Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

استخدام تحسين الفلورية المستحث بالبروتين الذي تم حله زمنيا لتحديد التركيبات المحلية المستقرة α-Synuclein Monomer في كل مرة

Published: May 30, 2021 doi: 10.3791/62655
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

الوقت حل واحد جزيء البروتين الناجم عن تعزيز الفلورية هو مفيد مضان مطيافية القرب الاستشعار حساسة للتغيرات الهيكلية المحلية في البروتينات. هنا نظهر أنه يمكن استخدامه للكشف عن تشكيلات محلية مستقرة في α-Synuclein ، والتي تعرف باسم غير منظم وغير مستقر كروي عند قياسه باستخدام مسطرة FRET طويلة المدى.

Abstract

استخدام المساطر الطيفية لتتبع تشكيلات متعددة من الجزيئات الحيوية واحدة ودينامياتها قد أحدثت ثورة في فهم الديناميات الهيكلية ومساهماتها في علم الأحياء. في حين أن المسطرة المستندة إلى FRET تقارير عن المسافات بين الصبغة في نطاق 3-10 نانومتر، تقنيات الطيفية الأخرى، مثل تعزيز الفلورية الناجمة عن البروتين (PIFE)، تقرير عن القرب بين صبغة وسطح البروتين في أقصر 0-3 نانومتر المدى. وبغض النظر عن الطريقة المفضلة، فإن استخدامها في قياس الجزيئات الحيوية المنتشرة بحرية واحدة تلو الثانية يسترجع المدرجات التكرارية للمعلمة التجريبية التي تسفر عن مجموعات فرعية منفصلة موزعة مركزيا من الجزيئات الحيوية، حيث يمثل كل مجموعة فرعية إما تشكيلا واحدا بقي دون تغيير داخل ميلي ثانية، أو تشكيلات متعددة تتقاطع أسرع بكثير من ميلي ثانية، وبالتالي مجموعة فرعية متوسطة. في FRET أحادي الجزيء ، حيث المعلمة المبلغ عنها في المدرجات التكرارية هي كفاءة FRET بين الصبغات ، تم الإبلاغ سابقا عن α بروتين فرعي متوسط واحد من التركيبات المتعددة التي تتشابك بسرعة. في حين أن هذه النتائج السابقة تعتمد على نطاق 3-10 نانومتر من المسطرة القائمة على FRET ، سعينا إلى وضع هذا البروتين على المحك باستخدام PIFE أحادي الجزيء ، حيث نتتبع عمر الفلورية لبروتينات sCy3 المحددة لموقع معين α-Synuclein واحدة في كل مرة. ومن المثير للاهتمام ، وذلك باستخدام هذا أقصر مدى مستشعر القرب الطيفي ، sCy3 المسمى α - Synuclein معارض عدة مجموعات فرعية مدى الحياة مع مختلفة بوضوح متوسط العمر التي تتقاطع في 10-100 مللي ثانية. وتبين هذه النتائج أنه على الرغم من أن α سينوكلين قد يكون مضطربا على الصعيد العالمي، فإنه يحقق مع ذلك هياكل محلية مستقرة. باختصار، في هذا العمل نسلط الضوء على ميزة استخدام أجهزة استشعار القرب الطيفية المختلفة التي تتبع التغيرات الهيكلية المحلية أو العالمية الجزيئات الحيوية واحد في وقت واحد.

Introduction

على مدى العقدين الماضيين، أصبحت الأساليب القائمة على مضان جزيء واحد أداة قوية لقياس الجزيئات الحيوية1،2، والتحقيق في كيفية توزيع المعلمات الجزيئية الحيوية المختلفة وكذلك كيف أنها تتقاطع ديناميكيا بين المجموعات الفرعية المختلفة من هذه المعلمات في قرار sub-millisecond3،4،5. المعلمات في هذه التقنيات تشمل كفاءة نقل الطاقة في قياسات FRET 6,7, مضان anisotropy8,9, مضان غلة الكم والعمر10,11, كدالة من مختلف مضان إخماد12 أو تعزيز13 آليات. واحدة من هذه الآليات، والمعروفة باسم تحسين الفلورية الناجمة عن البروتين (PIFE)14 يقدم تعزيز العائد الكم الفلوري والعمر كدالة لعرقلة steric إلى إيزوميريس الحرة من الفلوروفور عندما تكون في حالة متحمس، الناجمة عن أسطح البروتين في محيط الصبغة14،15،16،17،18،19 . وتعتبر كل من FRET وPIFE مساطر طيفية أو مستشعرات القرب لأن معلمتهما المقاسة ترتبط مباشرة بمقياس مكاني داخل الجزيئات الحيوية المسماة تحت القياس. في حين أن كفاءة FRET ترتبط بالمسافة بين زوج من الأصباغ ضمن نطاق 3-10 نانومتر20، فإن مسارات PIFE تزيد في غلة الكم الفلوري أو العمر المرتبط بالمسافة بين الصبغة وسطح بروتين قريب في نطاق 0-3 نانومتر19.

وقد استخدمت على نطاق واسع FRET جزيء واحد لتوفير رؤى الهيكلية في العديد من أنظمة البروتين المختلفة, بما في ذلك البروتينات المضطربة في جوهرها (النازحين)21, مثل α-سينوكلين (α-سين)22. α-Syn يمكن تشكيل هياكل مرتبة بعد ربط الجزيئات الحيوية المختلفة وتحت ظروف مختلفة23،24،25،26،27،28،29،30. ومع ذلك ، عندما لا تنضم ، يتميز مونومر α سين بعدم التجانس العالي مع التوافق السريع31،32.

وقد درست سابقا تشكيلات α سين باستخدام تقنيات مختلفة مختلفة تساعد في تحديد ديناميات تشكيلية من هذه النظم البروتين غير متجانسة للغاية وديناميكية33،34،35،36،37،38،39. ومن المثير للاهتمام، جزيء واحد FRET (smFRET) قياسات α سين في العازلة ذكرت واحد FRET السكان39،40 التي هي نتيجة لمتوسط الوقت من التوافقات بشكل حيوي في بعض الأحيان أسرع بكثير من وقت الانتشار النموذجي من α سين من خلال بقعة الكونفوار (مرات أسرع من بضع ميكروثانية وأسرع من ذلك ، بالنسبة لأوقات نشر ميلي ثانية نموذجية)40، 41. ومع ذلك ، باستخدام مسطرة مطيافية FRET مع حساسية المسافة 3-10 نانومتر في بعض الأحيان تقارير فقط عن التغيرات الهيكلية الشاملة في بروتين صغير مثل α سين. ويمكن أن تبلغ قياسات جزيء واحد باستخدام أجهزة استشعار القرب الطيفي ذات الحساسيات الأقصر مسافة عن ديناميات الهياكل المحلية. هنا نقوم بإجراء قياسات PIFE جزيء واحد من α-Syn وتحديد مجموعات فرعية مختلفة من العمر الفلوري رسم الخرائط إلى هياكل محلية مختلفة مع التحولات بينهما بطيئة مثل 100 مللي ثانية. يلخص هذا العمل قياسات smPIFE التي تم حلها زمنيا لجزيئات α-Syn التي يتم نشرها بحرية واحدة في كل مرة ، في المخزن المؤقت وعندما تكون مرتبطة بالأغشية المستندة إلى SDS كمستشعر القرب الطيفي أحادي الجزيئات قصير المدى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التحول البلازميد

