Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

AAV-distribusjon av Enhancer-baserte uttrykkskonstruksjoner in vivo i musehjerne

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/62650
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

Summary

Denne protokollen beskriver en ny rAAV-basert forbigående enhancer-reporter-analyse. Denne analysen kan brukes til å indusere enhancer-drevet uttrykk in vivo i musehjernen.

Abstract

Enhancers er bindende plattformer for et mangfoldig utvalg av transkripsjonsfaktorer som driver spesifikke uttrykksmønstre av vevs- og celletypespesifikke gener. Flere metoder for å vurdere ikke-kodende DNA og forskjellige kromatintilstander har vist seg å være nyttige for å forutsi tilstedeværelsen av forsterkersekvenser i genomet, men å validere aktiviteten til disse sekvensene og finne organene og utviklingsstadiene de er aktive i, er en arbeidsintensiv prosess. Nylige fremskritt i adeno-assosierte virus (AAV) vektorer har muliggjort utbredt levering av transgener til musevev, noe som muliggjør in vivo enhancer testing uten å nødvendiggjøre et transgent dyr. Denne protokollen viser hvordan en reporterkonstruksjon som uttrykker EGFP under kontroll av en minimal promotor, som ikke driver signifikant uttrykk alene, kan brukes til å studere aktivitetsmønstrene til kandidatforsterkersekvenser i musehjernen. En AAV-pakket reporterkonstruksjon leveres til musehjernen og inkuberes i 1-4 uker, hvoretter dyret ofres, og hjerneseksjoner observeres under et mikroskop. EGFP vises i celler der den testede forsterkeren er tilstrekkelig til å initiere genuttrykk, og identifiserer plasseringen og utviklingsstadiet der forsterkeren er aktiv i hjernen. Standard kloningsmetoder, rimelig AAV-emballasje og utvidelse av AAV-serotyper og metoder for in vivo-levering og standard bildeavlesning gjør dette til en tilgjengelig tilnærming for studiet av hvordan genuttrykk reguleres i hjernen.

Introduction

Enhancers er genomiske cis-regulatoriske elementer som fungerer som transkripsjonsfaktorbindingssteder og kan drive uttrykket av et målgen på en spatiotemporalt spesifikk måte 1,2. De er differensielt aktive i forskjellige celletyper, vev og utviklingsstadier og kan være substrater for sykdomsrisikorelatert genomisk variasjon 3,4. Dermed er behovet for å forstå dynamikken i enhancer-funksjonen avgjørende for fremgang i både translasjonelle og grunnleggende vitenskapelige applikasjoner innen genomikk. I silico spådommer om enhancer aktivitet kan tjene som gode ressurser for å generere hypoteser som til enhancer evne 5,6. Slik forutsagt forsterkeraktivitet kan kreve ytterligere validering og avhør for en full forståelse av den funksjonelle aktiviteten. Enhancer reporter analyser har vist seg verdifulle for dette formålet på tvers av en rekke systemer, fra celler til dyr 7,8,9. Mot å utvide disse studiene i en fleksibel og kostnadseffektiv forbigående in vivo-sammenheng, beskriver denne protokollen bruken av in vivo AAV-baserte metoder for å teste antatte forsterkersekvenser for deres evne til å drive uttrykket av et ektopisk reportergen i den postnatale musehjernen. Denne familien av metoder har nytte for å forhøre enkeltkandidatsekvenser eller parallellbiblioteksscreening og er relevant for grunnleggende og translasjonell forskning.

Denne metoden kombinerer i et enkelt plasmid en antatt forsterkerkandidat-DNA-sekvens med et reportergen (her EGFP), under kontroll av en minimal promotor som alene ikke driver signifikant uttrykk. Plasmidet pakkes i rekombinant AAV (rAAV) og injiseres i en dyremodell. Mens applikasjonen her er til hjernen, muliggjør ulike rAAV-serotyper infeksjon på tvers av forskjellige vevstyper, slik at denne tilnærmingen kan utvides til andre systemer10. Etter en periode kan hjernen samles og analyseres for ekspresjon av reportergenet. Sterkt uttrykk, sammenlignet med kontroller, indikerer at den testede kandidatsekvensen var i stand til å "forbedre" ekspresjonen av genet (figur 1). Denne enkle designen gir en enkel og klar tilnærming til å teste en sekvens for forsterkeraktivitet in vivo i hjernen.

I tillegg til testing for enhancer evne til en sekvens, kan denne metoden kombineres med teknikker for å bestemme celle-type enhancer aktivitet. I sekvensbaserte tilnærminger til å bestemme differensialforsterkeraktivitet kan sortering av celler på celletypespesifikke markører før DNA- og RNA-sekvensering tillate forskere å avgjøre om forskjellige celletyper viser differensialforsterkeraktivitet, som beskrevet i Gisselbrecht et al.11. I bildebaserte tilnærminger tillater sammerking av bilder med celletypespesifikke markører undersøkelse av om celler som viser enhancer-drevet fluorescens også viser celletypemarkører av interesse 12,13,14,15,16. Enhancer reporteranalyser muliggjør direkte testing av risikoassosiert allelisk variasjon i forsterkere for effekter på enhancer-evnen. De aller fleste risikosteder identifisert i genom-wide association studies (GWAS) ligger i ikke-kodende regioner av genomet17. Funksjonelle merknadsstudier av disse risikolokiene indikerer at en stor del sannsynligvis fungerer som forsterkere18,19,20. MPRA-distribusjon in vivo kan tillate testing av disse risikoassosierte variantene for forsterkeraktivitet i hjernen12,21. Endelig kan levering og henting på forskjellige tidspunkter gi innsikt i utviklingsstadiene der en forsterker er aktiv.

Enhancer-reporter plasmid design er mangfoldig og kan tilpasses for å passe eksperimentelle mål. Det finnes flere alternativer for minimal promotorer som har blitt brukt i enhancer forskning, for eksempel den menneskelige β-globin minimal promotor22 og musen Hsp68 minimal promotor23. Disse promotørene er kjent for å drive lave uttrykksnivåer med mindre de kombineres med et forsterkerelement for å aktivere dem. I motsetning til dette driver konstitutive promotorelementer sterkt uttrykk for det transgene, nyttig for positiv kontroll eller for å teste for forsterkerfunksjon mot en bakgrunn av robust uttrykk. Vanlige valg for konstitutive promotorer inkluderer CAG, en hybridpromotor avledet fra kylling β-aktinpromotoren og cytomegalovirus immediate-early enhancer24, eller human EF1α25. Siden forsterkere er kjent for å fungere toveis26, er orienteringen og plasseringen av forsterkeren i forhold til den minimale promotoren fleksibel (figur 2A). Tradisjonelle enhancer-reporter-analyser plasserer forsterkeren oppstrøms for promotoren og, i bibliotekleveranser, inkluderer en strekkodesekvens nedstrøms for reportergenet for å knytte sekvenseringsavlesninger med den testede forsterkeren27. Imidlertid kan forsterkere også plasseres i den åpne leserammen til reportergenet og tjene som sin egen strekkodesekvens, slik det gjøres i STARR-seq28. Protokollen beskrevet her benytter STARR-seq-analysedesignet, og plasserer kandidatforsterkersekvensen i 3 'UTR av reportergenet. Mens STARR-seq-orienteringen gir fordelen av mer strømlinjeformet kloning, er den mindre godt forstått enn den konvensjonelle tilnærmingen og kan indusere variabel RNA-stabilitet mellom konstruksjoner. De beskrevne metodene kan enkelt tilpasses enten STARR-seq eller konvensjonell orientering med mindre endringer i kloningsprosessen som er beskrevet andre steder27,29.

Ulike metoder for AAV-levering kan brukes til å tilpasse denne teknikken ytterligere for å passe eksperimentelle mål (figur 2B). Direkte intrakranielle injeksjoner, beskrevet nærmere i denne protokollen, gir en høy konsentrasjon av virus direkte til hjernen30. Dette gir en høy transduksjonseffektivitet sentrert på injeksjonsstedet, noe som gjør dette til en utmerket teknikk for eksperimenter som ønsker å maksimere tettheten av transducerte celler over et område av vev. Stereotaktisk injeksjon kan bidra til å standardisere injeksjonsstedet på tvers av dyr for reproduserbar lokalisert transduksjon. Intrakraniale injeksjoner er mest enkle hos tidlige postnatale dyr. Som en alternativ teknikk kan systemiske injeksjoner levere transgener ved hjelp av AAV med serotyper som er i stand til å krysse blod-hjernebarrieren31. Tail-vene injeksjoner tillate viruset å sirkulere gjennom hele kroppen, slik at generalisert levering over mange vev10. Retro-orbitale injeksjoner er en annen systemisk injeksjonsteknikk som leverer viruset bak øyet inn i retro-orbital sinus32. Dette gir en mer direkte rute for AAV fra venesystemet til hjernen, noe som resulterer i en høyere konsentrasjon av transducerte celler i hjernen enn injeksjoner i flere perifere blodkar33.

Et annet fleksibelt aspekt ved denne teknikken er metoden for avlesning. I grove trekk kan alternativene beskrives som reporterbaserte eller sekvenseringsbaserte (figur 2C). Inkorporering av en fluorescerende reporter som GFP i den åpne leserammen til konstruksjonen resulterer i uttrykket av det fluorescerende proteinet i noen transducerte celler der kandidatforsterkeren kjørte uttrykk. Merkings- og avbildningsteknikker som immunhistokjemi muliggjør signalforsterkning. Sekvenseringsbaserte avlesningsteknikker innebærer å identifisere sekvenser fra den leverte konstruksjonen i RNA samlet fra vevet. Ved å kvantifisere mengden viralt DNA som opprinnelig ble levert, kan sammenligningen av uttrykt RNA versus levert DNA brukes til å bestemme i hvilken grad en testet forsterkersekvens var i stand til å drive økt uttrykk for transgenet, for eksempel i sammenheng med en massivt parallell reporteranalyse (MPRA). MPRA-er tilbyr en kraftig utvidelse av disse teknikkene for å teste opptil tusenvis av kandidatforsterkere for aktivitet samtidig og har blitt beskrevet omfattende i genomforskning 12,27,34,35,36. Høyere gjennomstrømningsscreening oppnås ved å utføre kloning, pakking, levering og sekvenseringstrinn for kandidatforsterkere i batch i stedet for individuelt.

Valg av kandidatforbedring gir en annen mulighet for fleksibilitet (figur 2D). For eksempel kan denne analysen brukes til å identifisere forsterkere av et bestemt gen, for å fastslå funksjonen til ikke-kodende DNA-regioner av interesse, eller for å bestemme bestemte celletyper eller utviklingsstadier der en forsterker er aktiv - som alle tjener mål både i grunnvitenskap og i sykdomsforskning. Generelt er valg av kandidatforsterker drevet av in silico-spådommer om enhancer-aktivitet. Vanligvis inkluderer silico-prediksjoner ChIP-seq for histonmodifikasjoner som indikerer sannsynlige forsterkere, for eksempel H3K27ac 37 og kromatin tilgjengelighetskartlegging 38. Endelig er et voksende forskningsområde den funksjonsbaserte screeningen av syntetisk utformede forsterkerelementer, noe som muliggjør studier av hvordan forsterkersekvensen styrer funksjon39 og utformingen av forsterkere med spesifikke egenskaper40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen er godkjent av UC Davis Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll #22339) og UC Davis Institutional Biosafety Committee (BUA-R1903). Denne protokollen er testet på C57BL/6J mus av begge kjønn på postnatal dag 0-1.

1. Klon forsterkerkandidatsekvensen til AAV-vektorplasmidet.

MERK: De representative protokollene er gitt, men kloningsstrategien har en høy grad av fleksibilitet.

  1. Velg eller utform en reporterkonstruksjon. Her settes forsterkerkandidaten inn i 3 'uoversatt region (UTR) av EGFP-reportergenet, som uttrykkes under kontroll av Hsp68 minimal promotor.
    MERK: Mange MPRA-plasmidkonstruksjoner som passer for denne analysen, er deponert i Addgene41 og er tilgjengelige for forskningsbruk.
  2. Design PCR-primere for å forsterke en sekvens av interesse. Legg til 5 'enden av primerne den riktige homologiarmen for Gibson-kloning (~ 35 bp som tilsvarer sekvens 5 'oppstrøms for innsettingsstedet, toppstreng for fremoverprimeren og bunnstrengen for omvendt primer).
    MERK: Forsikre deg om at grunngrunnsekvensen er ~ 18-24 bp lang og ~ 50% -60% GC-innhold med en smeltetemperatur på ca. 57-59 ° C.
  3. Utfør PCR fra en DNA-prøve ved hjelp av de designede primerne.
    1. Sett sammen PCR-reaksjonsblandingen i 0,2 ml PCR-rør som beskrevet i tabell 1.
    2. Plasser PCR-reaksjonsmiksen(e) på en termisk syklus og sykle i henhold til programmet nevnt i tabell 1.
    3. Bekreft suksessen til PCR ved å kjøre 5 μL PCR-produkt på en 0,7% -1% agarosegel ved 100 V i 30-60 minutter. Se etter fragmentet av forventet lengde.
    4. Rydd opp i PCR-produktet ved hjelp av et kommersielt enzymatisk reaksjonsoppryddingskolonnesett. Det siste eluatet er kloningsinnsatsen.
  4. Utfør restriksjonsfordøyelsen for å linearisere AAV-vektoren på det unike kloningsstedet for å sette forsterkeren inn i vektoren.
    1. Kloningsstedet i 3 'UTR av enhancer reporter konstruere brukes her er avgrenset av unike PacI og AscI begrensning nettsteder. Utfør en fordøyelse for å linearisere plasmidet på dette stedet i henhold til følgende parametere (trinn 1.4.2-1.4.4).
    2. Fordøye 1-10 μg vektor-DNA ved hjelp av PacI og AscI, avhengig av hvor mange kloningsreaksjoner som trengs. Forbered reaksjonene ved hjelp av den medfølgende bufferen i henhold til produsentens instruksjoner.
    3. Inkuber ved 37 °C i 1-2 timer for å fordøye vektor-DNA. (Hvis du fordøyer mer enn 5 μg i en 50 μL reaksjon, kan lengre inkubasjon være nødvendig.)
    4. Etter 1-2 timers inkubasjon, inaktiver enzymet ved å inkubere ved 65 ° C i 20 minutter.
    5. Separat restriksjonsfordøyelsesfragmentene ved gelelektroforese ved bruk av en 0,7% -1% agarosegel, kjør ved 100 V i 30-60 minutter.
    6. Excise bandet for linearized vektor og rense ved hjelp av en kommersiell gel ekstraksjon kit.
  5. Utfør Gibson-kloningsreaksjoner og transformer
    1. Bestem konsentrasjonen av den rensede vektoren og kloningsinnsatsen ved hjelp av et spektrofotometer.
      MERK: DNA absorberer lys ved 260 nm, mens forurensninger absorberer lys ved 230 nm og 280 nm. Høye forhold (>1,8) på 260/230 og 260/280 indikerer høyt renset DNA.
    2. Monter Gibson-kloningsreaksjoner i 0,2 ml PCR-rør: 5 μL 2x Gibson-masterblanding, 0,02-0,5 pmol DNA-fragmenter i forholdet 3: 1-innsats til vektor (Optimal DNA-konsentrasjon for reaksjonen skal bestemmes empirisk) og Nuclease-fritt vann (ta opp volumet til 10 μL).
    3. Inkuber Gibson-reaksjoner ved 50 °C i 20 minutter i en termisk syklus.
  6. Transform rekombinasjon mangelfull (recA-) kompetent Escherichia coli (E. coli).
    1. Sett et vannbad til 42 °C og tine de kommersielt tilgjengelige kompetente cellene på is.
      MERK: Dette trinnet kan gjøres før trinn 1.4, og cellene kan tine mens de forbereder og inkuberer Gibson-reaksjonen.
    2. Aliquot 30-50 μL celler i 2,0 ml mikrosentrifugerør. Legg til 2 μL Gibson-reaksjon på en aliquot og merk røret med identiteten til Gibson. Inkuber cellene på is i 30 min.
      MERK: Bruk 5-10 ng ufordøyd tom vektor som en positiv kontroll og vann som en negativ kontroll.
    3. Varmesjokk cellene i 42 ° C vannbad i 30-45 s, returner rørene umiddelbart til is, og la dem komme seg i 5 minutter.
    4. Mens du er på is, tilsett 400-950 μL av det kommersielt tilgjengelige gjenopprettingsmediet.
      MERK: Gjenopprettingsmediet som brukes i disse forsøkene inneholder 2% vegetabilsk pepton, 0,5% gjærekstrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 og 20 mM glukose.
    5. Etter utvinning på is, fullstendig gjenopprette cellene ved å inkubere ved 37 ° C med forsiktig omrøring på 250 RPM i 30-60 min.
    6. Pellet cellene ved sentrifugering ved 5000 x g i 5 minutter og fjern 400 μL av supernatanten, og la ~ 50 μL bakterier til plate.
    7. Plate på selektive medier og rug ved 37 °C over natten.
      MERK: Det selektive mediet som brukes i disse forsøkene inneholder 1,0% trypton, 0,5% gjærekstrakt, 1,0% natriumklorid, 1-2% agar, 96-97% vann og karbenicillin i en konsentrasjon på 100 μg / ml. Bruk alltid rekombinasjon mangelfulle bakteriestammer for kloning av virale plasmider fordi de virale inverterte terminale repetisjonene (ITR) har matchende sekvenser og kan gjennomgå homolog rekombinasjon. Imidlertid gjennomgår recA-stammer av bakterier fortsatt lave nivåer av rekombinasjon. Reporterplasmidet som brukes her er en selvkomplementær AAV, der sekvensen til en av ITR-ene er endret og ikke lenger samsvarer perfekt med den andre ITR. Dyrking av bakteriene ved 30 °C anbefales også for ytterligere å redusere hastigheten på homolog rekombinasjon.
  7. Verifiser kloner og gjenopprett plasmider.
    1. Forbered en PCR-masterblanding ved hjelp av fremre og bakoverprimere (materialtabell) som anneal til vektoren, flankerer innsettingsstedet. Aliquot 10 μL volumer i 0,2 ml PCR-striperør.
    2. I 14 ml rundbunnsrør, tilbered 5 ml aliquots av antibiotika selektiv LB-buljong, en for hver koloni blir testet via PCR og negativ kontroll.
    3. Bruk en steril tannpirker eller pipettespiss for å velge en individuell koloni og grovt skrape kolonien ned i bunnen av ett PCR-rør.
    4. Når kolonien har dissosiert inn i PCR-masterblandingen, slipp tannpirkeren eller spissen i en av LB-aliquotene og merk 14 ml røret med Gibson-reaksjonen og PCR-rørnummeret.
    5. Plasser koloniens PCR-reaksjoner på en termisk syklus og sykle med programmet beskrevet i tabell 2.
    6. Inkuber de 5 ml væskekulturene inokulert med tannpirkere eller pipettespisser i en ristende inkubator satt til 37 ° C og 180 RPM.
    7. Kjør koloniens PCR-reaksjoner på en 0,7% -1% agarosegel ved 100 V i 30-60 minutter og visualiser båndene i et gel doc-bildesystem.
    8. Kast bort 5 ml kulturer som ikke viser det forutsagte PCR-båndet.
    9. For hver vellykket integrert klone, la 5 ml kulturer vokse over natten og deretter utføre et plasmid mini prep fra 4,5 ml ved hjelp av et kommersielt sett. Reserver 0,5 ml av væskekulturen og spar ved -80 °C som glyserolmasse.
    10. Bekreft at transgenene i plasmidene er fri for uønskede mutasjoner ved hjelp av Sanger-sekvensering42.
    11. Etter at reporterkonstruksjonen er bekreftet å være vellykket klonet, bruk den lagrede glyserolbestanden til å inokulere en 5 ml startkultur og vokse i 8-16 timer i en ristende inkubator ved 30 ° C og 180 RPM.
    12. Når buljongen er overskyet, fortynn startkulturen 1,000x i 250-300 ml fersk selektiv LB-buljong og inkuber minst over natten i en ristende inkubator ved 30 ° C og 180 RPM. Rens deretter plasmidet ved hjelp av et kommersielt plasmid maxi-sett.
      MERK: Bakterier vil vokse saktere ved 30 ° C sammenlignet med 37 ° C, men dette er den beste temperaturen for å bremse frekvensen av spontan rekombinasjon når man vokser store kulturer.
    13. Utfør et XmaI-sammendrag for å teste for rekombinasjon av ITR-ene ved hjelp av trinn 1.4.2-1.4.5, og erstatt XmaI i stedet for PacI og AscI. Visualiser båndene på et gel doc bildebehandlingssystem.
      MERK: Et rAAV-plasmid med begge ITR-ene tilstede vil gi to bånd på en gel etter denne fordøyelsen: en lengden på rAAV-genomet og den andre lengden på resten av plasmidryggraden. Hvis det bare er ett bånd, har ITR-ene gjennomgått homolog rekombinasjon, og rAAV-plasmidet vil ikke være i stand til å pakke viruspartikler. RAAV-plasmid-ryggraden beskrevet her er utformet slik at XmaI-steder bare forekommer i ITR-ene. Hvis enhancer-kandidatinnsatsen også inneholder noen XmaI-nettsteder, må du oppdatere de forventede båndresultatene og analysen deretter.

2. Få pakket rAAV.

  1. Bruk pakket rAAV (profesjonelt eller internt) for eksperimentene i denne studien.
    MERK: Det er mange alternativer for å pakke en rAAV. En rAAV kan være profesjonelt pakket på et selskap eller et universitet kjernefasilitet. rAAV kan også pakkes internt ved hjelp av forskjellige teknikker som varierer i kompleksitet og behov for spesialutstyr43,44. Den primære bekymringen er å skaffe en vektor som er av høy kvalitet og at den smittsomme titeren er bestemt med høy grad av sikkerhet. Både profesjonelt pakkede og interne pakkede rAAV-er ble brukt til forskjellige eksperimenter beskrevet i denne studien.

3. Intrakranialt injiser rAAV-pakket plasmid i neonatale mus.

  1. Forbered rAAV-blandingen for levering.
    1. Hvis hensikten er å sammenligne uttrykksmønstrene mellom forskjellige enhancer reportervirus, utjevne titerne av alle virus som skal sammenlignes ved å fortynne alle for å matche det minst konsentrerte viruset.
    2. Bland sammen et 2: 1 eller 3: 1-forhold mellom enhancer reportervirus og konstitutivt uttrykt kontrollreportervirus og legg til en liten mengde (0,06% sluttkonsentrasjon) av Fast Green-fargestoff.
      MERK: Fast Green er et fargestoff som brukes mye i injeksjoner av forsøksdyr, inkludert med AAV, for å visualisere injeksjonsstedet under og umiddelbart etter prosedyren45,46,47,48. Selv om dette er et viktig kvalitetssikringstrinn, er det mulig at tilsetning av fargestoff kan forstyrre transduksjon. Å revurdere bruken av injeksjonsvæske kan være viktig for protokolloptimalisering i visse tilfeller. Det konstitutivt drevne kontrollviruset er helt avgjørende for å sammenligne uavhengige injeksjoner. Virusinjeksjoner vil variere i sted og omfang av transduksjon fra dyr til dyr. Den konstitutive kontrollen vil gjøre det mulig å ekskludere mislykkede injeksjoner fra analyse og gi en standard for normalisering av variasjon i viruslevering.
    3. Bryt spissen av en steril trukket glasspipette laget av et μL-gradert kapillærrør ved å stikke det forsiktig gjennom en delikat tørk sterilisert ved å bløtlegge den i 70% etanol og la den tørke helt. Sett deretter den trukket glasspipetten inn i aspiratorenheten som består av en enhet for påføring av trykk koblet til 15-tommers lang gummislange som slutter med en gummipakning for å holde en mikrokapillær pipette.
      MERK: "Enheten for påføring av trykk" kan være en sprøyte eller et munnstykke. Hvis en sprøyte skal brukes, vil en annen person bli pålagt å legge trykk gjennom sprøyten mens forsøkspersonen manipulerer pipetten i den ene hånden og dyret i den andre. Hvis du bruker et munnstykke, slik at eksperimentøren får fin kontroll over både dyrets og pipettens posisjoner og trykket som påføres sprøyten, er det nødvendig med ekstra forsiktighet for å unngå virusforurensning.
    4. Påfør negativt trykk gjennom aspiratorenheten for å trekke et lite volum (~ 0,2-0,5 μL) mineralolje inn i glasspipetten.
      MERK: Dette trinnet er svært viktig for å gi en barriere for å forhindre aerosoliserte viruspartikler fra å forurense aspiratorenheten.
    5. Sett den forberedte aspiratorenheten til side og hold viruset på is til det er klart til å injisere.
  2. Kryobedøvelse av nyfødte mus i en tørr plastskål delvis nedsenket i is til opphør av pedaluttaksrefleksen (~ 5 min). Sørg for at musene ikke er i direkte kontakt med isen.
  3. Bruk negativt trykk gjennom aspiratorenheten for å trekke virusblandingen inn i den trukket glasspipetten til menisken passerer 2 μL-merket.
  4. Fjern musen fra kjølekammeret og plasser den på benken. Lokaliser de bilaterale injeksjonsstedene midtveis mellom lambda og bregma og midtveis mellom sagittal sutur og hvert øye. Desinfiser begge områdene med en spritserviett.
  5. Bruk den trukket glasspipetten til å stikke hull i skallen til de nyfødte musene og forsiktig påfør positivt trykk gjennom aspiratorenheten når nålen kommer inn i hjernen. Se menisken av virusblandingen. Motstand mot trykket som påføres vil avta når pipettens spiss når lateral ventrikel. Dispenser 1 μL av viruset, trekk pipetten og gjenta for den andre laterale ventrikkelen.
  6. Plasser musen på en varmepute eller et varmekammer for å komme seg. Når det er våkent og aktivt, returner dyret til hjemmeburet.

4. Samle vev og utfør immunhistokjemi.

  1. Etter tilstrekkelig tid etter virustransduksjon, bedøve musene og ofre ved transkardial perfusjon.
    MERK: Mange eksperimenter, inkludert de representative resultatene som vises her, tillater en periode på 4 uker eller lenger for viruset å overføre. Imidlertid kan selvkomplementerende AAV-er vise sterkt uttrykk så tidlig som 7 dager12. Den ønskede inkubasjonsperioden må kanskje optimaliseres avhengig av spesifikke eksperimentelle teknikker og mål.
    1. Klargjør en peristaltisk pumpe med intravenøs infusjonsslange og en 25 G kanyle.
    2. Forbered 1x PBS og 4% paraformaldehyd (PFA) og legg dem på is.
    3. Plasser inntaksenden av slangen i den iskalde 1x PBS. Still inn strømningshastigheten (2,5 ml/min for P7-mus, 3,5 ml/min for P28-mus) og kjør pumpen til bufferen trekkes helt gjennom slangen og er tømt for bobler. Sett nålen til side til klar for perfusjon.
    4. Inne i en avtrekkshette pipetter du et lite volum isofluran på et papirhåndkle i bunnen av et dråpeglasskammer. Plasser musen som tidligere er injisert på en rist over papirhåndkleet, slik at den ikke kommer i direkte kontakt med isofluranen. Forsegl kammeret for å bedøve musen. Vent i ~ 5 min og åpne deretter kammeret og se etter en pedaluttaksrefleks. Fortsett når dyret er bevisstløs.
      MERK: Gjennom hele perfusjonen bør musen holdes på isofluran med en nesekjegle for å hindre at bevisstheten gjenvinnes.
    5. Bruk kirurgisk saks for å åpne magen og brystet på musen, fjern ribbe buret og utsett hjertet.
    6. Bruk et par iris mikrosaks for å lage et lite snitt i musens høyre atrium, sett IV-nålen inn i venstre ventrikel og aktiver den peristaltiske pumpen.
    7. Perfuse dyret med iskald 1x PBS til blodet skyller ut av snittet i høyre atrium går klart. Å rydde vevet av blod er svært viktig fordi røde blodlegemer har autofluorescens, og blodkar kan svekke evnen til å avbilde reporteruttrykkende celler.
    8. Sett den peristaltiske pumpen på pause og flytt inntaksslangen fra PBS til 4 % PFA. Aktiver pumpen på nytt og bruk 1 ml/g kroppsvekt, ~25 ml for en voksen mus.
      MERK: Fikseringsskjelvinger skal kunne observeres, og musens kropp skal stivne.
  2. Dissekere og post-fikse hjernen.
    1. Fjern musens hode med kirurgisk saks.
    2. Bruk liten kirurgisk saks, start ved bunnen av skallen og gjør et snitt langs midtlinjen av hodet og trekk tilbake huden og underliggende vev for å eksponere skallen.
    3. Bruk irissaks, klipp forsiktig baksiden av skallen, start ved foramen magnum og fortsett opp mot og langs sagittal suturen til olfaktoriske pærer er passert.
    4. Sett saksen inn i skallen over olfaktoriske pærer og gjør to horisontale kutt i skallen. Lag et lignende par horisontale kutt i occipitalbenet. De horisontale kuttene og midtlinjekuttene skaper et par dørlignende klaffer i toppen av skallen.
    5. Skrell av klaffene på skallen for å eksponere hjernen fullt ut. Bruk en pinsett til å kutte olfaktoriske pærer fra skallen og å kutte kranialnervene, frigjøre hjernen fra skallen.
    6. Slipp hjernen i et 15 ml konisk rør med 3-5 ml 4% PFA i PBS. Post-fix 6 timer til over natten. Ikke fest vevet for mye.
  3. Forbered hjernen for kryoseksjonering.
    1. Overfør den faste hjernen til et nytt 15 ml konisk rør med 12-14 ml 30% sukrose i PBS for dehydrering. Inkuber ved 4 °C til hjernen synker til bunnen av røret (2-3 dager).
    2. Senk den faste og dehydrerte hjernen i optimal skjæretemperatur (OCT) forbindelse i en 15 mm x 15 mm x 5 mm kryomm. Tilsett OCT til hjernen er helt dekket.
    3. Legg kryommas på en blokk med tørris og frys prøven i en fast blokk med OCT (~ 5 min).
      MERK: OCT-blokker kan lagres ved -80 °C i måneder til år.
    4. Merk kryommet med prøvenavnet og orienteringen av hjernen.
  4. Oppnå koronale seksjoner ved hjelp av en cryostat mikrotom.
    1. Merk orienteringen av hjernen på OCT-blokken i blyant og fjern blokken fra kryommen inne i kryostat.
    2. Plasser OCT-blokken slik at hjernen er orientert med olfaktoriske pærer som vender mot kryostatbladet og fest blokken til objektholderen til kryostat med litt frisk OCT.
    3. Når den er frosset på plass, begynner du å kutte 50 μm seksjoner gjennom blokken ved å følge trinn 4.4.4-4.4.6.
    4. Ikke bruk antirullplaten. Seksjoner vil krølle seg i tette ruller når de kuttes og vil samle seg enten på toppen av blokken eller falle under i et oppsamlingsbrett.
    5. Se formen på blokken i de første kuttene som er laget. Gjør vertikale kutt gjennom blokken, og produser et jevnt ansikt når du begynner å kutte. Juster vinkelen ved hjelp av prøvejusteringsarmene om nødvendig.
    6. Når de olfaktoriske pærene er synlige, vær oppmerksom på formen på seksjonene. Hvis den ene virker større enn den andre, er kuttene i en vinkel i forhold til hjernen, og det er nødvendig å rette orienteringen av hjernen mot bladet ved hjelp av prøvejusteringsarmene.
      MERK: Hvis du kutter rett, bør cortex begynne å vises over hver olfaktorisk pære samtidig.
    7. Når den olfaktoriske pæren er seksjonert og rostral hjernevev er synlig, reduser skjæretykkelsen til 30-35 μm og begynn å samle de flytende seksjonene. Følg trinn 4.4.8-4.4.13 for å seksjonere hjernen.
    8. Børst alle tidligere seksjoner av blokken og objektholderen slik at de faller ned i oppsamlingsbrettet. Børst dem av til den ene siden av skuffen og hold dem atskilt. Hvis haugen er for stor, tøm skuffen.
    9. Dispenser 1 ml PBS i hver brønn i en 24-brønnplate. Merk 1 rad for hver hjerne.
    10. Klipp 6 koronale seksjoner. Hent seksjonene ved hjelp av kald pinsett og ordne dem på kryostatstadiet. Gjenta dette trinnet 2 eller 3 ganger, og hold gruppene med 6 seksjoner atskilt.
    11. Fukt en pensel i størrelse 000 med PBS og legg bort overflødig væske på et lofritt vev eller papirhåndkle. Bruk penselen til å forsiktig plukke opp hver seksjon, en om gangen, og plasser den i de riktige brønnene på 24-brønnplaten.
    12. Plasser en av de 6 seksjonene fra gruppen av skiver i hver av de 6 brønnene på rad av 24-brønnplaten. Dette sikrer at hver brønn inneholder representative seksjoner som spenner over det seksjonerte området av hjernen.
    13. Fortsett seksjonering i grupper på 6 til den kaudale enden av hjernebarken er seksjonert.
    14. For oppbevaring, forsegl 24-brønnplaten med parafilm og oppbevar ved 4 °C.
      MERK: Seksjonene er stabile i 1-2 måneder ved 4 °C. En PBS-løsning med 0,1% natriumazid kan brukes til å hemme bakterievekst og forlenge holdbarheten til seksjonene. Men hvis seksjonene skal oppbevares i mer enn 2 måneder, bør de plasseres i kryobeskyttende oppløsning og fryses ved -20 °C for best resultat.
  5. Utfør immunhistokjemi for reportergensignalforsterkning.
    MERK: Alle trinn unntatt antigenuthenting skal utføres ved bruk av mild til moderat omrøring (~ 100 RPM) på en orbital shaker. For å bevare innebygd fluorescens av kontrollreporteren (mRuby3), bør alle trinn beskyttes mot lys så mye som mulig.
    1. Forbered nødvendige buffere som beskrevet i tabell 3.
    2. Forbered en ny 24 brønnplate med en rad for hver hjerne som blir farget. I den første kolonnen av brønner, legg til 1 ml PBS til hver brønn.
    3. Bruk en størrelse 000 pensel, overfør forsiktig 1 brønn med seksjoner fra den opprinnelige samlingsbrønnen til den friske PBS i den nye 24-brønnplaten for rask skylling for å fjerne gjenværende OCT-forbindelse.
    4. Legg til 1 ml ARB til neste brønn i 24 brønnplate og overfør seksjoner til denne brønnen. Inkuber i en ovn ved 60 °C i 1 time.
    5. La platen avkjøles ved romtemperatur (RT) i 20 minutter.
    6. Legg til 1 ml PB til neste brønn og overfør seksjonene til denne brønnen. Inkuber ved RT i 20 min.
    7. Tilsett 500 μL BB til neste brønn og overfør seksjonene til denne brønnen. Inkuber ved RT i 1 time.
    8. Tilsett 2 ml WB til BB og pipette deretter ut ~ 2 ml oppløsning og kast, og la en fortynnet BB-oppløsning ligge i brønnen. Gjenta til seksjonene er godt synlige.
    9. Fortynn det primære antistoffet (Chicken IgY anti-GFP, 1:1000) i BB. Tilsett 350-500 μL primær antistoffløsning til neste brønn og overfør seksjonene til denne brønnen. Forsegl platen med parafilm og rug ved 4 °C over natten.
    10. Fortynn BB med WB som gjort tidligere til seksjonene er tydelig synlige.
    11. Legg til 1 ml WB til neste brønn og overfør seksjonene til denne brønnen. Inkuber ved RT i 20 min.
    12. Fjern ~800-900 μL buffer og kast. Tilsett 1 ml fersk WB og rug 20 min. Bytt ut 1 ml WB 4 ganger til for totalt 5 vasker, 20 minutter hver.
    13. Fortynn det sekundære antistoffet (Donkey anti-kylling Alexa Fluor 488 konjugert, 1:500) i BB. Tilsett 350-500 μL av den sekundære antistoffløsningen til en ny brønn. Inkuber ved RT i 45 minutter til 1 time.
      MERK: Dette er den syvende brønnen, så hvis du flekker seksjoner fra mer enn 2 hjerner, vil det være behov for en ny plate på dette tidspunktet.
    14. Fortynn BB med WB som tidligere og overfør seksjonene til en ny brønn fylt med 1 ml WB. Vask seksjonene som gjort tidligere i 20 min 3 ganger.
    15. Forbered en arbeidsløsning av DAPI i PBS (endelig konsentrasjon 0,04-0,8 μg / ml). Beskytt løsningen mot lys.
    16. Tilsett 1 ml DAPI-løsning til neste brønn og overfør seksjonene til denne brønnen. Inkuber ved RT i ~ 5 min.
    17. Overfør seksjonene tilbake til WB og monter forsiktig på mikroskoplysbilder ved hjelp av en størrelse 000 pensel. La lysbildene lufttørke.
    18. Påfør deksler med et passende monteringsmedium. Tillat lysbilder å kurere på RT i mørket over natten.

5. Bilde og analyser hjernevevsseksjoner for forsterkeraktivitet.

  1. Bruk en objektivlinse med lav forstørrelse (5x) for å ta fluorescensbilder som spenner over hjerneseksjonen.
  2. Finn injeksjonsstedet og evaluer omfanget av virustransduksjonen basert på tettheten og intensiteten av røde fluorescerende celler. Pass på å sammenligne dyr som ble transdusert på samme måte.
  3. Ta detaljerte fluorescerende bilder med et objektiv med høyere forstørrelse (≥25x) hvis ønskelig.
    MERK: Sørg alltid for å bruke de samme innstillingene for innsamlingsparametere som eksitasjonslysintensitet, filtre og eksponeringstid mellom prøver som skal sammenlignes.
  4. Behandle bildene ved hjelp av bildeanalyseprogramvare.
    MERK: Behandling kan gjøres i hvilken som helst programvarepakke for bildeanalyse. Følgende trinn er forslag for å avgjøre om en sekvens fungerer som en forsterker i reporterkonstruksjonskonteksten (et ja eller nei-spørsmål) ved hjelp av FIJI-distribusjonen av ImageJ med åpen kildekode. Mer dyptgående fotometri kan være hensiktsmessig når man sammenligner aktivitetsgrader mellom enhancer-varianter. Bilder fra forskjellige prøver bør alltid behandles konsekvent for å bli sammenlignet.
    1. Bruk filtre for å redusere støy. I Fiji velger du Despeckle-alternativet under menyen Process > Noise .
      MERK: Dette er et 3 x 3 median filter.
    2. Trekk bakgrunnsfluorescens ved å følge trinn 5.4.3-5.4.6.
    3. Skill kanalene i et flerkanalsbilde. På Fiji velger du alternativet Del kanaler under menyen Bilde > farge .
    4. Bruk verktøyet for valg av rektangel eller sirkel til å tegne en liten form i et område av bildet som ikke har fluorescerende celler, og mål den gjennomsnittlige pikselintensiteten i bakgrunnen ved hjelp av Analyse > Measure. Gjenta for å prøve flere områder.
      MERK: Kontroller at Middelgråverdi er valgt på menyen Analyser > Angi mål .
    5. Gjennomsnittlig gråverdi fra 5–8 bakgrunnsområder, og slipp desimaltegnet. Trekk denne verdien fra hvert bildepunkt i bildet ved hjelp av Process > Math > Subtraher.
      MERK: Avrunding til nærmeste hele tall kan overvurdere bakgrunnen for å trekke fra. Det er mer konservativt å bare droppe desimaltegnet. For eksempel vil 6,4 avrundes ned til 6, men 6,5 bør også avrundes ned til 6 for å unngå risikoen for å trekke 0,5 enheter reelt signal fra hver piksel.
    6. Hvis du vil, kan du slå sammen kanalene tilbake til et flerkanalsbilde. På Fiji bruker du Image > Color > Merge Channels.
    7. Sy eventuelle overlappende bilder sammen. På Fiji bruker du Plugins > Stitching > Grid/Collection-sømmer.
    8. Juster lysstyrke og kontrast. I Fiji bruker du Image > Adjust > Brightness/Contrast.
      MERK: Bruk alltid de samme minimums- og maksimumsverdiene for hvert bilde som skal sammenlignes.
    9. Tell antall grønne fluorescerende celler ved å følge trinn 5.4.10-5.4.12. Dette er cellene der kandidatforsterkersekvensen var i stand til å drive reporteruttrykk.
    10. Start med å skjule den grønne kanalen og bruk frihåndsvalgverktøyet til å tegne en form rundt hjerneområdet som uttrykker rød fluorescens. Ved hjelp av Mål-funksjonen på Fiji måler du området, integrert tetthet og gjennomsnittlig gråverdi for den røde kanalen i denne sonen.
    11. Bruk flerpunktsmarkeringsverktøyet til å telle antall grønne celler i denne sonen.
    12. Normaliser antall grønne celler ved den integrerte tettheten til den røde kanalen. Den lokale røde kanallysstyrken er et proxy-mål for størrelsen på viruseksponering, noe som gjør det mulig å sammenligne forbedrende aktivitet mellom forskjellige transducerte dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av disse metodene ble en 915 bp-sekvens i den psykiatriske risikoassosierte tredje intronen av genet CACNA1C19,49,50 testet for forsterkeraktivitet i den postnatale musehjernen. Denne sekvensen ble oppdaget i en MPRA på 345 kandidatforsterkersekvenser sentrert på psykiatrisk og nevrologisk risiko SNPs12, og karakteriseringseksperimenter er beskrevet her som et generelt eksempel. C57BL/6 mus ble injisert ved P0 med en AAV9-konstruksjon pakket som en selvkomplementær vektor51 inneholdende EGFP under kontroll av Hsp68 minimal promotor og en enkelt kandidatforsterkersekvens (figur 3A). Ytterligere mus ble injisert med konstruksjoner som inneholdt en negativ kontrollsekvens som ble spådd å ikke ha noen regulatorisk aktivitet (figur 3B). Virale titere for disse konstruksjonene ble normalisert til 6,85 x 1010 vg/ml. Alle injiserte mus ble co-injisert med en AAV9-pakket konstruksjon som inneholder mRuby3 under kontroll av den konstitutive CAG-promotoren for å visualisere området som ble vellykket transdusert og kontrollere for potensiell variasjon på stedet og spredning av infeksjon. Hjerner ble samlet inn på barseldagen (P)28 for immunhistokjemi og bildediagnostikk. Disse eksperimentene bekreftet at denne kandidatforsterkerregionen i CACNA1C kjørte uttrykk for EGFP i P28 musehjerne (figur 3A), mens en negativ kontrollsekvens ikke gjorde det (figur 3B). Disse resultatene viser anvendelsen av enhancer-reporter-analyser i musehjernen, noe som muliggjør in vivo studier av forsterkere under forhold som ikke kan rekapituleres ved hjelp av tradisjonelle in vitro-modeller.

Disse metodene kan også brukes til å teste biblioteker med kandidatforsterkersekvenser for aktivitet ved hjelp av AAV-baserte leveringsmetoder, for eksempel i MPRAer. Representative bilder av bibliotekbasert reporteruttrykk ved forskjellige titere demonstrerer fleksibiliteten til denne analysen og effekten av viral titer på transduksjonseffektivitet. Høytiter (figur 4A) versus lavtiter (figur 4B) virale preparater resulterer i forskjeller i mengden transducerte celler, noe som fremgår av både positivt kontroll mRuby3-uttrykk drevet av en CAG-promotor og EGFP-uttrykk produsert fra kandidatforsterkerbibliotekene i postnatal musehjerne. Det finnes situasjoner der enten høy titer og bred transduksjon eller lav titer og sparsom transduksjon kan foretrekkes.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over protokollen. Nøkkelelementer i denne analysen inkluderer et kandidatforsterkerelement, en minimal promotor, et reportergen og, avhengig av analysedesign, en strekkodesekvens for unik merking. Disse elementene er klonet inn i en AAV-plasmid-ryggrad og pakket inn i AAV. Viruset leveres til dyret og får inkubere i flere dager eller uker. Til slutt samles vevet av interesse og forsterkeraktiviteten fastslås via avbildning eller sekvensering. Enhancer-drevet transgenuttrykk kan produsere uttrykk med celletype, regional og tidsmessig spesifisitet, i motsetning til konstitutive drivere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Fleksibilitet i analysedesign . (A) Plasmidorientering kan plassere forsterkeren oppstrøms for den minimale promotoren eller nedstrøms for reportergenet, som i STARR-seq28. For sekvensbaserte avlesninger er en strekkode inkludert nedstrøms for reportergenet, eller forsterkeren kan fungere som sin egen strekkode i den andre retningen. (B) Vanlige virale leveringsteknikker til hjernen inkluderer intrakranielle injeksjoner, retro-orbitale injeksjoner eller haleveneinjeksjoner, noe som kan resultere i forskjellige tettheter av transducerte celler i forskjellige vev. (C) Avlesninger kan være sekvenseringsbaserte eller bildebaserte. I sekvenseringsbaserte avlesninger er forsterkeraktivitet definert av en relativ økning av RNA-sekvens versus inngangs-DNA-sekvens (kontrollerende for AAV-levering). I avlesninger økes uttrykket av reportergenet der forsterkeren er aktiv. (D) Potensielle introniske forsterkere i det psykiatriske risikoassosierte genet CACNA1C er uthevet. I det øverste bildet er det valgt et bredt område som viser sterke assosiasjoner til GWAS-testede egenskaper og interaksjoner med CACNA1C-promotoren via PLAC-seq20. I innfellingen identifiseres mindre kandidatregioner som er evolusjonært bevart på sekvensnivå, er i områder med åpen kromatin og viser epigenetiske merker som indikerer forsterkere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Enhancer i CACNA1C driver EGFP-uttrykk i P28 musehjerne. (A) En mus injisert intrakranialt ved P0 med en enhancer-reporter-konstruksjon (scAAV9-Hsp68-EGFP-CACNA1C_3) og konstitutivt uttrykt injeksjonskontroll (AAV9-CAG-mRuby3) viser enhancer-drevet EGFP-uttrykk i de midterste nedre lagene av cortex ved P28. (B) En mus injisert ved P0 med en negativ kontrollkonstruksjon (scAAV9-Hsp68-EGFP-NEG_4) og injeksjonskontroll viser ikke uttrykk for EGFP ved P28. Helhjernebilder ble tatt ved 5x forstørrelse og innfelt viser zoomet inn visning av boksområdet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: AAV-leverte enhancer-reporter-biblioteker med forskjellige titere viser aktivitet i musehjernen. (A) Kommersielt pakket, høytiter AAV-PHP.eB bibliotek med kandidatforsterkere driver bredt EGFP-uttrykk i P7 musehjerne. (B) Nedre titer AAV9 bibliotek med kandidatforsterkere utfelt fra betingede medier av emballasjecellene driver sparsomt EGFP-uttrykk i P7 musehjerne. Bildene ble tatt med 5x forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

PCR-reaksjon Mix
5x reaksjon buffer 10 μL
dNTP-er endelig konsentrasjon på 200 μM hver
Kloning primere endelig konsentrasjon på 0,2 μM hver
Mal DNA 50 ng
High fidelity polymerase endelig konsentrasjon på 0,02 U/μL
Nuclease-fritt vann for å nå 50 μL endelig reaksjonsvolum
Thermocycling forhold
30 sykluser av følgende: Notater
Skritt Temperatur Tid
Denaturering 98 °C 10 s
Anneal 60 °C 20 s Optimal temperatur kan variere basert på primere.
Forlenge 72 °C 30 s Optimal temperatur og varighet kan variere basert på polymerase.
Endelig forlengelse 72 °C 2 minutter Optimal temperatur og varighet kan variere basert på polymerase.
Holde 4 °C

Tabell 1: PCR-reaksjonsblanding og termosyklingsforhold.

Thermocycling forhold
30 sykluser av følgende: Notater
Skritt Temperatur Tid
Celle Lysis 98 °C 5 minutter
Denaturering 98 °C 10 s
Anneal 55 °C 15 s Optimal temperatur kan variere avhengig av primere.
Forlenge 72 °C 30 s Optimal temperatur og varighet kan variere avhengig av polymerase.
Holde 4 °C

Tabell 2: Termosyklingsbetingelser for koloni-PCR.

Buffere for immunhistokjemi
Buffer Komposisjon
1x PBS 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4
1x Citrate Antigen Retrieval Buffer (ARB), pH 6,0 Proprietær, se materialtabell
Permeabiliseringsbuffer (PB) 1x PBS + 0,5% Triton X100
Vask buffer (WB) 1x PBS + 0,1% Triton X100
Blokkeringsbuffer (BB) WB + 5% melk

Tabell 3: Buffere for immunhistokjemi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en rAAV-basert metode for distribusjon av enhancer-drevne transgener i den postnatale musehjernen. I denne generaliserte protokollen blir en kandidatforsterker, en minimal promotor, et reportergen og en valgfri strekkodesekvens klonet til en AAV-plasmid-ryggrad. Disse eksperimentene kan gjøres med en enkelt kandidatforsterkersekvens eller med mange sekvenser parallelt. Plasmidet pakkes inn i en rAAV og leveres til den postnatale musehjernen. Etter en periode for å tillate virustransduksjon, blir hjernen samlet og avbildet for reportergenuttrykk. Et konstitutivt uttrykt reportervirus (CAG-mRuby3) inngår som injeksjonskontroll. Ved hjelp av denne analysen vises forsterkerelementer for å drive transkripsjon av EGFP i musehjernen, og demonstrere forsterkeraktivitet in vivo.

De primære målene for feilsøking og optimalisering av denne analysen inkluderer viral titer, injeksjonsteknikk og transduksjonstidsramme. Ulike virale titere kan ha en sterk effekt på tettheten av transducerte celler. Mens en høyere transduksjonseffektivitet sannsynligvis er å foretrekke for de fleste undersøkelser, er det optimale transduksjonsnivået svært avhengig av eksperimentelle mål. Intrakranielle injeksjoner gir en høy tetthet av transducerte celler, men vil sannsynligvis være mer fokale på injeksjonsstedet, selv om spredning av infeksjon kan avhenge av viral serotype og alder av dyret52. Retro-orbital injeksjoner kan vise jevnere fordeling av transducerte celler i hele hjernen, men er mindre sannsynlig å gi noe område med høy infeksjon. Tail-vene injeksjoner kan mer effektivt transdusere andre vev i tillegg til hjernen, men vil trolig gi enda lavere tettheter av transducerte celler i hjernen. På samme måte kan en rekke tidsrammer for virustransduksjon i hjernen tjene forskjellige formål. Robust scAAV-uttrykk kan forekomme i hjernen så tidlig som syv dager etter intrakraniell injeksjon, selv om perioder på 28 dager eller lenger er mer typisk brukt og gir sterkt uttrykk. Siden forsterkere kan være tidsmessig spesifikke i sin aktivitet, er det viktig å vurdere den forventede aktiviteten til de testede forsterkerne når man bestemmer studiedesign.

Det er noen begrensninger knyttet til disse metodene som kan gjøre andre alternativer til et mer passende valg, avhengig av eksperimentelle mål. Siden AAV-er utviser lav integrasjon i genomet, blir vev mest effektivt transdusert når de er modne og det er en høy tetthet av postmitotiske celler, da en stor mengde fortsatte celledelinger vil redusere tettheten av transgene uttrykkende celler. For viral levering av et transgen til en mindre moden modell, for eksempel vev som fortsatt vokser, kan lentivirus være et mer hensiktsmessig valg, da de integreres i genomet og vil bli arvet av alle datterceller i en transducert prolifererende celle. I tillegg, mens reporteranalysen beskrevet her er en mye brukt teknikk for funksjonell studie av cis-regulatorisk aktivitet, kan den ikke gi et komplett bilde av hvordan reguleringselementet fungerer innenfor sin opprinnelige kontekst. For eksempel gir denne analysen ikke informasjon om hvilke gener som kan være målrettet av reguleringselementet i genomet. Men hvis forsterkerens målgener er kjent, kan denne informasjonen utnyttes for å avgjøre om celletypene som viser uttrykk i denne analysen er de samme som de som er kjent for å uttrykke forsterkerens målrettede gener, noe som vil gi høy biologisk gyldighet til tolkningen av resultatene. Analysen kan heller ikke fullstendig rekapitulere effektene som den omkringliggende genomiske sekvensen eller normal biologisk og atferdsmessig aktivitet av dyret kan ha på aktiviteten til det testede regulatoriske elementet. Til slutt beskriver denne protokollen STARR-seq reporter assay design, der kandidatforsterkerelementet er klonet nedstrøms for reportergenet i ORF, i motsetning til oppstrøms for promotoren, som i den konvensjonelle kloningsorienteringen for reporteranalyse. Inkludert lange variable sekvenser i ORF av reportergenet kan forårsake redusert RNA-stabilitet på grunn av faktorer som RNA-bindende proteinmotiver, alternative spleisesteder eller variabelt GC-innhold 36,53, og statistiske metoder er utviklet for å ta hensyn til sekvensbaserte forstyrrelser ved analyse av STARR-seq-data54,55. Til tross for disse hensynene har STARR-seq MPRAer blitt mye brukt de siste årene for å kunne identifisere cis-regulatoriske elementer56,57,58,59. Metodene beskrevet her kan enkelt tilpasses for bruk med konvensjonell MPRA-orientering.

Celletypespesifisiteten til forsterkere gjør denne analysen til et kraftig verktøy for å drive det celletypespesifikke uttrykket av gener av interesse in vivo. Nåværende teknikker for celletypespesifikt uttrykk av et ønsket gen kan begrenses av tilgjengeligheten av betingede ekspresjonskonstruksjoner eller kreve generering av nye transgene muselinjer. Ved hjelp av et rAAV-basert enhancer-drevet system, kan et gen av interesse uttrykkes på en spatiotemporalt spesifikk måte ved å bruke validerte celletypespesifikke forsterkere eller promotorer for å drive uttrykk13,14,15. Nylige utviklinger i denne teknologien har vist at kombinasjon av celletypespesifikke forsterkere med rAAV-serotyper med tropismer for celler eller vev av interesse kan vise lignende spesifisitet av transgenuttrykk som i transgene dyremodeller60. Dette gir en billig, rask og potensielt høy gjennomstrømningsmetode for sekvensscreening og spesifikk induksjon av transgenuttrykk in vivo i dyremodeller.

Denne teknologien har også terapeutisk potensial. Kliniske studier har funnet at rAAV-basert levering av et transgen in vivo kan indusere ekspresjon av friske kopier av et gen i tilfeller der bare en defekt kopi er tilstede, eller genet ikke transkriberes med tilstrekkelig hastighet61,62,63. Valget av et drivende forsterkerelement har potensial til å muliggjøre generalisert levering, men uttrykksinduksjon på en celletypespesifikk måte. Til slutt, å levere transgenet via rAAV gir også betydelige fordeler; AAV har lavere immunogenisitet enn andre virus som ofte brukes i transgen levering64, noe som gjør dette til en potensielt sikker viral vektor som skal brukes til klinisk bruk.

Spesifikk distribusjon av in vivo rAAV-baserte enhancer-reporter-analyser kan tilpasses og kan endres for å passe til en rekke eksperimentelle mål. Ulike vev og celler kan målrettes ved å velge AAV-serotyper eller forsterkere som har celletype eller spatiotemporal spesifisitet. Alt fra en til tusenvis av enhancer-reporter-konstruksjoner kan leveres in vivo, og aktivitet kan analyseres ved hjelp av en rekke bildebehandlings- og sekvenseringsbaserte avlesninger, som det har blitt vist i et fremvoksende sett med studier som bruker denne tilnærmingen 15,16,65,66,67,68 . Utvalget av alternativer for konstruksjonsdesign og levering gjør at denne teknikken kan endres for en rekke bruksområder i både translasjonell og grunnleggende vitenskap, noe som gjør dette til et kraftig nytt verktøy for genomikk og nevrovitenskapsforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Sekvensering ble utført ved UC Davis DNA Technologies Core. Vi takker laboratoriet til Lin Tian ved UC Davis for opplæring på rAAV-emballasje og sjenerøst gifting oss AAV-hjelper og rep / cap plasmider. Dette arbeidet ble støttet av NIH/NIGMS R35GM119831.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Citrate Buffer Sigma-Aldrich C9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Forward primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
5'-gatggctggcaactagaagg-3' Integrated DNA Technologies N/A: Custom designed Reverse primer for verifying clones after transformation. These primers are specific to the vector used and were designed for the specific vector used in our experiments.
Agarose VWR VWRVN605-500G
Aspirator tube assemblies Sigma-Aldrich A5177-5EA for mouth-driven delivery of rAAV
Bacteriological petri dishes Thermo Fisher Scientific 08-757-100D
Carbenicillin Sigma-Aldrich C1389-5G
Chicken IgY anti-GFP Thermo Fisher Scientific A10262
Confocal microscope Zeiss LSM900 The images were taken on the LSM800 model, but Zeiss launched the LSM900 model in recent years to replace LSM800.
Conical centrifuge tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific 12-565-269
Cryomolds Thermo Fisher Scientific NC9806558 These molds are suitable for P28 mouse brain. Other sizes may be more suitable for larger or smaller tissues.
DAPI Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dissecting scissors, 4.5" VWR 82027-578
Donkey anti-chicken AlexaFlour-488 Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Dulbecco's PBS 1x Thermo Fisher Scientific MT21031CV
Eppendorf Microcentrifuge tubes 2.0 mL Thermo Fisher Scientific 22431048
Falcon round-bottom tubes 14 mL Thermo Fisher Scientific 352059
Fast Green dye Grainger F0099-1G
Fine detail paint brush set Artbrush Tower B014GWCLFO
Gibson Assembly Master Mix NEB E2611S
Glass capillary tubes Drummond Scientific Company 5-000-2005
HiSpeed Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12663 Commercial plasmid maxi prep kit
HyClone HyPure Molecular Biology Grade Water VWR SH30538.03
IV butterfly infusion set with 12" tubing and 25G needle Thermo Fisher Scientific 26708
Kimwipes Kimberly Clark 34155 Lint-free wipe
LB Agar Thermo Fisher Scientific BP1425-500 LB agar pre-mix for selective media
McPherson Vannas iris scissor Integra LifeSciences 360-215
Mineral oil Sigma Life Science 69794-500ML
NEB Stable Competent E. coli NEB C3040I
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Takara 740609.5 Kit for enzymatic reaction cleanup and gel extraction
OCT medium VWR 25608-930
Orbital shaker Cole Parmer 60-100
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
PCR strip tubes 0.2 mL VWR 490003-692
Peristaltic pump Gilson F155005
Phosphate buffered saline (PBS) 10x Thermo Fisher Scientific 70011044
Phusion Hot Start II High Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F549L
Powdered milk Sunny Select
ProLong Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific P36934
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28106
rCutSmart Buffer NEB B6004S Buffer for restriction digest with PacI, AscI, and XmaI
Restriction enzyme: AscI NEB R0558L
Restriction enzyme: PacI NEB R0547L
Restriction enzyme: XmaI NEB R0180L
SOC outgrowth medium NEB B0920S Recovery medium after transformation
Sucrose (RNase/DNase free) Millipore Sigma 033522.5KG
TAE buffer Apex 20-194
Transfer tubing Gilson F1179941 For peristaltic pump
Triton X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Thermo Fisher Scientific A1460 Plasmid mini prep kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pennacchio, L. A., et al. In vivo enhancer analysis of human conserved non-coding sequences. Nature. 444 (7118), 499-502 (2006).
  2. Nord, A. S., et al. Rapid and pervasive changes in genome-wide enhancer usage during mammalian development. Cell. 155 (7), 1521-1531 (2013).
  3. Finucane, H. K., et al. Partitioning heritability by functional annotation using genome-wide association summary statistics. Nature Genetics. 47 (11), 1228-1235 (2015).
  4. Nord, A. S., West, A. E. Neurobiological functions of transcriptional enhancers. Nature Neuroscience. 23 (1), 5-14 (2020).
  5. Hallikas, O., et al. Genome-wide prediction of mammalian enhancers based on analysis of transcription-factor binding affinity. Cell. 124 (1), 47-59 (2006).
  6. Su, J., Teichmann, S. A., Down, T. A. Assessing computational methods of cis-regulatory module prediction. PLoS Computational Biology. 6 (12), 1001020 (2010).
  7. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  8. Kvon, E. Z., et al. Genome-scale functional characterization of Drosophila developmental enhancers in vivo. Nature. 512 (7512), 91-95 (2014).
  9. Yáñez-Cuna, J. O., et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features. Genome Research. 24 (7), 1147-1156 (2014).
  10. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Molecular Therapy. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  11. Gisselbrecht, S. S., et al. Highly parallel assays of tissue-specific enhancers in whole Drosophila embryos. Nature Methods. 10 (8), 774-780 (2013).
  12. Lambert, J. T., et al. Parallel functional testing identifies enhancers active in early postnatal mouse brain. eLife. 10, 69479 (2021).
  13. Chen, Y. -J. J., et al. Use of "MGE Enhancers" for labeling and selection of embryonic stem cell-derived medial ganglionic eminence (MGE) progenitors and neurons. PLoS ONE. 8, 61956 (2013).
  14. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses and a transgenic platform for combinatorial cell subclass-specific labeling. bioRxiv. , 525014 (2019).
  15. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  16. Rubin, A. N., et al. Regulatory elements inserted into AAVs confer preferential activity in cortical interneurons. eNeuro. 7, (2020).
  17. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  18. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  19. Ripke, S., et al. Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci. Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).
  20. Nott, A., et al. Brain cell type-specific enhancer-promoter interactome maps and disease-risk association. Science. 366 (6469), 1134-1139 (2019).
  21. Lagunas, T., et al. A Cre-dependent massively parallel reporter assay allows for cell-type specific assessment of the functional effects of genetic variants in vivo. bioRxiv. , (2021).
  22. DeBoer, E., Antoniou, M., Mignotte, V., Wall, L., Grosveld, F. The human beta-globin promoter; nuclear protein factors and erythroid specific induction of transcription. The EMBO journal. 7 (13), 4203-4212 (1988).
  23. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  25. Kim, D. W., Uetsuki, T., Kaziro, Y., Yamaguchi, N., Sugano, S. Use of the human elongation factor 1α promoter as a versatile and efficient expression system. Gene. 91 (2), 217-223 (1990).
  26. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  27. Patwardhan, R. P., et al. High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis. Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).
  28. Arnold, C. D., et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).
  29. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nature Biotechnology. 30, 271-277 (2012).
  30. Kim, J. -Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51863 (2014).
  31. Liu, D., Zhu, M., Zhang, Y., Diao, Y. Crossing the blood-brain barrier with AAV vectors. Metabolic Brain Disease. 36 (1), 45-52 (2021).
  32. Prabhakar, S., Lule, S., Da Hora, C. C., Breakefield, X. O., Cheah, P. S. AAV9 transduction mediated by systemic delivery of vector via retro-orbital injection in newborn, neonatal and juvenile mice. Experimental Animals. , (2021).
  33. Gruntman, A. M., Su, L., Flotte, T. R. Retro-orbital venous sinus delivery of rAAV9 mediates high-level transduction of brain and retina compared with temporal vein delivery in neonatal mouse pups. Human Gene Therapy. 28 (3), 228-230 (2017).
  34. Inoue, F., Ahituv, N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays. Genomics. 106 (3), 159-164 (2015).
  35. Gordon, M. G., et al. lentiMPRA and MPRAflow for high-throughput functional characterization of gene regulatory elements. Nature Protocols. 15 (8), 2387-2412 (2020).
  36. Klein, J. C., et al. A systematic evaluation of the design and context dependencies of massively parallel reporter assays. Nature Methods. 17 (11), 1083-1091 (2020).
  37. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  38. Song, L., Crawford, G. E. DNase-seq: A high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), 5384 (2010).
  39. King, D. M., et al. Synthetic and genomic regulatory elements reveal aspects of Cis-regulatory grammar in mouse embryonic stem cells. eLife. 9, 41279 (2020).
  40. Amit, R., Garcia, H. G., Phillips, R., Fraser, S. E. Building enhancers from the ground up: a synthetic biology approach. Cell. 146, 105-118 (2011).
  41. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307, 1877 (2005).
  42. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology. 94, 441-448 (1975).
  43. Broussard, G. J., Unger, E. K., Liang, R., McGrew, B. P., Tian, L. L. glutamate with genetically encoded fluorescent sensors. Biochemical Approaches for Glutamatergic Neurotransmission. Parrot, S., Denoroy, L. 130, Springer. New York. 117-153 (2018).
  44. Chen, Y. H., Keiser, M. S., Davidson, B. L. Adeno-associated virus production, purification, and titering. Current Protocols in Mouse Biology. 8, 56 (2018).
  45. He, C. X., Arroyo, E. D., Cantu, D. A., Goel, A., Portera-Cailliau, C. A Versatile Method for Viral Transfection of Calcium Indicators in the Neonatal Mouse Brain. Frontiers in Neural Circuits. 12, 56 (2018).
  46. Chen, S. -Y., Kuo, H. -Y., Liu, F. -C. Stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57270 (2018).
  47. Brenowitz, S. D., Regehr, W. G. Presynaptic imaging of projection fibers by in vivo injection of dextran-conjugated calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
  48. Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53628 (2016).
  49. Green, E. K., et al. The bipolar disorder risk allele at CACNA1C also confers risk of recurrent major depression and of schizophrenia. Molecular Psychiatry. 15 (10), 1016-1022 (2010).
  50. Takahashi, S., Glatt, S. J., Uchiyama, M., Faraone, S. V., Tsuang, M. T. Meta-analysis of data from the Psychiatric Genomics Consortium and additional samples supports association of CACNA1C with risk for schizophrenia. Schizophrenia Research. 168 (1-2), 429-433 (2015).
  51. McCarty, D. M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Molecular Therapy. 16 (10), 1648-1656 (2008).
  52. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).
  53. Rabani, M., Pieper, L., Chew, G. -L., Schier, A. F. A massively parallel reporter assay of 3′ UTR sequences identifies in vivo rules for mrna degradation. Molecular Cell. 68, 1083-1094 (2017).
  54. Kim, Y. -S., et al. Correcting signal biases and detecting regulatory elements in STARR-seq data. Genome Research. 31, 877-889 (2021).
  55. Lee, D., et al. STARRPeaker: uniform processing and accurate identification of STARR-seq active regions. Genome Biology. 21, 298 (2020).
  56. Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A., Hawkins, R. D. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nature Communications. 11, 1061 (2020).
  57. Singh, G., et al. A flexible repertoire of transcription factor binding sites and a diversity threshold determines enhancer activity in embryonic stem cells. Genome Research. 31, 564-575 (2021).
  58. Wang, X., et al. High-resolution genome-wide functional dissection of transcriptional regulatory regions and nucleotides in human. Nature Communications. 9, 5380 (2018).
  59. Peng, T., et al. STARR-seq identifies active, chromatin-masked, and dormant enhancers in pluripotent mouse embryonic stem cells. Genome Biology. 21, 243 (2020).
  60. Nair, R. R., Blankvoort, S., Lagartos, M. J., Kentros, C. Enhancer-driven gene expression (EDGE) enables the generation of viral vectors specific to neuronal subtypes. iScience. 23, 100888 (2020).
  61. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65 -mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
  62. Gaudet, D., et al. Efficacy and long-term safety of alipogene tiparvovec (AAV1-LPLS447X) gene therapy for lipoprotein lipase deficiency: an open-label trial. Gene Therapy. 20, 361-369 (2013).
  63. Nguyen, G. N., et al. A long-term study of AAV gene therapy in dogs with hemophilia A identifies clonal expansions of transduced liver cells. Nature Biotechnology. 39, 47-55 (2021).
  64. Nayak, S., Herzog, R. W. Progress and prospects: Immune responses to viral vectors. Gene Therapy. 17 (3), 295-304 (2010).
  65. Visel, A., et al. A high-resolution enhancer atlas of the developing telencephalon. Cell. 152 (4), 895-908 (2013).
  66. Shen, S. Q., et al. Massively parallel cis-regulatory analysis in the mammalian central nervous system. Genome Research. 26 (2), 238-255 (2016).
  67. Shen, S. Q., et al. A candidate causal variant underlying both higher intelligence and increased risk of bipolar disorder. bioRxiv. , (2019).
  68. Hrvatin, S., et al. A scalable platform for the development of cell-type-specific viral drivers. eLife. 8, 48089 (2019).

Tags

Nevrovitenskap utgave 181
AAV-distribusjon av Enhancer-baserte uttrykkskonstruksjoner <em>in vivo</em> i musehjerne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, … More

Warren, T. L., Lambert, J. T., Nord, A. S. AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs In Vivo in Mouse Brain. J. Vis. Exp. (181), e62650, doi:10.3791/62650 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter