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Biochemistry

एक समय में स्थिर स्थानीय संरचना एक α-सिन्यूक्लिन मोनोमर की पहचान करने के लिए समय-संकल्पित प्रोटीन-प्रेरित फ्लोरेसेंस एन्हांसमेंट का उपयोग करना

Published: May 30, 2021 doi: 10.3791/62655
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

समय-हल एकल अणु प्रोटीन प्रेरित फ्लोरेसेंस वृद्धि प्रोटीन में स्थानीय संरचनात्मक परिवर्तनों के प्रति संवेदनशील एक उपयोगी फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपिक निकटता सेंसर है। यहां हम दिखाते हैं कि इसका उपयोग α-सिन्यूक्लिन में स्थिर स्थानीय संरचनाओं को उजागर करने के लिए किया जा सकता है, जिसे अन्यथा लंबी दूरी के FRET शासक का उपयोग करके मापा जाता है तो इसे गोलाकार रूप से असंरचित और अस्थिर के रूप में जाना जाता है।

Abstract

एकल जैव अणुओं और उनकी गतिशीलता के कई अनुरूपों को ट्रैक करने के लिए स्पेक्ट्रोस्कोपिक शासकों का उपयोग करने से संरचनात्मक गतिशीलता और जीव विज्ञान में इसके योगदान की समझ में क्रांतिकारी बदलाव आया है। जबकि FRET आधारित शासक 3-10 एनएम रेंज में अंतर डाई दूरी पर रिपोर्ट, अन्य स्पेक्ट्रोस्कोपिक तकनीकों, जैसे प्रोटीन प्रेरित फ्लोरेसेंस एन्हांसमेंट (PIFE), एक डाई और कम 0-3 एनएम रेंज में एक प्रोटीन सतह के बीच निकटता पर रिपोर्ट । पसंद की विधि के बावजूद, एक समय में स्वतंत्र रूप से फैलाने वाले बायोमॉलिक्यूल्स को मापने में इसका उपयोग जैव अणुओं की अलग-अलग केंद्रीय-वितरित उप-आबादी उपज वाले प्रयोगात्मक पैरामीटर के हिस्टोग्राम को पुनः प्राप्त करता है, जहां प्रत्येक उप-आबादी या तो एक ही संरचना का प्रतिनिधित्व करती है जो मिलीसेकंड के भीतर अपरिवर्तित रही, या कई संरचनाएं जो मिलीसेकंड की तुलना में बहुत तेजी से इंटरकन्वर्ट करती हैं, और इसलिए एक औसत-उप-आबादी। एकल-अणु FRET में, जहां हिस्टोग्राम में रिपोर्ट किया गया पैरामीटर अंतर-डाई FRET दक्षता है, एक आंतरिक रूप से अव्यवस्थित प्रोटीन, जैसे बफर में α-सिन्यूक्लिन मोनोमर, पहले कई अनुरूपता के एक औसत-बाहर उप-आबादी को तेजी से प्रदर्शित करने के रूप में सूचित किया गया था। हालांकि ये पिछले निष्कर्ष FRET-आधारित शासक की 3-10 एनएम रेंज पर निर्भर करते हैं, हमने इस प्रोटीन को एकल-अणु PIFE का उपयोग करके परीक्षण में डालने की मांग की, जहां हम साइट-विशिष्ट sCy3-लेबल α-सिन्यूक्लिन प्रोटीन के फ्लोरेसेंस जीवनकाल को ट्रैक करते हैं। दिलचस्प बात यह है कि इस छोटी दूरी के स्पेक्ट्रोस्कोपिक प्रॉक्सिमिटी सेंसर का उपयोग करके, SCy3-लेबल α-सिन्यूक्लिन कई आजीवन उप-आबादी को अलग-अलग मतलब वाले जीवन काल के साथ प्रदर्शित करता है जो 10-100 एमएस में इंटरकनवर्ट करते हैं। इन परिणामों से पता चलता है कि जबकि α-सिन्यूक्लिन विश्व स्तर पर अस्त-व्यस्त हो सकता है, यह फिर भी स्थिर स्थानीय संरचनाओं प्राप्त करता है । संक्षेप में, इस काम में हम विभिन्न स्पेक्ट्रोस्कोपिक निकटता सेंसरों का उपयोग करने के लाभ को उजागर करते हैं जो एक समय में स्थानीय या वैश्विक संरचनात्मक परिवर्तनों को ट्रैक करते हैं।

Introduction

पिछले दो दशकों में, एकल अणु फ्लोरेसेंस-आधारित विधियां जैव अणुओं को मापने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गई हैं1,2,यह जांच करते हुए कि विभिन्न जैव अणु मापदंड कैसे वितरित करते हैं और साथ ही वे उप-मिलीसेकंड संकल्प3, 4,5पर इन मापदंडों की विभिन्न उप-आबादी के बीच गतिशील रूप से कैसे आपस में छेड़छाड़ करते हैं। इन तकनीकों के मापदंडों में एफईआरटी मापन 6,7,फ्लोरेसेंस एनिसोट्रोपी8,9,फ्लोरेसेंस क्वांटम पैदावार औरजीवनकाल 10, 11में ऊर्जा हस्तांतरण दक्षता शामिल है, जो विभिन्न फ्लोरेसेंस शमन 12 या वृद्धि13 तंत्रों के एक समारोह के रूप में है। इन तंत्रों में से एक, जिसे प्रोटीन-प्रेरित फ्लोरेसेंस एन्हांसमेंट (पीईएफई)14 के रूप में जाना जाता है, फ्लोरोफोर के मुक्त आइसोमराइजेशन के लिए स्टेरिक बाधा के कार्य के रूप में फ्लोरेसेंस क्वांटम यील्ड और जीवनकाल की वृद्धि का परिचय देता है, जब उत्तेजित-राज्य में, डाई14,15, 16,17,18, 19, 19के आसपास प्रोटीन सतहों के कारण होता है। . FRET और PIFE दोनों को स्पेक्ट्रोस्कोपिक शासकों या निकटता सेंसर माना जाता है क्योंकि उनका मापा पैरामीटर सीधे माप के तहत लेबल वाले बायोमॉल्यूल के भीतर एक स्थानिक उपाय से जुड़ा हुआ है। जबकि FRET दक्षता 3-10 एनएम20की सीमा के भीतर रंगों की एक जोड़ी के बीच की दूरी से संबंधित है, PIFE पटरियों फ्लोरेसेंस क्वांटम पैदावार या डाई और 0-3 एनएम19की सीमा में पास के प्रोटीन की सतह के बीच की दूरी से संबंधित जीवन काल में बढ़ जाती है ।

एकल अणु FRET व्यापक रूप से कई अलग प्रोटीन प्रणालियों में संरचनात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, आंतरिक रूप से अस्त-व्यस्त प्रोटीन (IDPs)21,जैसे α-सिन्यूक्लिन (α-सिन)22सहित । α - सिन विभिन्न जैव अणुओं के लिए बाध्यकारी और विभिन्न परिस्थितियों में23 , 24,25, 26, 27,28,29,30के लिए बाध्यकारी होने के बाद आदेशित संरचनाएं बनासकतेहैं। हालांकि, जब अनबाउंड, α-सिन मोनोमर को उच्च अनुरूप विषमता की विशेषता है, जिसमें तेजी से इंटरकनवर्टिंग कॉन्फॉर्मेशन31,32है।