  1. إعداد 0.5 لتر من SOC المتوسطة
    1. وزن 10 غرام من التريبتون، 2.5 غرام من استخراج الخميرة، 0.25 غرام من كلوريد الصوديوم (NaCl)، 0.1 غرام من كلوريد البوتاسيوم (KCl).
    2. أضف الماء المقطر المزدوج (DDW) حتى الحجم الإجمالي 0.5 لتر.
    3. ضبط درجة الحموضة 7 بإضافة هيدروكسيد الصوديوم (NaOH).
    4. إعداد aliquots الأسهم من 100 مل وautclave.
    5. قبل الاستخدام، أضف 0.5 مل من كلوريد المغنيسيوم المعقم (MgCl2)و 1.8 مل من الجلوكوز المعقم إلى 100 مل من SOC.
  2. إذابة BL21 (DE3) خلايا الإشريكية القولونية المختصة على الجليد.
  3. خلط الخلايا المختصة بلطف.
  4. إعداد اثنين من أنابيب 15 مل. تسمية واحدة كما أنبوب رد فعل التحول والآخر كما أنبوب التحكم.
  5. Aliquot 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة في الأنابيب.
  6. إضافة 1 ميكرولتر من البلازميد بتركيز 0.1 نانوغرام / ميكرولتر في أنبوب رد فعل التحول.
  7. سخني SOC المتوسطة في 42 °C حمام مائي للاستخدام في الخطوة 1.8.
  8. الحرارة نبض الأنبوبين في 42 °C حمام مائي لمدة 45 ثانية. (خطوة حاسمة!)
  9. إضافة 900 ميكرولتر من SOC المتوسطة ساخنة إلى كل أنبوب.
  10. احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع اهتزاز بسرعة 225 دورة في الدقيقة.
  11. انتشار 200 ميكرولتر من الخلايا معplasmid تحول على واحد LB (لوريا-برتاني) -أغار لوحة تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين، وذلك باستخدام منتشر الخلايا العقيمة.
  12. انتشار 200 ميكرولتر من الخلايا معplasmid تحول على لوحة واحدة LB-أجار دون أمبيسلين، وذلك باستخدام موزع معقمة (السيطرة الإيجابية).
  13. انتشار 200 ميكرولتر من خلايا التحكم (لا تحتوي على بلازميد) على لوحة LB-agar واحدة تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين، وذلك باستخدام موزع معقم(السيطرة السلبية).
  14. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 °C.

2. إعداد البروتين

  1. إعادة تركيب α-Synuclein التعبير والتنقية
    1. اختيار مستعمرة واحدة وتنمو في 100 مل من LB autoclaved (لوريا-بيرتاني) المتوسطة السائلة التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين في 37 درجة مئوية (بداية).
    2. إعداد أربع قوارير 2 L Erlenmeyer، كل منها يحتوي على 1 لتر من المتوسط LB autoclaved و 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين (تلقيح كبير).
    3. قياس الكثافة البصرية (OD في λ = 600 نانومتر) من محلول الخلية. عندما تصل كثافة الخلية في البداية إلى ODλ= 600nm من 0.6-0.7، أضف 10 مل من محلول المبتدئين لكل 1 لتر من متوسط LB الذي تم إعداده في الخطوة السابقة.
    4. زراعة الوسائط البكتيرية في شاكر حاضنة في 37 درجة مئوية وسرعة 200 دورة في الدقيقة.
    5. عندما تصل كثافة الخلية إلى ODλ= 600nm من 0.6-0.8، حث تعبير البروتين عن طريق إضافة الأيزوبروبيل β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) لكل 1 لتر من متوسط النمو إلى تركيز نهائي قدره 1 مليون.
      ملاحظة: حل 0.96 غرام من IPTG في 4 مل من DDW وإضافة 1 مل من محلول IPTG الناتج لكل 1 لتر من النمو البكتيري.
    6. زراعة الخلايا لمدة 4 ساعات وجمعها عن طريق الطرد المركزي في أنابيب 50 مل بسرعة 5170 × ز لمدة 8 دقائق.
      ملاحظة: في كل جولة، تجاهل supernatant، والحفاظ على بيليه وملء مرة أخرى نفس الأنابيب مع النمو البكتيري.
    7. تخزين بيليه البكتيرية في تخزين التجميد العميق (على سبيل المثال، -80 درجة مئوية) لليوم التالي.
    8. في اليوم التالي، وإعداد 200 مل من العازلة تحلل: 40٪ (ث / الخامس) السكروز والعازل A، والذي يتضمن 30 mM تريس-HCl، 2 M إيثيلينديامينتتراستيك حمض (EDTA)، 2 mM dithiothreitol (DTT) في درجة الحموضة 8.0.
    9. إضافة 25 مل من العازلة تحلل إلى كل أنبوب مع بيليه البكتيرية.
    10. إعادة تعليق بيليه (استخدام المصاطب البستر البلاستيك العقيم) في العازلة Lysis (انظر 2.1.8).
    11. إعداد العقيمة 250 مل قارورة Erlenmeyer مع مغناطيس stirrer على الجليد.
    12. إضافة 5 مل من المخزن المؤقت للتحلل، ومن ثم نقل الخلايا المتجانسة إعادة تعليق إليها.
    13. يحرك الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 200 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    14. تقسيم الحل إلى أنابيب 50 مل والطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بسرعة 17400 × غرام.
    15. تجاهل الناتنات الفائق.
    16. إعداد العقيمة 250 مل قارورة Erlenmeyer مع مغناطيس stirrer على الجليد.
    17. إضافة 15 مل من العازلة حل (90 مل تبريد العازلة A و 37 ميكرولتر من MgCl2 حلها خارج الحد الذوبان وتصفيتها) في كل أنبوب. استخدام المصصات البستر البلاستيك العقيمة وحل بيليه.
    18. عندما يصبح جزء من الحل متجانسا ، نقله إلى قارورة Erlenmeyer التي تم تحريكها على الجليد.
    19. تحديد وحدة تخزين الحل في Erlenmeyer.
    20. إضافة 10 ملغ من كبريتات الستربتومايسين لكل 1 مل من الحل (قبل إضافة، حل كبريتات الستريبتومايسين في 2 مل من العازلة A).
      ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة من أجل إزالة الحمض النووي والريبوسومات بعيدا.
    21. يحرك المحلول لمدة 10-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    22. تقسيم الحل إلى أنابيب 50 مل والطرد المركزي في 4 درجة مئوية وسرعة 20700 × ز لمدة 30 دقيقة.
    23. جمع supernatant والتخلص من بيليه.
    24. إعداد قارورة Erlenmeyer 250 مل معقمة على الجليد مع ستيرر.
    25. تصفية supernatant باستخدام 0.22 ميكرومتر حقنة مرشح في قارورة Erlenmeyer نظيفة.
    26. تحديد حجم الحل ووزن 0.3 غرام من كبريتات الأمونيوم لكل مل واحد من الحل.
    27. تدريجيا، إضافة كبريتات الأمونيوم إلى الحل أثار.
      ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لتسريع البروتينات. عندما يربط كبريتات الأمونيوم البروتينات ، يصبح المحلول محجوبا ومشوشا ، والذي يظهر كاللون الأبيض.
    28. يحرك المزيج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    29. تقسيم الحل إلى أنابيب 50 مل والطرد المركزي في 4 درجة مئوية وسرعة 20700 غرام لمدة 30 دقيقة.
    30. تجاهل بعناية supernatant والحفاظ على بيليه.
    31. حل بيليه مع 20 مل من العازلة A.
    32. توحيد جميع الحلول في أنبوب واحد، ومن ثم قياس الطيف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية من الحل.
      ملاحظة: إذا أظهر الطيف توقيع التجميع (الامتصاص فوق طول موجي 300 نانومتر)، استمر في الخطوة التالية. إذا لم يكن كذلك، تخطي الخطوة التالية والانتقال إلى الخطوة 2.1.34.
      ملاحظة: مؤشر التجميع (A.I.) محسوب من أطياف الأشعة فوق البنفسجية كما ODλ = 350nm/ (ODλ= 280nm - ODλ = 350nm) ×100. 41
    33. استخدم أنابيب centriprep وأجهزة الطرد المركزي التي تبلغ سرعتها 100 كيلودا بسرعة 3,590 x g عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. جمع السائل الذي مر من خلال مرشح.
    34. Dialyze الحل في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها، ضد العازلة A، وذلك باستخدام أكياس غسيل الكلى مع قطع 3.5 كيلودا.
    35. إجراء جولة أخرى من غسيل الكلى لمدة 4 ساعات على الأقل.
    36. تحميل نموذج dialyzed على عمود تبادل أنيون MonoQ 1 مل. استخدام 30 mM تريس هيدروكلوريد (تريس-HCl) العازلة في 7.5 pH كعازل الغسيل و 30 mM تريس-HCl العازلة pH 7.5 مع 500 م م NaCl كحاجز elution.
    37. قم بحقن العينة في العمود. ثم يغسل مع 20 حجم العمود (السير الذاتية) من 0٪ العازلة elution و100٪ غسل العازلة من أجل إزالة البروتينات غير منضم.
    38. غسل مع 7 السير الذاتية من 30٪ elution العازلة.
    39. Elute عينة بروتين α سين باستخدام التدرج الذي يتغير من 30٪ إلى 100٪ العازلة elution ل30 السير الذاتية، بمعدل تدفق 1.5 مل / دقيقة.
      ملاحظة: α-Syn elutes في 46-66 السير الذاتية في الموصلية 20-24 mS/cm، وهو ما يشير إلى 38-50٪ الغضوء العازلة.
    40. جمع كسور ذروة elution الرئيسية. تحقق من وجود α سين عن طريق تشغيل عينات في 15٪ من الصوديوم دودسيل كبريتات البولي أكريلاميد هلام electrophoresis (SDS-PAGE)، بعد تلطيخ إما مع حل تلطيخ Coomassie الأزرق أو سريع SeeBand. ومن المتوقع فرقة في 15 kDa.
    41. توحيد الكسور ذات الصلة و dialyze لهم بين عشية وضحاها، ضد العازلة A، وذلك باستخدام أكياس غسيل الكلى مع قطع 3.5 كيلودا في 4 درجة مئوية.
    42. إعداد aliquots من عينة البروتين وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  2. Cy3 المسمى α سينوكلين
    1. تقليل ثيول من بقايا السيستين في α-Syn A56C متحولة بإضافة DTT إلى تركيز نهائي من 2 mM لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    2. إزالة DTT عن طريق إجراء جولتين من غسيل الكلى باستخدام 3.5 كيلودا قطع أكياس غسيل الكلى. للجولة الأولى، dialyze ضد 30 mM تريس-HCl الرقم الحموضة 8.0 و 2 MM EDTA. للجولة الثانية، dialyze ضد 50 mM HEPES الرقم الحموضة 7.2 و 2 MM EDTA.
    3. تقليل بقايا السيستين بإضافة Tris(2-carboxyethyl)فوسفين هيدروكلوريد (TCEP) إلى عينة البروتين، إلى تركيز نهائي قدره 50 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: TCEP هو عامل تقليل غير سلفهيدريل، وبالتالي فإنه يحافظ على مجموعات ثيول خفضت دون رد فعل مع الصبغة. أضفنا 0.5 ميكرولتر من محلول مخزون من 1 M TCEP.
    4. حساب كميات البروتين المطلوبة لحجم رد الفعل النهائي من 1 مل.
      ملاحظة: هنا مثال على الحساب الذي استخدمناه:
      20 ميكرومتر تركيز البروتين النهائي × 1 مل الحجم النهائي = 56 ميكرومتر تركيز البروتين الأولي × البروتين الخامس لإضافتها
    5. حساب كمية الصبغة المطلوبة لحجم رد الفعل النهائي من 1 مل. يجب إجراء وضع العلامات صبغ من السيستين واحد مع صبغ الزائدة، في نسبة الضرس dye:protein من 3:1 على الأقل.
      ملاحظة: مثال على الحساب الذي استخدمناه:
      60 ميكرومتر تركيز صبغ النهائي × 1 مل الحجم النهائي = 370 ميكرومتر تركيز الصبغة الأولية × صبغة V أن تضاف
    6. حساب مقدار المخزن المؤقت من dialysate المطلوبة لضبط حجم رد الفعل الإجمالي إلى 1 مل.
      ملاحظة: مثال الحساب: 1 مل - (V محسوبة من الخطوة 2.2.4 + V محسوبة من الخطوة 2.2.5)
    7. إعداد قارورة رد الفعل مع المغناطيس على رأس stirrer.
    8. أولا، إضافة كمية محسوبة من البروتين والعازل. بعد ذلك، إضافة المبلغ المحسوب من الصبغة (سولفو-Cy3 maleimide).
    9. الحفاظ على رد الفعل في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 3-5 ساعات.
    10. إنهاء رد الفعل عن طريق إضافة 2 MM DTT وتستمر لمدة 1 ساعة.
    11. قم بإجراء ثلاث جولات من غسيل الكلى ضد Buffer A، باستخدام أكياس غسيل الكلى مع قطع 3.5 كيلودا لإزالة الصبغة الحرة الزائدة من المحلول.
    12. تحميل العينة على عمود استبعاد حجم لفصل مزيد من المسمى α-Syn من الصبغة الحرة.
    13. تحديد تركيز نقي المسمى α-Syn عن طريق قياس امتصاص الصبغة (معامل امتصاص لسولفو-Cy3 هو 162,000 M-1سم-1في λ=548 نانومتر).
    14. إذا لزم الأمر، ركز الحل α-Syn المسمى نقي باستخدام مركز فراغ (على سبيل المثال، SpeedVac). ثم، إجراء جولة واحدة من غسيل الكلى ضد العازلة A، وذلك باستخدام أكياس غسيل الكلى مع قطع 3.5 كيلودا وتحديد مرة أخرى تركيز البروتين المسمى.
    15. إعداد aliquots من عينة البروتين المسمى وتخزينها في -20 درجة مئوية.

