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Biochemistry

Utilizando la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas resueltas en el tiempo para identificar conformaciones locales estables un monómero α-sinucleína a la vez

Published: May 30, 2021 doi: 10.3791/62655
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

La mejora de la fluorescencia inducida por proteínas de una sola molécula resuelta en el tiempo es un útil sensor de proximidad espectroscópico de fluorescencia sensible a los cambios estructurales locales en las proteínas. Aquí mostramos que se puede usar para descubrir conformaciones locales estables en α-sinucleína, que también se conoce como globularmente no estructurada e inestable cuando se mide utilizando la regla FRET de mayor alcance.

Abstract

El uso de reglas espectroscópicas para rastrear múltiples conformaciones de biomoléculas individuales y su dinámica han revolucionado la comprensión de la dinámica estructural y sus contribuciones a la biología. Mientras que la regla basada en FRET informa sobre las distancias entre colorantes en el rango de 3-10 nm, otras técnicas espectroscópicas, como la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas (PIFE), informan sobre la proximidad entre un colorante y una superficie de proteína en el rango más corto de 0-3 nm. Independientemente del método de elección, su uso en la medición de biomoléculas de difusión libre de una en una recupera histogramas del parámetro experimental que producen subtensiones separadas de biomoléculas distribuidas centralmente, donde cada subpuesto representa una sola conformación que permaneció sin cambios en milisegundos, o múltiples conformaciones que se interconvierten mucho más rápido que milisegundos, y por lo tanto una subalidad promediada. En fret de molécula única, donde el parámetro reportado en los histogramas es la eficiencia fretante entre colorantes, una proteína intrínsecamente desordenada, como el monómero de α-sinucleína en tampón, se informó previamente como exhibiendo una sola sub-población promediada de múltiples conformaciones que se interconvierten rápidamente. Si bien estos hallazgos anteriores dependen del rango de 3-10 nm de la regla basada en FRET, buscamos poner esta proteína a prueba utilizando PIFE de molécula única, donde rastreamos la vida útil de fluorescencia de las proteínas de α-sinucleínas α-Synuclein etiquetadas con sCy3 específicas del sitio. Curiosamente, utilizando este sensor de proximidad espectroscópico de corto alcance, la α-Sinucleína etiquetada con sCy3 exhibe varias subtensiones de por vida con vidas medias claramente diferentes que se interconvierten en 10-100 ms. Estos resultados muestran que, si bien α-sinucleína puede estar desordenada a nivel mundial, sin embargo, alcanza estructuras locales estables. En resumen, en este trabajo destacamos la ventaja de utilizar diferentes sensores de proximidad espectroscópicos que rastrean los cambios estructurales locales o globales una biomolécula a la vez.

Introduction

En las últimas dos décadas, los métodos basados en fluorescencia de una sola molécula se han convertido en una poderosa herramienta para medir biomoléculas1,2,sondeando cómo se distribuyen los diferentes parámetros biomoleculares, así como cómo se interconvierten dinámicamente entre diferentes subtensiones de estos parámetros a una resolución de menos de milisegundos3,4,5. Los parámetros en estas técnicas incluyen la eficiencia de transferencia de energía en las mediciones FRET 6,7,anisotropía de fluorescencia8,9,rendimientos cuánticos de fluorescencia y vidasútiles 10,11,en función de diferentes mecanismos de enfriamiento de fluorescencia12 o mejora13. Uno de estos mecanismos, más conocido como mejora de la fluorescencia inducida por proteínas (PIFE)14 introduce la mejora del rendimiento cuántico de fluorescencia y la vida útil en función de la obstrucción estérica a la isomerización libre del fluoróforo cuando está en estado excitado, causada por superficies de proteínas en las cercanías del colorante14,15,16,17,18,19 . Tanto FRET como PIFE se consideran reglas espectroscópicas o sensores de proximidad, ya que su parámetro medido está directamente relacionado con una medida espacial dentro de la biomolécula etiquetada bajo medición. Mientras que la eficiencia FRET está relacionada con la distancia entre un par de colorantes dentro de un rango de 3-10 nm20,PIFE rastrea aumentos en los rendimientos cuánticos de fluorescencia o vidas útiles relacionadas con la distancia entre el tinte y una superficie de una proteína cercana en el rango de 0-3 nm19.

El FRET de molécula única se ha utilizado ampliamente para proporcionar información estructural sobre muchos sistemas de proteínas diferentes, incluidas las proteínas intrínsecamente desordenadas (IDPs)21, como la α-Sinucleína (α-Syn)22. α-Syn puede formar estructuras ordenadas después de la unión a diferentes biomoléculas y bajo diferentes condiciones23,24,25,26,27,28,29,30. Sin embargo, cuando no está unido, el monómero α-Syn se caracteriza por una alta heterogeneidad conformacional con conformaciones que se interconvierten rápidamente31,32.

Las conformaciones de α-Syn han sido estudiadas previamente utilizando diversas técnicas diferentes que ayudan a identificar dinámicas conformacionales de tales sistemas proteicos altamente heterogéneos y dinámicos33,34 , 35,36,37,38,39. Curiosamente, las mediciones fret de una sola molécula (smFRET) de α-Syn en tampón informaron una sola población fret39,40 que es el resultado del promedio de tiempo de conformaciones que se interconvierten dinámicamente a veces mucho más rápido que el tiempo de difusión típico de α-Syn a través del punto confocal (tiempos tan rápidos como pocos microsegundos e incluso más rápido que eso, en relación con los tiempos de difusión típicos de milisegundos)40, 41. Sin embargo, el uso de una regla espectroscópica FRET con la sensibilidad de distancia de 3-10 nm a veces informa solo sobre los cambios estructurales generales en una proteína pequeña como α-Syn. Las mediciones de una sola molécula que utilizan sensores de proximidad espectroscópicos con sensibilidades de distancia más cortas tienen el potencial de informar sobre la dinámica de las estructuras locales. Aquí realizamos mediciones PIFE de una sola molécula de α-Syn e identificamos diferentes sub-poblaciones de vidas de fluorescencia mapeando diferentes estructuras locales con transiciones entre ellas tan lentas como 100 ms. Este trabajo resume las mediciones smPIFE resueltas en el tiempo de moléculas de α-Syn de difusión libre de una en una, en tampón y cuando se unen a membranas basadas en SDS como un sensor de proximidad espectroscópico de molécula única de corto alcance.

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Protocol

1. Transformación de plásmidos

  1. Preparación de 0,5 L de SOC medio
    1. Pesar 10 g de triptona, 2,5 g de extracto de levadura, 0,25 g de cloruro de sodio (NaCl), 0,1 g de cloruro de potasio (KCl).
    2. Agregue agua de doble destilación (DDW) hasta un volumen total de 0.5 L.
    3. Ajuste al pH 7 agregando hidróxido de sodio (NaOH).
    4. Preparar alícuotas de stock de 100 mL y autoclave.
    5. Antes de usar, agregue 0.5 ml de cloruro de magnesio estéril (MgCl2) y 1.8 ml de glucosa estéril a 100 ml de SOC.
  2. Descongelar las células competentes de Escherichia coli BL21 (DE3) en hielo.
  3. Mezcle las células competentes suavemente.
  4. Preparar dos tubos de 15 ml. Etiquete uno como tubo de reacción de transformación y el otro como tubo de control.
  5. Alícuota 100 μL de células competentes en los tubos.
  6. Añadir 1 μL de plásmido a una concentración de 0,1 ng/μL en el tubo de reacción de transformación.
  7. Calentar el medio SOC en un baño de agua a 42 °C para su uso en el paso 1.8.
  8. Pulso térmico de los dos tubos en un baño de agua a 42 °C durante una duración de 45 segundos. (¡Paso crítico!)
  9. Añadir 900 μL de medio SOC calentado a cada tubo.
  10. Incubar los tubos a 37 °C durante 45 minutos con agitación a una velocidad de 225 rpm.
  11. Diseminar 200 μL de las células con el plásmido transformado en una placa de agar LB (Luria-Bertani) que contiene 100 μg/ml de ampicilina, utilizando un esparcidor celular estéril.
  12. Extender 200 μL de las células con el plásmido transformado en una placa de LB-agar sin ampicilina, utilizando un esparcidor estéril (control positivo).
  13. Diseminar 200 μL de las células de control (que no contienen un plásmido) sobre una placa de LB-agar que contiene 100 μg/ml de ampicilina, utilizando un esparcidor estéril(control negativo).
  14. Incubar las placas durante la noche a 37 °C.

2. Preparación de proteínas

  1. Expresión y purificación de α-sinucleína recombinante
    1. Elija una sola colonia y cultive en 100 ml de medio líquido LB (Luria-Bertani) en autoclave que contenga 100 μg/ml de ampicilina a 37 °C (iniciador).
    2. Preparar cuatro matraces Erlenmeyer de 2 L, cada uno con 1 L de medio LB en autoclave y 100 μg/ml de ampicilina (inoculación grande).
    3. Medir la densidad óptica (OD a λ = 600 nm) de la solución celular. Cuando la densidad celular del iniciador alcance un ODλ=600nm de 0.6-0.7, agregue 10 mL de solución de arranque por cada 1 L de medio LB preparado en el paso anterior.
    4. Cultive los medios bacterianos en un agitador de incubadora a 37 °C y una velocidad de 200 rpm.
    5. Cuando la densidad celular alcanza un ODλ=600nm de 0.6-0.8, inducir la expresión de proteínas agregando isopropilo β-d-1-tiogalactopyranoside (IPTG) por cada 1 L de medio de crecimiento a una concentración final de 1 mM.
      NOTA: Disolver 0,96 g de IPTG en 4 ml de DDW y añadir 1 ml de la solución de IPTG resultante por cada 1 L de crecimiento bacteriano.
    6. Cultivar las células durante 4 horas y recogerlas por centrifugación en tubos de 50 mL a una velocidad de 5.170 x g durante una duración de 8 minutos.
      NOTA: En cada ronda, deseche el sobrenadante, mantenga el pellet y llene nuevamente los mismos tubos con crecimiento bacteriano.
    7. Guarde el pellet bacteriano en el almacenamiento por congelación (por ejemplo, -80 °C) durante el día siguiente.
    8. Al día siguiente, prepare 200 ml de tampón de lisis: 40% (p/v) sacarosa y tampón A, que incluye 30 mM Tris-HCl, 2 mM de ácido etilendiaminetraacético (EDTA), 2 mM de ditiotreitol (TDT) a pH 8.0.
    9. Agregue 25 ml de tampón de lisis a cada tubo con gránulo bacteriano.
    10. Vuelva a suspender el pellet (utilice pipetas Pasteur de plástico estéril) en tampón de lisis (véase 2.1.8).
    11. Prepare un matraz Erlenmeyer estéril de 250 ml con un imán agitador sobre hielo.
    12. Agregue 5 ml de tampón de lisis y luego transfiera las células resislizadas homogéneas a él.
    13. Revuelva las células durante 20 minutos a 200 rpm a temperatura ambiente.
    14. Divida la solución en tubos de 50 ml y centrífuga a 4 °C durante 30 minutos a una velocidad de 17.400 x g.
    15. Deseche el sobrenadante.
    16. Preparar matraz estéril Erlenmeyer de 250 ml con imán agitador sobre hielo.
    17. Añadir 15 ml de tampón de disolución (90 ml de tampón A refrigerado y 37 μL de MgCl2 disuelto más allá del límite de solubilidad y filtrado) en cada tubo. Use pipetas Pasteur de plástico estéril y disuelva el pellet.
    18. Cuando parte de la solución se vuelva homogénea, muévala a un matraz Erlenmeyer agitado sobre hielo.
    19. Determine el volumen de solución en el Erlenmeyer.
    20. Agregue 10 mg de sulfato de estreptomicina por cada 1 ml de solución (antes de agregar, disuelva el sulfato de estreptomicina en 2 ml de tampón A).
      NOTA: Este paso se realiza con el fin de eliminar el ADN y los ribosomas.
    21. Revuelva la solución durante 10-20 minutos a temperatura ambiente.
    22. Divida la solución en tubos de 50 ml y centrífuga a 4 °C y a una velocidad de 20.700 x g durante 30 minutos.
    23. Recoge el sobrenadante y desecha el pellet.
    24. Prepare un matraz Erlenmeyer estéril de 250 ml sobre hielo con un agitador.
    25. Filtre el sobrenadante con un filtro de jeringa de 0,22 μm en el matraz Erlenmeyer limpio.
    26. Determine el volumen de la solución y pese 0,3 g de sulfato de amonio por cada 1 ml de solución.
    27. Gradualmente, agregue el sulfato de amonio a la solución agitada.
      NOTA: Este paso se realiza para precipitar proteínas. Cuando el sulfato de amonio se une a las proteínas, la solución se vuelve oscura y borrosa, lo que aparece como color blanco.
    28. Revuelva durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    29. Divida la solución en tubos de 50 ml y centrífuga a 4 °C y a una velocidad de 20.700 g durante 30 minutos.
    30. Deseche cuidadosamente el sobrenadante y conserve el pellet.
    31. Disolver el pellet con 20 mL de Buffer A.
    32. Unifique todas las soluciones en un tubo y luego mida el espectro de absorción UV de la solución.
      NOTA: Si el espectro muestra una firma de agregación (absorción por encima de una longitud de onda de 300 nm), continúe con el siguiente paso. De lo contrario, omita el siguiente paso y vaya al paso 2.1.34.
      NOTA: El índice de agregación (A.I.) calculado a partir de los espectros UV como ODλ=350nm/ (ODλ=280nm - ODλ=350nm) ×100. 41
    33. Utilice tubos de centriprep de corte de 100 kDa y centrífuga a una velocidad de 3.590 x g a 4 °C durante 15 minutos. Recoge el líquido que pasó por el filtro.
    34. Dializar la solución a 4 °C durante la noche, contra Buffer A, utilizando bolsas de diálisis con un corte de 3,5 kDa.
    35. Realice otra ronda de diálisis durante una duración de al menos 4 horas.
    36. Cargue la muestra dializada en una columna de intercambio de aniones MonoQ de 1 ml. Utilice un tampón de clorhidrato Tris (Tris-HCl) de 30 mM a pH 7.5 como tampón de lavado y un tampón Tris-HCl de 30 mM pH 7.5 con NaCl de 500 mM como tampón de elución.
    37. Inyecte la muestra en la columna. Luego lavar con 20 volúmenes de columna (CV) de tampón de elución al 0% y tampón de lavado al 100% para eliminar las proteínas no unidas.
    38. Lavar con 7 CV de tampón de elución al 30%.
    39. Elute la muestra de proteína α-Syn utilizando un gradiente que cambia de 30% a 100% de tampón de elución para 30 CV, a una velocidad de flujo de 1,5 ml / min.
      NOTA: α-Syn elutes a 46-66 CV a una conductividad de 20-24 mS/cm, lo que se refiere al tampón de elución del 38-50%.
    40. Recoge las fracciones del pico de elución principal. Verifique la presencia de α-Syn ejecutando muestras en electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio al 15% (SDS-PAGE), después de la tinción con Coomassie Blue o Solución de tinción Fast SeeBand. Se espera una banda de 15 kDa.
    41. Unifique las fracciones pertinentes y diálisis durante la noche, contra el tampón A, utilizando bolsas de diálisis con un corte de 3,5 kDa a 4 °C.
    42. Preparar alícuotas de la muestra de proteína y almacenarlas a -20 °C.
  2. Α-Synuclein etiquetado con Cy3
    1. Reducir el tiol del residuo de cisteína en el mutante α-Syn A56C añadiendo TDT a una concentración final de 2 mM durante 1 hora a temperatura ambiente.
    2. Elimine la TDT realizando dos rondas de diálisis con bolsas de diálisis de corte de 3,5 kDa. Para la primera ronda, dializar contra 30 mM Tris-HCl pH 8.0 y 2 mM EDTA. Para la segunda ronda, dializar contra 50 mM HEPES pH 7.2 y 2 mM EDTA.
    3. Reduzca los residuos de cisteína agregando clorhidrato de tris(2-carboxietilo)fosfina (TCEP) a la muestra de proteína, a una concentración final de 50 μM durante una duración de 30 minutos a temperatura ambiente.
      NOTA: TCEP es un agente reductor no sulfhidrilo, por lo tanto, mantiene los grupos tiol reducidos sin reaccionar con el tinte. Añadimos 0,5 μL a partir de una solución stock de 1 M de TCEP.
    4. Calcule las cantidades de proteína requeridas para el volumen de reacción final de 1 ml.
      NOTA: Aquí hay un ejemplo para el cálculo que utilizamos:
      Concentración final de proteína de 20 μM × 1 ml de volumen final = concentración inicial de proteína de 56 μM × proteína V que se agregará
    5. Calcule la cantidad de tinte requerida para el volumen de reacción final de 1 ml. El etiquetado de colorante de una sola cisteína debe realizarse con exceso de colorante, en una proporción molar colorante:proteína de al menos 3:1.
      NOTA: Un ejemplo para el cálculo que utilizamos:
      Concentración final de colorante de 60 μM × 1 ml de volumen final = concentración inicial de colorante de 370 μM × de V de colorante que se agregará
    6. Calcule la cantidad de tampón del dializador necesario para ajustar el volumen total de reacción a 1 ml.
      NOTA: Ejemplo de cálculo: 1 mL - (V calculado a partir del paso 2.2.4 + V calculado a partir del paso 2.2.5)
    7. Prepare el vial de reacción con un imán en la parte superior de un agitador.
    8. En primer lugar, agregue la cantidad calculada de la proteína y el tampón. Después, agregue la cantidad calculada del tinte (maleimida sulfo-Cy3).
    9. Mantenga la reacción a temperatura ambiente en la oscuridad durante una duración de 3-5 horas.
    10. Finalice la reacción añadiendo 2 mM de TDT y continúe durante 1 hora.
    11. Realice tres rondas de diálisis contra Buffer A, utilizando bolsas de diálisis con un corte de 3,5 kDa para eliminar el exceso de colorante libre de la solución.
    12. Cargue la muestra en una columna de exclusión de tamaño para separar aún más el α-Syn etiquetado del tinte libre.
    13. Determinar la concentración de α-Syn puros etiquetados midiendo la absorción del colorante (el coeficiente de absorción para sulfo-Cy3 es de 162.000 M-1cm-1a λ=548 nm).
    14. Si es necesario, concentre la solución pura etiquetada α-Syn utilizando un concentrador de vacío (por ejemplo, SpeedVac). Luego, realice una ronda de diálisis contra el tampón A, utilizando bolsas de diálisis con un corte de 3.5 kDa y determine nuevamente la concentración de la proteína etiquetada.
    15. Preparar alícuotas de la muestra de proteína etiquetada y almacenarlas a -20 °C.

