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Biochemistry

Utilizzo del miglioramento della fluorescenza indotta da proteine risolte nel tempo per identificare le conformazioni locali stabili un monomero α-sinucleina alla volta

Published: May 30, 2021 doi: 10.3791/62655
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Il potenziamento della fluorescenza indotto da proteine a singola molecola risolto nel tempo è un utile sensore di prossimità spettroscopico a fluorescenza sensibile ai cambiamenti strutturali locali nelle proteine. Qui mostriamo che può essere usato per scoprire conformazioni locali stabili in α-sinucleina, che è altrimenti nota come globulare non strutturata e instabile quando misurata usando il righello FRET a lungo raggio.

Abstract

L'uso di righelli spettroscopici per tracciare più conformazioni di singole biomolecole e le loro dinamiche hanno rivoluzionato la comprensione delle dinamiche strutturali e dei suoi contributi alla biologia. Mentre il righello basato su FRET riporta le distanze inter-coloranti nell'intervallo 3-10 nm, altre tecniche spettroscopiche, come il potenziamento della fluorescenza indotto da proteine (PIFE), riportano la vicinanza tra un colorante e una superficie proteica nell'intervallo più breve di 0-3 nm. Indipendentemente dal metodo di scelta, il suo uso nella misurazione di biomolecole a diffusione libera una alla volta recupera gli istogrammi del parametro sperimentale producendo sotto-popolazioni separate distribuite centralmente di biomolecole, dove ogni sotto-popolazione rappresenta una singola conformazione che è rimasta invariata entro millisecondi, o più conformazioni che si interconvertono molto più velocemente dei millisecondi, e quindi una sotto-popolazione mediata. Nel FRET a singola molecola, dove il parametro riportato negli istogrammi è l'efficienza FRET inter-colorante, una proteina intrinsecamente disordinata, come il monomero α-sinucleina in tampone, è stata precedentemente segnalata come esibiva una singola sotto-popolazione mediata di conformazioni multiple che si interconvertono rapidamente. Mentre questi risultati passati dipendono dall'intervallo di 3-10 nm del righello basato su FRET, abbiamo cercato di mettere alla prova questa proteina usando PIFE a singola molecola, dove tracciamo la durata di fluorescenza delle proteine α-sinucleina labelte sCy3 sito-specifiche una alla volta. È interessante notare che, utilizzando questo sensore di prossimità spettroscopico a corto raggio, la α-sinucleina etichettata sCy3 presenta diverse sotto-popolazioni di vita con una vita media nettamente diversa che si interconverte in 10-100 ms. Questi risultati mostrano che mentre α-sinucleina potrebbe essere disordinata a livello globale, raggiunge comunque strutture locali stabili. In sintesi, in questo lavoro evidenziamo il vantaggio di utilizzare diversi sensori di prossimità spettroscopici che tracciano i cambiamenti strutturali locali o globali una biomolecola alla volta.

Introduction

Negli ultimi due decenni, i metodi basati sulla fluorescenza a singola molecola sono diventati un potente strumento per misurare le biomolecole1,2,sondando come si distribuiscono i diversi parametri biomolecolari e come si interconvertono dinamicamente tra diverse sotto-popolazioni di questi parametri a risoluzione inferiore al millisecondo3,4,5. I parametri in queste tecniche includono l'efficienza di trasferimento di energia nelle misure FRET 6,7,l'anisotropia di fluorescenza8,9,i rendimenti quantistici di fluorescenza e le durate10,11,in funzione di diversi meccanismi di temprafluorescenza 12 o di potenziamento13. Uno di questi meccanismi, meglio noto come protein-induced fluorescence enhancement (PIFE)14 introduce il potenziamento della resa quantistica e della durata della fluorescenza in funzione dell'ostruzione sterica all'isomerizzazione libera del fluoroforo quando in stato eccitato, causata da superfici proteiche in prossimità del colorante14,15,16,17,18,19 . Sia FRET che PIFE sono considerati righelli spettroscopici o sensori di prossimità poiché il loro parametro misurato è direttamente collegato a una misura spaziale all'interno della biomolecola etichettata in fase di misurazione. Mentre l'efficienza FRET è correlata alla distanza tra una coppia di coloranti entro un intervallo di 3-10 nm20, PIFE traccia aumenti delle rese quantistiche di fluorescenza o della durata di vita legate alla distanza tra il colorante e una superficie di una proteina vicina nell'intervallo di 0-3 nm19.

La FRET a singola molecola è stata ampiamente utilizzata per fornire informazioni strutturali su molti sistemi proteici diversi, tra cui proteine intrinsecamente disordinate (IDP)21, come α-Sinucleina (α-Syn)22. α-Syn può formare strutture ordinate in seguito al legame a diverse biomolecole e in diverse condizioni23,24,25,26,27,28,29,30. Tuttavia, quando non legato, il monomero α-Syn è caratterizzato da un'elevata eterogeneità conformazionale con conformazioni rapidamente interconvertite31,32.

Le conformazioni di α-Syn sono state studiate in precedenza utilizzando varie tecniche diverse che aiutano a identificare la dinamica conformazionale di tali sistemi proteici altamente eterogenei e dinamici33,34,35,36,37,38,39. È interessante notare che le misurazioni FRET a singola molecola (smFRET) di α-Syn nel buffer hanno riportato una singola popolazione FRET39,40 che è il risultato della media temporale delle conformazioni che si interconvertono dinamicamente a volte molto più velocemente del tempo di diffusione tipico di α-Syn attraverso il punto confocale (tempi veloci come pochi microsecondi e anche più veloci di quello, rispetto ai tipici tempi di diffusione al millisecondo)40, 41. Tuttavia, l'uso di un righello spettroscopico FRET con la sensibilità alla distanza di 3-10 nm a volte riporta solo i cambiamenti strutturali complessivi in una piccola proteina come α-Syn. Le misurazioni a singola molecola che utilizzano sensori di prossimità spettroscopici con sensibilità a distanza più breve hanno il potenziale per riferire sulla dinamica delle strutture locali. Qui eseguiamo misurazioni PIFE a singola molecola di α-Syn e identifichiamo diverse sotto-popolazioni di vite di fluorescenza mappate a diverse strutture locali con transizioni tra loro lente fino a 100 ms. Questo lavoro riassume le misurazioni smPIFE risolte nel tempo di molecole α-Syn a diffusione libera una alla volta, in buffer e quando legate a membrane basate su SDS come sensore di prossimità spettroscopico a singola molecola a corto raggio.

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Protocol

1. Trasformazione del plasmide

  1. Preparazione di 0,5 L di mezzo SOC
    1. Pesare 10 g di triptone, 2,5 g di estratto di lievito, 0,25 g di cloruro di sodio (NaCl), 0,1 g di cloruro di potassio (KCl).
    2. Aggiungere acqua a doppia distillazione (DDW) fino a un volume totale di 0,5 L.
    3. Regolare a pH 7 aggiungendo idrossido di sodio (NaOH).
    4. Preparare aliquote di riserva di 100 ml e autoclave.
    5. Prima dell'uso, aggiungere 0,5 mL di cloruro di magnesio sterile (MgCl2) e 1,8 mL di glucosio sterile a 100 mL di SOC.
  2. Scongelare BL21 (DE3) cellule competenti di Escherichia coli su ghiaccio.
  3. Mescolare delicatamente le cellule competenti.
  4. Preparare due tubi da 15 ml. Etichettare uno come tubo di reazione di trasformazione e l'altro come tubo di controllo.
  5. Aliquota 100 μL delle cellule competenti nei tubi.
  6. Aggiungere 1 μL di plasmide ad una concentrazione di 0,1 ng/μL nel tubo di reazione di trasformazione.
  7. Riscaldare il mezzo SOC a bagnomaria a 42 °C per l'uso nel passaggio 1.8.
  8. Impulso termico dei due tubi a bagnomaria a 42 °C per una durata di 45 secondi. (Passaggio critico!)
  9. Aggiungere 900 μL di mezzo SOC riscaldato a ciascun tubo.
  10. Incubare i tubi a 37 °C per una durata di 45 minuti con agitazione ad una velocità di 225 giri/min.
  11. Distribuire 200 μL delle cellule con il plasmide trasformato su una piastra LB (Luria-Bertani)-agar contenente 100 μg/mL di ampicillina, utilizzando uno spandicellulare sterile.
  12. Distribuire 200 μL delle cellule con il plasmide trasformato su una piastra LB-agar senza ampicillina, utilizzando uno spargitore sterile (controllo positivo).
  13. Distribuire 200 μL delle cellule di controllo (non contenenti un plasmide) su una piastra LB-agar contenente 100 μg/mL di ampicillina, utilizzando uno spargitore sterile(controllo negativo).
  14. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C.

2. Preparazione proteica

  1. Espressione e purificazione ricombinante α-sinucleina
    1. Scegliere una singola colonia e coltivare in 100 ml di terreno liquido autoclavato LB (Luria-Bertani) contenente 100 μg/mL di ampicillina a 37 °C (starter).
    2. Preparare quattro palloni Erlenmeyer da 2 L, ciascuno contenente 1 L di LB medio autoclavato e 100 μg/mL di ampicillina (inoculazione di grandi dimensioni).
    3. Misurare la densità ottica (OD a λ = 600 nm) della soluzione cellulare. Quando la densità cellulare dello starter raggiunge un ODλ=600nm di 0,6-0,7, aggiungere 10 mL di soluzione di avviamento per ogni 1 L di terreno LB preparato nella fase precedente.
    4. Coltivare i mezzi batterici in uno shaker incubatore a 37 °C e una velocità di 200 giri/min.
    5. Quando la densità cellulare raggiunge un ODλ =600nm di 0,6-0,8, indurre l'espressione proteica aggiungendo isopropil β-d-1-tiogalattopoliranoside (IPTG) per ogni 1 L di terreno di crescita ad una concentrazione finale di 1 mM.
      NOTA: Sciogliere 0,96 g di IPTG in 4 mL di DDW e aggiungere 1 mL della soluzione IPTG risultante per ogni 1 L di crescita batterica.
    6. Far crescere le cellule per una durata di 4 ore e raccoglierle per centrifugazione in tubi da 50 ml ad una velocità di 5.170 x g per una durata di 8 minuti.
      NOTA: In ogni round, scartare il surnatante, tenere il pellet e riempire nuovamente gli stessi tubi con la crescita batterica.
    7. Conservare il pellet batterico in un congelatore (ad esempio, -80 °C) per il giorno successivo.
    8. Il giorno successivo, preparare 200 mL di tampone di lisi: 40% (p / v) saccarosio e tampone A, che include 30 mM Tris-HCl, 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 2 mM ditiotreitolo (DTT) a pH 8,0.
    9. Aggiungere 25 ml di tampone di lisi a ciascun tubo con pellet batterico.
    10. Sospendere di sospendere il pellet (utilizzare pipette di plastica sterile Pasteur) nel tampone di Lisi (vedere 2.1.8).
    11. Preparare il matraccio Erlenmeyer sterile da 250 ml con un magnete agitatore su ghiaccio.
    12. Aggiungere 5 mL di tampone di lisi, quindi trasferire le celle omogenee ri-sospese ad esso.
    13. Mescolare le celle per una durata di 20 minuti a 200 giri / min a temperatura ambiente.
    14. Dividere la soluzione in tubi da 50 mL e centrifugare a 4 °C per una durata di 30 minuti ad una velocità di 17.400 x g.
    15. Scartare il surnatante.
    16. Preparare il matraccio Erlenmeyer sterile da 250 ml con magnete agitatore su ghiaccio.
    17. Aggiungere 15 mL di tampone di dissoluzione (90 mL di tampone raffreddato A e 37 μL di MgCl2 disciolto oltre il limite di solubilità e filtrato) in ciascun tubo. Utilizzare pipette Pasteur di plastica sterili e sciogliere il pellet.
    18. Quando una parte della soluzione diventa omogenea, spostarla in un matraccio Erlenmeyer mescolato su ghiaccio.
    19. Determinare il volume della soluzione in Erlenmeyer.
    20. Aggiungere 10 mg di streptomicina solfato per ogni 1 mL di soluzione (prima di aggiungere, sciogliere la streptomicina solfato in 2 mL di tampone A).
      NOTA: Questo passaggio viene eseguito al fine di rimuovere il DNA e i ribosomi.
    21. Mescolare la soluzione per una durata di 10-20 minuti a temperatura ambiente.
    22. Dividere la soluzione in tubi da 50 mL e centrifugare a 4 °C e ad una velocità di 20.700 x g per una durata di 30 minuti.
    23. Raccogliere il surnatante ed scartare il pellet.
    24. Preparare un matraccio Erlenmeyer sterile da 250 ml su ghiaccio con un agitatore.
    25. Filtrare il surnatante utilizzando un filtro a siringa da 0,22 μm nel matraccio Erlenmeyer pulito.
    26. Determinare il volume della soluzione e pesare 0,3 g di solfato di ammonio per ogni 1 mL di soluzione.
    27. A poco a poco, aggiungere il solfato di ammonio alla soluzione mescolata.
      NOTA: Questo passaggio viene eseguito per precipitare le proteine. Quando il solfato di ammonio lega le proteine, la soluzione diventa oscurata e sfocata, che si presenta come colore bianco.
    28. Mescolare per 30 minuti a temperatura ambiente.
    29. Dividere la soluzione in tubi da 50 mL e centrifugare a 4 °C e ad una velocità di 20.700 g per una durata di 30 minuti.
    30. Scartare con attenzione il surnatante e conservare il pellet.
    31. Sciogliere il pellet con 20 ml di Tampone A.
    32. Unificare tutte le soluzioni in un unico tubo, quindi misurare lo spettro di assorbimento UV della soluzione.
      NOTA: se lo spettro mostra una firma di aggregazione (assorbimento superiore a una lunghezza d'onda di 300 nm), continuare con il passaggio successivo. In caso contrario, saltare il passaggio successivo e passare al passaggio 2.1.34.
      NOTA: L'indice di aggregazione (A.I.) calcolato dagli spettri UV come ODλ=350nm/ (ODλ=280nm - ODλ=350nm) ×100. 41 anni
    33. Utilizzare tubi centriprep cutoff da 100 kDa e centrifugare ad una velocità di 3.590 x g a 4 °C per una durata di 15 minuti. Raccogliere il liquido che è passato attraverso il filtro.
    34. Dializzare la soluzione a 4 °C durante la notte, contro il tampone A, utilizzando sacche per dialisi con un cutoff di 3,5 kDa.
    35. Eseguire un altro ciclo di dialisi per una durata di almeno 4 ore.
    36. Caricare il campione dializzato su una colonna di scambio anionico MonoQ da 1 mL. Utilizzare un tampone Tris cloridrato (Tris-HCl) da 30 mM a pH 7,5 come tampone di lavaggio e un tampone Tris-HCl da 30 mM pH 7,5 con NaCl da 500 mM come tampone di eluizione.
    37. Inserire l'esempio nella colonna. Quindi lavare con 20 volumi di colonna (CV) di tampone di eluizione allo 0% e tampone di lavaggio al 100% per rimuovere le proteine non legate.
    38. Lavare con 7 CV di tampone di eluizione al 30%.
    39. Eluire il campione di proteina α-Syn utilizzando un gradiente che passa dal 30% al 100% tampone di eluizione per 30 CV, ad una portata di 1,5 ml/min.
      NOTA: α-Syn eluisce a 46-66 CV con conducibilità 20-24 mS/cm, che si riferisce al tampone di eluizione al 38-50%.
    40. Raccogli le frazioni del picco di eluizione principale. Verificare la presenza di α-Syn eseguendo campioni in elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecilsalfato di sodio al 15% (SDS-PAGE), dopo la colorazione con soluzione di colorazione Coomassie Blue o Fast SeeBand. È prevista una banda a 15 kDa.
    41. Unificare le frazioni rilevanti e dializzarle durante la notte, contro il tampone A, utilizzando sacche di dialisi con un cutoff di 3,5 kDa a 4 °C.
    42. Preparare aliquote del campione proteico e conservarle a -20 °C.
  2. Sinucleina α marcata Cy3
    1. Ridurre il tiolo del residuo di cisteina nel mutante α-Syn A56C aggiungendo DTT ad una concentrazione finale di 2 mM per una durata di 1 ora a temperatura ambiente.
    2. Rimuovere la DTT eseguendo due cicli di dialisi utilizzando sacche per dialisi da 3,5 kDa. Per il primo round, dializzare contro 30 mM Tris-HCl pH 8,0 e 2 mM EDTA. Per il secondo round, dializzare contro 50 mM HEPES pH 7,2 e 2 mM EDTA.
    3. Ridurre i residui di cisteina aggiungendo Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato (TCEP) al campione proteico, ad una concentrazione finale di 50 μM per una durata di 30 minuti a temperatura ambiente.
      NOTA: TCEP è un agente riducente non sulfidrilico, quindi mantiene i gruppi tiolici ridotti senza reagire con il colorante. Abbiamo aggiunto 0,5 μL da una soluzione stock di 1 M TCEP.
    4. Calcolare le quantità di proteine necessarie per il volume di reazione finale di 1 mL.
      NOTA: Ecco un esempio per il calcolo che abbiamo usato:
      20 μM di concentrazione proteica finale × 1 mL di volume finale = 56 μM di concentrazione proteica iniziale × proteina V da aggiungere
    5. Calcolare la quantità di colorante necessaria per il volume di reazione finale di 1 mL. L'etichettatura del colorante di una singola cisteina deve essere eseguita con colorante in eccesso, con un rapporto molare colorante/proteina di almeno 3:1.
      NOTA: un esempio per il calcolo che abbiamo usato:
      Concentrazione finale del colorante di 60 μM × 1 mL di volume finale = 370 μM di concentrazione iniziale del colorante × V da aggiungere
    6. Calcolare la quantità di tampone dal dializzato necessario per regolare il volume totale della reazione a 1 mL.
      NOTA: Esempio di calcolo: 1 mL - (V calcolato dal passo 2.2.4 + V calcolato dal passaggio 2.2.5)
    7. Preparare il flaconcino di reazione con un magnete sopra un agitatore.
    8. In primo luogo, aggiungere la quantità calcolata della proteina e il buffer. Successivamente, aggiungere la quantità calcolata del colorante (sulfo-Cy3 maleimmide).
    9. Mantenere la reazione a temperatura ambiente al buio per una durata di 3-5 ore.
    10. Terminare la reazione aggiungendo 2 mM DTT e continuare per una durata di 1 ora.
    11. Eseguire tre cicli di dialisi contro il tampone A, utilizzando sacche per dialisi con un cutoff di 3,5 kDa per rimuovere il colorante libero in eccesso dalla soluzione.
    12. Caricare il campione su una colonna di esclusione delle dimensioni per separare ulteriormente il α-Syn etichettato dal colorante libero.
    13. Determinare la concentrazione di α-Syn puro etichettato misurando l'assorbimento del colorante (il coefficiente di assorbimento per sulfo-Cy3 è 162.000 M-1cm-1a λ=548 nm).
    14. Se necessario, concentrare la soluzione pura etichettata α-Syn utilizzando un concentratore a vuoto (ad esempio, SpeedVac). Quindi, eseguire un ciclo di dialisi contro il tampone A, utilizzando sacche di dialisi con un cutoff di 3,5 kDa e determinare nuovamente la concentrazione della proteina etichettata.
    15. Preparare aliquote del campione proteico etichettato e conservarle a -20 °C.

3. Misurazioni

  1. Configurazione sperimentale smPIFE
    NOTA: utilizzare la seguente configurazione basata su confocale o simile.
    1. Utilizzare una sorgente laser pulsata (nel nostro caso, λ = laser pulsato a picosecondi da 532 nm con larghezza di impulso di ~ 100 ps FWHM), operante a una velocità di ripetizione adeguata (20 MHz nel nostro caso) e instradata al SYNC di una scheda di conteggio a singolo fotone correlato al tempo (TCSPC), come fonte di eccitazione sulfo-Cy3 (sCy3).
    2. Utilizzare uno specchio dicroico con elevata riflettività a 532 nm, per separare l'eccitazione e la dispersione dalla fluorescenza.
    3. Utilizzare un foro stenopeico di 100 μm di diametro al fuoco della luce emessa, dopo che il fascio di emissione collimato è stato focalizzato da una lente e prima che il raggio di emissione sia stato ri-collimato da un'altra lente.
    4. Utilizzare un filtro passa banda (585/40 nm nel nostro caso) per filtrare ulteriormente la fluorescenza sCy3 da altre sorgenti luminose.
    5. Rileva la fluorescenza utilizzando un rilevatore (diodo a valanga a singolo fotone o fotomoltiplicatore ibrido, nel nostro caso) instradato (attraverso un router 4 a 1, nel nostro caso) a un modulo TCSPC (Becker & Hickl SPC-150, nel nostro caso).
      NOTA: Nel nostro caso, l'acquisizione dei dati viene eseguita tramite il software VistaVision (ISSTM)nel formato di file time-tagged-time-resolved (TTTR).
  2. Preparazione del campione smPIFE
    1. Preparare 25 pM di α-Syn con etichetta sCy3 nel tampone di misurazione: 10 mM di acetato di sodio, 10 mM di sodio diidrogeno fosfato, 10 mM di glicina pH 8,0, 20 mM NaCl, 10 mM di cisteamina e 1 mM di acido 6-idrossi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-carbossilico (TROLOX), in un tubo a basso legame proteico.
      NOTA: se α-Syn viene misurato in presenza di vescicole SDS, aggiungere anche la quantità SDS appropriata.
    2. Risciacquare un vetrino per microscopia a 18 camere con 100 μL di albumina sierica bovina da 1 mg/mL (BSA) per una durata di 1 minuto, quindi rimuovere la BSA.
    3. Aggiungere 100 μL del campione α-Syn da 25 pM con etichetta sCy3 a una camera nella diapositiva del coperchio.
    4. Eseguire la misurazione smPIFE del campione utilizzando l'impostazione descritta, come riportato di seguito nei passaggi successivi.
  3. acquisizione dati smPIFE
    1. Utilizzare un obiettivo ad immersione in acqua ad alta apertura numerica (nel nostro caso, Olympus UPLSAPO 60x N.A. 1.2) e aggiungere una goccia di acqua ultrapura sopra l'obiettivo.
    2. Fissare il vetrino di copertura in una camera di palcoscenico e installarlo sopra lo stadio del microscopio.
    3. Portare la lente dell'obiettivo verso l'alto, fino a quando la goccia d'acqua sulla parte superiore della lente dell'obiettivo si spalma nella parte inferiore della diapositiva del coperchio.
    4. Aprire l'otturatore laser e portare l'obiettivo verso l'alto, mentre si ispeziona il modello su una fotocamera CMOS, raccogliendo la luce diffusa dal campione. Osserva il modello degli anelli Airy: il primo rappresenta il focus sull'interfaccia acqua-vetro, e poi il secondo rappresenta il focus sull'interfaccia tra il vetro e la soluzione campione.
    5. Aumentare l'altezza della lente dell'obiettivo di ulteriori 75 μm, portando la messa a fuoco laser in profondità nella soluzione, per ridurre al minimo l'autofluorescenza dalla superficie di vetro del coperchio.
    6. Sintonizzare la potenza del laser sulla lente dell'obiettivo in modo che sia ~ 100 μW.
    7. Iniziare l'acquisizione dei fotoni rilevati per un tempo predefinito (2 ore, nelle nostre misurazioni).
      NOTA: la maggior parte del segnale di acquisizione dovrebbe avere una velocità (misurata in conteggi al secondo, cps) simile a quella acquisita quando si misura solo il buffer; i dati binned al millisecondo dovrebbero mostrare scarsi eventi di burst di fotoni, con la maggior parte dei contenitori che ha una velocità media paragonabile alla tipica frequenza di sfondo del rivelatore (< 1.000 cps, nel nostro caso).

4. analisi del burst smPIFE

  1. Conversione di dati grezzi
    NOTA: I dati vengono solitamente memorizzati in un file binario con un formato predefinito dalla società che produce la scheda TCSPC (file .spc nel nostro caso).
    1. Convertire il file di dati grezzi nel formato di file universale fotone-HDF542, utilizzando la suite di software phconvert (https://github.com/Photon-HDF5/phconvert). Chiamare il file di dati grezzi come input e convertirlo in un file .hdf5 di dati grezzi utilizzando il codice appropriato nella suite phconvert (il Converti i file ns-ALEX Becker-Hickl in Photon-HDF5.ipynb Jupyter notebook, nel nostro caso).
      NOTA: la conversione in un file .hdf5 include: (1) la determinazione dei flussi di fotoni rilevanti nei dati grezzi (ad es. flussi di fotoni di fotoni registrati dell'ID del rivelatore pertinente); (2) i nanotempi di fotone pertinenti (i tempi di rilevamento dei fotone relativi al tempo SYNC di eccitazione); e (3) aggiunto di metadati.
  2. Burst Search and Selection utilizzando FRETbursts43
    NOTA: Tutti i file di dati grezzi fotoni-HDF5 delle misurazioni smPIFE, così come il codice che riassume l'analisi dei dati grezzi, sono memorizzati in Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4587698). Tutti i passaggi seguenti sono dettagliati e mostrati all'interno dei notebook Jupyter, forniti anche nel collegamento al repository Zenodo.
    1. Apri i Quaderni Jupyter (all'interno del framework Anaconda, nel nostro caso).
    2. Aprire il notebook smPIFE-aSyn 56C(Cy3) 25 pM newBuffer (Final notebook).ipynb (si trova nel link Zenodo).
    3. Carica FRETbursts.
    4. Caricare il file di dati del fotone HDF5.
    5. Valutazione della velocità BG: utilizzando l'istogramma dei tempi inter-fotoni, calcolare le velocità di sfondo (BG) per ogni 30 secondi di acquisizione dati nel file di dati HDF5 del fotone.
      NOTA: i seguenti passaggi descrivono la ricerca burst utilizzando l'algoritmo della finestra scorrevole44,45,46.
    6. Spostare una finestra temporale di m=20 fotoni consecutivi, un fotone alla volta.
    7. Raccogliere i dati fotonici solo se la velocità istantanea del fotone, ( Equation 1 ), è almeno F=11 volte maggiore della velocità BG per quel periodo di acquisizione dei dati.
      NOTA: un burst è costruito da tutti i fotoni consecutivi che sono stati raccolti facendo scorrere la finestra un fotone alla volta (passo 4.2.6.) e concordando con il criterio della velocità del fotone (passo 4.2.7).
    8. Calcola le seguenti caratteristiche di scoppio:
      Dimensione del burst: la quantità di fotoni in una raffica.
      Durata dello scoppio: la differenza di tempo tra l'ultimo e il primo tempo di rilevamento del fotone in una raffica.
      Luminosità di raffica: il valore più grande della velocità istantanea di fotone in una raffica.
      Burst separation: l'intervallo di tempo tra raffiche consecutive.
      NOTA: i seguenti punti descrivono l'ulteriore procedura di selezione burst.
    9. Traccia l'istogramma dei valori di luminosità di burst (la più alta velocità istantanea di fotone in una raffica), con l'asse degli eventi in scala logaritmica.
    10. Definite la soglia di luminosità di burst come il valore minimo di luminosità di burst da cui l'istogramma presenta un pattern di decadimento.
    11. Selezionare burst con valori di luminosità superiori alla soglia di luminosità burst.
      NOTA: i passaggi successivi descrivono la durata media della fluorescenza di burst.
    12. Traccia l'istogramma dei nanotempi di fotoni per tutti i fotoni in tutte le esplosioni selezionate con l'asse del conteggio dei fotoni in scala logaritmica.
    13. Definire la soglia nanotime come il valore nanotime minimo da cui l'istogramma dei nanotime fotoni mostra un pattern di decadimento.
    14. Selezionare solo fotoni con nanotime più grandi della soglia nanotime.
    15. Calcola la media algebrica di tutti i nanotempi di fotoni selezionati.
    16. Sottrarre la soglia nanotime dalla media algebrica nanotime del fotone. Il risultato è il nanotempo medio dei fotone del burst, che è direttamente proporzionale alla durata media della fluorescenza.
    17. Traccia l'istogramma di tutte le vite di fluorescenza media di burst. Possono comparire sotto popolazioni distribuite centralmente della vita di fluorescenza. Le sotto-popolazioni con medie di valore basse rappresentano specie di molecole con sCy3 che non è stato ostruito stericamente, mentre le sotto-popolazioni con medie di valore più elevate rappresentano specie di molecole con sCy3 che è stato ostruito più stericamente.
      NOTA: i passaggi successivi descrivono la dinamica lenta tra burst basata sull'analisi della recidiva di burst47
    18. Traccia l'istogramma dei tempi di separazione burst, con l'asse del tempo di separazione in scala logaritmica.
      NOTA: appariranno due sotto-popolazioni di tempi di separazione burst:
      Una sotto-popolazione importante con tempi di separazione di secondi, che rappresenta raffiche consecutive originate da diverse molecole misurate consecutivamente.
      Una sotto-popolazione minore con tempi di separazione ~ < 100 ms, che rappresenta esplosioni consecutive entrambe originate dalla stessa molecola, ricorrenti indietro attraverso il volume confocale.
    19. Selezionare per salvare tutte le coppie di raffiche consecutive separate da meno di un tempo di separazione massimo che definisce la sotto-popolazione della stessa molecola (<100 ms, nel nostro caso).
    20. Tracciare un istogramma o un grafico a dispersione della durata media della fluorescenza della prima e della seconda raffica per tutte le coppie di esplosioni che si sono ripresentate al di sotto di una certa soglia temporale di separazione

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Representative Results

Come IDP, quando non è legato a un'altra biomolecola, α-Syn mostra dinamiche strutturali tra più conformazioni, con transizioni a pochi microsecondi40 e persino a centinaia di nanosecondi41. Quando α-Syn attraversa il punto confocale, può subire migliaia di transizioni tra le conformazioni. In effetti, questo è stato il caso quando smFRET è stato utilizzato39,40. Qui eseguiamo misure smPIFE al fine di sondare la dinamica conformazionale locale di α-Syn.

La misurazione registra i fotoni di fluorescenza emessi da un colorante sulfo-Cy3 (sCy3), attaccato al gruppo tiolo della cisteina nel mutante α-Syn A56C. Il fluoroforo sCy3 può subire isomerizzazione quando è in stato eccitato. Tuttavia, sCy3 emette un fotone quando si de-eccita dal suo isomero trans. Pertanto, se nulla ostruisce stericamente l'isomerizzazione dello stato eccitato sCy3, emetterà in media pochi fotoni, ma mostrerà una bassa resa quantistica di fluorescenza e una breve durata di fluorescenza. Tuttavia, se l'isomerizzazione allo stato eccitato di sCy3 è ostruita, ad esempio, dalla superficie di una proteina vicina, il tasso di isomerizzazione diminuirà, il che a sua volta porterà a più de-eccitazioni dall'isomero trans, e quindi più fotoni, una maggiore resa quantistica di fluorescenza e una maggiore durata di fluorescenza. Questo è meglio conosciuto come effetto PIFE.

Utilizzando smPIFE abbiamo misurato la durata media di fluorescenza dell'etichettatura sCy3 α-Syn al residuo 56 una α-Syn alla volta, dove il colorante sCy3 rileva l'ambiente proteico intorno al residuo 56. La proteina è stata misurata ad una concentrazione di 25 pM, in cui si trova principalmente come monomero. I risultati delle misurazioni di smPIFE sono mostrati come istogrammi della vita media di fluorescenza di singole molecole α-Syn (Figura 1). Le durate medie di fluorescenza possono essere raggruppate in due sotto-popolazioni principali (Figura 1A). La prima sotto-popolazione presenta brevi durate di fluorescenza, con una durata di fluorescenza caratteristica di 1,6 ns, che rappresenta stati conformazionali α-Syn con nessuna o poche superfici proteiche trovate in prossimità del residuo 56. La seconda sotto-popolazione presenta una vita di fluorescenza più lunga, con una durata di fluorescenza caratteristica di 3,5 ns, che rappresenta stati conformazionali α-Syn con più superfici proteiche trovate in prossimità del residuo 56.

È noto che in presenza di ~5-10 mM SDS, i segmenti N-terminale e NAC di quasi tutte le molecole α-Syn in soluzione adottano una struttura a forcina elicoidale al momento del legame alle vescicole SDS40. Poiché il residuo 56 si trova all'interno del segmento NAC, la fluorescenza del residuo di etichettatura sCy3 56 dovrebbe percepire un microambiente piuttosto uniforme, poiché la maggior parte di quasi tutte le molecole α-Syn dovrebbe acquisire la struttura a forcina elicoidale legata alle vescicole. Pertanto, abbiamo eseguito misurazioni smPIFE simili ma in presenza di 5 mM SDS come controllo, aspettandoci di identificare una singola popolazione di vite di fluorescenza. In effetti, queste misurazioni si traducono in una singola popolazione di vite di fluorescenza con una durata di fluorescenza caratteristica di 3,1 ns (Figura 1B). La durata di fluorescenza caratteristica di ~3 ns punta a una struttura locale in prossimità del residuo 56, che non esiste nella sotto-popolazione di ~1,5 ns di vita di α-Syn in soluzione, sottolineando la strutturazione che α-Syn subisce quando si forma la forcina elicoidale e si è verificato il legame alla superficie della vescicola SDS. È interessante notare che quella singola popolazione ha una durata di fluorescenza caratteristica più breve rispetto alla sotto-popolazione di ~ 3,5 ns di vita di α-Syn in soluzione.

L'aspetto di due distinte sotto-popolazioni distribuite centralmente di esplosioni a singola molecola è una firma ben nota dell'eterogeneità molecolare. Poiché non è coinvolta alcuna miscela di molecole etichettate separate, entrambe le sottosociantie a vita rappresentano due specie separate di residuo di etichettatura sCy3 56 in α-Syn (Figura 1A). Pertanto, i risultati riportano eterogeneità dinamica. Questo perché il parametro riportato nell'istogramma viene calcolato utilizzando tutti i fotoni in un lampo per tutta la durata di pochi ms della diffusione α-Syn all'interno del volume confocale. Pertanto, le molecole α-Syn etichettate con sCy3 hanno attraversato il volume confocale quando hanno mostrato una vita media breve o lunga. Le transizioni tra queste specie devono avvenire più lentamente dei tempi di diffusione caratteristici attraverso la macchia confocale, quindi più lente di pochi millisecondi. Per valutare questo comportamento dinamico, abbiamo eseguito l'analisi burst-recurrence47. In breve, poiché cerchiamo di valutare le dinamiche che si verificano a volte più a lungo della durata di un burst a singola molecola, abbiamo testato la possibilità che una singola molecola α-Syn mostri un cambiamento nella vita media di fluorescenza sCy3 tra incroci consecutivi del punto confocale. Per fare ciò, distinguiamo innanzitutto tra due tipi di scoppi consecutivi: i) raffiche consecutive di diverse molecole α-Syn con tempi di separazione burst che si distribuiscono in secondi, e ii) burst consecutivi della stessa molecola α-Syn che si ripresenta nel volume confocale dopo un tempo di separazione burst, a volte lento come ~ 100 ms (Figura 2A). Seguendo le due sotto-popolazioni di vita media, abbiamo scelto di ispezionare coppie di esplosioni consecutive che sono separate al massimo da 100 ms (Figura 2A), dove il primo della coppia di esplosioni ha mostrato una durata media di fluorescenza all'interno della sotto-popolazione di breve durata (0-2 ns) o all'interno della sotto-popolazione di lunga vita (>3,5 ns; Figura 2B, sfumature colorate). L'ispezione verifica quale delle esplosioni di esplosioni ricorrenti, rappresentata dalla seconda esplosione nella coppia di esplosioni consecutive, mostra una durata media di fluorescenza all'interno della sottosociopolità di vita opposta a quella della prima esplosione. Si può osservare che una frazione di molecole che iniziano come un'esplosione nella sottopopolazione di breve durata si ripresentano come un lampo al di fuori di tale intervallo e anche all'interno della sottopopolazione di lunga durata (Figura 2C), e che una frazione di molecole che iniziano come un lampo nella sottopopolazione di lunga durata si ripresentano come un lampo al di fuori di tale intervallo e anche all'interno della sottopopolazione di breve durata (Figura 2D), il tutto entro 10-100 ms.

Figure 1
Figura 1: Sotto popolazioni medie di vita di fluorescenza del residuo di etichettatura sCy3 56 in α-Syn A56C. istogrammi di vita media di fluorescenza di α-Syn A56C (a 25 pM) a diffusione libera di sCy3 in assenza (A) e presenza (B) di 5 mM SDS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: L'analisi della recidiva di scoppio PIFE mostra che le singole molecole subiscono transizioni tra diversi valori medi di vita entro 100 ms. Dall'alto verso il basso: (A) l'istogramma dei tempi di separazione tra esplosioni consecutive a singola molecola. La tonalità arancione rappresenta i tempi di separazione tra esplosioni consecutive di molecole ricorrenti, dove il primo e il secondo scoppio derivano dalla stessa molecola. (B) L'istogramma medio della durata di fluorescenza di tutti i burst a singola molecola. Le tonalità giallo e verde rappresentano l'intervallo di valori medi di vita scelti per rappresentare i valori all'interno di sotto popolazioni di vita media breve e lunga, rispettivamente. (C) o (D). Gli istogrammi medi di vita della fluorescenza di esplosioni che sono stati separati da un burst precedente da un tempo all'interno della scala temporale ombreggiata di arancione (in A), e in cui il burst precedente ha avuto una vita media all'interno dell'intervallo rappresentato dalle tonalità gialle o verdi, rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Sono stati condotti ampi studi biochimici e biofisici per studiare le caratteristiche strutturali di α-Syn e la sua natura disordinata33,34,35,36,37,38. Diversi lavori hanno già utilizzato smFRET a diffusione libera per studiare la dinamica intra-molecolare del monomero α-Syn privo di legame. Questi lavori hanno riportato l'elevata eterogeneità dinamica di α-Syn, che porta alla media di più specie strutturali diverse entro i tempi di diffusione tipici attraverso la macchia confocale, portando alla comparsa di una singola popolazione FRET39,40. Tuttavia, si deve ricordare che le misurazioni smFRET riportano cambiamenti nelle distanze inter-coloranti che si verificano entro 3-10 nm, una scala che caratterizza i cambiamenti strutturali complessivi in una piccola proteina come α-Syn.

Eravamo curiosi di sapere quali risultati avremmo potuto trovare quando si utilizzava un diverso sensore basato sulla fluorescenza dei cambiamenti spaziali all'interno di una proteina sensibile alle dinamiche strutturali locali e che è stata utilizzata anche a livello di singola molecola. smPIFE può tracciare i cambiamenti spaziali locali nelle vicinanze di sCy3 etichettando uno specifico residuo di amminoacidi nell'intervallo 0-3 nm.

In questo studio, abbiamo utilizzato smPIFE per studiare la dinamica delle strutture locali all'interno di α-Syn e più specificamente i cambiamenti della struttura locale vicino al residuo NAC 56. I risultati suggeriscono che la regione in prossimità del residuo 56 in α-Syn presenta alcune sotto-popolazioni strutturali distinte che sono abbastanza stabili termodinamicamente da interconvertirsi lentamente fino a 100 ms, e forse anche più lentamente. Queste sotto-popolazioni sono identificate attraverso l'ispezione della durata media di fluorescenza delle singole molecole α-Syn misurate con marchio sCy3. In queste sotto-popolazioni, più lunga è la durata caratteristica della fluorescenza della sotto-popolazione, più vicina è una superficie proteica che ostruisce l'isomerizzazione allo stato eccitato di sCy3, e quindi più la superficie proteica è vicina a quel residuo etichettato sCy3.

Come altri sfollati interni, α-Syn è stato segnalato per avere interazioni con altre biomolecole, così come l'auto-associazione, dove in molti casi questi eventi di legame comportano la stabilizzazione di una struttura specifica all'interno della subunità α-Syn56,57,58,59. Alcune proteine acquisiscono una struttura specifica al momento del legame, attraverso un meccanismo di adattamento indotto. Tuttavia altre proteine si interconvertono spontaneamente tra diverse conformazioni distinte, e l'evento di legame a una specifica biomolecola si limita a stabilizzare una delle conformazioni preesistenti. Per quest'ultimo caso, uno dei requisiti è che la conformazione da stabilizzare sopravviva abbastanza a lungo da adattarsi al legame iniziale. Pertanto, più a lungo sopravvive una regione strutturale in una proteina, maggiore sarà l'efficienza di legame. Suggeriamo che le sotto-popolazioni osservate stabili al millisecondo rappresentino l'esistenza di specie distinte di struttura locale in prossimità del residuo 56. Questi indicano diverse specie di strutture locali vicino al centro dei segmenti NAC e NTD. In un recente lavoro, riportiamo che questo e altri residui etichettati sCy3 in questi segmenti mostrano anche tali sotto-popolazioni60. Questo risultato dimostra che la dinamica strutturale del monomero libero α-Syn può essere meglio descritta come dinamica proteica complessiva rapida (pochi microsecondi al massimo40),trasportando segmenti strutturali locali che rimangono stabili per millisecondi. Altri sfollati interni come Tau e β amiloide erano noti per condividere caratteristiche simili di trasportare una regione strutturata locale48,49,50.

smPIFE è stato utilizzato principalmente per studiare le interazioni tra biomolecole separate. Qui, impieghiamo smPIFE per studiare PIFE all'interno di segmenti della stessa proteina. È importante ricordare che la maggior parte dei precedenti esperimenti smPIFE sono stati eseguiti monitorando i cambiamenti relativi nelle intensità di fluorescenza di singole molecole immobilizzate con sCy313,14,15,16,17,18,19,51,52,53 . Sebbene utile per le molecole immobilizzate, questa procedura è meno informativa quando si misurano singole molecole a diffusione libera. Hwang et al. hanno mostrato come misurare l'effetto PIFE anche tracciando i cambiamenti nelle vite di fluorescenza, che riportano direttamente il cambiamento nella dinamica di isomerizzazione allo stato eccitato di sCy319. Qui sondiamo l'effetto PIFE della singola diffusione α-Syn attraverso la durata media della fluorescenza sCy3, piuttosto che tracciare i cambiamenti relativi nelle intensità di fluorescenza. In questo modo, siamo stati in grado di acquisire sotto-popolazioni correlate a PIFE nonostante il breve tempo di permanenza di ogni singola molecola α-Syn nel punto confocale. In effetti, le durate medie di fluorescenza si sono rivelate utili non solo nella definizione di sottopolipoli correlate a PIFE, ma anche nella valutazione di dinamiche lente correlate a PIFE utilizzando il quadro di analisi della recidiva di scoppio47. Tuttavia, è necessario più lavoro nello sviluppo di procedure che consentano di valutare correttamente le dinamiche PIFE più veloci. Esistono molti strumenti di statistica dei fotoni esistenti, utilizzati per valutare la dinamica rapida di FRET in esperimenti smFRET a diffusione libera, che intendiamo riutilizzare per essere utilizzati in smPIFE54,55.

Per riassumere, in questo lavoro abbiamo usato la combinazione relativamente nuova di misurazioni PIFE di singole molecole a diffusione libera per identificare sotto-popolazioni ms-stabili di strutture locali in α-Syn, che non sono state recuperate da smFRET. Abbiamo impiegato misurazioni di smPIFE per studiare α-Syn come IDP modello e i nostri risultati si estendono oltre i risultati passati di α-Syn che è stato disordinato a livello globale. I risultati suggeriscono α-Syn può trasportare strutture locali ordinate ms-stable e ipotizziamo che queste strutture locali possano svolgere un ruolo nel riconoscimento vincolante.

Finora, smPIFE è stato utilizzato come mezzo per studiare le interazioni degli acidi nucleici etichettati con sCy3 con le loro controparti proteiche non etichettate51. Con ciò, smPIFE è stato utilizzato come un potente strumento per percepire le interazioni biomolecolari, e quindi il naturale passo successivo in quella direzione sarebbe quello di usarlo per percepire le interazioni proteina-proteina e le loro dinamiche, un complesso alla volta.

La potenza dell'utilizzo di un sensore di prossimità a corto raggio come smPIFE può aiutare a identificare una strutturazione locale stabile all'interno di altri sistemi proteici considerati disordinati e strutturalmente instabili. Tuttavia, la potenza dell'utilizzo di un sensore di breve prossimità basato sulla fluorescenza a singola molecola non si ferma qui. Ci sono molti sistemi biomolecolari che mostrano dinamiche conformazionali su scala corta per facilitare la loro funzione, come molti canali ionici. Riteniamo che smPIFE possa fungere da strumento complementare al FRET a singola molecola, in questi casi in cui la gamma dinamica dei cambiamenti di prossimità all'interno del sistema proteico non corrisponde alla gamma dinamica di distanze che FRET può rilevare e risolvere. In sintesi, promuoviamo l'uso di smPIFE come sensore di prossimità complementare alle misurazioni FRET a singola molecola, al fine di coprire una scala più ampia di prossimità biomolecolari e forse osserviamo sottopopolazioni chiare medie al millisecondo dei parametri misurati che riportano strutture stabili che sono locali o complessive.

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Disclosures

Tutti gli autori non condividono alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Il plasmide pT-t7 che codifica per il mutante A56C α-Syn ci è stato regalato dal Dr. Asaf Grupi, dal Dr. Dan Amir e dal Dr. Elisha Haas. Questo documento è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH, grant R01 GM130942 to E.L. come subaward), dalla Israel Science Foundation (grant 3565/20 nell'ambito del KillCorona - Curbing Coronavirus Research Program), dal Milner Fund e dall'Università Ebraica di Gerusalemme (fondi di avvio).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merc C7715 cutoff: 100 kDa
ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
BSA Sigma-Aldrich A9647
cysteamine Sigma-Aldrich 30070
dialysis bags - MEGA GeBaFlex-tube Gene Bio-Application MEGA320
dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Fast SeeBand staining solution Gene Bio-Application SB050
Glycine Sigma-Aldrich 50046
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES Sigma-Aldrich 54457
HiTrap Desalting 5 mL Sigma-Aldrich GE17-1408
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX) Sigma-Aldrich 238813
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
LB broth Sigma-Aldrich L3152
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63068
MonoQ column Sigma-Aldrich 54807
protein LoBind tube Sigma-Aldrich EP0030108094 0.5 mL
Rinse a µ-slide 18 Ibidi 81816
SDS Sigma-Aldrich 75746
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich 71507
Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas mini-plast 815-004-05-001
streptomycin sulfate Sigma-Aldrich S9137
sulfo-Cy3 maleimide abcam ab146493
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich 75259
Tris-HCl Sigma-Aldrich 93363
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625

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Biochimica Numero 171 Singola molecola potenziamento della fluorescenza indotta da proteine durata della fluorescenza α-sinucleina conformazioni dinamica proteina intrinsecamente disordinata
Utilizzo del miglioramento della fluorescenza indotta da proteine risolte nel tempo per identificare le conformazioni locali stabili un monomero α-sinucleina alla volta
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Zaer, S., Lerner, E. Utilizing… More

Zaer, S., Lerner, E. Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One α-Synuclein Monomer at a Time. J. Vis. Exp. (171), e62655, doi:10.3791/62655 (2021).

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