3. القياسات

  1. الإعداد التجريبي smPIFE
    ملاحظة: استخدم الإعداد المستند إلى confocal التالية أو ما شابه ذلك.
    1. استخدام مصدر ليزر نبضي (في حالتنا، λ= 532 نانومتر picosecond الليزر النبضي مع عرض نبض ~ 100 PS FWHM)، تعمل بمعدل تكرار مناسب (20 ميغاهرتز في حالتنا) وتوجيهها إلى SYNC من بطاقة العد الفوتون واحد المترابطة زمنيا (TCSPC)، كمصدر للسولفو-Cy3 (sCy3) الإثارة.
    2. استخدام مرآة ديكثروليك مع انعكاسية عالية في 532 نانومتر، لفصل الإثارة والتشتت من الفلورية.
    3. استخدم ثقب قطره 100 ميكرومتر في بؤرة الضوء المنبعث، بعد تركيز شعاع الانبعاثات المحصلة بواسطة عدسة، وقبل أن يتم إعادة تجميع شعاع الانبعاثات بعدسة أخرى.
    4. استخدام مرشح تمرير الفرقة (585/40 نانومتر في حالتنا) لمزيد من تصفية sCy3 مضان من مصادر الضوء الأخرى.
    5. الكشف عن الفلورسينس باستخدام كاشف (الصمام الثنائي الانهيار الجليدي الفوتون واحد أو فوتولتر الهجين، في حالتنا) توجيهها (من خلال جهاز التوجيه 4-إلى-1، في حالتنا) إلى وحدة TCSPC (بيكر وهيكل SPC-150، في حالتنا).
      ملاحظة: في حالتنا، يتم إجراء الحصول على البيانات عبر برنامج VistaVision (ISSTM)بتنسيق ملف (TTTR) الذي تم حله بالوقت.
  2. إعداد عينة smPIFE
    1. إعداد 25 pM sCy3 المسمى α-Syn في القياسات العازلة: خلات الصوديوم 10 mM, 10 م الصوديوم ثنائي هيدروجين فوسفات، 10 م غليسين درجة الحموضة 8.0، 20 م م NaCl، 10 mM السيستين و 1 M 6-هيدروكسي-2،5،7،8-tetramethylchroman-2-carboxylic حمض (TROLOX)، في أنبوب منخفض البروتين ملزمة.
      ملاحظة: إذا تم قياس α-Syn في وجود الحويصلات SDS إضافة مقدار SDS المناسبة أيضا.
    2. شطف شريحة أغطية مجهرية من 18 غرفة مع 100 ميكرولتر من 1 ملغم / مل ألبوم مصل البقر (BSA) لمدة دقيقة واحدة ، ثم إزالة BSA.
    3. أضف 100 ميكرولتر من عينة α-Syn التي تحمل علامة pM sCy3 إلى غرفة في الشريحة ذات الغطاء.
    4. قم بإجراء قياس smPIFE للعينة باستخدام الإعداد الموضح، كما يلي في الخطوات التالية.
  3. الحصول على بيانات smPIFE
    1. استخدام عدسة عالية الفتحة العددية الغمر المياه الهدف (في حالتنا، أوليمبوس UPLSAPO 60x N.A. 1.2)، وإضافة قطرة من المياه فائقة النقاء على رأس العدسة الهدف.
    2. إصلاح الشريحة coverslip في غرفة المرحلة وتثبيته على رأس مرحلة المجهر.
    3. جلب العدسة الهدف صعودا ، حتى قطرة الماء على رأس مسحات العدسة الهدف في الجزء السفلي من الشريحة coverslip.
    4. افتح مصراع الليزر وارفع العدسة الهدف إلى الأعلى، بينما تفقد النمط على كاميرا CMOS، وجمع الضوء المتناثر من العينة. مراقبة نمط الحلقات متجدد الهواء: الأول يمثل التركيز في واجهة الماء والزجاج، ومن ثم الثاني يمثل التركيز في واجهة بين الزجاج والحل عينة.
    5. زيادة ارتفاع العدسة الهدف من قبل 75 ميكرومتر إضافية، وبذلك تركيز الليزر في عمق الحل، للحد من السيارات الفلورسينس من السطح الزجاجي للأغطية.
    6. ضبط قوة الليزر في عدسة الهدف ليكون ~ 100 μW.
    7. ابدأ في اقتناء الفوتونات المكتشفة لفترة محددة مسبقا (ساعتان، في قياساتنا).
      ملاحظة: يجب أن يكون لدى معظم إشارة الامتلاك معدل (يقاس بالتعول في الثانية، cps) مشابه للنسبة التي تم الحصول عليها عند قياس المخزن المؤقت فقط؛ يجب أن تظهر البيانات التي تحتوي على مللي ثانية أحداث انفجار الفوتون النادرة ، مع وجود معدل متوسط لمعدل خلفية الكاشف النموذجي (1000 cps < ، في حالتنا).

4. smPIFE انفجار التحليل

  1. تحويل البيانات الخام
    ملاحظة: عادة ما يتم تخزين البيانات في ملف ثنائي بتنسيق تم تعريفه مسبقا من قبل الشركة التي تصنع بطاقة TCSPC (ملفات.spc في حالتنا).
    1. تحويل ملف البيانات الخام إلى شكل ملف عالمي فوتون HDF542، وذلك باستخدام برنامج جناح phconvert (https://github.com/Photon-HDF5/phconvert). استدعاء ملف البيانات الخام كمدخل وتحويلها إلى ملف البيانات الخام .hdf5 باستخدام رمز المناسبة في جناح phconvert (تحويل ns-ALEX بيكر-هيكل الملفات إلى فوتون HDF5.ipynb Jupyter دفتر الملاحظات، في حالتنا).
      ملاحظة: التحويل إلى ملف .hdf5 يتضمن: (1) تحديد تدفقات الفوتون ذات الصلة في البيانات الأولية (أي تدفقات الفوتونات من الفوتونات المسجلة من معرف الكاشف ذات الصلة)؛ (2) تحديد تدفقات الفوتونات ذات الصلة في البيانات الأولية (أي تدفقات الفوتونات من الفوتونات المسجلة ل ID الكاشف ذي الصلة)؛ (2) تحديد تدفقات الفوتونات ذات الصلة في البيانات الأولية.) (2) نانو تايمز فوتون ذات الصلة (مرات الكشف عن فوتون بالنسبة إلى الوقت SYNC الإثارة)؛ و (3) وأضاف البيانات الوصفية.
  2. انفجار البحث والاختيار باستخدام FRETbursts43
    ملاحظة: يتم تخزين كافة ملفات البيانات الأولية فوتون HDF5 من القياسات smPIFE، وكذلك رمز تلخيص تحليل البيانات الخام، في Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4587698). جميع الخطوات أدناه مفصلة وتظهر داخل دفاتر Jupyter ، كما تم توفيرها في رابط مستودع Zenodo.
    1. افتح دفاتر Jupyter (ضمن إطار أناكوندا، في حالتنا).
    2. افتح دفتر الملاحظات smPIFE-aSyn 56C(Cy3) 25 pM newBuffer (دفتر ملاحظات نهائي).ipynb (يمكن العثور عليه في ارتباط Zenodo).
    3. تحميل FRETbursts.
    4. تحميل ملف بيانات HDF5 فوتون.
    5. تقييم معدل BG: باستخدام الرسم البياني للعصر بين الفوتونات، احسب معدلات الخلفية (BG) لكل 30 ثانية من الحصول على البيانات في ملف بيانات HDF5 الفوتون.
      ملاحظة: تصف الخطوات التالية البحث الاندفاع باستخدام خوارزمية إطار انزلاق44،45،46.
    6. نقل إطار زمني من m = 20 فوتون متتالية، فوتون واحد في وقت واحد.
    7. جمع بيانات الفوتون فقط إذا كان معدل الفوتون الفوري، ( Equation 1 ) ، هو على الأقل F = 11 مرات أكبر من معدل BG لتلك الفترة من الحصول على البيانات.
      ملاحظة: يتم إنشاء انفجار من كافة فوتونات متتالية التي تم جمعها عن طريق انزلاق نافذة فوتون واحد في وقت واحد (الخطوة 4.2.6.) والاتفاق مع معيار معدل فوتون (الخطوة 4.2.7).
    8. حساب خصائص الاندفاع التالية:
      حجم الانفجار: كمية من فوتونات في انفجار.
      مدة الانفجار: الفرق الزمني بين آخر وأول أوقات الكشف عن فوتون في انفجار.
      انفجار السطوع: أكبر قيمة لمعدل فوتون فوري في انفجار.
      فصل الاندفاع: الفاصل الزمني بين رشقات نارية متتالية.
      ملاحظة: توضح النقاط التالية إجراء تحديد الاندفاع إضافية.
    9. رسم الرسم البياني لقيم سطوع الانفجار (أعلى معدل فوتون فوري في انفجار) ، مع محور الأحداث في مقياس لوغاريتمي.
    10. حدد عتبة سطوع الاندفاع على أنها قيمة سطوع الاندفاع الدنيا التي يعرض منها الرسم البياني نمطا متحللا.
    11. حدد الاندفاعات ذات قيم السطوع الأكبر من عتبة سطوع الاندفاع.
      ملاحظة: تصف الخطوات التالية الاندفاع متوسط العمر الفلوري.
    12. رسم الرسم البياني للنانوتايم فوتون لجميع فوتونات في جميع رشقات نارية مختارة مع محور العد فوتون في مقياس لوغاريتمي.
    13. حدد عتبة نانوتايم على أنها الحد الأدنى لقيمة نانوتايم التي يعرض منها الرسم البياني للنانوتيزمانات الضوئية نمطا متحللا.
    14. حدد فوتونات فقط ذات أوقات نانوية أكبر من عتبة نانوتايم.
    15. حساب المتوسط الجبري لجميع nanotimes فوتون مختارة.
    16. طرح عتبة نانوتايم من المتوسط الجبري نانوتايم فوتون. والنتيجة هي متوسط نانوتايم الفوتون للانفجار ، والذي يتناسب مباشرة مع متوسط عمر الفلورسينس.
    17. رسم الرسم البياني لجميع انفجار يعني العمر الفلوري. قد تظهر مجموعات فرعية موزعة مركزيا من العمر الفلوري. تمثل المجموعات الفرعية ذات المتوسطات المنخفضة القيمة أنواع الجزيئات مع sCy3 التي لم يتم عرقلتها بشكل نجمي ، في حين أن المجموعات الفرعية ذات المتوسطات ذات القيمة الأعلى تمثل أنواع الجزيئات مع sCy3 التي كانت أكثر عرقلة نجمية.
      ملاحظة: تصف الخطوات التالية ديناميكيات بطيئة بين الاندفاع استنادا إلى تحليل تكرار الاندفاع47
    18. رسم الرسم البياني لوقت فصل الانفجار، مع محور وقت الفصل في مقياس لوغاريتمي.
      ملاحظة: سيظهر مجموعتان فرعيتان من أوقات الفصل المتفجرة:
      مجموعة فرعية رئيسية مع أوقات فصل من الثواني ، تمثل رشقات نارية متتالية تنشأ من جزيئات مختلفة تقاس على التوالي.
      مجموعة فرعية طفيفة مع أوقات الانفصال ~ <100 مللي ثانية ، تمثل رشقات نارية متتالية على حد سواء منشؤها من نفس الجزيء ، تتكرر مرة أخرى من خلال حجم confocal.
    19. حدد لحفظ جميع أزواج من رشقات نارية متتالية التي يتم فصلها بأقل من وقت الفصل الأقصى الذي يحدد نفس الجزيء الفرعية السكان (<100 مللي ثانية، في حالتنا).
    20. رسم رسم بياني أو قطعة مبعثرة من متوسط العمر الفلوري للانفجارات الأولى والثانية لجميع أزواج الرشقات التي تتكرر تحت عتبة زمنية معينة للفصل

