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Neuroscience

माउस मस्तिष्क में विवो में एन्हांसर-आधारित अभिव्यक्ति संरचनाओं की एएवी तैनाती

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/62650
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

Summary

यह प्रोटोकॉल एक उपन्यास आरएएवी-आधारित क्षणिक एन्हांसर-रिपोर्टर परख का वर्णन करता है। इस परख का उपयोग माउस मस्तिष्क में विवो में एन्हांसर-संचालित अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

एन्हांसर प्रतिलेखन कारकों की एक विविध सरणी के लिए बाध्यकारी मंच हैं जो ऊतक- और सेल-प्रकार-विशिष्ट जीन के विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न को चलाते हैं। गैर-कोडिंग डीएनए और विभिन्न क्रोमैटिन राज्यों का आकलन करने के कई साधन जीनोम में एन्हांसर अनुक्रमों की उपस्थिति की भविष्यवाणी करने में उपयोगी साबित हुए हैं, लेकिन इन अनुक्रमों की गतिविधि को मान्य करना और उन अंगों और विकास चरणों को ढूंढना जिनमें वे सक्रिय हैं, एक श्रम-गहन प्रक्रिया है। एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) वैक्टर में हालिया प्रगति ने माउस ऊतकों में ट्रांसजेन के व्यापक वितरण को सक्षम किया है, जो ट्रांसजेनिक जानवर की आवश्यकता के बिना विवो एन्हांसर परीक्षण में सक्षम है। यह प्रोटोकॉल दिखाता है कि कैसे एक रिपोर्टर निर्माण जो न्यूनतम प्रमोटर के नियंत्रण में ईजीएफपी को व्यक्त करता है, जो अपने दम पर महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति नहीं चलाता है, का उपयोग माउस मस्तिष्क में उम्मीदवार बढ़ाने वाले अनुक्रमों के गतिविधि पैटर्न का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। एक एएवी-पैक किए गए रिपोर्टर निर्माण को माउस मस्तिष्क में पहुंचाया जाता है और 1-4 सप्ताह के लिए इनक्यूबेट किया जाता है, जिसके बाद जानवर की बलि दी जाती है, और मस्तिष्क वर्गों को माइक्रोस्कोप के तहत देखा जाता है। ईजीएफपी उन कोशिकाओं में दिखाई देता है जिनमें परीक्षण किया गया एन्हांसर जीन अभिव्यक्ति शुरू करने के लिए पर्याप्त है, उस स्थान और विकास चरण को इंगित करता है जिसमें मस्तिष्क में एन्हांसर सक्रिय होता है। मानक क्लोनिंग विधियां, कम लागत वाली एएवी पैकेजिंग, और विवो डिलीवरी और मानक इमेजिंग रीडआउट में एएवी सीरोटाइप और विधियों का विस्तार इसे मस्तिष्क में जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के अध्ययन के लिए एक सुलभ दृष्टिकोण बनाता है।

Introduction

एन्हांसर जीनोमिक सीआईएस-नियामक तत्व हैं जो प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइटों के रूप में काम करते हैं और एक लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति को स्थानिक रूप से विशिष्ट तरीके से चला सकते हैं। वे विभिन्न सेल प्रकारों, ऊतकों और विकास के चरणों में अलग-अलग सक्रिय हैं और रोग जोखिम से संबंधित जीनोमिक भिन्नता 3,4 के सब्सट्रेट हो सकते हैं। इस प्रकार, जीनोमिक्स के भीतर ट्रांसलेशनल और बुनियादी विज्ञान अनुप्रयोगों दोनों में प्रगति के लिए एन्हांसर फ़ंक्शन की गतिशीलता को समझने की आवश्यकता महत्वपूर्ण है। एन्हांसर गतिविधि की सिलिको भविष्यवाणियां परिकल्पना उत्पन्न करने के लिए उत्कृष्ट संसाधनों के रूप में काम कर सकती हैंताकि क्षमता 5,6 को बढ़ाया जा सके। इस तरह की अनुमानित एन्हांसर गतिविधि को कार्यात्मक गतिविधि की पूरी समझ के लिए अतिरिक्त सत्यापन और पूछताछ की आवश्यकता हो सकती है। एन्हांसर रिपोर्टर परख विभिन्न प्रकार की प्रणालियों में इस उद्देश्य के लिए मूल्यवान साबित हुए हैं, कोशिकाओं से जानवरों तक 7,8,9। विवो संदर्भ में एक लचीले और लागत प्रभावी क्षणिक में इन अध्ययनों का विस्तार करने की दिशा में, यह प्रोटोकॉल प्रसवोत्तर माउस मस्तिष्क में एक अस्थानिक रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति को चलाने की उनकी क्षमता के लिए कथित एन्हांसर अनुक्रमों का परीक्षण करने के लिए विवो एएवी-आधारित विधियों के उपयोग का वर्णन करता है। विधियों के इस परिवार में एकल उम्मीदवार अनुक्रमों या समानांतर पुस्तकालय स्क्रीनिंग से पूछताछ करने के लिए उपयोगिता है और यह बुनियादी और अनुवाद अनुसंधान के लिए प्रासंगिक है।

यह विधि एक एकल प्लास्मिड में एक रिपोर्टर जीन (यहां ईजीएफपी) के साथ एक कथित एन्हांसर उम्मीदवार डीएनए अनुक्रम को जोड़ती है, जो एक न्यूनतम प्रमोटर के नियंत्रण में है जो अकेले महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति नहीं चलाता है। प्लास्मिड को पुनः संयोजक एएवी (आरएएवी) में पैक किया जाता है और एक पशु मॉडल में इंजेक्ट किया जाता है। जबकि यहां आवेदन मस्तिष्क के लिए है, विभिन्न आरएएवी सीरोटाइप विभिन्न ऊतक प्रकारों में संक्रमण को सक्षम करते हैं ताकि इस दृष्टिकोण को अन्य प्रणालियों10 तक बढ़ाया जा सके। समय की अवधि के बाद, मस्तिष्क को रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति के लिए एकत्र और परख किया जा सकता है। नियंत्रण की तुलना में मजबूत अभिव्यक्ति इंगित करती है कि परीक्षण किए गए उम्मीदवार अनुक्रम जीन की अभिव्यक्ति को "बढ़ाने" में सक्षम था (चित्रा 1)। यह सरल डिजाइन मस्तिष्क में विवो में एन्हांसर गतिविधि के लिए एक अनुक्रम का परीक्षण करने के लिए एक आसान और स्पष्ट दृष्टिकोण प्रदान करता है।

एक अनुक्रम की एन्हांसर क्षमता के लिए परीक्षण के अलावा, इस विधि को सेल-प्रकार एन्हांसर गतिविधि निर्धारित करने के लिए तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है। अंतर बढ़ाने वाली गतिविधि का निर्धारण करने के लिए अनुक्रम-आधारित दृष्टिकोणों में, डीएनए और आरएनए अनुक्रमण से पहले सेल-प्रकार-विशिष्ट मार्करों पर कोशिकाओं को छांटने से शोधकर्ताओं को यह निर्धारित करने की अनुमति मिल सकती है कि क्या विभिन्न सेल प्रकार अंतर बढ़ाने वाली गतिविधि दिखाते हैं, जैसा कि गिसेलब्रेक्ट एट अल.11 में वर्णित किया गया था। इमेजिंग-आधारित दृष्टिकोणों में, सेल-प्रकार-विशिष्ट मार्करों के साथ सह-लेबलिंग छवियां इस बात की जांच करने की अनुमति देती हैं कि क्या एन्हांसर-संचालित प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन करने वाली कोशिकाएं 12,13,14,15,16 की रुचि के सेल-प्रकार मार्कर भी प्रदर्शित करती हैं। एन्हांसर रिपोर्टर परख एन्हांसर क्षमता पर प्रभाव के लिए एन्हांसर में जोखिम से जुड़े एलील भिन्नता के प्रत्यक्ष परीक्षण को सक्षम करता है। जीनोम-वाइड एसोसिएशन स्टडीज (जीडब्ल्यूएएस) में पहचाने गए जोखिम लोकी का विशाल बहुमत जीनोम17 के गैर-कोडिंग क्षेत्रों में निहित है। इन जोखिम लोकी के कार्यात्मक एनोटेशन अध्ययन से संकेत मिलता है कि एक बड़ा हिस्सासंभवतः 18,19,20 को बढ़ाने के रूप में कार्य करता है। विवो में एमपीआरए तैनाती मस्तिष्क12,21 में एन्हांसर गतिविधि के लिए इन जोखिम से जुड़े वेरिएंट के परीक्षण की अनुमति दे सकती है। अंत में, विभिन्न समय बिंदुओं पर वितरण और संग्रह विकास के चरणों में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं जिसके दौरान एक एन्हांसर सक्रिय होता है।

एन्हांसर-रिपोर्टर प्लास्मिड डिजाइन विविध हैं और प्रयोगात्मक लक्ष्यों के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है। न्यूनतम प्रमोटरों के लिए कई विकल्प हैं जिनका उपयोग एन्हांसर अनुसंधान में किया गया है, जैसे कि मानव β-ग्लोबिन न्यूनतम प्रमोटर22 और माउस एचएसपी 68 न्यूनतम प्रमोटर23। इन प्रमोटरों को अभिव्यक्ति के निम्न स्तर को चलाने के लिए जाना जाता है जब तक कि उन्हें सक्रिय करने के लिए एक एन्हांसर तत्व के साथ युग्मित न किया जाए। इसके विपरीत, संवैधानिक प्रमोटर तत्व ट्रांसजीन की मजबूत अभिव्यक्ति को चलाते हैं, जो सकारात्मक नियंत्रण के लिए उपयोगी होता है या मजबूत अभिव्यक्ति की पृष्ठभूमि के खिलाफ एन्हांसर फ़ंक्शन के लिए परीक्षण करता है। संवैधानिक प्रमोटरों के लिए आम विकल्पों में सीएजी, चिकन β-एक्टिन प्रमोटर से प्राप्त एक हाइब्रिड प्रमोटर और साइटोमेगालोवायरस तत्काल-प्रारंभिक एन्हांसर24, या मानव ईएफ 1 -25 शामिल हैं। चूंकि एन्हांसर को द्विदिश रूप से काम करने के लिए जाना जाता है, इसलिए न्यूनतम प्रमोटर के सापेक्ष एन्हांसर का अभिविन्यास और स्थान लचीला होता है (चित्रा 2 ए)। पारंपरिक एन्हांसर-रिपोर्टर परख प्रमोटर के अपस्ट्रीम में एन्हांसर को रखते हैं और लाइब्रेरी डिलीवरी में, रिपोर्टर जीन के डाउनस्ट्रीम में एक बारकोड अनुक्रम शामिल होता है ताकि अनुक्रमण को परीक्षण किए गए एन्हांसर27 के साथ जोड़ा जा सके। हालांकि, एन्हांसर को रिपोर्टर जीन के खुले रीडिंग फ्रेम में भी रखा जा सकता है और अपने स्वयं के बारकोड अनुक्रम के रूप में काम किया जा सकता है, जैसा कि STARR-seq28 में किया गया है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल स्टार-सेक परख डिजाइन का उपयोग करता है, उम्मीदवार एन्हांसर अनुक्रम को रिपोर्टर जीन के 3 'यूटीआर में रखता है। जबकि STARR-seq अभिविन्यास अधिक सुव्यवस्थित क्लोनिंग का लाभ प्रदान करता है, यह पारंपरिक दृष्टिकोण की तुलना में कम अच्छी तरह से समझा जाता है और संरचनाओं के बीच परिवर्तनीय आरएनए स्थिरता को प्रेरित कर सकता है। वर्णित विधियों को आसानी से या तो STARR-seq या पारंपरिक अभिविन्यास के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें क्लोनिंग प्रक्रिया में मामूली परिवर्तन होते हैं जिन्हें कहीं और वर्णित किया गया है।

प्रयोगात्मक लक्ष्यों (चित्रा 2 बी) को फिट करने के लिए इस तकनीक को और अनुकूलित करने के लिए एएवी वितरण के विभिन्न तरीकों को नियोजित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में आगे वर्णित प्रत्यक्ष इंट्राक्रैनील इंजेक्शन, सीधे मस्तिष्क30 में वायरस की उच्च सांद्रता प्रदान करते हैं। यह इंजेक्शन की साइट पर केंद्रित एक उच्च पारगमन दक्षता देता है, जिससे यह ऊतक के एक क्षेत्र में ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं के घनत्व को अधिकतम करने के लिए प्रयोगों के लिए एक उत्कृष्ट तकनीक बन जाती है। स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्थानीयकृत पारगमन के लिए जानवरों में इंजेक्शन की साइट को मानकीकृत करने में मदद कर सकता है। इंट्राक्रैनील इंजेक्शन शुरुआती प्रसवोत्तर जानवरों में सबसे सरल हैं। एक वैकल्पिक तकनीक के रूप में, प्रणालीगत इंजेक्शन रक्त-मस्तिष्क बाधा 31 को पार करने में सक्षम सीरोटाइप के साथ एएवी का उपयोग करके ट्रांसजेन वितरित करसकते हैं। टेल-वेन इंजेक्शन वायरस को पूरे शरीर में प्रसारित करने की अनुमति देता है, जिससे कई ऊतकों में सामान्यीकृत वितरण सक्षम होताहै। रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन एक और प्रणालीगत इंजेक्शन तकनीक है जो रेट्रो-ऑर्बिटल साइनस32 में आंख के पीछे वायरस पहुंचाता है। यह शिरापरक प्रणाली से मस्तिष्क तक एएवी के लिए एक अधिक सीधा मार्ग प्रदान करता है, जिसके परिणामस्वरूप मस्तिष्क में ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं की उच्च सांद्रता अधिक परिधीय रक्त वाहिकाओं में इंजेक्शन की तुलना मेंहोती है।

इस तकनीक का एक और लचीला पहलू रीडआउट की विधि है। मोटे तौर पर, विकल्पों को रिपोर्टर-आधारित या अनुक्रमण-आधारित (चित्रा 2 सी) के रूप में वर्णित किया जा सकता है। निर्माण के खुले रीडिंग फ्रेम में जीएफपी जैसे फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को शामिल करने से किसी भी ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति होती है जहां उम्मीदवार एन्हांसर ने अभिव्यक्ति को प्रेरित किया। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जैसी लेबलिंग और इमेजिंग तकनीक सिग्नल प्रवर्धन को सक्षम करती है। अनुक्रमण-आधारित रीडआउट तकनीकों में ऊतक से एकत्र किए गए आरएनए में वितरित निर्माण से अनुक्रमों की पहचान करना शामिल है। शुरू में वितरित किए गए वायरल डीएनए की मात्रा को निर्धारित करके, व्यक्त आरएनए बनाम वितरित डीएनए की तुलना का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि एक परीक्षण किया गया एन्हांसर अनुक्रम ट्रांसजेन की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति को चलाने में सक्षम था, उदाहरण के लिए, बड़े पैमाने पर समानांतर रिपोर्टर परख (एमपीआरए) के संदर्भ में। एमपीआरए एक साथ गतिविधि के लिए हजारों उम्मीदवार एन्हांसर का परीक्षण करने के लिए इन तकनीकों का एक शक्तिशाली विस्तार प्रदान करते हैं और जीनोमिक्स अनुसंधान 12,27,34,35,36 में बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है। व्यक्तिगत रूप से के बजाय बैच में उम्मीदवार बढ़ाने वालों के लिए क्लोनिंग, पैकेजिंग, डिलीवरी और अनुक्रमण चरणों को निष्पादित करके उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्राप्त की जाती है।

उम्मीदवार एन्हांसर चयन लचीलेपन के लिए एक और अवसर प्रदान करता है (चित्रा 2 डी)। उदाहरण के लिए, इस परख का उपयोग एक विशिष्ट जीन के एन्हांसर की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, रुचि के गैर-कोडिंग डीएनए क्षेत्रों के कार्य का पता लगाने के लिए, या विशिष्ट सेल प्रकार या विकास चरणों को निर्धारित करने के लिए जिसके दौरान एक एन्हांसर सक्रिय है - जिनमें से सभी बुनियादी विज्ञान और रोग अनुसंधान दोनों में लक्ष्यों की सेवा करते हैं। आम तौर पर, उम्मीदवार एन्हांसर चयन एन्हांसर गतिविधि की सिलिको भविष्यवाणियों से प्रेरित होता है। आमतौर पर, सिलिको भविष्यवाणियों में हिस्टोन संशोधनों के लिए CHIP-seq शामिल होता है जो संभावित एन्हांसर को इंगित करता है, जैसे H3K27ac37 और क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी मैपिंग38। अंत में, अनुसंधान का एक बढ़ता हुआ क्षेत्र कृत्रिम रूप से डिज़ाइन किए गए एन्हांसर तत्वों की फ़ंक्शन-आधारित स्क्रीनिंग है, जो इस अध्ययन को सक्षम करता है कि एन्हांसर अनुक्रम फ़ंक्शन39 को कैसे निर्देशित करता है और विशिष्ट गुणों के साथ एन्हांसरका डिजाइन 40 है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल को यूसी डेविस संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (प्रोटोकॉल # 22339) और यूसी डेविस संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (बीयूए-आर 1903) द्वारा अनुमोदित किया गया है। इस प्रोटोकॉल का परीक्षण प्रसवोत्तर दिन 0-1 पर दोनों लिंगों के सी 57बीएल / 6 जे चूहों पर किया गया है।

1. एएवी वेक्टर प्लास्मिड में एन्हांसर उम्मीदवार अनुक्रम क्लोन करें।

नोट: प्रतिनिधि प्रोटोकॉल दिए गए हैं, लेकिन क्लोनिंग रणनीति में उच्च स्तर का लचीलापन है।

  1. एक रिपोर्टर निर्माण का चयन या डिज़ाइन करें। यहां, एन्हांसर उम्मीदवार को ईजीएफपी रिपोर्टर जीन के 3 'अअनुवादित क्षेत्र (यूटीआर) में डाला जाता है, जिसे एचएसपी 68 न्यूनतम प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किया जाता है।
    नोट: इस परख के लिए उपयुक्त कई एमपीआरए प्लास्मिड संरचनाओं को एडजीन41 में जमा किया गया है और अनुसंधान उपयोग के लिए उपलब्ध हैं।
  2. रुचि के अनुक्रम को बढ़ाने के लिए पीसीआर प्राइमर डिजाइन करें। प्राइमरों के 5 'छोर में गिब्सन क्लोनिंग के लिए उपयुक्त होमोलॉजी आर्म जोड़ें (~ 35 बीपी सम्मिलन स्थान के ऊपर अनुक्रम 5' के अनुरूप, फॉरवर्ड प्राइमर के लिए शीर्ष स्ट्रैंड, और रिवर्स प्राइमर के लिए निचला स्ट्रैंड)।
    नोट: सुनिश्चित करें कि बेस प्राइमर अनुक्रम ~ 18-24 बीपी लंबा और ~ 50% -60% जीसी सामग्री लगभग 57-59 डिग्री सेल्सियस के पिघलने तापमान के साथ है।
  3. डिज़ाइन किए गए प्राइमरों का उपयोग करके डीएनए नमूने से पीसीआर करें।
    1. तालिका 1 में वर्णित 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबों में पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण को इकट्ठा करें।
    2. तालिका 1 में उल्लिखित कार्यक्रम के अनुसार थर्मल साइक्लर और चक्र पर पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण (ईएस) रखें।
    3. 30-60 मिनट के लिए 100 वोल्ट पर 0.7% -1% एगारोस जेल पर 5 μL पीसीआर उत्पाद चलाकर पीसीआर की सफलता की पुष्टि करें। अनुमानित लंबाई के टुकड़े की जांच करें।
    4. एक वाणिज्यिक एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया क्लीनअप कॉलम किट का उपयोग करके पीसीआर उत्पाद को साफ करें। अंतिम एलुएट क्लोनिंग सम्मिलित है।
  4. वेक्टर में एन्हांसर डालने के लिए अद्वितीय क्लोनिंग साइट पर एएवी वेक्टर को रैखिक करने के लिए प्रतिबंध पाचन करें।
    1. यहां उपयोग किए जाने वाले एन्हांसर रिपोर्टर निर्माण के 3 'यूटीआर में क्लोनिंग साइट अद्वितीय पीएसीआई और एएसआई प्रतिबंध साइटों से घिरा हुआ है। निम्नलिखित मापदंडों (चरण 1.4.2-1.4.4) के अनुसार इस स्थान पर प्लास्मिड को रैखिक करने के लिए एक पाचन निष्पादित करें।
    2. PACI और AsciI का उपयोग करके वेक्टर डीएनए के 1-10 μg को पचाएं, यह इस बात पर निर्भर करता है कि कितनी क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं की आवश्यकता होगी। निर्माता के निर्देशों के अनुसार आपूर्ति किए गए बफर का उपयोग करके प्रतिक्रियाएं तैयार करें।
    3. वेक्टर डीएनए को पचाने के लिए 1-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। (यदि 50 μL प्रतिक्रिया में 5 μg से अधिक पचा ता है, तो लंबे समय तक इनक्यूबेशन की आवश्यकता हो सकती है।
    4. इनक्यूबेशन के 1-2 घंटे के बाद, 20 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके एंजाइम को निष्क्रिय करें।
    5. 0.7% -1% अगारोस जेल का उपयोग करके जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रतिबंध पाचन टुकड़ों को अलग करें, 30-60 मिनट के लिए 100 वी पर चलाएं।
    6. रैखिक वेक्टर के लिए बैंड का उत्पादन और वाणिज्यिक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके शुद्ध करें।
  5. गिब्सन क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करें और परिवर्तन करें
    1. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके शुद्ध वेक्टर और क्लोनिंग सम्मिलित की एकाग्रता निर्धारित करें।
      नोट: डीएनए 260 एनएम पर प्रकाश को अवशोषित करता है, जबकि दूषित पदार्थ 230 एनएम और 280 एनएम पर प्रकाश को अवशोषित करते हैं। 260/230 और 260/280 के उच्च अनुपात (>1.8) अत्यधिक शुद्ध डीएनए का संकेत देते हैं।
    2. 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबों में गिब्सन क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं को इकट्ठा करें: 2 एक्स गिब्सन मास्टर मिक्स के 5 μL, वेक्टर में 3: 1 सम्मिलित के अनुपात में 0.02-0.5 pmol डीएनए टुकड़े (प्रतिक्रिया के लिए इष्टतम डीएनए एकाग्रता अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जानी चाहिए) और न्यूक्लियस-मुक्त पानी (मात्रा को 10 μL तक लाएं)।
    3. एक थर्मल साइक्लर में 20 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर गिब्सन प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. ट्रांसफॉर्म पुनर्संयोजन की कमी (आरईसीए-) सक्षम एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई)।
    1. 42 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान सेट करें और बर्फ पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सक्षम कोशिकाओं को पिघलाएं।
      नोट: यह चरण चरण 1.4 से पहले किया जा सकता है, और गिब्सन प्रतिक्रिया तैयार करते और इनक्यूबेट करते समय कोशिकाएं पिघल सकती हैं।
    2. एलिकोट 30-50 μL कोशिकाओं को 2.0 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में बदल देता है। एक एलिकोट में गिब्सन प्रतिक्रिया के 2 μL जोड़ें और ट्यूब को गिब्सन की पहचान के साथ लेबल करें। 30 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
      नोट: सकारात्मक नियंत्रण के रूप में 5-10 एनजी बिना पचे खाली वेक्टर का उपयोग करें और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पानी का उपयोग करें।
    3. 30-45 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कोशिकाओं को गर्मी-झटका दें, तुरंत ट्यूबों को बर्फ में वापस करें, और उन्हें 5 मिनट के लिए ठीक होने दें।
    4. बर्फ पर रहते हुए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिकवरी मीडिया के 400-950 μL जोड़ें।
      नोट: इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले रिकवरी मीडिया में 2% सब्जी पेप्टोन, 0.5% खमीर निकालने, 10 एमएम एनएसीएल, 2.5 एमएम केसीएल, 10 एमएम एमजीसीएल2, 10 एमएम एमजीएसओ4 और 20 एमएम ग्लूकोज शामिल हैं।
    5. बर्फ पर रिकवरी के बाद, 30-60 मिनट के लिए 250 आरपीएम के कोमल आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके कोशिकाओं को पूरी तरह से पुनर्प्राप्त करें।
    6. 5 मिनट के लिए 5,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को छर्रों को छर्रों से हटा दें और सतह पर तैरने वाले 400 μL को हटा दें, जिससे प्लेट में ~ 50 μL बैक्टीरिया रह जाते हैं।
    7. चयनात्मक मीडिया पर प्लेट करें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: इन प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले चयनात्मक मीडिया में 1.0% ट्रिप्टोन, 0.5% खमीर निकालने, 1.0% सोडियम क्लोराइड, 1-2% आगर, 96-97% पानी और 100 μg / mL की एकाग्रता पर कार्बेनिसिलिन शामिल हैं। वायरल प्लास्मिड की क्लोनिंग के लिए हमेशा बैक्टीरिया के पुनर्संयोजन की कमी वाले उपभेदों का उपयोग करें क्योंकि वायरल उल्टे टर्मिनल रिपीट (आईटीआर) में मिलान अनुक्रम होते हैं और समरूप पुनर्संयोजन से गुजर सकते हैं। हालांकि, बैक्टीरिया के आरईसीए-उपभेद अभी भी पुनर्संयोजन के निम्न स्तर से गुजरते हैं। यहां इस्तेमाल किया जाने वाला रिपोर्टर प्लास्मिड एक स्व-पूरक एएवी है, जहां आईटीआर में से एक का अनुक्रम बदल दिया गया है और अब दूसरे आईटीआर से पूरी तरह से मेल नहीं खाता है। 30 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया को बढ़ने की भी सिफारिश की जाती है ताकि समरूप पुनर्संयोजन की दर को धीमा किया जा सके।
  7. क्लोन सत्यापित करें और प्लास्मिड को पुनर्प्राप्त करें।
    1. फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमरों (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके एक पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें जो वेक्टर को नष्ट कर देता है, जो सम्मिलित स्थान को फ्लैंक करता है। 0.2 एमएल पीसीआर स्ट्रिप ट्यूबों में 10 μL वॉल्यूम।
    2. 14 एमएल राउंड-बॉटम ट्यूबों में, एंटीबायोटिक चयनात्मक एलबी शोरबा के 5 एमएल एलिकोट तैयार करें, पीसीआर और नकारात्मक नियंत्रण के माध्यम से परीक्षण किए जा रहे प्रत्येक कॉलोनी के लिए एक।
    3. एक व्यक्तिगत कॉलोनी चुनने के लिए बाँझ टूथपिक या पिपेट टिप का उपयोग करें और मोटे तौर पर कॉलोनी को एक पीसीआर ट्यूब के तल में खुरचें।
    4. जब कॉलोनी पीसीआर मास्टर मिश्रण में अलग हो जाती है, तो टूथपिक या टिप को एलबी एलिकोट में से एक में गिरा दें और गिब्सन प्रतिक्रिया और पीसीआर ट्यूब नंबर के साथ 14 एमएल ट्यूब को लेबल करें।
    5. कॉलोनी पीसीआर प्रतिक्रियाओं को थर्मल साइकिलर पर रखें और तालिका 2 में वर्णित कार्यक्रम के साथ चक्र करें।
    6. 37 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर सेट किए गए एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में टूथपिक्स या पिपेट टिप्स के साथ टीका लगाए गए 5 एमएल तरल संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें।
    7. कॉलोनी पीसीआर प्रतिक्रियाओं को 30-60 मिनट के लिए 100 वी पर 0.7% -1% अगारोस जेल पर चलाएं और जेल डॉक इमेजिंग सिस्टम में बैंड की कल्पना करें।
    8. उन 5 एमएल संस्कृतियों को छोड़ दें जो अनुमानित पीसीआर बैंड प्रदर्शित नहीं करते हैं।
    9. प्रत्येक सफलतापूर्वक एकीकृत क्लोन के लिए, 5 एमएल संस्कृतियों को रातोंरात बढ़ने की अनुमति दें और फिर एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके 4.5 एमएल से प्लास्मिड मिनी तैयारी करें। तरल संस्कृति के 0.5 एमएल को आरक्षित करें और ग्लिसरॉल स्टॉक के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर बचत करें।
    10. पुष्टि करें कि प्लास्मिड के भीतर निहित ट्रांसजेन सेंगर अनुक्रमण42 का उपयोग करके अवांछनीय उत्परिवर्तन से मुक्त हैं।
    11. रिपोर्टर निर्माण को सफलतापूर्वक क्लोन करने की पुष्टि होने के बाद, बचाए गए ग्लिसरॉल स्टॉक का उपयोग 5 एमएल स्टार्टर कल्चर को टीका लगाने के लिए करें और 30 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में 8-16 घंटे तक बढ़ें।
    12. एक बार शोरबा बादल होने के बाद, स्टार्टर कल्चर को 250-300 एमएल ताजा चयनात्मक एलबी शोरबा में 1,000 गुना पतला करें और 30 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर एक हिलने वाले इनक्यूबेटर में कम से कम रात भर इनक्यूबेट करें। फिर एक वाणिज्यिक प्लास्मिड मैक्सी किट का उपयोग करके प्लास्मिड को शुद्ध करें।
      नोट: बैक्टीरिया 37 डिग्री सेल्सियस की तुलना में 30 डिग्री सेल्सियस पर अधिक धीरे-धीरे बढ़ेगा, लेकिन बड़ी संस्कृतियों को बढ़ने पर सहज पुनर्संयोजन की दर को धीमा करने के लिए यह सबसे अच्छा तापमान है।
    13. चरण 1.4.2-1.4.5 का उपयोग करके आईटीआर के पुनर्संयोजन के लिए परीक्षण करने के लिए एक एक्सएमएआई डाइजेस्ट करें, पीएसीआई और एएससीआई के बजाय एक्सएमएआई को प्रतिस्थापित करें। जेल डॉक इमेजिंग सिस्टम पर बैंड की कल्पना करें।
      नोट: दोनों आईटीआर मौजूद होने के साथ एक आरएएवी प्लास्मिड इस पाचन के बाद एक जेल पर दो बैंड उत्पन्न करेगा: एक आरएएवी जीनोम की लंबाई और दूसरा प्लास्मिड रीढ़ के बाकी हिस्सों की लंबाई। यदि केवल एक बैंड है, तो आईटीआर समरूप पुनर्संयोजन से गुजरे हैं, और आरएएवी प्लास्मिड वायरल कणों की पैकेजिंग करने में सक्षम नहीं होगा। यहां वर्णित आरएएवी प्लास्मिड बैकबोन को डिजाइन किया गया है ताकि एक्सएमएआई साइटें केवल आईटीआर में हों। यदि एन्हांसर उम्मीदवार सम्मिलित में कोई एक्सएमएआई साइटें भी शामिल हैं, तो अनुमानित बैंड परिणामों को अपडेट करें और तदनुसार विश्लेषण करें।

2. पैक किया गया आरएएवी प्राप्त करें।

  1. इस अध्ययन में प्रयोगों के लिए पैक किए गए आरएएवी (पेशेवर या इन-हाउस) का उपयोग करें।
    नोट: एक आरएएवी पैकेजिंग के लिए कई विकल्प हैं। एक आरएएवी को पेशेवर रूप से एक कंपनी या विश्वविद्यालय कोर सुविधा में पैक किया जा सकता है। आरएएवी को विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके इन-हाउस भी पैक किया जा सकता है जो जटिलता और विशेष उपकरण43,44 की आवश्यकता में हैं। प्राथमिक चिंता एक वेक्टर प्राप्त करना है जो उच्च गुणवत्ता वाला है और यह कि संक्रामक टिटर को उच्च स्तर की निश्चितता के लिए निर्धारित किया गया है। इस अध्ययन में वर्णित विभिन्न प्रयोगों के लिए पेशेवर रूप से पैक किए गए और इन-हाउस पैक किए गए आरएएवी दोनों का उपयोग किया गया था।

3. इंट्राक्रैनियल रूप से नवजात चूहों में आरएएवी-पैक किए गए प्लास्मिड को इंजेक्ट करें।

  1. डिलीवरी के लिए आरएएवी मिश्रण तैयार करें।
    1. यदि इरादा विभिन्न एन्हांसर रिपोर्टर वायरस के बीच अभिव्यक्ति पैटर्न की तुलना करना है, तो कम से कम केंद्रित वायरस से मेल खाने के लिए सभी को पतला करके तुलना करने के लिए सभी वायरस के टिटर्स को बराबर करें।
    2. एन्हांसर रिपोर्टर वायरस के 2: 1 या 3: 1 अनुपात को एक साथ मिलाएं और संवैधानिक रूप से व्यक्त नियंत्रण रिपोर्टर वायरस और फास्ट ग्रीन डाई की एक छोटी मात्रा (0.06% अंतिम एकाग्रता) जोड़ें।
      नोट: फास्ट ग्रीन एक डाई है जिसका उपयोग प्रयोगात्मक जानवरों के इंजेक्शन में व्यापक रूप से किया जाता है, जिसमें एएवी भी शामिल है, प्रक्रिया के दौरान और उसके तुरंत बाद इंजेक्शन साइट की कल्पना करने के लिए 45,46,47,48। हालांकि यह एक महत्वपूर्ण गुणवत्ता आश्वासन कदम है, यह संभव है कि डाई के अतिरिक्त पारगमन में हस्तक्षेप हो सकता है। इंजेक्शन डाई के उपयोग पर पुनर्विचार करना कुछ मामलों में प्रोटोकॉल अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। स्वतंत्र इंजेक्शन की तुलना करने के लिए संवैधानिक रूप से संचालित नियंत्रण वायरस बिल्कुल महत्वपूर्ण है। वायरस इंजेक्शन स्थान और जानवर से जानवर में पारगमन की सीमा में भिन्न होंगे। संवैधानिक नियंत्रण विश्लेषण से विफल इंजेक्शन को बाहर करने में सक्षम होगा और वायरस वितरण में भिन्नता के सामान्यीकरण के लिए एक मानक प्रदान करेगा।
    3. एक μL-स्नातक केशिका ट्यूब से बने बाँझ खींचे गए ग्लास पिपेट की नोक को 70% इथेनॉल में भिगोकर एक नाजुक पोंछे के माध्यम से धीरे से छेदकर तोड़ें और पूरी तरह से सूखने दें। फिर खींचे गए ग्लास पिपेट को एस्पिरेटर असेंबली में डालें जिसमें माइक्रो-केशिका पिपेट को पकड़ने के लिए रबर गैसकेट के साथ समाप्त होने वाले 15 इंच लंबे रबर टयूबिंग से जुड़े दबाव को लागू करने के लिए एक उपकरण शामिल है।
      नोट: "दबाव लागू करने के लिए उपकरण" एक सिरिंज या मुखपत्र हो सकता है। यदि एक सिरिंज का उपयोग किया जाना है, तो एक दूसरे व्यक्ति को सिरिंज के माध्यम से दबाव लगाने की आवश्यकता होगी, जबकि प्रयोगकर्ता एक हाथ में पिपेट और दूसरे में जानवर में हेरफेर करता है। यदि एक मुखपत्र का उपयोग करते हैं, तो प्रयोगकर्ता को जानवर और पिपेट दोनों स्थितियों और सिरिंज पर लागू दबाव पर ठीक नियंत्रण करने में सक्षम बनाता है, वायरस संदूषण से बचने के लिए अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता होती है।
    4. ग्लास पिपेट में खनिज तेल की एक छोटी मात्रा (~ 0.2-0.5 μL) खींचने के लिए एस्पिरेटर असेंबली के माध्यम से नकारात्मक दबाव लागू करें।
      नोट: यह कदम एरोसोलाइज्ड वायरल कणों को एस्पिरेटर असेंबली को दूषित करने से रोकने के लिए एक बाधा प्रदान करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।
    5. तैयार एस्पिरेटर असेंबली को एक तरफ रखें और वायरस को इंजेक्ट करने के लिए तैयार होने तक बर्फ पर रखें।
  2. क्रायो-एनेस्थेटाइज नवजात चूहों को एक सूखे प्लास्टिक डिश में आंशिक रूप से बर्फ में डुबोया जाता है जब तक कि पेडल वापसी रिफ्लेक्स (~ 5 मिनट) की समाप्ति तक। सुनिश्चित करें कि चूहे बर्फ के सीधे संपर्क में नहीं हैं।
  3. वायरस मिश्रण को खींचे गए ग्लास पिपेट में खींचने के लिए एस्पिरेटर असेंबली के माध्यम से नकारात्मक दबाव का उपयोग करें जब तक कि मेनिस्कस 2 μL टिक मार्क से नहीं गुजरता।
  4. माउस को ठंडे कक्ष से निकालें और इसे बेंचटॉप पर रखें। लैम्ब्डा और ब्रेग्मा के बीच में और प्रत्येक आंख के बीच में द्विपक्षीय इंजेक्शन साइटों का पता लगाएं। अल्कोहल वाइप के साथ दोनों क्षेत्रों को साफ करें।
  5. नवजात चूहों की खोपड़ी को छेदने के लिए खींचे गए ग्लास पिपेट का उपयोग करें और धीरे से एस्पिरेटर असेंबली के माध्यम से सकारात्मक दबाव लागू करें क्योंकि सुई मस्तिष्क में प्रवेश करती है। वायरस मिश्रण के मेनिस्कस को देखें। लागू दबाव का प्रतिरोध कम हो जाएगा जब पिपेट की नोक पार्श्व वेंट्रिकल तक पहुंच जाती है। वायरस के 1 μL को वितरित करें, पिपेट को वापस लें, और दूसरे पार्श्व वेंट्रिकल के लिए दोहराएं।
  6. ठीक होने के लिए माउस को हीटिंग पैड या वार्मिंग चैंबर पर रखें। एक बार जागने और सक्रिय होने के बाद, जानवर को उसके घर के पिंजरे में वापस कर दें।

4. ऊतक एकत्र करें और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करें।

  1. वायरस ट्रांसडक्शन के बाद पर्याप्त समय के बाद, चूहों को एनेस्थेटाइज करें और ट्रांसकार्डियल छिड़काव द्वारा बलिदान करें।
    नोट: यहां दिखाए गए प्रतिनिधि परिणामों सहित कई प्रयोग, वायरस को ट्रांसड्यूस करने के लिए 4 सप्ताह या उससे अधिक की अवधि की अनुमति देते हैं। हालांकि, स्व-पूरक एएवी 7 दिन 12 की शुरुआत में मजबूत अभिव्यक्ति दिखासकते हैं। वांछित इनक्यूबेशन अवधि को विशिष्ट प्रयोगात्मक तकनीकों और लक्ष्यों के आधार पर अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    1. अंतःशिरा जलसेक ट्यूबिंग और 25 ग्राम सुई के साथ एक पेरिस्टाल्टिक पंप तैयार करें।
    2. 1x PBS और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (PFA) तैयार करें और उन्हें बर्फ पर रखें।
    3. ट्यूबिंग के सेवन छोर को बर्फ-ठंडा 1x PBS में रखें। प्रवाह दर (पी 7 चूहों के लिए 2.5 एमएल / मिनट, पी 28 चूहों के लिए 3.5 एमएल / मिनट) सेट करें और पंप को तब तक चलाएं जब तक कि बफर को ट्यूबिंग के माध्यम से सभी तरह से खींचा न जाए और बुलबुले से साफ न हो जाए। छिड़काव के लिए तैयार होने तक सुई को एक तरफ रखें।
    4. एक फ्यूम हुड के अंदर, एक ड्रॉप जार कक्ष के तल में एक पेपर तौलिया पर आइसोफ्लुरेन की एक छोटी मात्रा को पाइपेट करें। पहले इंजेक्ट किए गए माउस को पेपर तौलिया के ऊपर एक कद्दूकस पर रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि यह आइसोफ्लुरेन के सीधे संपर्क में न आए। माउस को एनेस्थेटाइज करने के लिए कक्ष को सील करें। ~ 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें और फिर कक्ष खोलें और पेडल निकासी रिफ्लेक्स की जांच करें। जानवर के बेहोश होने के बाद आगे बढ़ें।
      नोट: छिड़काव के दौरान, होश में आने से रोकने के लिए माउस को नाक शंकु के साथ आइसोफ्लुरेन पर बनाए रखा जाना चाहिए।
    5. माउस के पेट और छाती को खोलने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करें, पसली पिंजरे को हटा दें और दिल को उजागर करें।
    6. माउस के दाहिने आलिंद में एक छोटा सा चीरा लगाने के लिए आईरिस माइक्रो कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें, आईवी सुई को बाएं वेंट्रिकल में डालें, और पेरिस्टालिक पंप को सक्रिय करें।
    7. जानवर को बर्फ-ठंडा 1x PBS के साथ तब तक रखें जब तक कि दाहिने आलिंद में चीरा से निकलने वाला रक्त स्पष्ट न हो जाए। रक्त के ऊतक को साफ करना बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि लाल रक्त कोशिकाओं में ऑटोफ्लोरेसेंस होता है, और रक्त वाहिकाएं रिपोर्टर-व्यक्त कोशिकाओं की छवि बनाने की क्षमता को खराब कर सकती हैं।
    8. पेरिस्टालिक पंप को रोकें और सेवन ट्यूबिंग को पीबीएस से 4% पीएफए तक ले जाएं। पंप को फिर से सक्रिय करें और शरीर के वजन के 1 एमएल / जी को बढ़ाएं, एक वयस्क माउस के लिए ~ 25 एमएल।
      नोट: फिक्सेशन झटके देखने योग्य होने चाहिए, और माउस का शरीर कठोर होना चाहिए।
  2. मस्तिष्क को विच्छेदित और पोस्ट-फिक्स करें।
    1. सर्जिकल कैंची से माउस के सिर को हटा दें।
    2. छोटी सर्जिकल कैंची का उपयोग करके, खोपड़ी के आधार पर शुरू करें और सिर की मध्य रेखा के साथ एक चीरा बनाएं और खोपड़ी को उजागर करने के लिए त्वचा और अंतर्निहित ऊतक को वापस खींचें।
    3. आईरिस कैंची का उपयोग करके, खोपड़ी के पिछले हिस्से को सावधानीसे काटें, फोरमेन मैग्नम से शुरू करें और घ्राण बल्बों के पारित होने तक सीवन की ओर और साथ-साथ जारी रखें।
    4. घ्राण बल्बों के ऊपर खोपड़ी में कैंची डालें और खोपड़ी में दो क्षैतिज कटौती करें। ओसीसीपटल हड्डी में क्षैतिज कटौती की एक समान जोड़ी बनाएं। क्षैतिज और मध्य रेखा कट खोपड़ी के शीर्ष में दरवाजे की तरह फ्लैप की एक जोड़ी बनाते हैं।
    5. मस्तिष्क को पूरी तरह से उजागर करने के लिए खोपड़ी के फ्लैप को वापस छील लें। खोपड़ी से घ्राण बल्बों को अलग करने और कपाल नसों को काटने के लिए चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करें, मस्तिष्क को खोपड़ी से मुक्त करें।
    6. मस्तिष्क को पीबीएस में 4% पीएफए के 3-5 एमएल के साथ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में छोड़ दें। पोस्ट-फिक्स 6 घंटे से रात भर के लिए। ऊतक को ओवर-फिक्स न करें।
  3. क्रायोसेक्शनिंग के लिए दिमाग तैयार करें।
    1. निर्जलीकरण के लिए पीबीएस में 30% सुक्रोज के 12-14 एमएल के साथ एक नए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में निश्चित मस्तिष्क को स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि मस्तिष्क ट्यूब के तल (2-3 दिन) तक न डूब जाए।
    2. 15 मिमी x 15 मिमी x 5 मिमी क्रायोमोल्ड में इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) यौगिक में स्थिर और निर्जलित मस्तिष्क को डुबोएं। ओसीटी जोड़ें जब तक कि मस्तिष्क पूरी तरह से कवर न हो जाए।
    3. क्रायोमोल्ड को सूखी बर्फ के एक ब्लॉक पर रखें और नमूने को ओसीटी (~ 5 मिनट) के ठोस ब्लॉक में फ्रीज करें।
      नोट: ओसीटी ब्लॉक महीनों से वर्षों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. क्रायोमोल्ड को नमूना नाम और मस्तिष्क के अभिविन्यास के साथ लेबल करें।
  4. क्रायोस्टेट माइक्रोटोम का उपयोग करके कोरोनल अनुभाग प्राप्त करें।
    1. पेंसिल में ओसीटी ब्लॉक पर मस्तिष्क के अभिविन्यास को चिह्नित करें और क्रायोस्टेट के अंदर क्रायोमोल्ड से ब्लॉक को हटा दें।
    2. ओसीटी ब्लॉक को रखें ताकि मस्तिष्क क्रायोस्टेट के ब्लेड के सामने घ्राण बल्बों के साथ उन्मुख हो और कुछ ताजा ओसीटी के साथ क्रायोस्टेट के ऑब्जेक्ट होल्डर के ब्लॉक का पालन करे।
    3. एक बार जम जाने के बाद, चरण 4.4.4-4.4.4.6 का पालन करते हुए ब्लॉक के माध्यम से 50 μm खंडों को काटना शुरू करें।
    4. एंटी-रोल प्लेट का उपयोग न करें। खंड तंग रोल में घुंघराले होंगे क्योंकि वे काटे जाते हैं और या तो ब्लॉक के ऊपर इकट्ठा होंगे या नीचे एक संग्रह ट्रे में गिर जाएंगे।
    5. किए गए पहले कुछ कटों में ब्लॉक का आकार देखें। ब्लॉक के माध्यम से ऊर्ध्वाधर कट बनाएं, काटना शुरू होने पर एक समान चेहरा पैदा करें। यदि आवश्यक हो तो नमूना समायोजन हथियारों का उपयोग करके कोण समायोजित करें।
    6. जब घ्राण बल्ब दिखाई देते हैं, तो वर्गों के आकार पर पूरा ध्यान दें। यदि एक दूसरे की तुलना में बड़ा दिखाई देता है, तो कट मस्तिष्क के सापेक्ष एक कोण पर होते हैं, और नमूना समायोजन बाहों का उपयोग करके ब्लेड के खिलाफ मस्तिष्क के अभिविन्यास को सीधा करना आवश्यक है।
      नोट: यदि सीधे काटते हैं, तो कॉर्टेक्स को एक ही समय में प्रत्येक घ्राण बल्ब के ऊपर दिखाई देना शुरू करना चाहिए।
    7. एक बार घ्राण बल्ब को विभाजित करने और रोस्ट्रल मस्तिष्क के ऊतकों को दिखाई देने के बाद, काटने की मोटाई को 30-35 μm तक कम करें और फ्लोटिंग अनुभागों को इकट्ठा करना शुरू करें। मस्तिष्क को विभाजित करने के लिए चरण 4.4.8-4.4.13 का पालन करें।
    8. ब्लॉक और ऑब्जेक्ट होल्डर के पिछले सभी खंडों को ब्रश करें ताकि वे एकत्र ट्रे में गिर जाएं। उन्हें ट्रे के एक तरफ ब्रश करें और उन्हें अलग रखें। अगर ढेर बहुत बड़ा है तो ट्रे खाली कर दें।
    9. 24 वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1 एमएल पीबीएस वितरित करें। प्रत्येक मस्तिष्क के लिए लेबल 1 पंक्ति।
    10. 6 कोरोनल सेक्शन काटें। ठंडे चिमटी का उपयोग करके अनुभागों को पुनः प्राप्त करें और उन्हें क्रायोस्टेट चरण पर व्यवस्थित करें। 6 खंडों के समूहों को अलग रखते हुए, इस चरण को 2 या 3 बार दोहराएं।
    11. पीबीएस के साथ एक आकार 000 पेंटब्रश गीला करें और एक लिंट-मुक्त ऊतक या पेपर तौलिया पर अतिरिक्त तरल को दूर करें। पेंटब्रश का उपयोग प्रत्येक खंड को धीरे से उठाने के लिए करें, एक बार में, और इसे 24 वेल प्लेट के उपयुक्त कुओं में रखें।
    12. स्लाइस के समूह से 6 वर्गों में से एक को 24 वेल प्लेट की एक पंक्ति में 6 कुओं में से प्रत्येक में रखें। यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक कुएं में प्रतिनिधि खंड होते हैं जो मस्तिष्क के खंडित क्षेत्र को फैलाते हैं।
    13. सेरेब्रल कॉर्टेक्स के पुच्छल छोर को विभाजित किए जाने तक 6 के समूहों में सेक्शनिंग जारी रखें।
    14. भंडारण के लिए, पैराफिल्म के साथ 24 वेल प्लेट को सील करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: अनुभाग 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 महीने के लिए स्थिर हैं। 0.1% सोडियम एज़ाइड के साथ एक पीबीएस समाधान का उपयोग बैक्टीरिया के विकास को रोकने और वर्गों के शेल्फ जीवन को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, यदि अनुभागों को 2 महीने से अधिक समय तक संग्रहीत किया जाना है, तो उन्हें क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान में रखा जाना चाहिए और सर्वोत्तम परिणामों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज किया जाना चाहिए।
  5. रिपोर्टर जीन सिग्नल प्रवर्धन के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करें।
    नोट: एंटीजन पुनर्प्राप्ति को छोड़कर सभी चरणों को कक्षीय शेकर पर कोमल-से-मध्यम आंदोलन (~ 100 आरपीएम) का उपयोग करके किया जाना चाहिए। नियंत्रण रिपोर्टर (mRuby3) के मूल प्रतिदीप्ति को संरक्षित करने के लिए, सभी चरणों को यथासंभव प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए।
    1. तालिका 3 में वर्णित आवश्यक बफर तैयार करें।
    2. प्रत्येक मस्तिष्क को दाग के लिए एक पंक्ति के साथ एक नई 24 वेल प्लेट तैयार करें। कुओं के पहले कॉलम में, प्रत्येक कुएं में 1 एमएल पीबीएस जोड़ें।
    3. आकार 000 पेंटब्रश का उपयोग करके, अवशिष्ट ओसीटी यौगिक को हटाने के लिए एक त्वरित कुल्ला के लिए नए 24 वेल प्लेट में मूल संग्रह से 1 अच्छी तरह से खंडों को ताजा पीबीएस में स्थानांतरित करें।
    4. 24 वेल प्लेट में अगले कुएं में 1 एमएल एआरबी जोड़ें और इस कुएं में अनुभागों को स्थानांतरित करें। एक ओवन में 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. प्लेट को 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर ठंडा होने दें।
    6. अगले कुएं में 1 एमएल पीबी जोड़ें और अनुभागों को इस कुएं में स्थानांतरित करें। 20 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    7. अगले कुएं में 500 μL BB जोड़ें और अनुभागों को इस कुएं में स्थानांतरित करें। 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    8. बीबी में 2 एमएल डब्ल्यूबी जोड़ें और फिर ~ 2 एमएल घोल को बाहर निकालें और कुएं में एक पतला बीबी समाधान छोड़ दें। तब तक दोहराएं जब तक कि अनुभाग स्पष्ट रूप से दिखाई न दें।
    9. बीबी में प्राथमिक एंटीबॉडी (चिकन आईजीवाई एंटी-जीएफपी, 1: 1000) को पतला करें। अगले कुएं में प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 350-500 μL जोड़ें और अनुभागों को इस कुएं में स्थानांतरित करें। प्लेट को पैराफिल्म के साथ सील करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    10. बीबी को डब्ल्यूबी के साथ पतला करें जैसा कि पहले किया गया था जब तक कि अनुभाग स्पष्ट रूप से दिखाई न दें।
    11. अगले कुएं में 1 एमएल डब्ल्यूबी जोड़ें और अनुभागों को इस कुएं में स्थानांतरित करें। 20 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    12. ~ 800-900 μL बफर निकालें और छोड़ दें। 1 एमएल ताजा डब्ल्यूबी जोड़ें और 20 मिनट इनक्यूबेट करें। डब्ल्यूबी के 1 एमएल को कुल 5 वॉश के लिए 4 बार प्रतिस्थापित करें, प्रत्येक 20 मिनट।
    13. बीबी में द्वितीयक एंटीबॉडी (गधे विरोधी चिकन एलेक्सा फ्लोर 488 संयुग्मित, 1: 500) को पतला करें। एक नए कुएं में द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान के 350-500 μL जोड़ें। आरटी पर 45 मिनट से 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: यह सातवां कुआं है, इसलिए यदि 2 से अधिक दिमागों से धुंधला खंड हैं, तो इस बिंदु पर एक नई प्लेट की आवश्यकता होगी।
    14. बीबी को पहले की तरह डब्ल्यूबी के साथ पतला करें और वर्गों को 1 एमएल डब्ल्यूबी से भरे एक नए कुएं में स्थानांतरित करें। अनुभागों को 20 मिनट के लिए 3 बार धोएं।
    15. पीबीएस में DAPI का एक कामकाजी समाधान तैयार करें (अंतिम एकाग्रता 0.04-0.8 μg / mL)। घोल को प्रकाश से बचाएं।
    16. अगले कुएं में 1 एमएल DAPI समाधान जोड़ें और अनुभागों को इस अच्छी तरह से स्थानांतरित करें। ~ 5 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    17. अनुभागों को वापस डब्ल्यूबी में स्थानांतरित करें और आकार 000 पेंटब्रश का उपयोग करके माइक्रोस्कोप स्लाइड पर धीरे से माउंट करें। स्लाइड्स को हवा में सूखने दें।
    18. एक उपयुक्त बढ़ते मीडिया के साथ कवरलिप लागू करें। स्लाइड्स को रात भर अंधेरे में आरटी पर ठीक करने की अनुमति दें।

5. एन्हांसर गतिविधि के लिए मस्तिष्क ऊतक वर्गों की छवि और विश्लेषण करें।

  1. मस्तिष्क अनुभाग को फैलाने वाली प्रतिदीप्ति छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए कम आवर्धन (5x) उद्देश्य लेंस का उपयोग करें।
  2. इंजेक्शन साइट का पता लगाएं और लाल फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के घनत्व और तीव्रता के आधार पर वायरस पारगमन की सीमा का मूल्यांकन करें। उन जानवरों की तुलना करने का ध्यान रखें जिन्हें समान रूप से ट्रांसड्यूस किया गया था।
  3. यदि वांछित हो तो उच्च आवर्धन उद्देश्य लेंस (≥25x) के साथ विस्तृत फ्लोरोसेंट छवियों को रिकॉर्ड करें।
    नोट: हमेशा अधिग्रहण मापदंडों जैसे उत्तेजना प्रकाश तीव्रता, फिल्टर और नमूनों के बीच एक्सपोजर समय के लिए समान सेटिंग्स का उपयोग करना सुनिश्चित करें जिनकी तुलना की जानी है।
  4. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवियों को संसाधित करें।
    नोट: प्रसंस्करण किसी भी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज में किया जा सकता है। निम्नलिखित चरण यह निर्धारित करने के लिए सुझाव हैं कि क्या कोई अनुक्रम इमेजजे के ओपन-सोर्स फिजी वितरण का उपयोग करके रिपोर्टर निर्माण संदर्भ (हां या नहीं प्रश्न) में एक एन्हांसर के रूप में कार्य करता है। एन्हांसर वेरिएंट के बीच गतिविधि की डिग्री की तुलना करते समय अधिक गहराई से फोटोमेट्री उपयुक्त हो सकती है। तुलना करने के लिए विभिन्न नमूनों से छवियों को हमेशा लगातार संसाधित किया जाना चाहिए।
    1. शोर कम करने के लिए फ़िल्टर लागू करें. फिजी में प्रक्रिया > शोर मेनू के तहत डेस्पेकल विकल्प का चयन करें।
      नोट: यह एक 3 x 3 माध्य फ़िल्टर है।
    2. चरण 5.4.3-5.4.6 के बाद पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटाएं।
    3. मल्टीचैनल छवि के चैनलों को अलग करें। फिजी में, छवि > रंग मेनू के तहत स्प्लिट चैनल विकल्प का चयन करें।
    4. छवि के एक क्षेत्र में एक छोटा आकार खींचने के लिए आयत या सर्कल चयन उपकरण का उपयोग करें जिसमें कोई फ्लोरोसेंट कोशिकाएं नहीं हैं और विश्लेषण > माप का उपयोग करके पृष्ठभूमि की औसत पिक्सेल तीव्रता को मापें। कई क्षेत्रों का नमूना लेने के लिए दोहराएं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि औसत ग्रे मान विश्लेषण > माप सेट मेनू में चुना गया है।
    5. पृष्ठभूमि के 5-8 क्षेत्रों से औसत ग्रे मान का औसत निकालें और दशमलव बिंदु को छोड़ दें। गणित > घटाने की प्रक्रिया का उपयोग करके छवि में प्रत्येक पिक्सेल से इस मान > घटाएं।
      नोट: निकटतम पूरी संख्या को गोल करना पृष्ठभूमि को घटाने के लिए अधिक अनुमान लगा सकता है। दशमलव बिंदु को छोड़ना अधिक रूढ़िवादी है। उदाहरण के लिए, 6.4 को 6 तक गोल किया जाएगा, लेकिन प्रत्येक पिक्सेल से वास्तविक सिग्नल की 0.5 इकाइयों को घटाने के जोखिम से बचने के लिए 6.5 को भी गोल किया जाना चाहिए।
    6. यदि वांछित हो, तो चैनलों को वापस एक मल्टीचैनल छवि में विलय करें। फिजी में, मर्ज चैनलों > छवि > रंग का उपयोग करें।
    7. किसी भी अतिव्यापी छवियों को एक साथ सिलाई करें। फिजी में, स्टिचिंग > ग्रिड / संग्रह सिलाई > प्लगइन्स का उपयोग करें।
    8. चमक और विपरीत समायोजित करें। फिजी में, छवि > > चमक / कंट्रास्ट समायोजित करें का उपयोग करें।
      नोट: तुलना करने के लिए प्रत्येक छवि के लिए हमेशा समान न्यूनतम और अधिकतम मानों का उपयोग करें।
    9. चरण 5.4.10-5.4.12 के बाद हरे फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की संख्या की गणना करें। ये वे कोशिकाएं हैं जिनमें उम्मीदवार एन्हांसर अनुक्रम रिपोर्टर अभिव्यक्ति को चलाने में सक्षम था।
    10. हरे रंग के चैनल को छिपाकर शुरू करें और मस्तिष्क के क्षेत्र के चारों ओर एक आकार खींचने के लिए फ्रीफॉर्म चयन उपकरण का उपयोग करें जो लाल प्रतिदीप्ति व्यक्त करता है। फिजी में माप फ़ंक्शन का उपयोग करके, इस क्षेत्र में लाल चैनल के क्षेत्र, एकीकृत घनत्व और औसत ग्रे मूल्य को मापें।
    11. बहु-बिंदु चयन उपकरण का उपयोग करके, इस क्षेत्र में हरी कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
    12. लाल चैनल के एकीकृत घनत्व द्वारा हरी कोशिकाओं की संख्या को सामान्य करें। स्थानीय लाल चैनल चमक वायरस जोखिम के परिमाण के लिए एक प्रॉक्सी उपाय है, जो विभिन्न ट्रांसड्यूस किए गए जानवरों के बीच एन्हांसर गतिविधि की तुलना को सक्षम करता है।

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Representative Results

इन विधियों का उपयोग करते हुए, प्रसवोत्तर माउस मस्तिष्क में एन्हांसर गतिविधि के लिए जीन CACNA1C 19,49,50 के मनोवैज्ञानिक जोखिम से जुड़े तीसरे इंट्रॉन में 915 बीपी अनुक्रम का परीक्षण किया गया था। इस अनुक्रम को मनोवैज्ञानिक और न्यूरोलॉजिकल जोखिम एसएनपी12 पर केंद्रित 345 उम्मीदवार एन्हांसर अनुक्रमों के एमपीआरए में खोजा गया था और लक्षण वर्णन प्रयोगों को यहां एक सामान्य उदाहरण के रूप में वर्णित किया गया है। सी 57बीएल /6 चूहों को एचएसपी 68 न्यूनतम प्रमोटर और एकल उम्मीदवार एन्हांसर अनुक्रम (चित्रा 3 ए) के नियंत्रण में ईजीएफपी युक्त एक स्व-पूरक वेक्टर51 के रूप में पैक किए गए एएवी 9 निर्माण के साथ पी 0 पर इंजेक्ट किया गया था। अतिरिक्त चूहों को संरचनाओं के साथ इंजेक्ट किया गया था जिसमें एक नकारात्मक नियंत्रण अनुक्रम था जिसमें कोई नियामक गतिविधि नहीं होने की भविष्यवाणी की गई थी (चित्रा 3 बी)। इन संरचनाओं के लिए वायरल टिटर्स को 6.85 x 1010 vg / mL तक सामान्यीकृत किया गया था। सभी इंजेक्शन वाले चूहों को संवैधानिक सीएजी प्रमोटर के नियंत्रण में एमआरयूबी 3 युक्त एएवी 9-पैक किए गए निर्माण के साथ सह-इंजेक्शन दिया गया था ताकि उस क्षेत्र की कल्पना की जा सके जिसे सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूस किया गया था और साइट में संभावित परिवर्तनशीलता और संक्रमण के प्रसार के लिए नियंत्रण किया गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इमेजिंग के लिए प्रसवोत्तर दिन (पी) 28 पर मस्तिष्क एकत्र किए गए थे। इन प्रयोगों ने पुष्टि की कि CACNA1C में इस उम्मीदवार एन्हांसर क्षेत्र ने P28 माउस मस्तिष्क (चित्रा 3A) में ईजीएफपी की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया, जबकि एक नकारात्मक नियंत्रण अनुक्रम नहीं था (चित्रा 3 बी)। ये परिणाम माउस मस्तिष्क में एन्हांसर-रिपोर्टर परख के अनुप्रयोग को प्रदर्शित करते हैं, जो उन स्थितियों के दौरान एन्हांसर के अध्ययन मेंसक्षम बनाता है जिन्हें पारंपरिक इन विट्रो मॉडल का उपयोग करके पुन: परिभाषित नहीं किया जा सकता है।

इन विधियों का उपयोग एएवी-आधारित वितरण विधियों का उपयोग करके गतिविधि के लिए उम्मीदवार बढ़ाने वाले अनुक्रमों के पुस्तकालयों का परीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि एमपीआरए में। विभिन्न टिटर्स पर लाइब्रेरी-आधारित रिपोर्टर अभिव्यक्ति की प्रतिनिधि छवियां इस परख के लचीलेपन और पारगमन दक्षता पर वायरल टिटर के प्रभाव को प्रदर्शित करती हैं। उच्च-टिटर (चित्रा 4 ए) बनाम कम-टिटर (चित्रा 4 बी) वायरल तैयारी के परिणामस्वरूप ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं की मात्रा में अंतर होता है, जैसा कि सीएजी प्रमोटर द्वारा संचालित सकारात्मक नियंत्रण एमआरयूबी 3 अभिव्यक्ति और प्रसवोत्तर माउस मस्तिष्क में उम्मीदवार एन्हांसर पुस्तकालयों से उत्पादित ईजीएफपी अभिव्यक्ति दोनों से स्पष्ट है। ऐसी स्थितियां हैं जहां या तो उच्च टिटर और व्यापक पारगमन या कम टिटर और विरल पारगमन को प्राथमिकता दी जा सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का अवलोकन। इस परख के प्रमुख तत्वों में एक उम्मीदवार एन्हांसर तत्व, एक न्यूनतम प्रमोटर, एक रिपोर्टर जीन और, परख डिजाइन के आधार पर, अद्वितीय टैगिंग के लिए एक बारकोड अनुक्रम शामिल है। इन तत्वों को एएवी प्लास्मिड बैकबोन में क्लोन किया जाता है और एएवी में पैक किया जाता है। वायरस जानवर को दिया जाता है और कई दिनों या हफ्तों के लिए इनक्यूबेट करने के लिए छोड़ दिया जाता है। अंत में, रुचि के ऊतक एकत्र किए जाते हैं और इमेजिंग या अनुक्रमण के माध्यम से एन्हांसर गतिविधि का पता लगाया जाता है। एन्हांसर-संचालित ट्रांसजीन अभिव्यक्ति संवैधानिक ड्राइवरों के विपरीत सेल-प्रकार, क्षेत्रीय और लौकिक विशिष्टता के साथ अभिव्यक्ति का उत्पादन कर सकती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: परख डिजाइन में लचीलापन। (ए) प्लास्मिड ओरिएंटेशन रिपोर्टर जीन के न्यूनतम प्रमोटर या डाउनस्ट्रीम के अपस्ट्रीम में एन्हांसर को रख सकता है, जैसा कि STARR-seq28 में है। अनुक्रम-आधारित रीडआउट के लिए, एक बारकोड रिपोर्टर जीन के डाउनस्ट्रीम में शामिल होता है, या एन्हांसर दूसरे अभिविन्यास में अपने स्वयं के बारकोड के रूप में काम कर सकता है। (बी) मस्तिष्क के लिए सामान्य वायरल वितरण तकनीकों में इंट्राक्रैनील इंजेक्शन, रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन या टेल-वेन इंजेक्शन शामिल हैं, जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न ऊतकों में ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं की अलग-अलग घनत्व हो सकती है। (सी) रीडआउट अनुक्रमण-आधारित या इमेजिंग-आधारित हो सकते हैं। अनुक्रमण-आधारित रीडआउट में, एन्हांसर गतिविधि को आरएनए अनुक्रम बनाम इनपुट डीएनए अनुक्रम (एएवी वितरण के लिए नियंत्रण) की सापेक्ष वृद्धि द्वारा परिभाषित किया जाता है। इमेजिंग रीडआउट में, रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है जहां एन्हांसर सक्रिय होता है। (डी) मनोवैज्ञानिक जोखिम से जुड़े जीन CACNA1C में संभावित इनट्रोनिक एन्हांसर पर प्रकाश डाला गया है। शीर्ष छवि में, एक व्यापक क्षेत्र का चयन किया जाता है जो जीडब्ल्यूएएस-परीक्षण लक्षणों और पीएलएसी-सेक20 के माध्यम से सीएसीएनए 1 सी प्रमोटर के साथ बातचीत के लिए मजबूत संबंध दिखाता है। इनसेट में, छोटे उम्मीदवार क्षेत्रों की पहचान की जाती है जो अनुक्रम स्तर पर क्रमिक रूप से संरक्षित होते हैं, खुले क्रोमैटिन के क्षेत्रों में होते हैं, और एन्हांसर के एपिजेनेटिक निशान दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: CACNA1C में एन्हांसर P28 माउस मस्तिष्क में EGFP अभिव्यक्ति को चलाता है। (A) एक माउस को P0 पर एक एन्हांसर-रिपोर्टर निर्माण (scAAV9-Hsp68-EGFP-CACNA1C_3) के साथ इंट्राक्रैनियल रूप से इंजेक्ट किया जाता है और संवैधानिक रूप से व्यक्त इंजेक्शन नियंत्रण (AAV9-CAG-mRuby3) P28 पर कॉर्टेक्स की मध्य-निचली परतों में एन्हांसर-संचालित EGFP अभिव्यक्ति दिखाता है। (बी) एक नकारात्मक नियंत्रण निर्माण (एससीएएवी 9-एचएसपी 68-ईजीएफपी-NEG_4) के साथ पी 0 पर इंजेक्ट किया गया एक माउस पी 28 पर ईजीएफपी की अभिव्यक्ति नहीं दिखाता है। पूरे मस्तिष्क की छवियों को 5x आवर्धन पर लिया गया था और इनसेट बॉक्स किए गए क्षेत्र को देखते हुए ज़ूम-इन दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: विभिन्न टिटर्स के एएवी-वितरित एन्हांसर-रिपोर्टर पुस्तकालय माउस मस्तिष्क में गतिविधि दिखाते हैं। (ए) व्यावसायिक रूप से पैक किए गए, उच्च-टिटर एएवी-पीएचपी.ईबी लाइब्रेरी उम्मीदवार एन्हांसर ्स पी 7 माउस मस्तिष्क में व्यापक ईजीएफपी अभिव्यक्ति चलाता है। (बी) पैकेजिंग कोशिकाओं के वातानुकूलित मीडिया से उपजी उम्मीदवार एन्हांसर की लोअर-टिटर एएवी 9 लाइब्रेरी पी 7 माउस मस्तिष्क में विरल ईजीएफपी अभिव्यक्ति चलाती है। छवियों को 5x आवर्धन पर लिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण
5x प्रतिक्रिया बफर 10 μL
dNTPs प्रत्येक की अंतिम सांद्रता 200 μM
क्लोनिंग प्राइमर प्रत्येक की अंतिम सांद्रता 0.2 μM
टेम्पलेट डीएनए 50 ng
उच्च निष्ठा पोलीमरेज़ 0.02 U/μL की अंतिम सांद्रता
न्यूक्लियस मुक्त पानी 50 μL अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा तक पहुंचने के लिए
थर्मोसाइक्लिंग की स्थिति
निम्नलिखित के 30 चक्र: नोट्स
क़दम तापमान समय
प्रकृति 98 °C 10 s
एनाल 60 °C 20 s प्राइमरों के आधार पर इष्टतम तापमान भिन्न हो सकता है।
पसार 72 °C 30 s पोलीमरेज़ के आधार पर इष्टतम तापमान और अवधि भिन्न हो सकती है।
अंतिम विस्तार 72 °C 2 मिनट पोलीमरेज़ के आधार पर इष्टतम तापमान और अवधि भिन्न हो सकती है।
पकड 4 °C

तालिका 1: पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण और थर्मोसाइक्लिंग की स्थिति।

थर्मोसाइक्लिंग की स्थिति
निम्नलिखित के 30 चक्र: नोट्स
क़दम तापमान समय
सेल लाइसिस 98 °C 5 मिनट
प्रकृति 98 °C 10 s
एनाल 55 °C 15 s प्राइमरों के आधार पर इष्टतम तापमान भिन्न हो सकता है।
पसार 72 °C 30 s पोलीमरेज़ के आधार पर इष्टतम तापमान और अवधि भिन्न हो सकती है।
पकड 4 °C

तालिका 2: कॉलोनी पीसीआर के लिए थर्मोसाइक्लिंग की स्थिति।

इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए बफर
बफ़र संयोजन
1x PBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4
1x साइट्रेट एंटीजन रिट्रीवल बफर (एआरबी), पीएच 6.0 मालिकाना, सामग्री की तालिका देखें
परमेबिलाइजेशन बफर (पीबी) 1x PBS + 0.5% Triton X100
वॉश बफर (WB) 1x PBS + 0.1% Triton X100
ब्लॉकिंग बफर (बीबी) WB + 5% दूध

तालिका 3: इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए बफर।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल प्रसवोत्तर माउस मस्तिष्क में एन्हांसर-संचालित ट्रांसजेन की तैनाती के लिए एक आरएएवी-आधारित विधि का वर्णन करता है। इस सामान्यीकृत प्रोटोकॉल में, एक उम्मीदवार एन्हांसर, एक न्यूनतम प्रमोटर, एक रिपोर्टर जीन और एक वैकल्पिक बारकोड अनुक्रम को एएवी प्लास्मिड बैकबोन में क्लोन किया जाता है। ये प्रयोग एकल उम्मीदवार एन्हांसर अनुक्रम के साथ या समानांतर में कई अनुक्रमों के साथ किए जा सकते हैं। प्लास्मिड को एक आरएएवी में पैक किया जाता है और प्रसवोत्तर माउस मस्तिष्क में पहुंचाया जाता है। वायरस ट्रांसडक्शन की अनुमति देने के लिए समय की अवधि के बाद, मस्तिष्क को रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति के लिए एकत्र और चित्रित किया जाता है। एक संवैधानिक रूप से व्यक्त रिपोर्टर वायरस (CAG-mRuby3) को इंजेक्शन नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया है। इस परख का उपयोग करके, एन्हांसर तत्वों को माउस मस्तिष्क में ईजीएफपी के प्रतिलेखन को चलाने के लिए दिखाया गया है, जो विवो में एन्हांसर गतिविधि का प्रदर्शन करता है।

इस परख के समस्या निवारण और अनुकूलन के लिए प्राथमिक लक्ष्यों में वायरल टिटर, इंजेक्शन तकनीक और पारगमन समय सीमा शामिल हैं। विभिन्न वायरल टिटर्स ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं के घनत्व पर एक मजबूत प्रभाव डाल सकते हैं। जबकि अधिकांश शोध के लिए एक उच्च पारगमन दक्षता बेहतर है, पारगमन का इष्टतम स्तर प्रयोगात्मक लक्ष्यों पर अत्यधिक निर्भर है। इंट्राक्रैनील इंजेक्शन ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं का एक उच्च घनत्व प्रदान करते हैं, लेकिन इंजेक्शन की साइट पर अधिक फोकल होने की संभावना है, हालांकि संक्रमण का प्रसार वायरल सीरोटाइप और जानवरकी उम्र 52 पर निर्भर हो सकता है। रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन पूरे मस्तिष्क में ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं के अधिक वितरण को दिखा सकते हैं लेकिन उच्च संक्रमण के किसी भी क्षेत्र को देने की संभावना कम है। टेल-वेन इंजेक्शन मस्तिष्क के अलावा अन्य ऊतकों को अधिक प्रभावी ढंग से ट्रांसड्यूस कर सकते हैं, लेकिन संभवतः मस्तिष्क में ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं की कम घनत्व देंगे। इसी तरह, मस्तिष्क में वायरस पारगमन के लिए विभिन्न प्रकार के समय-सीमा विभिन्न उद्देश्यों की सेवा कर सकते हैं। मजबूत एससीएएवी अभिव्यक्ति इंट्राक्रैनील इंजेक्शन के सात दिन बाद मस्तिष्क में हो सकती है, हालांकि 28 दिनों या उससे अधिक की अवधि का अधिक आम तौर पर उपयोग किया जाता है और मजबूत अभिव्यक्ति होती है। चूंकि एन्हांसर अपनी गतिविधि में अस्थायी रूप से विशिष्ट हो सकते हैं, इसलिए अध्ययन डिजाइन का निर्धारण करते समय परीक्षण किए गए एन्हांसर की अनुमानित गतिविधि पर विचार करना महत्वपूर्ण है।

इन विधियों से जुड़ी कुछ सीमाएं हैं जो प्रयोगात्मक लक्ष्यों के आधार पर अन्य विकल्पों को अधिक उपयुक्त विकल्प बना सकती हैं। चूंकि एएवी जीनोम में कम एकीकरण प्रदर्शित करते हैं, ऊतकों को परिपक्व होने पर सबसे प्रभावी ढंग से ट्रांसड्यूस किया जाता है और पोस्टमाइटोटिक कोशिकाओं का उच्च घनत्व होता है, क्योंकि निरंतर सेल डिवीजनों की एक बड़ी मात्रा ट्रांसजीन-व्यक्त कोशिकाओं के घनत्व को कम करेगी। एक ट्रांसजीन के वायरल वितरण के लिए, जैसे कि ऊतक जो अभी भी बढ़ रहे हैं, लेंटीवायरस एक अधिक उपयुक्त विकल्प हो सकता है, क्योंकि वे जीनोम में एकीकृत होते हैं और एक ट्रांसड्यूस्ड प्रोलिफ़ेरिंग सेल की सभी बेटी कोशिकाओं द्वारा विरासत में मिलेंगे। इसके अतिरिक्त, जबकि यहां वर्णित रिपोर्टर परख सीआईएस-नियामक गतिविधि के कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है, यह अपने मूल संदर्भ के भीतर नियामक तत्व कैसे कार्य करता है, इसकी पूरी तस्वीर प्रदान नहीं कर सकता है। उदाहरण के लिए, यह परख इस बात की जानकारी प्रदान नहीं करती है कि जीनोम में नियामक तत्व द्वारा किन जीनों को लक्षित किया जा सकता है। हालांकि, अगर एन्हांसर के लक्ष्य जीन ज्ञात हैं, तो इस जानकारी का लाभ यह निर्धारित करने के लिए उठाया जा सकता है कि क्या इस परख में अभिव्यक्ति दिखाने वाले सेल प्रकार एन्हांसर के लक्षित जीन को व्यक्त करने के लिए जाने जाते हैं, जो परिणामों की व्याख्या के लिए उच्च जैविक वैधता प्रदान करेंगे। परख उन प्रभावों को भी पूरी तरह से पुन: परिभाषित नहीं कर सकती है जो आसपास के जीनोमिक अनुक्रम या जानवर की सामान्य जैविक और व्यवहारिक गतिविधि का परीक्षण नियामक तत्व की गतिविधि पर हो सकता है। अंत में, यह प्रोटोकॉल स्टार-सेक रिपोर्टर परख डिजाइन का वर्णन करता है, जिसमें उम्मीदवार एन्हांसर तत्व को ओआरएफ में रिपोर्टर जीन के डाउनस्ट्रीम क्लोन किया जाता है, प्रमोटर के अपस्ट्रीम के विपरीत, जैसा कि पारंपरिक रिपोर्टर परख क्लोनिंग अभिविन्यास में होता है। रिपोर्टर जीन के ओआरएफ में लंबे चर अनुक्रमों को शामिल करने से आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन रूपांकनों, वैकल्पिक स्प्लिस साइटों, या चर जीसी सामग्री 36,53 जैसे कारकों के कारण आरएनए स्थिरता कम हो सकती है, और स्टार-सेक डेटा 54,55 का विश्लेषण करते समय अनुक्रम-आधारित पूर्वाग्रहों के लिए सांख्यिकीय तरीकोंको विकसित किया गया है। इन विचारों के बावजूद, स्टार-सेक एमपीआरए का व्यापक रूप से हाल के वर्षों में सीआईएस-नियामक तत्वों 56,57,58,59 की सफलतापूर्वक पहचान करने के लिए उपयोग किया गया है। यहां वर्णित विधियों को पारंपरिक एमपीआरए अभिविन्यास के साथ उपयोग के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

एन्हांसर की सेल-प्रकार विशिष्टता इस परख को विवो में रुचि के जीन की सेल-प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ति को चलाने में एक शक्तिशाली उपकरण बनाती है। वांछित जीन की सेल-प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए वर्तमान तकनीकों को सशर्त अभिव्यक्ति संरचनाओं की उपलब्धता से सीमित किया जा सकता है या नई ट्रांसजेनिक माउस लाइनों की पीढ़ी की आवश्यकता होती है। आरएएवी-आधारित एन्हांसर-संचालित प्रणाली का उपयोग करके, अभिव्यक्ति13,14,15 को चलाने के लिए मान्य सेल-प्रकार-विशिष्ट एन्हांसर या प्रमोटरों का उपयोग करके रुचि के जीन को स्थानिक रूप से विशिष्ट तरीके से व्यक्त किया जा सकता है। इस तकनीक में हाल के विकास से पता चला है कि कोशिकाओं या रुचि के ऊतकों के लिए ट्रोपिज्म के साथ आरएएवी सीरोटाइप के साथ सेल-प्रकार-विशिष्ट एन्हांसर का संयोजन ट्रांसजेनिक पशु मॉडल60 में ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की समान विशिष्टता दिखा सकता है। यह पशु मॉडल में विवो में ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के अनुक्रम स्क्रीनिंग और विशिष्ट प्रेरण के लिए एक सस्ता, तेज और संभावित रूप से उच्च-थ्रूपुट विधि प्रदान करता है।

इस तकनीक में चिकित्सीय क्षमता भी है। नैदानिक अध्ययनों में पाया गया है कि विवो में ट्रांसजीन की आरएएवी-आधारित डिलीवरी उन मामलों में जीन की स्वस्थ प्रतियों की अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकती है जहां केवल एक दोषपूर्ण प्रति मौजूद है, या जीन को पर्याप्त दर61,62,63 पर स्थानांतरित नहीं किया जा रहा है। ड्राइविंग एन्हांसर तत्व के चयन में सामान्यीकृत वितरण को सक्षम करने की क्षमता है लेकिन सेल-प्रकार-विशिष्ट तरीके से अभिव्यक्ति प्रेरण। अंत में, आरएएवी के माध्यम से ट्रांसजीन वितरित करना भी महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है; एएवी में ट्रांसजीन डिलीवरी64 में अक्सर उपयोग किए जाने वाले अन्य वायरस की तुलना में कम इम्युनोजेनेसिटी होती है, जिससे यह नैदानिक उपयोग के लिए नियोजित होने वाला संभावित रूप से सुरक्षित वायरल वेक्टर बन जाता है।

विवो आरएएवी-आधारित एन्हांसर-रिपोर्टर परख की विशिष्ट तैनाती अनुकूलन योग्य है और प्रयोगात्मक लक्ष्यों की एक श्रृंखला के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है। विभिन्न ऊतकों और कोशिकाओं को एएवी सीरोटाइप या एन्हांसर का चयन करके लक्षित किया जा सकता है जिनमें सेल प्रकार या स्थानिक विशिष्टता होती है। विवो में एक से हजारों एन्हांसर-रिपोर्टर संरचनाओं को वितरित किया जा सकता है, और गतिविधि को कई इमेजिंग- और अनुक्रमण-आधारित रीडआउट का उपयोग करके परख लिया जा सकता है, जैसा कि इस दृष्टिकोण का उपयोग करके अध्ययनों के एक उभरते सेट में दिखाया गया है 15,16,65,66,67,68 . निर्माण डिजाइन और वितरण के लिए विकल्पों की सीमा इस तकनीक को ट्रांसलेशनल और बुनियादी विज्ञान दोनों में विभिन्न प्रकार के उपयोगों के लिए संशोधित करने में सक्षम बनाती है, जिससे यह जीनोमिक्स और तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली नया उपकरण बन जाता है।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

अनुक्रमण यूसी डेविस डीएनए टेक्नोलॉजीज कोर में किया गया था। हम आरएएवी पैकेजिंग पर प्रशिक्षण के लिए यूसी डेविस में लिन तियान की प्रयोगशाला को धन्यवाद देते हैं और उदारतापूर्वक हमें एएवी हेल्पर और रेप / कैप प्लास्मिड उपहार में देते हैं। इस काम को एनआईएच / एनआईजीएमएस आर 35 जीएम 119831 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 181
माउस मस्तिष्क <em>में विवो में</em> एन्हांसर-आधारित अभिव्यक्ति संरचनाओं की एएवी तैनाती
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Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, … More

Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).

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