3. Medidas

  1. Configuración experimental de smPIFE
    NOTA: Utilice la siguiente configuración basada en confocales o similar.
    1. Utilice una fuente láser pulsada (en nuestro caso, λ = láser pulsado de picosegundos de 532 nm con un ancho de pulso de ~ 100 ps FWHM), que funcione a una velocidad de repetición adecuada (20 MHz en nuestro caso) y se dirija al SYNC de una tarjeta de conteo de fotón único correlacionada en el tiempo (TCSPC), como fuente de excitación sulfo-Cy3 (sCy3).
    2. Utilice un espejo dicroico con alta reflectividad a 532 nm, para separar la excitación y la dispersión de la fluorescencia.
    3. Utilice un agujero de alfiler de 100 μm de diámetro en el foco de la luz emitida, después de que el haz de emisión colimado haya sido enfocado por una lente y antes de que el haz de emisión haya sido recolimado por otra lente.
    4. Utilice un filtro de paso de banda (585/40 nm en nuestro caso) para filtrar aún más la fluorescencia sCy3 de otras fuentes de luz.
    5. Detectar la fluorescencia mediante un detector (diodo de avalancha de fotón único o fotomultiplicador híbrido, en nuestro caso) encaminado (a través de un router 4 a 1, en nuestro caso) a un módulo TCSPC (Becker & Hickl SPC-150, en nuestro caso).
      NOTA: En nuestro caso, la adquisición de datos se realiza a través del software VistaVision (ISSTM)en el formato de archivo time-tagged-time-resolved (TTTR).
  2. Preparación de muestras smPIFE
    1. Preparar 25 pM de α-Syn con etiqueta sCy3 en mediciones tampón: 10 mM de acetato de sodio, 10 mM de fosfato de dihidrógeno de sodio, 10 mM de glicina pH 8.0, 20 mM de NaCl, 10 mM de cisteamina y 1 mM de ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-carboxílico (TROLOX), en un tubo de unión a proteínas bajo.
      NOTA: Si α-Syn se mide en presencia de vesículas SDS, agregue también la cantidad SDS adecuada.
    2. Enjuague un portaobjetos de microscopía de 18 cámaras con 100 μL de albúmina sérica bovina (BSA) de 1 mg/ml durante 1 minuto y luego retire el BSA.
    3. Agregue 100 μL de la muestra de α-Syn de 25 pM con etiqueta sCy3 a una cámara en la diapositiva de la cubierta.
    4. Realice la medición smPIFE de la muestra utilizando la configuración descrita, como se indica a continuación en los pasos siguientes.
  3. Adquisición de datos smPIFE
    1. Utilice una lente de objetivo de inmersión en agua de alta apertura numérica (en nuestro caso, Olympus UPLSAPO 60x N.A. 1.2) y agregue una gota de agua ultra pura en la parte superior de la lente del objetivo.
    2. Fije el portaobjetos de la cubierta en una cámara de escenario e instálelo en la parte superior del escenario del microscopio.
    3. Lleve la lente del objetivo hacia arriba, hasta que la gota de agua en la parte superior de la lente del objetivo se manche en la parte inferior de la diapositiva del labio de la cubierta.
    4. Abra el obturador láser y lleve la lente del objetivo hacia arriba, mientras inspecciona el patrón en una cámara CMOS, recogiendo la luz dispersada de la muestra. Observe el patrón de anillos Airy: el primero representa el enfoque en la interfaz agua-vidrio, y luego el segundo representa el enfoque en la interfaz entre el vidrio y la solución de muestra.
    5. Aumente la altura de la lente del objetivo en 75 μm adicionales, llevando el enfoque láser profundamente en la solución, para minimizar la autofluorescencia de la superficie de vidrio de la cubierta.
    6. Ajuste la potencia del láser en la lente del objetivo para que sea de ~ 100 μW.
    7. Iniciar la adquisición de fotones detectados por un tiempo predefinido (2 horas, en nuestras mediciones).
      NOTA: La mayoría de la señal de adquisición debe tener una velocidad (medida en recuentos por segundo, cps) que sea similar a la adquirida cuando se mide solo el búfer; los datos de milisegundos encuadernados deberían mostrar eventos de ráfaga de fotones escasos, y la mayoría de los contenedores tienen una tasa promedio que es comparable a la tasa de fondo típica del detector (< 1,000 cps, en nuestro caso).

4. Análisis de ráfagas smPIFE

  1. Conversión de datos sin procesar
    NOTA: Los datos suelen almacenarse en un archivo binario con un formato que fue predefinido por la empresa que fabrica la tarjeta TCSPC (archivos .spc en nuestro caso).
    1. Convierta el archivo de datos sin procesar al formato de archivo universal photon-HDF542, utilizando la suite de software phconvert (https://github.com/Photon-HDF5/phconvert). Llame al archivo de datos sin procesar como entrada y conviértalo en un archivo .hdf5 de datos sin procesar utilizando el código apropiado en la suite phconvert (el cuaderno Convert ns-ALEX Becker-Hickl a Photon-HDF5.ipynb Jupyter, en nuestro caso).
      NOTA: La conversión en un archivo .hdf5 incluye: (1) determinar los flujos de fotones relevantes en los datos sin procesar (es decir, flujos de fotones de fotones registrados del ID del detector correspondiente); (2) los nanotiempos de fotones relevantes (los tiempos de detección de fotones en relación con el tiempo SYNC de excitación); y (3) metadatos añadidos.
  2. Búsqueda y selección de ráfagas mediante FRETbursts43
    NOTA: Todos los archivos de datos sin procesar photon-HDF5 de las mediciones smPIFE, así como el código que resume el análisis de los datos sin procesar, se almacenan en Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4587698). Todos los pasos a continuación se detallan y se muestran en los cuadernos de Jupyter, también suministrados en el enlace del repositorio de Zenodo.
    1. Abra los Jupyter Notebooks (dentro del marco de Anaconda, en nuestro caso).
    2. Abra el portátil smPIFE-aSyn 56C(Cy3) 25 pM newBuffer (Final notebook).ipynb (se puede encontrar en el enlace de Zenodo).
    3. Cargar FRETbursts.
    4. Cargue el archivo de datos HDF5 del fotón.
    5. Evaluación de la tasa BG: utilizando el histograma de los tiempos entre fotones, calcule las tasas de fondo (BG) por cada 30 segundos de adquisición de datos en el archivo de datos HDF5 del fotón.
      NOTA: Los siguientes pasos describen la búsqueda de ráfaga utilizando el algoritmo de ventana deslizante44,45,46.
    6. Mueva una ventana de tiempo de m = 20 fotones consecutivos, un fotón a la vez.
    7. Recopile los datos de los fotones solo si la velocidad instantánea de los fotones, ( Equation 1 ), es al menos F = 11 veces mayor que la velocidad BG para ese período de adquisición de datos.
      NOTA: Una ráfaga se construye a partir de todos los fotones consecutivos que se recolectaron deslizando la ventana un fotón a la vez (paso 4.2.6.) y de acuerdo con el criterio de velocidad de fotones (paso 4.2.7).
    8. Calcule las siguientes características de ráfaga:
      Tamaño de ráfaga: la cantidad de fotones en una ráfaga.
      Duración de la ráfaga: la diferencia de tiempo entre los tiempos de detección del último y el primer fotón en una ráfaga.
      Brillo de ráfaga: el mayor valor de la tasa instantánea de fotones en una ráfaga.
      Separación de ráfagas: el intervalo de tiempo entre ráfagas consecutivas.
      NOTA: Los siguientes puntos describen el procedimiento de selección de ráfagas adicional.
    9. Traza el histograma de los valores de brillo de ráfaga (la tasa de fotones instantáneos más alta en una ráfaga), con el eje de los eventos en escala logarítmica.
    10. Defina el umbral de brillo de ráfaga como el valor de brillo de ráfaga mínimo a partir del cual el histograma exhibe un patrón de descomposición.
    11. Seleccione ráfagas con valores de brillo mayores que el umbral de brillo de ráfaga.
      NOTA: Los siguientes pasos describen la vida útil de fluorescencia media de ráfaga.
    12. Trazar el histograma de nanotiempos de fotones para todos los fotones en todas las ráfagas seleccionadas con el eje de conteo de fotones en escala logarítmica.
    13. Defina el umbral de nanotiempo como el valor mínimo de nanotiempo a partir del cual el histograma de nanotiempos de fotones exhibe un patrón de descomposición.
    14. Seleccione solo fotones con nanotiempos mayores que el umbral de nanotiempo.
    15. Calcular el promedio algebraico de todos los nanotiempos de fotones seleccionados.
    16. Reste el umbral de nanotiempo del promedio algebraico de nanotiempo de fotones. El resultado es el nanotiempo medio de fotones de la explosión, que es directamente proporcional a la vida media de fluorescencia.
    17. Traza el histograma de todas las vidas de fluorescencia medias de ráfaga. Pueden aparecer sub poblaciones distribuidas centralmente de fluorescencia de por vida. Las subcun poblaciones con promedios de valores bajos representan especies de moléculas con sCy3 que no estaba obstruida estéricamente, mientras que las sub poblaciones con promedios de valores más altos representan especies de moléculas con sCy3 que estaba más obstruida estéricamente.
      NOTA: Los siguientes pasos describen la dinámica lenta entre ráfagas basada en el análisis de recurrencia deráfagas 47
    18. Trazar el histograma de los tiempos de separación de ráfaga, con el eje de tiempo de separación en escala logarítmica.
      NOTA: Aparecerán dos subpú poblaciones de tiempos de separación de ráfagas:
      Una subcoblación importante con tiempos de separación de segundos, que representa ráfagas consecutivas que se originan a partir de diferentes moléculas medidas consecutivamente.
      Una subcoblación menor con tiempos de separación ~ <100 ms, que representan ráfagas consecutivas que se originan en la misma molécula, recurriendo a través del volumen confocal.
    19. Seleccione para guardar todos los pares de ráfagas consecutivas que están separadas por menos de un tiempo de separación máximo que define la sub población de la misma molécula (<100 ms, en nuestro caso).
    20. Trazar un histograma o un gráfico de dispersión de las vidas medias de fluorescencia de la primera y segunda ráfaga para todos los pares de ráfagas que se repitieron por debajo de un cierto umbral de tiempo de separación

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Representative Results

Como IDP, cuando no está unido a otra biomolécula, α-Syn exhibe dinámica estructural entre múltiples conformaciones, con transiciones a pocos microsegundos40 e incluso a cientos de nanosegundos41. Cuando α-Syn cruza la mancha confocal, puede sufrir miles de transiciones entre conformaciones. De hecho, este fue el caso cuando se utilizó smFRET39,40. Aquí realizamos mediciones smPIFE para sondear la dinámica conformacional local de α-Syn.

La medición registra fotones de fluorescencia emitidos por un colorante sulfo-Cy3 (sCy3), unido al grupo tiol de la cisteína en el mutante α-Syn A56C. El fluoróforo sCy3 puede someterse a isomerización cuando está en estado excitado. Sin embargo, sCy3 emite un fotón cuando se des-excita de su isómero trans. Por lo tanto, si nada obstruye estéricamente la isomerización de estado excitado sCy3, emitirá pocos fotones en promedio, pero exhibirá un bajo rendimiento cuántico de fluorescencia y una corta vida útil de fluorescencia. Sin embargo, si la isomerización en estado excitado de sCy3 está obstruida por, por ejemplo, la superficie de una proteína cercana, la tasa de isomerización disminuirá, lo que a su vez conducirá a más desexcitaciones del isómero trans y, por lo tanto, más fotones, un mayor rendimiento cuántico de fluorescencia y vidas de fluorescencia más largas. Esto es más conocido como el efecto PIFE.

Usando smPIFE medimos la vida útil media de fluorescencia del etiquetado sCy3 α-Syn en el residuo 56 un α-Syn a la vez, donde el colorante sCy3 detecta el entorno proteico alrededor del residuo 56. La proteína se midió a una concentración de 25 pM, en la que se encuentra principalmente como monómero. Los resultados de las mediciones de smPIFE se muestran como histogramas de la vida media de fluorescencia de moléculas individuales de α-Syn(Figura 1). La vida media de fluorescencia se puede agrupar en dos subpoblaciones principales(Figura 1A). La primera subcoblación exhibe vidas cortas de fluorescencia, con una vida útil de fluorescencia característica de 1,6 ns, lo que representa estados conformacionales α-Syn con ninguna o pocas superficies de proteínas encontradas en las cercanías del residuo 56. La segunda subcoblación exhibe vidas de fluorescencia más largas, con una vida útil de fluorescencia característica de 3,5 ns, lo que representa estados conformacionales α-Syn con más superficies de proteínas que se encuentran en las cercanías del residuo 56.

Se sabe que en presencia de ~5-10 mM SDS, los segmentos N-terminal y NAC de casi todas las moléculas α-Syn en solución adoptan una estructura de horquilla helicoidal al unirse a las vesículas SDS40. Dado que el residuo 56 se encuentra dentro del segmento NAC, se espera que la fluorescencia del residuo de etiquetado sCy3 56 detecte un microambiente bastante uniforme, ya que la mayoría de casi todas las moléculas de α-Syn deberían adquirir la estructura de horquilla helicoidal unida a vesículas. Por lo tanto, realizamos mediciones smPIFE similares pero en presencia de SDS de 5 mM como control, esperando identificar una sola población de vidas de fluorescencia. De hecho, estas mediciones dan como resultado una sola población de vidas de fluorescencia con una vida útil de fluorescencia característica de 3.1 ns(Figura 1B). La vida útil de fluorescencia característica de ~3 ns apunta a una estructura local en las cercanías del residuo 56, que no existe en la subtensión de vida de ~1.5 ns de α-Syn en solución, enfatizando la estructuración α-Syn sufre cuando se forma la horquilla helicoidal y se ha producido la unión a la superficie de la vesícula SDS. Curiosamente, esa sola población tiene una vida útil de fluorescencia característica más corta en relación con la subpúrma de vida de ~ 3.5 ns de α-Syn en solución.

La aparición de dos subpoblaciones distintas distribuidas centralmente de estallidos de una sola molécula es una firma bien conocida de la heterogeneidad molecular. Dado que no se trata de una mezcla de moléculas etiquetadas separadas, ambas sub poblaciones de por vida representan dos especies separadas de residuo de etiquetado sCy3 56 en α-Syn(Figura 1A). Por lo tanto, los resultados informan de heterogeneidad dinámica. Esto se debe a que el parámetro reportado en el histograma se calcula utilizando todos los fotones en una ráfaga a lo largo de los pocos ms de duración de la difusión α-Syn dentro del volumen confocal. Por lo tanto, las moléculas de α-Syn etiquetadas con sCy3 cruzaron el volumen confocal cuando exhibieron una vida media corta o larga. Las transiciones entre estas especies deben ocurrir más lentas que los tiempos de difusión característicos a través de la mancha confocal, por lo tanto, más lentas que unos pocos milisegundos. Para evaluar este comportamiento dinámico, se realizó un análisis de recurrencia deráfagas 47. En resumen, dado que buscamos evaluar la dinámica que ocurre a veces más que la duración de un estallido de una sola molécula, probamos la posibilidad de que una sola molécula α-Syn exhiba un cambio en la vida útil media de fluorescencia sCy3 entre cruces consecutivos del punto confocal. Para ello, primero distinguimos entre dos tipos de ráfagas consecutivas: i) ráfagas consecutivas de diferentes moléculas α-Syn con tiempos de separación de ráfagas que se distribuyen en segundos, y ii) ráfagas consecutivas de la misma molécula α-Syn que se repite en el volumen confocal después de un tiempo de separación de ráfagas, a veces tan lentas como ~ 100 ms(Figura 2A). Siguiendo las dos subpedales medias de vida, se optó por inspeccionar pares de ráfagas consecutivas que están separadas por un máximo de 100 ms(Figura 2A),donde el primero del par de ráfagas exhibió una vida media de fluorescencia dentro de la subal población de vida corta (0-2 ns) o dentro de la subcoblación de larga vida (>3,5 ns; Figura 2B,tonos de color). La inspección prueba cuál de las ráfagas de ráfagas recurrentes, representadas por la segunda ráfaga en el par de ráfagas consecutivas, exhibe una vida útil media de fluorescencia dentro de la subcoblación de por vida opuesta a la de la primera ráfaga. Se puede observar que una fracción de moléculas que comienzan como un estallido en la subpoblación de vida corta se repiten como un estallido fuera de ese rango e incluso dentro de la subpoblación de larga vida(Figura 2C),y que una fracción de moléculas que comienzan como un estallido en la subpoblación de larga vida recurren como un estallido fuera de ese rango e incluso dentro de la subpoblación de vida corta(Figura 2D), todo dentro de 10-100 ms.

Figure 1
Figura 1: Sub poblaciones medias de fluorescencia de por vida del residuo de etiquetado sCy3 56 en α-Syn A56C. histogramas de por vida de fluorescencia media de S56C α-Syn de libre difusión de sCy3 (a 25 pM) en ausencia (A) y presencia (B) de SDS de 5 mM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2:El análisis de recurrencia de ráfagas PIFE muestra que las moléculas individuales experimentan transiciones entre diferentes valores promedio de vida útil dentro de los 100 ms. De arriba a abajo: (A) el histograma de los tiempos de separación entre ráfagas consecutivas de una sola molécula. El tono naranja representa los tiempos de separación entre ráfagas consecutivas de moléculas recurrentes, donde la primera y la segunda ráfaga surgen de la misma molécula. (B) El histograma medio de fluorescencia de por vida de todos los estallidos de una sola molécula. Los tonos amarillo y verde representan el rango de valores promedio de vida elegidos para representar valores dentro de sub poblaciones de vida media corta y larga, respectivamente. (C) o (D). Los histogramas medios de vida de fluorescencia de ráfagas que se separaron de una ráfaga anterior por un tiempo dentro de la escala de tiempo sombreada de naranja (en A), y donde la ráfaga anterior tuvo una vida útil promedio dentro del rango representado por los tonos amarillo o verde, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Se realizaron extensos estudios bioquímicos y biofísicos para estudiar las características estructurales de α-Syn y su naturaleza desordenada33,34,35,36,37,38. Varios trabajos ya han utilizado smFRET de libre difusión para investigar la dinámica intramolecul molecular del monómero α-Syn libre de unión. Estos trabajos reportaron la alta heterogeneidad dinámica de α-Syn, lo que lleva a promediar múltiples especies estructurales diferentes dentro de los tiempos de difusión típicos a través de la mancha confocal, dando lugar a la aparición de una sola población FRET39,40. Sin embargo, hay que recordar que las mediciones de smFRET informan sobre los cambios en las distancias entre colorantes que ocurren dentro de 3-10 nm, una escala que caracteriza los cambios estructurales generales en una proteína pequeña como α-Syn.

Teníamos curiosidad por saber qué resultados podríamos encontrar al usar un sensor diferente basado en fluorescencia de cambios espaciales dentro de una proteína que es sensible a la dinámica estructural local y que se ha utilizado también a nivel de molécula única. smPIFE puede rastrear los cambios espaciales locales cercanos a sCy3 etiquetando un residuo de aminoácido específico en el rango de 0-3 nm.

En este estudio, utilizamos smPIFE para investigar la dinámica de las estructuras locales dentro de α-Syn y más específicamente los cambios de estructura local cerca del residuo NAC 56. Los resultados sugieren que la región en las cercanías del residuo 56 en α-Syn exhibe algunas subpoblaciones estructurales distintas que son lo suficientemente estables termodinámicamente como para interconvertir en tan solo 100 ms, y tal vez incluso más lentas. Estas sub poblaciones se identifican a través de la inspección de la vida media de fluorescencia de las moléculas de α-Syn únicas con etiqueta sCy3 medidas. En estas subcoblaciones, cuanto más larga es la vida útil característica de la fluorescencia de la subal población, más cerca está una superficie de proteína que obstruye la isomerización en estado excitado de sCy3 y, por lo tanto, cuanto más cerca está la superficie de la proteína de ese residuo etiquetado con sCy3.

Al igual que otros desplazados internos, se ha informado que α-Syn tiene interacciones con otras biomoléculas, así como autoasoculación, donde en muchos casos estos eventos de unión implican la estabilización de una estructura específica dentro de la subunidad α-Syn56,57,58,59. Algunas proteínas adquieren una estructura específica al unirse, a través de un mecanismo de ajuste inducido. Sin embargo, otras proteínas se interconvierten espontáneamente entre varias conformaciones distintas, y el evento de unión a una biomolécula específica simplemente estabiliza una de las conformaciones preexistentes. Para este último caso, uno de los requisitos es que la conformación a estabilizar sobrevivirá el tiempo suficiente para acomodar la unión inicial. Por lo tanto, cuanto más tiempo sobreviva una región estructural en una proteína, mayor será la eficiencia de unión. Sugerimos que las subexacciones de milisegundos estables observadas representan la existencia de especies distintas de estructura local en las cercanías del residuo 56. Estos apuntan a diferentes especies de estructura local cerca de la mitad de los segmentos NAC y NTD. En un trabajo reciente, informamos que este y otros residuos etiquetados con sCy3 en estos segmentos también exhiben tales sub-poblaciones60. Este resultado viene a mostrar que la dinámica estructural del monómero libre de α-Syn puede describirse mejor como una dinámica proteica general rápida (pocos microsegundos como máximo40),que transporta segmentos estructurales locales que permanecen estables durante milisegundos. Se sabía que otros desplazados internos como Tau y β amiloide compartían características similares de llevar una región estructurada local48,49,50.

smPIFE se ha utilizado principalmente para estudiar las interacciones entre biomoléculas separadas. Aquí, empleamos smPIFE para investigar PIFE dentro de segmentos de la misma proteína. Es importante mencionar que la mayoría de los experimentos previos de smPIFE se realizaron mediante el seguimiento de cambios relativos en las intensidades de fluorescencia de moléculas individuales inmovilizadas con la marca sCy313,14,15,16,17,18,19,51,52,53 . Si bien es útil para moléculas inmovilizadas, este procedimiento es menos informativo cuando se miden moléculas individuales de difusión libre. Hwang et al. han demostrado cómo medir el efecto PIFE también mediante el seguimiento de los cambios en las vidas de fluorescencia, que informan directamente sobre el cambio en la dinámica de isomerización del estado excitado de sCy319. Aquí investigamos el efecto PIFE de la difusión única α-Syn a través de las vidas medias de fluorescencia sCy3, en lugar de rastrear los cambios relativos en las intensidades de fluorescencia. Al hacerlo, pudimos adquirir sub poblaciones relacionadas con PIFE a pesar del corto tiempo de residencia de cada molécula de α-Syn en el punto confocal. De hecho, las vidas medias de fluorescencia demostraron ser útiles no solo para definir subpoblaciones relacionadas con PIFE, sino también para evaluar la dinámica lenta relacionada con PIFE utilizando el marco de análisis de recurrencia deráfagas 47. Sin embargo, se requiere más trabajo en el desarrollo de procedimientos que permitan evaluar adecuadamente la dinámica PIFE más rápida. Hay muchas herramientas de estadística de fotones existentes, utilizadas para evaluar la dinámica rápida de FRET en experimentos smFRET de difusión libre, que pretendemos reutilizar para ser utilizados en smPIFE54,55.

Para resumir, en este trabajo utilizamos la combinación relativamente nueva de mediciones PIFE de moléculas individuales de difusión libre para identificar subpedes de ms-estables de estructuras locales en α-Syn, que no fueron recuperadas por smFRET. Empleamos mediciones smPIFE para estudiar α-Syn como modelo de IDP y nuestros resultados se extienden más allá de los hallazgos anteriores de α-Syn que está desordenado a nivel mundial. Los hallazgos sugieren α-Syn puede llevar estructuras locales ordenadas estables y planteamos la hipótesis de que estas estructuras locales pueden desempeñar un papel en el reconocimiento vinculante.

Hasta ahora, smPIFE se utilizó como medio para estudiar las interacciones de los ácidos nucleicos etiquetados con sCy3 con sus contrapartes de proteínas no etiquetadas51. Con eso, smPIFE se utilizó como una herramienta poderosa para detectar interacciones biomoleculares, y por lo tanto, el siguiente paso natural en esa dirección sería usarlo para detectar las interacciones proteína-proteína y su dinámica, un complejo a la vez.

El poder de usar un sensor de proximidad de corto alcance como smPIFE puede ayudar a identificar la estructuración local estable dentro de otros sistemas de proteínas considerados desordenados y estructuralmente inestables. Sin embargo, el poder de usar un sensor de proximidad corta basado en fluorescencia de una sola molécula no se detiene allí. Hay muchos sistemas biomoleculares que exhiben dinámicas conformacionales a escala corta para facilitar su función, como muchos canales iónicos. Creemos que smPIFE puede servir como una herramienta complementaria a FRET de molécula única, en tales casos donde el rango dinámico de los cambios de proximidad dentro del sistema de proteínas no coincide con el rango dinámico de distancias que FRET puede detectar y resolver. En resumen, promovemos el uso de smPIFE como un sensor de proximidad complementario a las mediciones fret de molécula única, con el fin de cubrir una escala más amplia de proximidades biomoleculares, y tal vez observar subpúbricas claras promediadas en milisegundos de los parámetros medidos que informan sobre estructuras estables que son locales o generales.

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Disclosures

Todos los autores no comparten ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

El plásmido pT-t7 que codifica el mutante A56C α-Syn nos fue dado como regalo por el Dr. Asaf Grupi, el Dr. Dan Amir y el Dr. Elisha Haas. Este documento fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH, subvención R01 GM130942 a E.L. como subaward), la Fundación de Ciencias de Israel (subvención 3565/20 dentro del Programa de Investigación KillCorona - Frenar el Coronavirus), el Fondo Milner y la Universidad Hebrea de Jerusalén (fondos de inicio).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merc C7715 cutoff: 100 kDa
ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
BSA Sigma-Aldrich A9647
cysteamine Sigma-Aldrich 30070
dialysis bags - MEGA GeBaFlex-tube Gene Bio-Application MEGA320
dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Fast SeeBand staining solution Gene Bio-Application SB050
Glycine Sigma-Aldrich 50046
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES Sigma-Aldrich 54457
HiTrap Desalting 5 mL Sigma-Aldrich GE17-1408
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX) Sigma-Aldrich 238813
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
LB broth Sigma-Aldrich L3152
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63068
MonoQ column Sigma-Aldrich 54807
protein LoBind tube Sigma-Aldrich EP0030108094 0.5 mL
Rinse a µ-slide 18 Ibidi 81816
SDS Sigma-Aldrich 75746
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich 71507
Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas mini-plast 815-004-05-001
streptomycin sulfate Sigma-Aldrich S9137
sulfo-Cy3 maleimide abcam ab146493
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich 75259
Tris-HCl Sigma-Aldrich 93363
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625

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Bioquímica Número 171 Molécula única mejora de la fluorescencia inducida por proteínas vidas útiles de fluorescencia α-sinucleína conformaciones dinámica proteína intrínsecamente desordenada
Utilizando la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas resueltas en el tiempo para identificar conformaciones locales estables un monómero α-sinucleína a la vez
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Zaer, S., Lerner, E. Utilizing… More

Zaer, S., Lerner, E. Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One α-Synuclein Monomer at a Time. J. Vis. Exp. (171), e62655, doi:10.3791/62655 (2021).

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