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كما المشردين داخليا، عندما لا يكون ملزما إلى الجزيئات الحيوية آخر، α سين معارض الديناميات الهيكلية بين تشكيلات متعددة، مع التحولات في عدد قليل من ميكروثانية40 وحتى في مئات نانو ثانية41. عندما يعبر α سين بقعة الكونفوجال ، قد يخضع لآلاف التحولات بين التركيبات. في الواقع ، كان هذا هو الحال عندما تم استخدام smFRET39،40. هنا نقوم بإجراء قياسات smPIFE من أجل التحقيق في الديناميات التركيبية المحلية α سين.

يسجل القياس الفوتونات الفلورية المنبعثة من صبغة sulfo-Cy3 (sCy3) ، المرفقة بمجموعة ثيول من السيستين في متحولة α-Syn A56C. يمكن أن يخضع الفلوروفور sCy3 للإيزوميرات عندما يكون في حالة متحمسة. ومع ذلك ، sCy3 تنبعث الفوتون عندما دي يثير من ايزومر عبر. لذلك ، إذا لم يكن هناك شيء يعيق بشكل نجمي إيزوميريس sCy3 متحمس الدولة ، فإنه سوف تنبعث منها عدد قليل من الفوتونات في المتوسط ، ولكن سوف تظهر انخفاض العائد الكم مضان وعمر قصير مضان. ومع ذلك ، إذا تم عرقلة إيزوميريشن حالة متحمس من sCy3 ، على سبيل المثال ، سطح بروتين قريب ، فإن معدل الإيزوميريشن سينخفض ، مما سيؤدي بدوره إلى المزيد من الإثارة من الإيزومر العابر ، وبالتالي المزيد من الفوتونات ، وعائد الكم الفلوري الأعلى وعمر أطول للفلور. هذا هو المعروف باسم تأثير PIFE.

باستخدام smPIFE قمنا بقياس متوسط العمر الفلوري ل sCy3 الذي وضع العلامات α-Syn في بقايا 56 α-Syn في وقت واحد ، حيث تستشعر صبغة sCy3 بيئة البروتين حول البقايا 56. تم قياس البروتين بتركيز 25 pM ، حيث يوجد بشكل رئيسي كمونومر. تظهر نتائج قياسات smPIFE كمسناز بياني لعمر الفلورسينس المتوسط لجزيئات α-سين المفردة(الشكل 1). يمكن تجميع متوسط العمر الفلوري إلى مجموعتين فرعيتين رئيسيتين(الشكل 1A). أول السكان الفرعية معارض قصيرة العمر الفلوري، مع عمر مضان مميزة من 1.6 ns، تمثل الدول α-سين تشكيلية مع عدم وجود أو عدد قليل من أسطح البروتين وجدت في محيط بقايا 56. أما المجموعة الفرعية الثانية فيعرض عمرا أطول للفلورسين، مع عمر مفلور مميز يبلغ 3.5 ns، وهو ما يمثل حالات تشكيلية α-Syn مع المزيد من أسطح البروتين الموجودة بالقرب من المخلفات 56.

ومن المعروف أنه في وجود ~ 5-10 MM SDS، وشرائح N-المحطة وNAC تقريبا كل من جزيئات α-سين في الحل اعتماد هيكل دبوس الشعر حلي على ملزمة لSDS vesicles40. منذ بقايا 56 يقع داخل الجزء NAC، ومن المتوقع أن تفلور من بقايا وضع العلامات sCy3 56 لاستشعار بيئة دقيقة موحدة نوعا ما، لأن غالبية تقريبا جميع جزيئات α سين ينبغي الحصول على هيكل دبوس الشعر حلزوني ملزمة الحويكل. لذلك ، قمنا بإجراء قياسات smPIFE مماثلة ولكن في وجود 5 mM SDS كعنصر تحكم ، ونتوقع تحديد مجموعة واحدة من العمر الفلوري. والواقع أن هذه القياسات تؤدي إلى مجموعة واحدة من العمر الفلوري مع عمر مضان مميز قدره 3.1 ns(الشكل 1B). يشير العمر الفلوري المميز ~3 ns إلى بنية محلية بالقرب من البقايا 56 ، غير موجودة في ~ 1.5 ns العمر الفرعي للسكان من α سين في الحل ، مع التأكيد على هيكلة α-Syn يخضع عندما يتم تشكيل دبوس الشعر الحلي والربط لسطح الحويص SDS قد حدث. ومن المثير للاهتمام أن السكان واحد لديه أقصر عمر مضان مميزة بالنسبة إلى ~ 3.5 ns العمر الفرعي للسكان من α سين في الحل.

ظهور اثنين من المجموعات الفرعية الموزعة مركزيا متميزة من رشقات نارية جزيء واحد هو توقيع معروف من التغايرية الجزيئية. وبما أنه لا يوجد خليط من الجزيئات المسماة المنفصلة، فإن كلا المجموعتين الفرعيتين مدى الحياة تمثلان نوعين منفصلين من بقايا وضع العلامات SCy3 56 في α-Syn (الشكل 1A). ولذلك، فإن النتائج تقرير التغاير الديناميكي. وذلك لأن المعلمة المبلغ عنها في الرسم البياني تحسب باستخدام جميع فوتونات في انفجار طوال مدة MS قليلة من نشر α سين داخل حجم confocal. لذلك ، عبرت جزيئات α-Syn المسماة sCy3 حجم الكونفوجكال إما عند عرض عمر متوسط قصير أو طويل. يجب أن تحدث التحولات بين هذه الأنواع أبطأ من أوقات الانتشار المميزة من خلال بقعة الكونفوجال ، وبالتالي أبطأ من بضع مللي ثانية. من أجل تقييم هذا السلوك الديناميكي، قمنا بتحليل تكرار الانفجار47. باختصار ، بما أننا نسعى إلى تقييم الديناميكيات التي تحدث في بعض الأحيان لفترة أطول من مدة انفجار جزيء واحد ، اختبرنا إمكانية أن يعرض جزيء واحد α-Syn تغييرا في متوسط عمر sCy3 الفلوري بين المعابر المتتالية لبقعة الكونفوجال. للقيام بذلك، نميز أولا بين نوعين من رشقات نارية متتالية: 1) رشقات نارية متتالية من جزيئات مختلفة α سين مع أوقات الفصل المتفجرة التي توزع في ثوان، و2) رشقات نارية متتالية من نفس جزيء α سين الذي يتكرر في حجم الكونفوجال بعد وقت انفجار الانفصال، في بعض الأحيان بطيئة مثل ~ 100 مللي ثانية(الشكل 2A). بعد اثنين من متوسط العمر السكان الفرعية، اخترنا لفحص أزواج من رشقات نارية متتالية التي يتم فصلها على الأكثر 100 مللي ثانية(الشكل 2A)،حيث أظهرت أول من زوج من رشقات نارية متوسط العمر الفلوري ضمن العمر القصير دون السكان (0-2 ns) أو ضمن السكان الفرعيين مدى الحياة الطويلة (>3.5 ns؛ الشكل 2B، ظلال ملونة). اختبارات التفتيش التي من رشقات نارية من رشقات نارية متكررة، ممثلة في الانفجار الثاني في زوج من رشقات نارية متتالية، والمعارض يعني العمر الفلوري داخل السكان الفرعية مدى الحياة مقابل واحد في الانفجار الأول. يمكن للمرء أن يلاحظ أن جزءا صغيرا من الجزيئات التي تبدأ كما انفجر في العمر القصير الفرعية السكان تتكرر كما انفجر خارج هذا النطاق وحتى داخل السكان الفرعية مدى الحياة الطويلة (الشكل 2C)، وأن جزءا صغيرا من الجزيئات التي تبدأ كما انفجر في العمر الطويل السكان الفرعية تتكرر كما انفجار خارج هذا النطاق وحتى ضمن العمر القصير subpopulation (الشكل 2D)، كل ذلك في غضون 10-100 مللي ثانية.