α - सिन की संरचना का अध्ययन पहले विभिन्न विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके किया गया है जो ऐसी अत्यधिक विषम और गतिशील प्रोटीन प्रणालियों 33 ,34, 35, 36 ,37,38,39की अनुरूप गतिशीलता की पहचान करने में मदद करते हैं। दिलचस्प है, बफर में α-सिन के एकल-अणु FRET (smFRET) मापों ने एक ही FRETजनसंख्या 39,40 की सूचना दी जो कॉन्फोकल स्पॉट के माध्यम से α-सिन के विशिष्ट प्रसार समय की तुलना में गतिशील रूप से कई बार तेजी से इंटरकनवर्टिंग के समय-औसत का परिणाम है (बार के रूप में तेजी से कुछ माइक्रोसेकंड और यहां तक कि तेजी से, ठेठ मिलीसेकंड प्रसार के सापेक्ष)400 41. हालांकि, 3-10 एनएम दूरी संवेदनशीलता के साथ एक FRET स्पेक्ट्रोस्कोपिक शासक का उपयोग करके कभी-कभी केवल α-सिन जैसे छोटे प्रोटीन में समग्र संरचनात्मक परिवर्तनों पर रिपोर्ट करता है। कम दूरी की संवेदनशीलता के साथ स्पेक्ट्रोस्कोपिक निकटता सेंसर का उपयोग करने वाले एकल-अणु मापों में स्थानीय संरचनाओं की गतिशीलता पर रिपोर्ट करने की क्षमता होती है। इसके साथ ही हम α-सिन के एकल-अणु PIFE माप करते हैं और फ्लोरेसेंस लाइफटाइम की विभिन्न उप-आबादी की पहचान करते हैं जो उन दोनों के बीच संक्रमण के साथ विभिन्न स्थानीय संरचनाओं के लिए मानचित्रण करते हैं, जो 100 एमएस के रूप में धीमी गति से होते हैं। यह काम एक समय में, बफर में और जब एसडीएस-आधारित झिल्ली को एक छोटी दूरी के एकल-अणु स्पेक्ट्रोस्कोपिक निकटता सेंसर के रूप में एसडी आधारित झिल्ली से बंधे होते हैं, तो स्वतंत्र रूप से फैलाने वाले α-सिन अणुओं के समय-हल किए गए एसएमपीआईएफ मापों को संक्षेप में प्रस्तुत करता है।

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Protocol

1. प्लाज्मिड ट्रांसफॉर्मेशन

  1. एसओसी माध्यम के 0.5 एल की तैयारी
    1. ट्राइप्टोन के 10 ग्राम, खमीर निकालने के 2.5 ग्राम, सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) के 0.25 ग्राम, पोटेशियम क्लोराइड (केसीएल) के 0.1 ग्राम वजन।
    2. 0.5 एल की कुल मात्रा तक डबल-डिस्टिल्ड वॉटर (डीडीडब्ल्यू) जोड़ें।
    3. सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) जोड़कर पीएच 7 में समायोजित करें।
    4. 100 एमएल और ऑटोक्लेव के स्टॉक एलिकोट्स तैयार करें।
    5. उपयोग करने से पहले, एसओसी के 100 एमएल में बाँझ मैग्नीशियम क्लोराइड (एमजीसीएल2)के 0.5 एमएल और 1.8 एमएल बाँझ ग्लूकोज जोड़ें।
  2. बर्फ पर गल BL21 (DE3) सक्षम Escherichia कोलाई कोशिकाओं ।
  3. सक्षम कोशिकाओं को धीरे-धीरे मिलाएं।
  4. दो 15 एमएल ट्यूब तैयार करें। एक को ट्रांसफॉर्मेशन रिएक्शन ट्यूब के रूप में लेबल करें और दूसरा कंट्रोल ट्यूब के रूप में।
  5. ट्यूबों में सक्षम कोशिकाओं के 100 माइक्रोन अलीकोट।
  6. परिवर्तन प्रतिक्रिया ट्यूब में 0.1 एनजी/μL की एकाग्रता पर प्लाज्मिड के 1 μL जोड़ें।
  7. चरण 1.8 में उपयोग के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में हीट एसओसी माध्यम।
  8. हीट-पल्स 42 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में दो ट्यूबों 45 सेकंडकी अवधि के लिए। (महत्वपूर्ण कदम!)
  9. प्रत्येक ट्यूब में गर्म एसओसी माध्यम के 900 माइक्रोन जोड़ें।
  10. 225 आरपीएम के वेग पर मिलाते हुए 45 मिनट की अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
  11. एक एलबी (लुरिया-बर्टानी) पर परिवर्तित प्लाज्मिड के साथ कोशिकाओं के 200 माइक्रोन फैलाएं- एक बाँझ सेल स्प्रेडर का उपयोग करके 100 μg/mL एम्पीसिलिन युक्त आगर प्लेट।
  12. एक बाँझ स्प्रेडर (सकारात्मक नियंत्रण)का उपयोग करते हुए, एम्पिसिलिन के बिना एक पौंड-अगर प्लेट पर परिवर्तित प्लाज्मिड के साथ कोशिकाओं के 200 माइक्रोन फैलाएं।
  13. एक बाँझ स्प्रेडर(नकारात्मक नियंत्रण)का उपयोग करके 100 माइक्रोग्राम/एमएल एम्पीसिलिन युक्त एक एलबी-एगर प्लेट पर नियंत्रण कोशिकाओं (प्लाज्मिड युक्त नहीं) के 200 माइक्रोन फैलाएं।
  14. प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

2. प्रोटीन की तैयारी

  1. फिर से मिलाने वाला α-सिन्यूक्लिन अभिव्यक्ति और शुद्धि
    1. एक ही कॉलोनी चुनें और 37 डिग्री सेल्सियस (स्टार्टर)पर 100 माइक्रोग्राम/एमएल एम्पीसिलिन युक्त ऑटोक्लेवेड एलबी (लुरिया-बर्टानी) तरल माध्यम के 100 एमएल में बढ़ें।
    2. चार 2 एल एर्लेनमेयर फ्लास्क तैयार करें, प्रत्येक में 1 एल ऑटोक्लेवेड एलबी माध्यम और 100 माइक्रोग्राम/एमएलए एम्पिसिलिन (बड़े टीका)शामिल हैं।
    3. सेल समाधान के ऑप्टिकल घनत्व (λ = 600 एनएम पर ओडी) को मापें। जब स्टार्टर का सेल घनत्व0.6-0.7 के एक ओडी λ = 600 एनएम तक पहुंचता है, तो पिछले चरण में तैयार एलबी माध्यम के प्रत्येक 1 एल के अनुसार स्टार्टर समाधान का 10 एमएल जोड़ें।
    4. एक इनक्यूबेटर शेकर में बैक्टीरियल माध्यमों को 37 डिग्री सेल्सियस पर और 200 आरपीएम का वेग बढ़ाएं।
    5. जब कोशिका घनत्व0.6-0.8 के एक ओडी λ = 600 एनएम तक पहुंचता है, तो 1 m m की अंतिम एकाग्रता के लिए विकास माध्यम के प्रत्येक 1 एल के प्रति आइसोप्रोपिल β-डी-1-थिओग्लाटोपिरानोसाइड (आईपीटीजी) जोड़कर प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करें।
      नोट: डीडीडब्ल्यू के 4 एमएल में आईपीटीजी के 0.96 ग्राम को भंग करें और प्रत्येक 1 एल बैक्टीरियल विकास के परिणामस्वरूप आईपीटीजी समाधान के 1 एमएल जोड़ें।
    6. कोशिकाओं को 4 घंटे की अवधि के लिए बढ़ाएं और उन्हें 8 मिनट की अवधि के लिए 5,170 x ग्राम के वेग पर 50 एमएल ट्यूबों में अपकेंद्री द्वारा एकत्र करें।
      नोट: प्रत्येक दौर में, सुपरनेट को त्यागें, गोली रखें और बैक्टीरियल विकास के साथ फिर से एक ही ट्यूब भरें।
    7. बैक्टीरियल गोली को अगले दिन के लिए डीप फ्रीज स्टोरेज (जैसे,-80 डिग्री सेल्सियस) में स्टोर करें।
    8. अगले दिन, लाइसिस बफर के 200 मिलियन तैयार करें: 40% (w/v) सुक्रोज और बफर ए, जिसमें 30 एमएमएम ट्रिस-एचसीएल, 2 एमएमएम एथिलीनिडिमाइन्टेस्ट्रेएक्टिक एसिड (EDTA), 2 m m dithiothreitol (DTT) पीएच 8.0 शामिल हैं।
    9. बैक्टीरियल पेलेट के साथ प्रत्येक ट्यूब में लाइसिस बफर के 25 एमएल जोड़ें।
    10. लाइसिस बफर में गोली (बाँझ प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें) को फिर से निलंबित करें (2.1.8 देखें)।
    11. बर्फ पर एक उभारक चुंबक के साथ बाँझ 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क तैयार करें।
    12. लाइसिस बफर के 5 एमएल जोड़ें, और फिर सजातीय पुनः निलंबित कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
    13. कमरे के तापमान पर 200 आरपीएम पर 20 मिनट की अवधि के लिए कोशिकाओं को हिलाओ।
    14. समाधान को 17,400 x ग्राम के वेग पर 30 मिनट की अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएल ट्यूब और सेंट्रलाइज में विभाजित करें।
    15. सुपरनेट को त्याग दें।
    16. बर्फ पर स्टरर चुंबक के साथ बाँझ 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क तैयार करें।
    17. प्रत्येक ट्यूब में विघटन बफर (90 एमएल कूल्ड बफर ए और एमजीसीएल2 के 37 माइक्रोन घुलनशीलता सीमा से परे भंग और फ़िल्टर) के 15 एमएल जोड़ें। बाँझ प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें और गोली को भंग करें।
    18. जब समाधान का हिस्सा सजातीय हो जाता है, तो इसे बर्फ पर एक उभारा गया एर्लेनमेयर फ्लास्क पर ले जाएं।
    19. एर्लेनमेयर में समाधान की मात्रा निर्धारित करें।
    20. समाधान के प्रत्येक 1 मिलीलीटर प्रति 10 मिलीग्राम स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट जोड़ें (जोड़ने से पहले, बफर ए के 2 एमएल में स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट को भंग करें)।
      नोट: यह कदम डीएनए को हटाने और राइबोसोम्स को दूर करने के लिए किया जाता है।
    21. कमरे के तापमान पर 10-20 मिनट की अवधि के लिए समाधान हिलाओ।
    22. समाधान को 50 एमएल ट्यूब और सेंट्रलाइज में 4 डिग्री सेल्सियस पर और 30 मिनट की अवधि के लिए 20,700 x ग्राम के वेग पर विभाजित करें।
    23. सुपरनैंट ले लीजिए और गोली को त्याग दें।
    24. एक बास्टर के साथ बर्फ पर एक बाँझ 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क तैयार करें।
    25. 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके सुपरनैंट को स्वच्छ एर्लेनमेयर फ्लास्क में फ़िल्टर करें।
    26. समाधान की मात्रा निर्धारित करें और समाधान के प्रत्येक 1 एमएल के प्रति 0.3 ग्राम अमोनियम सल्फेट का वजन करें।
    27. धीरे-धीरे, अमोनियम सल्फेट को उभारा समाधान में जोड़ें।
      नोट: यह कदम प्रोटीन को कम करने के लिए किया जाता है। जब अमोनियम सल्फेट प्रोटीन बांधता है, तो समाधान अस्पष्ट और धुंधला हो जाता है, जो सफेद रंग के रूप में दिखाई देता है।
    28. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए हिलाओ ।
    29. समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएल ट्यूब और सेंट्रलाइज और 30 मिनट की अवधि के लिए 20,700 ग्राम के वेग पर विभाजित करें।
    30. सुपरनेट को सावधानी से त्यागें और गोली रखें।
    31. बफर ए के 20 एमएल के साथ गोली को भंग करें।
    32. सभी समाधानों को एक ट्यूब में एकजुट करें, और फिर समाधान के यूवी अवशोषण स्पेक्ट्रम को मापें।
      नोट: यदि स्पेक्ट्रम एकत्रीकरण (300 एनएम की तरंगदैर्ध्य से ऊपर अवशोषण) के हस्ताक्षर दिखाता है, तो अगले चरण तक जारी रखें। यदि नहीं, तो अगले चरण को छोड़ दें और 2.1.34 चरण में जाएं।
      नोट: एकत्रीकरण सूचकांक (एआई) की गणना यूवी स्पेक्ट्रा से ओडीλ = 350एनएम/(ओडीλ = 280एनएम - ओडीλ = 350एनएम) ×100के रूप में की जाती है। 41
    33. 15 मिनट की अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,590 x g के वेग पर 100 केडीए कटऑफ सेंट्रिप्रेप ट्यूब और सेंट्रलाइज का उपयोग करें। फिल्टर के माध्यम से पारित तरल ले लीजिए।
    34. 3.5 केडीए कटऑफ के साथ डायलिसिस बैग का उपयोग करते हुए, बफर ए के खिलाफ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को डायलाइज करें।
    35. कम से कम 4 घंटे की अवधि के लिए डायलिसिस का एक और दौर प्रदर्शन करें।
    36. 1 एमएल मोनोक्यू एनियन एक्सचेंज कॉलम पर डायलिज्ड सैंपल लोड करें। पीएच 7.5 पर 30 एमएम ट्रिस हाइड्रोक्लोराइड (ट्राइस-एचसीएल) बफर का उपयोग एक वाशिंग बफर के रूप में और 30 एमएम ट्रिस-एचसीएल बफर पीएच 7.5 के साथ 500 एमएल एनएसीएल के साथ एक एल्यूशन बफर के रूप में करें।
    37. कॉलम में नमूना इंजेक्ट करें। फिर अनबाउंड प्रोटीन को हटाने के लिए 0% एल्यूशन बफर के 20 कॉलम वॉल्यूम (सीवी) और 100% वॉश बफर के साथ धोएं।
    38. 30% एल्यूशन बफर के 7 सीवी के साथ धोएं।
    39. एक ढाल का उपयोग कर α-सिन प्रोटीन नमूना एल्यूट करें जो 1.5 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर 30 सीवी के लिए 30% से 100% एल्यूशन बफर में बदलता है।
      नोट: α-सिन 20-24 एमएस/सेमी पर 46-66 सीवी पर elutes, जो 38-50% एल्यूशन बफर की बात कर रहा है ।
    40. मुख्य एल्यूशन पीक के अंशों को इकट्ठा करें। कूमासी ब्लू या फास्ट सीबैंड स्टेनिंग समाधान के साथ धुंधला होने के बाद, 15% सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीएक्रीलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) में नमूने चलाकर α-सिन की उपस्थिति को सत्यापित करें। 15 केडीए में एक बैंड की उम्मीद है।
    41. प्रासंगिक अंशों को एकजुट करें और बफर ए के खिलाफ, 4 डिग्री सेल्सियस पर 3.5 केडीए कटऑफ के साथ डायलिसिस बैग का उपयोग करके, उन्हें रातोंरात डायलाइज़ करें।
    42. प्रोटीन के नमूने के एलिकोट तैयार करें और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. Cy3-लेबल α-सिन्यूक्लिन
    1. कमरे के तापमान पर 1 घंटे की अवधि के लिए 2 mm की अंतिम एकाग्रता के लिए डीटीटी को जोड़कर α-Syn A56C उत्परिवर्ती में सिस्टीन अवशेषों के थिओल को कम करें।
    2. 3.5 केडीए कटऑफ डायलिसिस बैग का उपयोग कर डायलिसिस के दो दौर प्रदर्शन करके डीटीटी निकालें। पहले दौर के लिए, 30 mM Tris-HCl पीएच 8.0 और 2 m EDTA के खिलाफ डायलाइज़। दूसरे दौर के लिए, 50 mM HEPES पीएच 7.2 और 2 m EDTA के खिलाफ डायलाइज।
    3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट की अवधि के लिए 50 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए प्रोटीन नमूने में ट्रिस (2-कार्बोक्सिएथिल) फॉस्फिन हाइड्रोक्लोराइड (टीसीईपी) जोड़कर सिस्टीन अवशेषों को कम करें।
      नोट: टीएमईपी एक गैर-सल्फ्रीड्रिल एजेंट को कम करता है, इसलिए यह डाई के साथ प्रतिक्रिया किए बिना थिओल समूहों को कम रखता है। हमने 1 एम टीएमईईपी के स्टॉक समाधान से 0.5 माइक्रोन जोड़ा।
    4. 1 मिलीएल की अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा के लिए आवश्यक प्रोटीन की मात्रा की गणना करें।
      नोट: यहां हमारे द्वारा उपयोग की गई गणना के लिए एक उदाहरण दिया गया है:
      20 μM अंतिम प्रोटीन एकाग्रता × 1 एमसीएल अंतिम मात्रा = 56 माइक्रोन प्रारंभिक प्रोटीन एकाग्रता × वी प्रोटीन जोड़ा जाएगा
    5. 1 मिलीएल की अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा के लिए आवश्यक डाई की मात्रा की गणना करें। एक डाई पर, एक डाई पर, एक सिस्टीन की डाई लेबलिंग अतिरिक्त डाई के साथ किया जाना चाहिए: कम से कम 3:1 का प्रोटीन मोलर अनुपात।
      नोट: हमने जिस गणना का उपयोग किया, उसके लिए एक उदाहरण:
      60 μM अंतिम डाई एकाग्रता × 1 एमएल अंतिम मात्रा = 370 μM प्रारंभिक डाई एकाग्रता × वी डाई जोड़ने के लिए
    6. कुल प्रतिक्रिया मात्रा को 1 मिलील में समायोजित करने के लिए आवश्यक डायलासेट से बफर की मात्रा की गणना करें।
      नोट: गणना उदाहरण: 1 एमएल - (V चरण 2.2.4 + V चरण 2.2.5 से गणना की गई है)
    7. एक उभारने वाले के शीर्ष पर एक चुंबक के साथ प्रतिक्रिया शीशी तैयार करें।
    8. सबसे पहले, प्रोटीन और बफर की गणना की गई मात्रा जोड़ें। बाद में, डाई (सल्फो-Cy3 मलीमाइड) की गणना की गई राशि जोड़ें।
    9. 3-5 घंटे की अवधि के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया रखें।
    10. 2 mm DTT जोड़कर प्रतिक्रिया समाप्त करें और 1 घंटे की अवधि के लिए जारी रखें।
    11. बफर ए के खिलाफ डायलिसिस के तीन दौर करें, समाधान से अतिरिक्त मुक्त डाई को हटाने के लिए 3.5 केडीए कटऑफ के साथ डायलिसिस बैग का उपयोग करें।
    12. मुफ्त डाई से लेबल वाले α-सिन को अलग करने के लिए एक आकार अपवर्जन कॉलम पर नमूना लोड करें।
    13. डाई के अवशोषण को मापने के द्वारा शुद्ध लेबल α-सिन की एकाग्रता निर्धारित करें (सल्फो-Cy3 के लिए अवशोषण गुणांक λ = 548 एनएम पर162,000एम-1सेमी -1 है)।
    14. यदि आवश्यक हो, तो वैक्यूम कंसंट्रेटर (जैसे, स्पीडवैक) का उपयोग करके शुद्ध लेबल वाले α-सिन समाधान को केंद्रित करें। फिर, बफर ए के खिलाफ डायलिसिस का एक दौर करें, 3.5 केडीए कटऑफ के साथ डायलिसिस बैग का उपयोग करें और फिर से लेबल किए गए प्रोटीन की एकाग्रता निर्धारित करें।
    15. लेबल किए गए प्रोटीन नमूने के एलिकोट्स तैयार करें और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. माप

