Potenciais potenciadores intrônicos no gene CACNA1C associado ao risco psiquiátrico são destacados. Na imagem superior, uma ampla região é selecionada que mostra fortes associações a características testadas pelo GWAS e interações com o promotor CACNA1C via PLAC-seq20. Na inserção, são identificadas regiões candidatas menores que são conservadas evolutivamente no nível da sequência, estão em áreas de cromatina aberta e mostram marcas epigenéticas indicativas de potenciadores. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: O potenciador no CACNA1C impulsiona a expressão do EGFP no cérebro do rato P28. (A) Um rato injetado intracranialmente em P0 com uma construção potenciadora-repórter (scAAV9-Hsp68-EGFP-CACNA1C_3) e controlo de injeção constitutivamente expresso (AAV9-CAG-mRuby3) mostra expressão EGFP impulsionada por potenciador nas camadas média-inferior do córtex em P28. (B) Um rato injetado em P0 com um construto de controle negativo (scAAV9-Hsp68-EGFP-NEG_4) e controle de injeção não mostra expressão de EGFP em P28. Imagens de todo o cérebro foram tiradas com ampliação de 5x e as inserções mostram uma visão ampliada da região encaixotada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Bibliotecas de intensificadores-repórteres entregues por AAV de diferentes títulos mostram atividade no cérebro de camundongos. (A) A biblioteca AAV-PHP.eB de potenciadores candidatos de alto título e embalada comercialmente impulsiona a ampla expressão de EGFP no cérebro de camundongos P7. (B) A biblioteca AAV9 de títulos mais baixos de potenciadores candidatos precipitados a partir de meios condicionados das células de embalagem impulsiona a expressão esparsa de EGFP no cérebro de rato P7. As imagens foram obtidas com ampliação de 5x. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Mistura de reação de PCR
Buffer de reação 5x 10 μL
dNTPs concentração final de 200 μM cada
Iniciadores de clonagem concentração final de 0,2 μM cada
DNA modelo 50 ng
Polimerase de alta fidelidade concentração final de 0,02 U/μL
Água isenta de nuclease para atingir 50 μL de volume final de reação
Condições de termociclagem
30 ciclos dos seguintes: Anotações
Passo Temperatura Hora
Desnaturar 98 °C 10 s
Temperar 60 °C 20 s A temperatura ideal pode variar com base nos primers.
Estender 72 °C 30 s A temperatura e a duração ideais podem variar com base na polimerase.
Extensão Final 72 °C 2 min A temperatura e a duração ideais podem variar com base na polimerase.
Segurar 4 °C

Tabela 1: Mistura de reação de PCR e condições de termociclagem.

Condições de termociclagem
30 ciclos dos seguintes: Anotações
Passo Temperatura Hora
Lise Celular 98 °C 5 min
Desnaturar 98 °C 10 s
Temperar 55 °C 15 s A temperatura ideal pode variar dependendo dos primers.
Estender 72 °C 30 s A temperatura e a duração ideais podem variar dependendo da polimerase.
Segurar 4 °C

Tabela 2: Condições de termociclagem para PCR de colônias.

Tamponamentos para imuno-histoquímica
Buffer Composição
1x PBS 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4
1x tampão de recuperação de antígeno citrato (ARB), pH 6,0 Proprietário, ver tabela de materiais
Tampão de Permeabilização (PB) 1x PBS + 0,5% Triton X100
Buffer de lavagem (WB) 1x PBS + 0,1% Triton X100
Buffer de bloqueio (BB) WB + 5% leite

Tabela 3: Tamponamentos para imuno-histoquímica.

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Discussion

Este protocolo descreve um método baseado em rAAV para a implantação de transgenes impulsionados por potenciadores no cérebro de camundongos pós-natais. Neste protocolo generalizado, um potenciador candidato, um promotor mínimo, um gene repórter e uma sequência de código de barras opcional são clonados em uma espinha dorsal do plasmídeo AAV. Esses experimentos podem ser feitos com uma única sequência de potenciador de candidatos ou com muitas sequências em paralelo. O plasmídeo é embalado em um rAAV e entregue ao cérebro do rato pós-natal. Após um período de tempo para permitir a transdução do vírus, o cérebro é coletado e fotografado para a expressão gênica do repórter. Um vírus repórter constitutivamente expresso (CAG-mRuby3) é incluído como um controle de injeção. Usando este ensaio, os elementos potenciadores são mostrados para conduzir a transcrição do EGFP no cérebro do rato, demonstrando a atividade potenciadora in vivo.

Os principais alvos para solução de problemas e otimização deste ensaio incluem título viral, técnica de injeção e período de tempo de transdução. Diferentes títulos virais podem ter um forte efeito sobre a densidade das células transduzidas. Embora uma maior eficiência de transdução seja provavelmente preferível para a maioria das pesquisas, o nível ideal de transdução é altamente dependente dos objetivos experimentais. As injeções intracranianas oferecem uma alta densidade de células transduzidas, mas provavelmente serão mais focais no local da injeção, embora a disseminação da infecção possa depender do sorotipo viral e da idade do animal52. As injeções retroorbitais podem mostrar uma distribuição mais uniforme das células transduzidas em todo o cérebro, mas são menos propensas a dar qualquer área de alta infecção. As injeções na veia da cauda podem transduzir de forma mais eficaz outros tecidos, além do cérebro, mas provavelmente darão densidades ainda mais baixas de células transduzidas no cérebro. Da mesma forma, uma variedade de prazos para a transdução do vírus no cérebro pode servir a diferentes propósitos. A expressão robusta de scAAV pode ocorrer no cérebro já sete dias após a injeção intracraniana, embora períodos de 28 dias ou mais sejam mais tipicamente usados e produzam forte expressão. Como os intensificadores podem ser temporalmente específicos em sua atividade, é importante considerar a atividade prevista dos intensificadores testados ao determinar o desenho do estudo.

Existem algumas limitações associadas a esses métodos que podem tornar outras opções uma escolha mais adequada, dependendo dos objetivos experimentais. Como os AAVs exibem baixa integração no genoma, os tecidos são mais efetivamente transduzidos quando estão maduros e há uma alta densidade de células pós-mitóticas, pois uma grande quantidade de divisões celulares contínuas diminuirá a densidade das células que expressam transgenes. Para a entrega viral de um transgene a um modelo menos maduro, como tecidos que ainda estão crescendo, os lentivírus podem ser uma escolha mais apropriada, pois se integram ao genoma e serão herdados por todas as células filhas de uma célula proliferante transduzida. Além disso, embora o ensaio do repórter descrito aqui seja uma técnica amplamente utilizada para o estudo funcional da atividade cis-regulatória, ele não pode fornecer uma imagem completa de como o elemento regulatório age dentro de seu contexto nativo. Por exemplo, este ensaio não fornece informações sobre quais genes podem ser alvo do elemento regulador no genoma. No entanto, se os genes-alvo do potenciador forem conhecidos, esta informação pode ser aproveitada para determinar se os tipos de células que mostram expressão neste ensaio são os mesmos que se sabe que expressam os genes-alvo do potenciador, o que daria alta validade biológica à interpretação dos resultados. O ensaio também pode não recapitular completamente os efeitos que a sequência genómica circundante ou a actividade biológica e comportamental normal do animal podem ter sobre a actividade do elemento regulador ensaiado. Finalmente, este protocolo descreve o desenho do ensaio do repórter STARR-seq, no qual o elemento potenciador candidato é clonado a jusante do gene do repórter no ORF, em contraste com o montante do promotor, como na orientação convencional de clonagem do ensaio do repórter. A inclusão de longas sequências variáveis no ORF do gene repórter pode causar redução da estabilidade do RNA devido a fatores como motivos proteicos de ligação ao RNA, locais de emenda alternativos ou conteúdo variável de GC 36,53, e métodos estatísticos foram desenvolvidos para explicar vieses baseados em sequências ao analisar dados de STARR-seq54,55. Apesar dessas considerações, os MPRAs STARR-seq têm sido amplamente utilizados nos últimos anos para identificar com sucesso elementos cis-regulatórios56,57,58,59. Os métodos descritos aqui podem ser facilmente adaptados para uso com a orientação MPRA convencional.

A especificidade do tipo celular dos potenciadores torna este ensaio uma ferramenta poderosa na condução da expressão específica do tipo celular de genes de interesse in vivo. As técnicas atuais para a expressão específica do tipo celular de um gene desejado podem ser limitadas pela disponibilidade de construções de expressão condicional ou requerem a geração de novas linhagens de camundongos transgênicos. Usando um sistema impulsionado por intensificador baseado em rAAV, um gene de interesse pode ser expresso de maneira espaço-temporalmente específica, usando intensificadores ou promotores específicos do tipo celular validados para impulsionar a expressão13,14,15. Desenvolvimentos recentes nesta tecnologia mostraram que a combinação de potenciadores específicos do tipo celular com sorotipos de rAAV com tropismos para células ou tecidos de interesse pode mostrar especificidade semelhante da expressão transgênica como em modelos animais transgênicos60. Isso oferece um método barato, rápido e potencialmente de alto rendimento para triagem de sequência e indução específica de expressão transgênica in vivo em modelos animais.

Essa tecnologia também tem potencial terapêutico. Estudos clínicos descobriram que a entrega in vivo de um transgene in vivo baseada em rAAV pode induzir a expressão de cópias saudáveis de um gene nos casos em que apenas uma cópia defeituosa está presente, ou o gene não está sendo transcrito a uma taxa suficiente61,62,63. A seleção de um elemento potenciador de condução tem o potencial de permitir a indução generalizada, mas a indução de expressão de uma maneira específica do tipo de célula. Finalmente, a entrega do transgene via rAAV também confere benefícios significativos; Os AAVs têm menor imunogenicidade do que outros vírus frequentemente utilizados na entrega transgênica64, tornando este um vetor viral potencialmente seguro a ser empregado para uso clínico.

A implantação específica de ensaios de intensificador-repórter baseados em rAAV in vivo é personalizável e pode ser modificada para atender a uma variedade de objetivos experimentais. Diferentes tecidos e células podem ser direcionados selecionando sorotipos ou potenciadores de AAV que tenham tipo de célula ou especificidade espaço-temporal. Em qualquer lugar, de um a milhares de construtos de intensificador-repórter podem ser entregues in vivo, e a atividade pode ser avaliada usando uma série de leituras baseadas em imagens e sequenciamento, como foi demonstrado em um conjunto emergente de estudos usando essa abordagem 15,16,65,66,67,68 . A gama de opções para o projeto e entrega de construções permite que essa técnica seja modificada para uma variedade de usos na ciência translacional e básica, tornando esta uma nova ferramenta poderosa para a pesquisa em genômica e neurociência.

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Disclosures

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

O sequenciamento foi realizado no UC Davis DNA Technologies Core. Agradecemos ao laboratório de Lin Tian na UC Davis por treinar em embalagens rAAV e generosamente nos presentear com ajudante AAV e plasmídeos rep/cap. Este trabalho foi apoiado pelo NIH/NIGMS R35GM119831.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit

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References

  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
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Neurociência Edição 181
Implantação de AAV de construções de expressão baseadas em potenciador <em>in vivo</em> no cérebro do rato
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Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, … More

Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).

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