Figure 1
الشكل 1: متوسط الفلورسينس العمر السكان الفرعية من sCy3 وضع العلامات بقايا 56 في α-Syn A56C. يعني المدرجات التكرارية العمرية الفلورية من sCy3 المسمى بحرية α-Syn A56C (عند 25 pM) في غياب (A) ووجود (B) من 5 mM SDS. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2:يظهر تحليل تكرار انفجار PIFE أن الجزيئات الفردية تخضع لتحولات بين قيم متوسطة مختلفة مدى الحياة في غضون 100 مللي ثانية. من أعلى إلى أسفل:(أ)الرسم البياني لأوقات الفصل بين رشقات نارية متتالية جزيء واحد. الظل البرتقالي يمثل أوقات الفصل بين رشقات نارية متتالية من الجزيئات المتكررة، حيث تنشأ رشقات نارية الأولى والثانية من نفس الجزيء. (ب)متوسط العمر الفلورية المدرج التكراري لجميع رشقات نارية جزيء واحد. تمثل الظلال الصفراء والخضراء نطاق متوسط قيم العمر المختار لتمثيل القيم ضمن مجموعات فرعية قصيرة وطويلة العمر على التوالي. (ج) أو (D). متوسط تخطيطات العمر الفلورية من رشقات نارية التي تم فصلها عن انفجار سابق من قبل مرة واحدة ضمن مقياس زمني مظلل باللون البرتقالي (في A)،وحيث كان الانفجار السابق متوسط العمر داخل النطاق الذي يمثله ظلال صفراء أو خضراء، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أجريت دراسات كيميائية حيوية وبيولوجية واسعة لدراسة الخصائص الهيكلية αسين وطبيعته المضطربة33و34و35و36و37و38. وقد استخدمت العديد من الأعمال بالفعل smFRET نشر بحرية للتحقيق في الديناميات داخل الجزيئية من α سين مونومر خالية من الربط. وأفادت هذه الأعمال عدم التجانس ديناميكية عالية من α سين، مما يؤدي إلى متوسط الخروج من الأنواع الهيكلية المختلفة متعددة ضمن أوقات الانتشار نموذجية من خلال بقعة confocal، مما يؤدي إلى ظهور السكان FRET واحد39،40. ومع ذلك ، يجب على المرء أن يتذكر أن قياسات smFRET تقرير عن التغيرات في المسافات بين الصبغة التي تحدث في غضون 3-10 نانومتر ، وهو مقياس يميز التغيرات الهيكلية الشاملة في بروتين صغير مثل α سين.

كنا فضوليين حول النتائج التي قد نجدها عند استخدام مستشعر مختلف قائم على الفلورسينس للتغيرات المكانية داخل بروتين حساس للديناميكيات الهيكلية المحلية وتم استخدامه أيضا على مستوى جزيء واحد. يمكن smPIFE تتبع التغيرات المكانية المحلية القريبة sCy3 وضع العلامات على بقايا الأحماض الأمينية محددة في نطاق 0-3 نانومتر.

في هذه الدراسة، استخدمنا smPIFE للتحقيق في ديناميات الهياكل المحلية داخل α-Syn وبشكل أكثر تحديدا التغييرات الهيكل المحلي بالقرب من بقايا NAC 56. وتشير النتائج إلى أن المنطقة المجاورة للمخلفات 56 في α سين تظهر عددا قليلا من المجموعات الفرعية الهيكلية المتميزة المستقرة بما يكفي لتفاعلها حراريا بحيث تتشابك ببطء يصل إلى 100 مللي ثانية، وربما أبطأ. يتم تحديد هذه المجموعات الفرعية من خلال فحص متوسط العمر الفلوري لجزيئات α-Syn المقاسة التي تحمل علامة sCy3. في هذه المجموعات الفرعية، كلما طالت مدة عمر الفلورية المميزة للسكان الفرعيين، كلما كان سطح البروتين أقرب إلى أيزوميريس الدولة المتحمسة ل sCy3، وبالتالي كلما اقترب سطح البروتين من تلك البقايا المسماة sCy3.

مثل النازحين داخليا الآخرين، تم الإبلاغ عن α-Syn أن يكون لها تفاعلات مع الجزيئات الحيوية الأخرى، فضلا عن الارتباط الذاتي، حيث في كثير من الحالات هذه الأحداث الملزمة تنطوي على تثبيت هيكل معين داخل α سين وحدة فرعية56،57،58،59. بعض البروتينات الحصول على بنية محددة على ملزمة، عن طريق آلية المستحثة تناسب. ومع ذلك البروتينات الأخرى تتشابك تلقائيا بين العديد من الامتثالات متميزة، وحدث ملزمة لمجزئ حيوي معين يستقر فقط واحدة من الامتثالات الموجودة من قبل. وبالنسبة للحالة الأخيرة، فإن أحد الشروط هو أن يبقى المطابقة التي يتعين تثبيتها لفترة كافية لاستيعاب الربط الأولي. لذلك ، كلما طالت مدة بقاء منطقة هيكلية في البروتين ، كلما زادت كفاءة الربط. ونقترح أن تمثل المجموعات الفرعية المستقرة التي لوحظت في ميلي ثانية وجود أنواع متميزة من الهيكل المحلي بالقرب من المخلفات 56. تشير هذه إلى أنواع مختلفة من الهياكل المحلية القريبة من منتصف مقاطع NAC و NTD. في عمل حديث، ونحن تقرير هذا وغيرها من المخلفات sCy3 المسمى في هذه القطاعات تظهر أيضا مثل هذه المجموعات الفرعية60. هذه النتيجة تأتي لإظهار أن الديناميات الهيكلية للمكونات α-سين الحرة يمكن وصفها على أفضل وجه بأنها سريعة (ميكروثانية قليلة على الأكثر40) ديناميات البروتين الشاملة، وتحمل شرائح الهيكلية المحلية التي تبقى مستقرة لميلي ثانية. ومن المعروف أن النازحين داخليا الآخرين مثل تاو والأميلويد β يشتركون في خصائص مماثلة لحمل منطقة محليةمنظمة 48و49و50.