  1. एसएमपीआईएफ प्रायोगिक सेटअप
    नोट: निम्नलिखित कॉन्फोकल-आधारित सेटअप या इसी तरह का उपयोग करें।
    1. एक स्पंदित लेजर स्रोत का उपयोग करें (हमारे मामले में, λ = 532 एनएम पिकोसेकंड स्पंदित लेजर ~ 100 पीएस एफडब्ल्यूएचएम की पल्स चौड़ाई के साथ, एक उपयुक्त पुनरावृत्ति दर (हमारे मामले में 20 मेगाहज़) पर काम कर रहा है और सल्फो-साइ3 (एससीसी) एक्सिशन के स्रोत के रूप में एक समय-सहसंबद्ध एकल फोटॉन काउंटिंग (टीसीएसपीसी) कार्ड के सिंक में रूट किया जाता है।
    2. 532 एनएम पर उच्च परावर्तन के साथ एक डिक्रोइक दर्पण का प्रयोग करें, उत्तेजन और फ्लोरेसेंस से बिखरने को अलग करने के लिए।
    3. उत्सर्जित प्रकाश के ध्यान में 100 माइक्रोन व्यास पिनहोल का उपयोग करें, कोलिमेटेड उत्सर्जन बीम के बाद एक लेंस द्वारा ध्यान केंद्रित किया गया था, और इससे पहले कि उत्सर्जन बीम को एक और लेंस द्वारा फिर से कोलिमेटेड किया गया है।
    4. अन्य प्रकाश स्रोतों से आगे sCy3 फ्लोरेसेंस फिल्टर करने के लिए एक बैंड पास फिल्टर (हमारे मामले में 585/40 एनएम) का उपयोग करें।
    5. एक डिटेक्टर (एकल फोटॉन हिमस्खलन डायोड या हाइब्रिड फोटोमल्टीप्लायर, हमारे मामले में) का उपयोग करके फ्लोरेसेंस का पता लगाएं (हमारे मामले में 4-से-1 राउटर के माध्यम से), हमारे मामले में) एक टीसीएसपीसी मॉड्यूल (बेकर और हिकल एससीसी-150, हमारे मामले में) के लिए रूट किया गया।
      नोट: हमारे मामले में, डेटा अधिग्रहण समय-टैग-समय-हल (टीटीटीआर) फ़ाइल प्रारूप में विस्टाविजन सॉफ्टवेयर (आईएसएसटीएम)के माध्यम से किया जाता है।
  2. एसएमपीआईएफ नमूना तैयार करना
    1. माप बफर में 25 पीएम sCy3-लेबल α-Syn तैयार करें: 10 mM सोडियम एसीटेट, 10 एमएम सोडियम डिहाइड्रोजन फॉस्फेट, 10 एमएम ग्लाइसिन पीएच 8.0, 20 एमएम एनएसीएल, 10 एमएम सिस्टेमाइन और 1 एमएम 6-हाइड्रोक्सी-2,5,7,8-टेट्रामेथाइलक्रोमन-2-कारबॉक्सिलिक एसिड (TROLOX), कम प्रोटीन बाइंडिंग ट्यूब में ।
      नोट: यदि α-सिन को एसडीएस वेसिकल्स की उपस्थिति में मापा जाता है, तो उपयुक्त एसडीएस राशि भी जोड़ें।
    2. कुल्ला एक 18 चैंबर माइक्रोस्कोपी 1 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के १०० μL के साथ 1 मिनट की अवधि के लिए स्लाइड कवरलिप, और फिर बीएसए को हटा दें ।
    3. कवरस्लिप स्लाइड में एक कक्ष में 25 पीएम sCy3-लेबल α-Syn नमूना के 100 μL जोड़ें।
    4. वर्णित सेटअप का उपयोग करके नमूने का एसएमपीआईएफ माप करें, जैसा कि अगले चरणों में है।
  3. एसएमपीआईएफ डेटा अधिग्रहण
    1. एक उच्च संख्यात्मक अपर्चर पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस का उपयोग करें (हमारे मामले में, ओलंपस UPLSAPO 60x एनए 1.2), और उद्देश्य लेंस के शीर्ष पर अल्ट्रा शुद्ध पानी की एक बूंद जोड़ें ।
    2. एक चरण कक्ष में कवरस्लिप स्लाइड को ठीक करें और इसे माइक्रोस्कोप चरण के शीर्ष पर स्थापित करें।
    3. उद्देश्य लेंस ऊपर की ओर लाओ, जब तक कि कवरस्लिप स्लाइड के तल पर उद्देश्य लेंस स्मीयरों के शीर्ष पर पानी की बूंद न हो जाए।
    4. लेजर शटर खोलें और एक सीएमओएस कैमरे पर पैटर्न का निरीक्षण करते हुए, नमूने से बिखरे हुए प्रकाश का संग्रह करते हुए ऑब्जेक्टिव लेंस को ऊपर की ओर लाएं। हवादार छल्ले पैटर्न का निरीक्षण करें: पहला पानी-ग्लास इंटरफ़ेस पर ध्यान केंद्रित करता है, और फिर दूसरा ग्लास और नमूना समाधान के बीच इंटरफ़ेस पर ध्यान केंद्रित करता है।
    5. एक अतिरिक्त 75 माइक्रोन द्वारा उद्देश्य लेंस की ऊंचाई बढ़ाएं, लेजर फोकस को समाधान में गहराई से लाते हैं, ताकि कवरस्लिप के ग्लास सतह से ऑटो-फ्लोरेसेंस को कम किया जा सके।
    6. उद्देश्य लेंस पर लेजर शक्ति ट्यून ~ 100 μW हो।
    7. एक पूर्वनिर्धारित समय (2 घंटे, हमारे माप में) के लिए पता लगाया फोटॉनों के अधिग्रहण शुरू करते हैं ।
      नोट: अधिग्रहण संकेत के बहुमत एक दर (प्रति सेकंड गिनती में मापा, सीपीएस) है कि अधिग्रहीत जब सिर्फ बफर मापने के समान है चाहिए; मिलीसेकंड-बिन्ड डेटा को दुर्लभ फोटॉन फट घटनाओं को दिखाना चाहिए, जिसमें अधिकांश डिब्बे औसत दर वाले हैं जो हमारे मामले में विशिष्ट डिटेक्टर पृष्ठभूमि दर (<1,000 सीपीएस) के बराबर है।

4. smPIFE फट विश्लेषण

  1. रॉ डेटा रूपांतरण
    नोट: डेटा आमतौर पर एक बाइनरी फ़ाइल में संग्रहीत किया जाता है जिसमें एक प्रारूप होता है जिसे टीसीएसपीसी कार्ड (हमारे मामले में पीसीसी फ़ाइलें) बनाने वाली कंपनी द्वारा पूर्वनिर्धारित किया जाता था।
    1. सॉफ्टवेयर सुइट फेकनवर्ट (https://github.com/Photon-HDF5/phconvert) का उपयोग करके कच्चे डेटा फ़ाइल को फोटॉन-एचडीएफ5 यूनिवर्सल फाइल प्रारूप42में परिवर्तित करें। एक इनपुट के रूप में कच्चे डेटा फ़ाइल को कॉल करें और हमारे मामले में, फोकन-एचडीएफ 5.इपिंटर नोटबुक में कन्वर्ट एनएस-एलेक्स बेकर-हिब्ल फाइल) में उपयुक्त कोड का उपयोग करके कच्चे डेटा में परिवर्तित करें।
      नोट: .hdf5 फ़ाइल में रूपांतरण में शामिल हैं: (1) कच्चे डेटा में प्रासंगिक फोटॉन धाराओं का निर्धारण (यानी, संबंधित डिटेक्टर आईडी के पंजीकृत फोटॉनों की फोटॉन धाराएं); (2) प्रासंगिक फोटॉन नैनोटाइम्स (उत्तेजन सिंक समय के सापेक्ष फोटॉन डिटेक्शन टाइम्स); और (3) मेटाडेटा जोड़ा गया।
  2. फट खोज और चयन का उपयोग कर FRETbursts43
    नोट: smPIFE माप के फोटॉन-HDF5 कच्चे डेटा फ़ाइलों के सभी, साथ ही कच्चे डेटा के विश्लेषण का सारांश कोड, Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4587698) में संग्रहीत कर रहे हैं । नीचे दिए गए सभी चरणों को विस्तृत किया गया है और जूपिटर नोटबुक के भीतर दिखाया गया है, जो ज़ेनोडो रिपॉजिटरी लिंक में भी आपूर्ति की जाती है।
    1. जुपिटर नोटबुक (एनाकोंडा फ्रेमवर्क के भीतर, हमारे मामले में) खोलें।
    2. नोटबुक smPIFE-aSyn 56C (Cy3) 25 पीएम newBuffer (अंतिम नोटबुक) खोलें। ipynb (यह Zenodo लिंक में पाया जा सकता है) ।
    3. लोड FRETbursts।
    4. फोटॉन HDF5 डेटा फाइल लोड करें।
    5. बीजी दर मूल्यांकन: अंतर-फोटॉन समय के हिस्टोग्राम का उपयोग करके, फोटॉन एचडीएफ 5 डेटा फाइल में डेटा अधिग्रहण के प्रत्येक 30 सेकंड के लिए पृष्ठभूमि (बीजी) दरों की गणना करें।
      नोट: निम्नलिखित चरण स्लाइडिंग विंडो एल्गोरिदम44 , 45,46का उपयोग करके फट खोज का वर्णनकरतेहैं।
    6. एक समय में एम = 20 लगातार फोटॉन, एक फोटॉन की एक समय खिड़की ले जाएँ।
    7. फोटॉन डेटा केवल तभी एकत्र करें जब तात्कालिक फोटॉन दर, Equation 1 (), डेटा अधिग्रहण की उस अवधि के लिए बीजी दर से कम से कम एफ = 11 गुना बड़ा हो।
      नोट: एक फट लगातार फोटॉन है कि एक समय में खिड़की एक फोटॉन फिसलने और फोटॉन दर मापदंड (चरण ४.२.७) के साथ सहमत द्वारा एकत्र किए गए सभी से बाहर का निर्माण किया है ।
    8. निम्नलिखित फट विशेषताओं की गणना करें:
      फट आकार: एक फट में फोटॉन की मात्रा।
      फट अवधि: एक फट में अंतिम और पहले फोटॉन का पता लगाने के समय के बीच समय अंतर।
      फट चमक: एक फट में तात्कालिक फोटॉन दर का सबसे बड़ा मूल्य।
      फट जुदाई: लगातार फटने के बीच समय अंतराल।
      नोट: निम्नलिखित बिंदु आगे फट चयन प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।
    9. फट चमक मूल्यों के हिस्टोग्राम (एक फट में उच्चतम तात्कालिक फोटॉन दर) प्लॉट, logarithmic पैमाने में घटनाओं की धुरी के साथ ।
    10. फट चमक सीमा को न्यूनतम फट चमक मूल्य के रूप में परिभाषित करें जिसमें से हिस्टोग्राम एक खस्ताहाल पैटर्न प्रदर्शित करता है।
    11. फटने की चमक सीमा से बड़ा चमक मूल्यों के साथ फटने का चयन करें।
      नोट: अगले कदम फट का वर्णन फ्लोरेसेंस जीवन काल का मतलब है ।
    12. फोटॉन के साथ सभी चयनित फटने में सभी फोटॉनों के लिए फोटॉन नैनोटाइम के हिस्टोग्राम को लॉगरिथम स्केल में धुरी की गिनती करें।
    13. नैनोटाइम सीमा को न्यूनतम नैनोटाइम मूल्य के रूप में परिभाषित करें जिसमें से फोटॉन नैनोटाइम का हिस्टोग्राम एक खस्ताहाल पैटर्न प्रदर्शित करता है।
    14. नैनोटाइम दहलीज से बड़ा नैनोटाइम के साथ केवल फोटॉन का चयन करें।
    15. सभी चयनित फोटॉन नैनोटाइम के बीजीय औसत की गणना करें।
    16. फोटॉन नैनोटाइम बीजगणित औसत से नैनोटाइम थ्रेसहोल्ड घटाएं। परिणाम फट का मतलब फोटॉन नैनोटाइम है, जो सीधे मतलब फ्लोरेसेंस लाइफटाइम के आनुपातिक है।
    17. सभी फट के हिस्टोग्राम प्लॉट फ्लोरेसेंस जीवन काल का मतलब है । फ्लोरेसेंस लाइफटाइम की केंद्र-वितरित उप-आबादी दिखाई दे सकती है। कम मूल्य औसत के साथ उप-आबादी SCy3 के साथ अणु प्रजातियों का प्रतिनिधित्व करती है जो स्टरकॉली बाधित नहीं थी, जबकि उच्च मूल्य औसत वाली उप-आबादी SCy3 के साथ अणु प्रजातियों का प्रतिनिधित्व करती है जो अधिक तारकीय रूप से बाधित थी।
      नोट: अगले कदम फट पुनरावृत्ति विश्लेषण४७ के आधार पर धीमी गति से बीच फट गतिशीलता का वर्णन
    18. लोगार्थिक पैमाने में जुदाई समय धुरी के साथ, फट जुदाई समय के हिस्टोग्राम प्लॉट।
      नोट: फट जुदाई समय के दो उप आबादी दिखाई देगा:
      सेकंड के जुदाई समय के साथ एक प्रमुख उप-आबादी, लगातार मापा जाने वाले विभिन्न अणुओं से निकलने वाले लगातार फटने का प्रतिनिधित्व करती है।
      जुदाई समय ~ <100 एमएस के साथ एक छोटी सी उप-आबादी, एक ही अणु से उत्पन्न होने वाले लगातार फटने का प्रतिनिधित्व करती है, जो कॉन्फोकल वॉल्यूम के माध्यम से वापस आवर्ती होती है।
    19. लगातार फटने के सभी जोड़े को बचाने के लिए चुनें जो एक अधिकतम पृथक्करण समय से कम से अलग होते हैं जो एक ही अणु उप-जनसंख्या (<100 एमएस, हमारे मामले में) को परिभाषित करता है।
    20. एक हिस्टोग्राम या एक निश्चित जुदाई समय सीमा से नीचे पुनरावृत्ति है कि फटने के सभी जोड़े के लिए पहले और दूसरे फटने के मतलब फ्लोरेसेंस जीवन काल के एक बिखरने की साजिश

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Representative Results

एक आईडीपी के रूप में, जब यह एक और बायोमॉलिक्यूल से बाध्य नहीं होता है, तो α-सिन कई संरचनाओं के बीच संरचनात्मक गतिशीलता प्रदर्शित करता है, जिसमें कुछ माइक्रोसेकंड40 पर संक्रमण और यहां तक कि सैकड़ों नैनोसेकंड41पर भी। जब α-सिन कॉन्फोकल स्पॉट को पार करता है, तो यह संरचनाओं के बीच हजारों संक्रमणों से गुजरना पड़ सकता है। दरअसल, यह मामला तब था जब एसएमफ्रेट का उपयोग39,40किया गया था । यहां हम α-सिन की स्थानीय अनुरूप गतिशीलता की जांच करने के लिए smPIFE माप करते हैं।

माप α-Syn A56C उत्परिवर्ती में सिस्टीन के थिओल समूह से जुड़े एक सल्फो-Cy3 (sCY3) डाई से उत्सर्जित फ्लोरेसेंस फोटॉन रिकॉर्ड करता है। SCy3 फ्लोरोफोर उत्तेजित स्थिति में आइसोमोराइजेशन से गुजर सकता है। हालांकि, SCy3 एक फोटॉन उत्सर्जित करता है जब यह अपने ट्रांस आइसोमर से de-उत्तेजित करता है । इसलिए, अगर कुछ भी नहीं sterically sCy3 उत्तेजित राज्य isomerization बाधा डालती है, यह औसत पर कुछ फोटॉन उत्सर्जन होगा, लेकिन एक कम फ्लोरेसेंस क्वांटम उपज और कम फ्लोरेसेंस जीवन भर प्रदर्शन करेंगे । हालांकि, यदि SCy3 के उत्तेजित-राज्य आइसोमराइजेशन को बाधित किया जाता है, उदाहरण के लिए, पास के प्रोटीन की सतह, आइसोमराइजेशन की दर कम हो जाएगी, जो बदले में ट्रांस आइसोमर से अधिक डी-एक्सटिटेशन का कारण बन जाएगी, और इसलिए अधिक फोटॉन, एक उच्च फ्लोरेसेंस क्वांटम उपज और लंबे समय तक फ्लोरेसेंस जीवन काल। यह बेहतर PIFE प्रभाव के रूप में जाना जाता है।

smPIFE का उपयोग करके हमने एक समय में अवशेष 56 α-सिन पर sCy3 लेबलिंग α-सिन के मतलब फ्लोरेसेंस लाइफटाइम को मापा, जहां sCy3 डाई अवशेषों के आसपास प्रोटीन वातावरण को होश में रखता है 56। प्रोटीन को 25 पीएम की सांद्रता पर मापा गया, जिसमें यह मुख्य रूप से मोनोमर के रूप में पाया जाता है । smPIFE माप के परिणाम एकल α-Syn अणुओं(चित्रा 1)के मतलब फ्लोरेसेंस जीवन काल के हिस्टोग्राम के रूप में दिखाए जाते हैं । मतलब फ्लोरेसेंस लाइफटाइम्स को दो प्रमुखउप-आबादी (चित्रा 1A)में बांटा जा सकता है। पहली उप-जनसंख्या 1.6 एनएस के एक विशिष्ट फ्लोरेसेंस जीवनकाल के साथ लघु फ्लोरेसेंस जीवनकाल प्रदर्शित करती है, जो अवशेष 56 के आसपास पाए जाने वाले α-सिन अनुरूप राज्यों का प्रतिनिधित्व करती है। दूसरी उप-जनसंख्या 3.5 एनएस के एक विशेषता फ्लोरेसेंस जीवनकाल के साथ लंबे समय तक फ्लोरेसेंस जीवनकाल प्रदर्शित करती है, जो अवशेष 56 के आसपास पाए जाने वाले अधिक प्रोटीन सतहों के साथ α-सिन अनुरूप राज्यों का प्रतिनिधित्व करती है।

यह ज्ञात है कि ~ 5-10 MM एसडीएस की उपस्थिति में, समाधान में लगभग सभी α-सिन अणुओं के एन-टर्मिनल और एनएसी खंड एसडीएस वेसिकल्स40के लिए बाध्यकारी होने पर एक पेचदार हेयरपिन संरचना को अपनाते हैं। चूंकि अवशेष 56 एनएसी खंड के भीतर स्थित है, इसलिए SCy3 लेबलिंग अवशेषों से फ्लोरेसेंस 56 को एक समान माइक्रोएनवायरमेंट को समझने की उम्मीद है, क्योंकि लगभग सभी α-सिन अणुओं के बहुमत को वेसिकल-बाउंड पेचिकल हेयरपिन संरचना प्राप्त करनी चाहिए। इसलिए, हमने इसी तरह के एसएमपीआईएफ माप किए, लेकिन नियंत्रण के रूप में 5 एमएम एसडीएस की उपस्थिति में, फ्लोरेसेंस लाइफटाइम की एक ही आबादी की पहचान करने की उम्मीद की। दरअसल, इन मापों के परिणामस्वरूप फ्लोरेसेंस लाइफटाइम की एक ही आबादी में 3.1 एनएस(चित्रा 1 बी)की विशेषता फ्लोरेसेंस जीवनकाल के साथ होता है। ~ 3 एनएस विशेषता फ्लोरेसेंस लाइफटाइम अवशेष 56 के आसपास एक स्थानीय संरचना को इंगित करता है, जो समाधान में α-सिन की ~ 1.5 एनएस आजीवन उप-आबादी में मौजूद नहीं है, जब पेचिक हेयरपिन का गठन होता है और एसडीएस वेसिकल सतह के लिए बाध्यकारी होता है तो संरचना α-सिन से गुजरता है। दिलचस्प बात यह है कि एकल आबादी में ~ 3.5 एनएस आजीवन उप-आबादी के सापेक्ष एक छोटी विशेषता फ्लोरेसेंस आजीवन है α-सिन समाधान में।

एकल अणु फटने की दो अलग केंद्रीय वितरित उप-आबादी की उपस्थिति आणविक विषमता का एक प्रसिद्ध हस्ताक्षर है। चूंकि अलग लेबल वाले अणुओं का कोई मिश्रण शामिल नहीं है, इसलिए दोनों आजीवन उप-आबादी α-सिन(चित्रा 1A)में SCy3 लेबलिंग अवशेषों 56 की दो अलग प्रजातियों का प्रतिनिधित्व करती है। इसलिए, परिणाम गतिशील विषमता की रिपोर्ट करते हैं। इसका कारण यह है कि हिस्टोग्राम में रिपोर्ट किए गए पैरामीटर की गणना कॉन्फोकल वॉल्यूम के अंदर डिफ्यूजिंग α-सिन की कुछ एमएस अवधि में एक फट में सभी फोटॉनों का उपयोग करके की जाती है। इसलिए, SCy3-लेबल α-Syn अणुओं या तो जब एक छोटे या एक लंबे समय से मतलब जीवनकाल का प्रदर्शन कॉन्फोकल मात्रा को पार कर गया । इन प्रजातियों के बीच संक्रमण कॉन्फोकल स्पॉट के माध्यम से विशेषता प्रसार समय की तुलना में धीमा होना चाहिए, इसलिए कुछ मिलीसेकंड की तुलना में धीमा होना चाहिए। इस गतिशील व्यवहार का आकलन करने के लिए, हमने फट-ऑड-ईवन विश्लेषण47किया। संक्षेप में, चूंकि हम एक एकल अणु फट की अवधि से अधिक समय में होने वाली गतिशीलता का आकलन करना चाहते हैं, इसलिए हमने इस संभावना का परीक्षण किया कि एक α-सिन अणु कॉन्फोकल स्पॉट के लगातार क्रॉसिंग के बीच SCy3 मतलब फ्लोरेसेंस जीवनकाल में परिवर्तन प्रदर्शित करता है। ऐसा करने के लिए, हम पहले लगातार फटने के दो प्रकार के बीच अंतर: i) फट जुदाई समय है कि सेकंड में वितरित के साथ विभिंन α-Syn अणुओं के लगातार फटने, और ii) एक ही α-Syn अणु है कि एक फट जुदाई समय के बाद confocal मात्रा में recurs के लगातार फटने, कई बार के रूप में ~१०० एमएस(चित्रा 2A)के रूप में धीमी गति से । दो मतलब आजीवन उप आबादी के बाद, हम लगातार फटने कि सबसे १०० एमएस(चित्रा 2A)में से अलग कर रहे है के जोड़े का निरीक्षण करने के लिए चुना है, जहां फटने की जोड़ी से बाहर कम जीवन काल के भीतर मतलब फ्लोरेसेंस जीवन काल का प्रदर्शन (0-2 ns) या लंबे जीवन काल के भीतर उप जनसंख्या (>३.५ ns; चित्रा 2B,रंगीन रंगों) । निरीक्षण परीक्षण जो आवर्ती फटने के फटने की, लगातार फटने की जोड़ी में दूसरे फटने का प्रतिनिधित्व किया, प्रदर्शन जीवन काल के भीतर फ्लोरेसेंस जीवन काल का मतलब है पहले फट में एक के विपरीत जनसंख्या । कोई भी यह देख सकता है कि अणुओं का एक अंश जो कम जीवनकाल की उप-जनसंख्या में फटने के रूप में शुरू होता है, उस सीमा के बाहर और यहां तक कि लंबे समय तकउप-जनसंख्या (चित्रा 2C)के भीतर भी, और यह कि अणुओं का एक अंश जो लंबे समय तक उप-जनसंख्या में फटने के रूप में शुरू होता है, उस सीमा के बाहर और यहां तक कि छोटे जीवनकाल की उप-आबादी(चित्रा 2 डी)के भीतर भी। सभी 10-100 एमएस के भीतर।

Figure 1
चित्रा 1:α-Syn A56C में SCy3 लेबलिंग अवशेषों 56 की औसत फ्लोरेसेंस आजीवन उप-आबादी। 5 एमएम एसडीएस की अनुपस्थिति (ए) और उपस्थिति (बी) में स्वतंत्र रूप से डिस्टर्बिंग sCy3-लेबल α-Syn A56C (25 पीएम पर) के फ्लोरेसेंस लाइफटाइम हिस्टोग्राम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:PIFE फट पुनरावृत्ति विश्लेषण से पता चलता है व्यक्तिगत अणुओं १०० एमएस के भीतर विभिंन औसत जीवन काल के मूल्यों के बीच संक्रमण से गुजरना । ऊपर से नीचे तक:(क)लगातार एकल अणु फटने के बीच जुदाई समय का हिस्टोग्राम । नारंगी छाया आवर्ती अणुओं के लगातार फटने के बीच जुदाई समय का प्रतिनिधित्व करती है, जहां पहले और दूसरे फटने एक ही अणु से उत्पन्न होते हैं । (ख)सभी एकल अणु फटने का मतलब फ्लोरेसेंस लाइफटाइम हिस्टोग्राम । पीले और हरे रंग क्रमशः कम और लंबे समय तक मतलब आजीवन उप-आबादी के भीतर मूल्यों का प्रतिनिधित्व करने के लिए चुने गए औसत आजीवन मूल्यों की सीमा का प्रतिनिधित्व करते हैं। (ग)या(घ)। नारंगी-छायांकित टाइमस्केल (ए में)के भीतर एक समय तक पिछले फटने से अलग किए गए फटने के मतलब फ्लोरेसेंस लाइफटाइम हिस्टोग्राम, और जहां पिछले फट में क्रमशः पीले या हरे रंगों द्वारा प्रतिनिधित्व की गई सीमा के भीतर एक औसत जीवनकाल था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

α - सिन और उसके अव्यवस्थित स्वरूप 33 , 35 ,36,37, 37 ,38की संरचनात्मक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए व्यापक जैव रासायनिक और जैव भौतिक अध्ययन किए गए . कई कार्यों ने पहले से ही बाध्यकारी से मुक्त α-सिन मोनोमर की अंतर-आणविक गतिशीलता की जांच करने के लिए स्वतंत्र रूप से फैलाना-स्मिट्रेट का उपयोग किया है। इन कार्यों ने α-सिन की उच्च गतिशील विषमता की सूचना दी, जो कॉन्फोकल स्पॉट के माध्यम से ठेठ प्रसार समय के भीतर कई विभिन्न संरचनात्मक प्रजातियों के औसत-बाहर की ओर जाता है, जिससे एक ही FRETआबादी 39,40की उपस्थिति होती है। हालांकि, किसी को याद रखना चाहिए कि 3-10 एनएम के भीतर होने वाली अंतर-डाई दूरी में परिवर्तन पर smFRET माप रिपोर्ट, एक छोटे प्रोटीन में समग्र संरचनात्मक परिवर्तन जैसे α-सिन की विशेषता वाला पैमाना।

हम इस बात के लिए उत्सुक थे कि एक प्रोटीन के भीतर स्थानिक परिवर्तनों के एक अलग फ्लोरेसेंस-आधारित सेंसर का उपयोग करते समय हमें क्या परिणाम मिल सकते हैं जो स्थानीय संरचनात्मक गतिशीलता के प्रति संवेदनशील है और इसका उपयोग एकल-अणु स्तर पर भी किया गया है । smPIFE 0-3 एनएम रेंज में एक विशिष्ट अमीनो एसिड अवशेषों लेबलिंग आसपास के स्थानिक परिवर्तनों को ट्रैक कर सकते हैं ।

इस अध्ययन में, हमने α-सिन के भीतर स्थानीय संरचनाओं की गतिशीलता की जांच करने के लिए smPIFE का उपयोग किया और एनएसी अवशेष 56 के पास अधिक विशेष रूप से स्थानीय संरचना परिवर्तन। परिणाम बताते हैं कि α-सिन में अवशेष 56 के आसपास का क्षेत्र कुछ अलग संरचनात्मक उप-आबादी को प्रदर्शित करता है जो 100 एमएस के रूप में धीमी गति से इंटरकनवर्ट करने के लिए पर्याप्त थर्मोडायनामिक रूप से स्थिर हैं, और शायद धीमी भी। इन उप आबादी मापा sCy3 लेबल एकल α-Syn अणुओं के मतलब फ्लोरेसेंस जीवन काल के निरीक्षण के माध्यम से पहचाने जाते हैं । इन उप-आबादी में, उप-आबादी की विशेषता फ्लोरेसेंस जीवनकाल जितना अधिक है, उतना ही पास की एक प्रोटीन सतह SCy3 के उत्तेजित-राज्य आइसोमराइजेशन को बाधित करती है, और इसलिए प्रोटीन सतह उस sCy3-लेबल अवशेषों के करीब है।

अन्य आईडीपीएस की तरह, α-सिन को अन्य जैव अणुओं के साथ-साथ आत्म-संघ के साथ बातचीत करने की सूचना दी गई है, जहां कई मामलों में इन बाध्यकारी घटनाओं में α-सिन सबयूनिट56,57,58,59के भीतर एक विशिष्ट संरचना का स्थिरीकरण शामिल है। कुछ प्रोटीन एक प्रेरित-फिट तंत्र के माध्यम से बाध्यकारी पर एक विशिष्ट संरचना प्राप्त करते हैं। हालांकि अन्य प्रोटीन अनायास कई अलग-अलग संरचनाओं के बीच आपस में छेड़छाड़ करते हैं, और एक विशिष्ट बायोमॉलिक्यूल के लिए बाध्यकारी घटना केवल पहले से मौजूद संरचनाओं में से एक को स्थिर करती है। बाद के मामले के लिए, आवश्यकताओं में से एक यह है कि संरचना को स्थिर करने के लिए प्रारंभिक बाध्यकारी को समायोजित करने के लिए काफी लंबे समय तक जीवित रहेगा । इसलिए, प्रोटीन में एक संरचनात्मक क्षेत्र जितना लंबा जीवित रहता है, बाध्यकारी दक्षता उतनी ही अधिक होगी। हमारा सुझाव है कि मनाया मिलीसेकंड स्थिर उप-आबादी अवशेष 56 के आसपास स्थानीय संरचना की विशिष्ट प्रजातियों के अस्तित्व का प्रतिनिधित्व करते हैं। ये एनएसी और एनटीडी खंडों के मध्य में विभिन्न स्थानीय संरचना प्रजातियों को इंगित करते हैं। हाल ही में एक काम में, हम इस और इन खंडों में अन्य sCy3-लेबल अवशेषों की रिपोर्ट भी ऐसीउप-आबादी 60प्रदर्शित करते हैं। यह परिणाम यह दर्शाता है कि मुक्त α-सिन मोनोमर की संरचनात्मक गतिशीलता को सबसे तेजी से (अधिकांश40पर कुछ माइक्रोसेकंड) समग्र प्रोटीन गतिशीलता के रूप में वर्णित किया जा सकता है, जो स्थानीय संरचनात्मक खंडों को ले जाता है जो मिलीसेकंड के लिए स्थिर रहते हैं। ताऊ और एमिलॉयड-β जैसे अन्य आईडीपी को स्थानीय संरचित क्षेत्र48 , 49,50ले जाने की समान विशेषताओं को साझा करने के लिए जानाजाताथा।

smPIFE मुख्य रूप से अलग जैव अणुओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहां, हम एक ही प्रोटीन के खंडों के भीतर PIFE की जांच करने के लिए smPIFE को रोजगार देते हैं। यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि पिछले एसएमपीआईएफ प्रयोगों में से अधिकांश एकल स्थिरsCy3-लेबल अणुओं13, 14, 15, 16,17,18,19,51,52, 53की फ्लोरेसेंस तीव्रता में सापेक्ष परिवर्तनों को ट्रैक करके किए गए थे। . स्थिर अणुओं के लिए उपयोगी है, जबकि स्वतंत्र रूप से फैलाना एकल अणुओं को मापने पर यह प्रक्रिया कम जानकारीपूर्ण है । ह्वांग एट अल ने दिखाया है कि फ्लोरेसेंस लाइफटाइम्स में बदलाव पर नज़र रखकर भी PIFE प्रभाव को कैसे मापने के लिए, जो सीधे SCy319के उत्तेजित राज्य isomerization गतिशीलता में परिवर्तन पर रिपोर्ट करते हैं । यहां हम फ्लोरेसेंस तीव्रता में सापेक्ष परिवर्तनों पर नज़र रखने के बजाय, sCy3 मतलब फ्लोरेसेंस लाइफटाइम के माध्यम से एकल फैलाना α-Syn के PIFE प्रभाव की जांच करते हैं। ऐसा करने से, हम confocal स्थान में प्रत्येक एक α-Syn अणु के छोटे निवास समय के बावजूद PIFE से संबंधित उप आबादी प्राप्त करने में सक्षम थे । वास्तव में, मतलब फ्लोरेसेंस जीवन काल न केवल PIFE से संबंधित उप-आबादी को परिभाषित करने में उपयोगी साबित हुआ, बल्कि फट पुनरावृत्ति विश्लेषण ढांचे47का उपयोग करके धीमी पीआईएफई से संबंधित गतिशीलता का आकलन करने में भी उपयोगी साबित हुआ। हालांकि, प्रक्रियाओं को विकसित करने में अधिक काम की आवश्यकता होती है जो तेजी से PIFE गतिशीलता का ठीक से आकलन करने की अनुमति देगा। बहुत सारे मौजूदा फोटॉन सांख्यिकी उपकरण हैं, जिनका उपयोग स्वतंत्र रूप से फैलाने वाले एसएमएफआरएफईटी प्रयोगों में तेजी से एफआरटी गतिशीलता का आकलन करने के लिए कियाजाताहै, जिसका हम54, 55में उपयोग करने के लिए पुन: उद्देश्य का इरादा रखते हैं।

संक्षेप में, इस काम में हमने α-सिन में स्थानीय संरचनाओं की एमएस-स्थिर उप-आबादी की पहचान करने के लिए स्वतंत्र रूप से फैलाने वाले एकल अणुओं के PIFE मापों के अपेक्षाकृत नए संयोजन का उपयोग किया, जो smFRET द्वारा बरामद नहीं किए गए थे। हम एक मॉडल IDP के रूप में α-Syn अध्ययन करने के लिए smPIFE माप कार्यरत है और हमारे परिणाम α के पिछले निष्कर्षों से परे का विस्तार-Syn विश्व स्तर पर अस्त-व्यस्त किया जा रहा है । निष्कर्षों का सुझाव है α-Syn एमएस स्थिर आदेश दिया स्थानीय संरचनाओं ले सकता है और हम परिकल्पना इन स्थानीय संरचनाओं बाध्यकारी मांयता में एक भूमिका की सेवा कर सकते हैं ।

इस प्रकार अब तक, smPIFE का उपयोग उनके अवेलेबल प्रोटीन समकक्षों51के साथ sCy3-लेबल वाले न्यूक्लिक एसिड की बातचीत का अध्ययन करने के साधन के रूप में किया जाता था। इसके द्वारा, स्मिफीफ को जैव आणविक बातचीत को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उपयोग किया गया था, और इसलिए उस दिशा में प्राकृतिक अगला कदम प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और उनकी गतिशीलता, एक समय में एक जटिल को समझने के लिए इसका उपयोग करना होगा।

एक छोटी दूरी की निकटता सेंसर जैसे smPIFE का उपयोग करने की शक्ति अस्त-व्यस्त और संरचनात्मक रूप से अस्थिर माने जाने वाले अन्य प्रोटीन प्रणालियों के भीतर स्थिर स्थानीय संरचना की पहचान करने में सहायता कर सकती है। हालांकि, एकल अणु फ्लोरेसेंस आधारित लघु निकटता सेंसर का उपयोग करने की शक्ति वहां बंद नहीं होती है। कई बायोमॉलिक्यूलर सिस्टम हैं जो उनके कार्य को सुविधाजनक बनाने के लिए छोटे पैमाने पर अनुरूप गतिशीलता प्रदर्शित करते हैं, जैसे कि कई आयन चैनल। हमारा मानना है कि smPIFE एकल अणु FRET के पूरक उपकरण के रूप में काम कर सकते हैं, ऐसे मामलों में जहां प्रोटीन प्रणाली के भीतर निकटता परिवर्तन की गतिशील सीमा दूरी FRET की गतिशील सीमा से मेल नहीं खाती है FRET का पता लगाने और हल कर सकते हैं । संक्षेप में, हम एक-अणु FRET माप के पूरक निकटता-सेंसर के रूप में smPIFE के उपयोग को बढ़ावा देते हैं, ताकि जैव अणु निकटता के व्यापक पैमाने को कवर किया जा सके, और शायद स्थिर संरचनाओं पर रिपोर्टिंग करने वाले मापा गए मापदंडों की स्पष्ट मिलीसेकंड-औसत उप-आबादी का निरीक्षण करें जो या तो स्थानीय या समग्र हैं।

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Disclosures

सभी लेखकों के हितों का कोई टकराव का हिस्सा है ।

Acknowledgments

पीटी-टी7 प्लाज्मिड एन्कोडिंग ए56सी α-सिन म्यूटेंट हमें डॉ आसफ ग्रुपी, डॉ डैन आमिर और डॉ एलिशा हास से वर्तमान के रूप में दिया गया था । इस कागज स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH, अनुदान R01 GM130942 एक उपवर्ण के रूप में ईएल के लिए), इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (KillCorona के भीतर अनुदान 3565/20-कोरोनावायरस अनुसंधान कार्यक्रम पर अंकुश लगाने), Milner कोष और यरूशलेम के हिब्रू विश्वविद्यालय (स्टार्टअप फंड) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merc C7715 cutoff: 100 kDa
ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
BSA Sigma-Aldrich A9647
cysteamine Sigma-Aldrich 30070
dialysis bags - MEGA GeBaFlex-tube Gene Bio-Application MEGA320
dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Fast SeeBand staining solution Gene Bio-Application SB050
Glycine Sigma-Aldrich 50046
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES Sigma-Aldrich 54457
HiTrap Desalting 5 mL Sigma-Aldrich GE17-1408
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX) Sigma-Aldrich 238813
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
LB broth Sigma-Aldrich L3152
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63068
MonoQ column Sigma-Aldrich 54807
protein LoBind tube Sigma-Aldrich EP0030108094 0.5 mL
Rinse a µ-slide 18 Ibidi 81816
SDS Sigma-Aldrich 75746
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich 71507
Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas mini-plast 815-004-05-001
streptomycin sulfate Sigma-Aldrich S9137
sulfo-Cy3 maleimide abcam ab146493
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich 75259
Tris-HCl Sigma-Aldrich 93363
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625

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बायोकेमिस्ट्री अंक 171 एकल-अणु प्रोटीन-प्रेरित फ्लोरेसेंस वृद्धि फ्लोरेसेंस लाइफटाइम्स α-सिन्यूक्लिन संरचनाएं गतिशीलता आंतरिक रूप से अस्त-व्यस्त प्रोटीन
एक समय में स्थिर स्थानीय संरचना एक α-सिन्यूक्लिन मोनोमर की पहचान करने के लिए समय-संकल्पित प्रोटीन-प्रेरित फ्लोरेसेंस एन्हांसमेंट का उपयोग करना
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Zaer, S., Lerner, E. Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One α-Synuclein Monomer at a Time. J. Vis. Exp. (171), e62655, doi:10.3791/62655 (2021).

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