وقد استخدمت smPIFE أساسا لدراسة التفاعلات بين الجزيئات الحيوية منفصلة. هنا، ونحن توظيف smPIFE للتحقيق في PIFE ضمن أجزاء من البروتين نفسه. من المهم أن نذكر أن غالبية التجارب smPIFE السابقة تم إجراؤها عن طريق تتبع التغيرات النسبية في كثافة الفلورية من جزيئات واحدة غير متحركة SCy3 المسمى13،14،15،16،17،18،19،51،52،53 . في حين مفيدة للجزيئات معطلة، وهذا الإجراء هو أقل إفادة عند قياس بحرية نشر جزيئات واحدة. وقد أظهرت هوانغ وآخرون كيفية قياس تأثير PIFE أيضا عن طريق تتبع التغيرات في العمر الفلوري، والتي تقدم تقارير مباشرة عن التغيير في ديناميات إيزوميريس متحمس للدولة من sCy319. هنا نحن التحقيق في تأثير PIFE من نشر واحد α سين عبر sCy3 يعني العمر الفلوري، بدلا من تتبع التغيرات النسبية في كثافة الفلورية. القيام بذلك، تمكنا من الحصول على السكان الفرعية ذات الصلة PIFE على الرغم من قصر وقت الإقامة من كل جزيء واحد α سين في بقعة confocal. في الواقع ، ثبت أن متوسط العمر الفلوري مفيد ليس فقط في تحديد المجموعات الفرعية المتعلقة ب PIFE ، ولكن أيضا في تقييم الديناميكيات البطيئة المتعلقة ب PIFE باستخدام إطار تحليل تكرار الانفجار47. ومع ذلك، هناك حاجة إلى مزيد من العمل في وضع الإجراءات التي من شأنها أن تسمح لتقييم صحيح أسرع ديناميات PIFE. هناك الكثير من أدوات إحصاءات الفوتون الموجودة ، وتستخدم لتقييم ديناميات FRET السريع في نشر تجارب smFRET بحرية ، والتي نعتزم إعادة استخدامها لاستخدامها في smPIFE54،55.

باختصار، استخدمنا في هذا العمل مزيجا جديدا نسبيا من قياسات PIFE للجزيئات المفردة المنتشرة بحرية لتحديد المجموعات الفرعية المستقرة للهياكل المحلية في α-Syn، والتي لم يتم استردادها بواسطة smFRET. لقد استخدمنا قياسات smPIFE لدراسة α-Syn كنموذج للنازحين داخليا وتتجاوز نتائجنا النتائج السابقة α-Syn التي تعاني من اضطراب عالمي. وتشير النتائج إلى أن α سين قد تحمل هياكل محلية مرتبة مستقرة، ونحن نفترض أن هذه الهياكل المحلية قد تؤدي دورا في الاعتراف الملزم.

حتى الآن، تم استخدام smPIFE كوسيلة لدراسة التفاعلات من الأحماض النووية sCy3 المسمى مع نظرائهم البروتين غير المسمى51. من خلال ذلك ، تم استخدام smPIFE كأداة قوية للاستشعار بالتفاعلات الجزيئية الحيوية ، وبالتالي فإن الخطوة الطبيعية التالية في هذا الاتجاه ستكون استخدامه من أجل الشعور بالتفاعلات البروتينية البروتينية وديناميكياتها ، وهي معقدة واحدة في كل مرة.

يمكن أن تساعد قوة استخدام مستشعر القرب قصير المدى مثل smPIFE في تحديد الهيكلة المحلية المستقرة داخل أنظمة البروتين الأخرى التي تعتبر مضطربة وغير مستقرة هيكليا. ومع ذلك ، فإن قوة استخدام مستشعر القرب القصير القائم على جزيء واحد لا تتوقف عند هذا الحد. هناك العديد من الأنظمة الجزيئية الحيوية التي تظهر ديناميات تشكيلية على نطاق قصير لتسهيل وظيفتها ، مثل العديد من القنوات الأيونية. ونحن نعتقد smPIFE يمكن أن تكون بمثابة أداة مكملة لجزيء واحد FRET، في مثل هذه الحالات حيث النطاق الديناميكي للتغيرات القرب داخل نظام البروتين لا تتطابق مع النطاق الديناميكي للمسافات FRET يمكن الكشف عنها وحلها. وباختصار، فإننا نشجع استخدام smPIFE كمستشعر قريب مكمل لقياسات FRET أحادية الجزيء، من أجل تغطية نطاق أوسع من القرب الجزيئي الحيوي، وربما مراقبة مجموعات فرعية صافية متوسطها مللي ثانية من المعلمات المقاسة التي تبلغ عن الهياكل المستقرة المحلية أو الشاملة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا يشترك جميع المؤلفين في أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وpT-t7 البلازميد ترميز A56C α سين متحولة أعطيت لنا كهدية من الدكتور عساف غروبي، الدكتور دان أمير والدكتور إليشا هاس. تم دعم هذه الورقة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH، منحة R01 GM130942 إلى E.L. باعتبارها سوباوارد)، ومؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة 3565/20 داخل KillCorona - كبح برنامج أبحاث فيروس كورونا)، وصندوق ميلنر والجامعة العبرية في القدس (أموال بدء التشغيل).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merc C7715 cutoff: 100 kDa
ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
BSA Sigma-Aldrich A9647
cysteamine Sigma-Aldrich 30070
dialysis bags - MEGA GeBaFlex-tube Gene Bio-Application MEGA320
dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Fast SeeBand staining solution Gene Bio-Application SB050
Glycine Sigma-Aldrich 50046
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES Sigma-Aldrich 54457
HiTrap Desalting 5 mL Sigma-Aldrich GE17-1408
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX) Sigma-Aldrich 238813
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
LB broth Sigma-Aldrich L3152
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63068
MonoQ column Sigma-Aldrich 54807
protein LoBind tube Sigma-Aldrich EP0030108094 0.5 mL
Rinse a µ-slide 18 Ibidi 81816
SDS Sigma-Aldrich 75746
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich 71507
Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas mini-plast 815-004-05-001
streptomycin sulfate Sigma-Aldrich S9137
sulfo-Cy3 maleimide abcam ab146493
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich 75259
Tris-HCl Sigma-Aldrich 93363
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gust, A., et al. A starting point for fluorescence-based single-molecule measurements in biomolecular research. Molecules. 19 (10), 15824-15865 (2014).
  2. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  3. Haran, G. Single-molecule fluorescence spectroscopy of biomolecular folding. Journal of Physics Condensed Matter. 15 (32), R1291 (2003).
  4. Schuler, B., Lipman, E. A., Eaton, W. A. Probing the free-energy surface for protein folding with single-molecule fluorescence spectroscopy. Nature. 419 (6908), 743-747 (2002).
  5. Michalet, X., Weiss, S., Jäger, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chemical Reviews. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  6. Ha, T., Enderle, T., Ogletree, D. F., Chemla, D. S., Selvin, P. R., Weiss, S. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
  7. Deniz, A. A., et al. Single-molecule protein folding: Diffusion fluorescence resonance energy transfer studies of the denaturation of chymotrypsin inhibitor 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5179-5184 (2000).
  8. Bialik, C. N., Wolf, B., Rachofsky, E. L., Ross, J. B. A., Laws, W. R. Dynamics of biomolecules: Assignment of local motions by fluorescence anisotropy decay. Biophysical Journal. 75 (5), 2564-2573 (1998).
  9. Jameson, D. M., Sawyer, W. H. Fluorescence anisotropy applied to biomolecular interactions. Methods in Enzymology. 246, 283-300 (1995).
  10. Kempe, D., Schöne, A., Fitter, J., Gabba, M. Accurate Fluorescence Quantum Yield Determination by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Journal of Physical Chemistry B. 119 (13), 4668-4672 (2015).
  11. Callis, P. R., Liu, T. Quantitative Prediction of Fluorescence Quantum Yields for Tryptophan in Proteins. Journal of Physical Chemistry B. 108, 4248-4259 (2004).
  12. Lehrer, S. S. Solute Perturbation of Protein Fluorescence. The Quenching of the Tryptophyl Fluorescence of Model Compounds and of Lysozyme by Iodide Ion. Biochemistry. 10 (17), 3254-3263 (1971).
  13. Xie, K. X., Liu, Q., Jia, S. S., Xiao, X. X. Fluorescence enhancement by hollow plasmonic assembly and its biosensing application. Analytica Chimica Acta. 1144, 96-101 (2021).
  14. Stennett, E. M. S., Ciuba, M. A., Lin, S., Levitus, M. Demystifying PIFE: The Photophysics behind the Protein-Induced Fluorescence Enhancement Phenomenon in Cy3. Journal of Physical Chemistry Letters. 6 (10), 1819-1823 (2015).
  15. Nguyen, B., Ciuba, M. A., Kozlov, A. G., Levitus, M., Lohman, T. M. Protein Environment and DNA Orientation Affect Protein-Induced Cy3 Fluorescence Enhancement. Biophysical Journal. 117 (1), 66-73 (2019).
  16. Song, D., Graham, T. G. W., Loparo, J. J. A general approach to visualize protein binding and DNA conformation without protein labelling. Nature Communications. 7, 10976 (2016).
  17. Ploetz, E., et al. Förster resonance energy transfer and protein-induced fluorescence enhancement as synergetic multi-scale molecular rulers. Scientific Reports. 6, 33257 (2016).
  18. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
  19. Hwang, H., Kim, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement as a single molecule assay with short distance sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7414-7418 (2011).
  20. Ray, P. C., Fan, Z., Crouch, R. A., Sinha, S. S., Pramanik, A. Nanoscopic optical rulers beyond the FRET distance limit: Fundamentals and applications. Chemical Society Reviews. 43, 6370-6404 (2014).
  21. Chen, H., Rhoades, E. Fluorescence characterization of denatured proteins. Current Opinion in Structural Biology. 18 (4), 516-524 (2008).
  22. Alderson, T. R., Markley, J. L. Biophysical characterization of α-synuclein and its controversial structure. Intrinsically Disordered Proteins. 1 (1), 18-39 (2013).
  23. Mane, J. Y., Stepanova, M. Understanding the dynamics of monomeric, dimeric, and tetrameric α-synuclein structures in water. FEBS Open Bio. 6 (7), 666-686 (2016).
  24. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  25. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  26. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  27. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  28. Trexler, A. J., Rhoades, E. α-Synuclein binds large unilamellar vesicles as an extended helix. Biochemistry. 48 (11), 2304-2306 (2009).
  29. Stephens, A. D., Zacharopoulou, M., Kaminski Schierle, G. S. The Cellular Environment Affects Monomeric α-Synuclein Structure. Trends in Biochemical Sciences. 44 (5), 453-466 (2019).
  30. Illes-Toth, E., Dalton, C. F., Smith, D. P. Binding of dopamine to alpha-synuclein is mediated by specific conformational states. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (9), 1346-1354 (2013).
  31. Frimpong, A. K., Abzalimov, R. R., Uversky, V. N., Kaltashov, I. A. Characterization of intrinsically disordered proteins with electrospray inization mass spectrometry: Conformationl heterogeneity of α-synuciein. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics. 78 (3), 714-722 (2010).
  32. Sandal, M., et al. Conformational equilibria in monomeric α-synuclein at the single-molecule level. PLoS Biology. 6 (1), e6 (2008).
  33. Brodie, N. I., Popov, K. I., Petrotchenko, E. V., Dokholyan, N. V., Borchers, C. H. Conformational ensemble of native α-synuclein in solution as determined by short-distance crosslinking constraint-guided discrete molecular dynamics simulations. PLoS Computational Biology. 15 (3), e1006859 (2019).
  34. Ullman, O., Fisher, C. K., Stultz, C. M. Explaining the structural plasticity of α-synuclein. Journal of the American Chemical Society. 133 (48), 19536-19546 (2011).
  35. Binolfi, A., Theillet, F. X., Selenko, P. Bacterial in-cell NMR of human α-synuclein: A disordered monomer by nature? Biochemical Society Transactions. 40 (5), 950-954 (2012).
  36. Waudby, C. A., et al. In-Cell NMR Characterization of the Secondary Structure Populations of a Disordered Conformation of α-Synuclein within E. coli Cells. PLoS ONE. 8 (8), e72286 (2013).
  37. Yu, J., Malkova, S., Lyubchenko, Y. L. α-Synuclein Misfolding: Single Molecule AFM Force Spectroscopy Study. Journal of Molecular Biology. 384 (4), 992-1001 (2008).
  38. Guerrero-Ferreira, R., Kovacik, L., Ni, D., Stahlberg, H. New insights on the structure of alpha-synuclein fibrils using cryo-electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 61, 89-95 (2020).
  39. Trexler, A. J., Rhoades, E. Single molecule characterization of α-synuclein in aggregation-prone states. Biophysical Journal. 99 (9), 3048-3055 (2010).
  40. Ferreon, A. C. M., Gambin, Y., Lemke, E. A., Deniz, A. A. Interplay of α-synuclein binding and conformational switching probed by single-molecule fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5645-5650 (2009).
  41. Rezaei-Ghaleh, N., et al. Local and Global Dynamics in Intrinsically Disordered Synuclein. Angewandte Chemie - International Edition. 57 (46), 15262-15266 (2018).
  42. Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. Photon-HDF5: An Open File Format for Timestamp-Based Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).
  43. Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S. Y., Weiss, S., Michalet, X. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing Single-molecule FRET. PLoS ONE. 11 (8), e0160716 (2016).
  44. Ingargiola, A., et al. Multispot single-molecule FRET: Highthroughput analysis of freely diffusing molecules. PLoS ONE. 12 (4), e0175766 (2017).
  45. Eggeling, C., Fries, J. R., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. A. M. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  46. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. Journal of Physical Chemistry A. 102, 6601-6613 (1998).
  47. Hoffmann, A., et al. Quantifying heterogeneity and conformational dynamics from single molecule FRET of diffusing molecules: Recurrence analysis of single particles (RASP). Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (5), 1857-1871 (2011).
  48. Eakin, C. M., Berman, A. J., Miranker, A. D. A native to amyloidogenic transition regulated by a backbone trigger. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 202-208 (2006).
  49. Jahn, T. R., Parker, M. J., Homans, S. W., Radford, S. E. Amyloid formation under physiological conditions proceeds via a native-like folding intermediate. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 195-201 (2006).
  50. Chen, D., et al. Tau local structure shields an amyloid-forming motif and controls aggregation propensity. Nature Communications. 10 (1), 2493 (2019).
  51. Lerner, E., Ploetz, E., Hohlbein, J., Cordes, T., Weiss, S. A Quantitative Theoretical Framework for Protein-Induced Fluorescence Enhancement-Förster-Type Resonance Energy Transfer (PIFE-FRET). Journal of Physical Chemistry. B. 120 (26), 6401-6410 (2016).
  52. Valuchova, S., Fulnecek, J., Petrov, A. P., Tripsianes, K., Riha, K. A rapid method for detecting protein-nucleic acid interactions by protein induced fluorescence enhancement. Scientific Reports. 6, 39653 (2016).
  53. Qiu, Y., Myong, S. Single-Molecule Imaging With One Color Fluorescence. Methods in Enzymology. 581, 33-51 (2016).
  54. Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), eaan1133 (2018).
  55. Lerner, E., et al. FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices. Elife. 10, e60416 (2021).
  56. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  57. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  58. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  59. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  60. Chen, J., et al. The structural heterogeneity of α-synuclein is governed by several distinct subpopulations with interconversion times slower than milliseconds. Structure. 29 (9), (2021).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 171، جزيء واحد، تعزيز الفلورية الناجمة عن البروتين، والعمر الفلوري، α-سينوكلين، التركيبات، الديناميات، البروتين المضطرب في جوهره
استخدام تحسين الفلورية المستحث بالبروتين الذي تم حله زمنيا لتحديد التركيبات المحلية المستقرة α-Synuclein Monomer في كل مرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zaer, S., Lerner, E. Utilizing… More

Zaer, S., Lerner, E. Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One α-Synuclein Monomer at a Time. J. Vis. Exp. (171), e62655, doi:10.3791/62655 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter