Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Utilizando o aprimoramento da fluorescência induzida por proteínas resolvidas pelo tempo para identificar conformações locais estáveis Um monômero α-sinucleína de cada vez

Published: May 30, 2021 doi: 10.3791/62655
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

O aprimoramento da fluorescência induzida por proteínas de molécula única é um sensor de proximidade espectroscópico de fluorescência útil sensível às mudanças estruturais locais nas proteínas. Aqui mostramos que pode ser usado para descobrir conformações locais estáveis em α-Synuclein, que também é conhecida como globularmente desestruturada e instável quando medida usando a régua FRET de longo alcance.

Abstract

O uso de réguas espectroscópicas para rastrear múltiplas conformações de biomoléculas únicas e sua dinâmica revolucionou a compreensão da dinâmica estrutural e suas contribuições para a biologia. Enquanto a régua baseada em FRET relata distâncias inter-corantes na faixa de 3-10 nm, outras técnicas espectroscópicas, como o aprimoramento da fluorescência induzida por proteínas (PIFE), relatam a proximidade entre um corante e uma superfície proteica na faixa mais curta de 0-3 nm. Independentemente do método de escolha, seu uso na medição de biomoléculas livremente difusas uma de cada vez recupera histogramas do parâmetro experimental produzindo subpopulgãs separadas distribuídas centralmente de biomoléculas, onde cada subpopo representa uma única conformação que permaneceu inalterada dentro de milissegundos, ou múltiplas conformações que intervertem muito mais rápido do que milissegundos, e, portanto, uma subpopoização média. Em fret de molécula única, onde o parâmetro relatado em histogramas é a eficiência fret inter-tingitária, uma proteína intrinsecamente desordenada, como o monômero α-Synucleína em buffer, foi previamente relatado como exibindo uma única subpopução média de múltiplas conformações interconverting rapidamente. Embora esses achados passados dependam da faixa de 3-10 nm da régua baseada em FRET, procuramos colocar essa proteína à prova usando pife de molécula única, onde rastreamos a vida de fluorescência de proteínas de α-sinucleína rotuladas no local uma de cada vez. Curiosamente, usando este sensor de proximidade espectroscópica de curto alcance, α-Synuclein com a marca Synuclein, com uma gama de tamanhos largos, exibe várias subpoporas vitalícias com vidas médias distintas que interconvertem em 10-100 ms. Esses resultados mostram que, embora α-Sinucleína possa ser desordenada globalmente, ela atinge estruturas locais estáveis. Em resumo, neste trabalho destacamos a vantagem de usar diferentes sensores de proximidade espectroscópicas que rastreiam mudanças estruturais locais ou globais uma biomolécula de cada vez.

Introduction

Nas últimas duas décadas, os métodos baseados em fluorescência de moléculas únicas tornaram-se uma poderosa ferramenta para medir biomoléculas1,2, sondando como diferentes parâmetros biomoleculares se distribuem, bem como como eles interconvertem dinamicamente entre diferentes subpopulgências desses parâmetros na resolução sub-milissegundo3,4,5. Os parâmetros nestas técnicas incluem a eficiência da transferência de energia nas medições de FRET 6,7, anisotropia de fluorescência8,9, rendimentos quânticos de fluorescência e vidas10,11, em função de diferentes mecanismos de fluorescência que saciem12 ou aprimoramento13 mecanismos. Um desses mecanismos, mais conhecido como aumento da fluorescência induzida por proteínas (PIFE)14 introduz o aprimoramento do rendimento quântico da fluorescência e da vida como uma função da obstrução estérica à isomerização livre do fluorohore quando em estado animado, causado por superfícies proteicas nas proximidades do corante14,15,16,17,18,19 . Tanto o FRET quanto o PIFE são considerados governantes espectroscópicos ou sensores de proximidade, uma vez que seu parâmetro medido está diretamente ligado a uma medida espacial dentro da biomolécula rotulada sob medição. Enquanto a eficiência do FRET está relacionada à distância entre um par de corantes dentro de uma faixa de 3-10 nm20,o PIFE rastreia aumentos nos rendimentos quânticos da fluorescência ou vidas relacionadas à distância entre o corante e uma superfície de uma proteína próxima na faixa de 0-3 nm19.

O FRET de molécula única tem sido amplamente utilizado para fornecer insights estruturais em muitos sistemas proteicos diferentes, incluindo proteínas intrinsecamente desordenadas (IDPs)21, como α-Synuclein (α-Syn)22. α-Syn pode formar estruturas ordenadas seguindo a ligação a diferentes biomoléculas e em diferentes condições23,24,25,26,27,28,29,30. No entanto, quando desvinculado, o monômero α-Syn é caracterizado por alta heterogeneidade conformacional com conformações rapidamente interconversas31,32.

As conformações de α-Syn têm sido estudadas anteriormente utilizando-se de diversas técnicas diferentes que ajudam na identificação da dinâmica conformacional de sistemas tão heterogêneos e dinâmicos33,34,35,36,37,38,39. Curiosamente, as medições de FRET (smFRET) de molécula única de α-Syn no buffer relataram uma única população de FRET39,40 que é um resultado da média de tempo de conformações interconvertidas dinamicamente às vezes muito mais rápido do que o tempo típico de difusão de α-Syn através do ponto confocal (vezes tão rápido quanto poucos microssegundos e ainda mais rápido do que isso, em relação aos tempos típicos de difusão de milissegundos)40, 41. No entanto, o uso de uma régua espectroscópica FRET com a sensibilidade à distância de 3-10 nm às vezes relata apenas mudanças estruturais globais em uma pequena proteína, como α-Syn. Medições de molécula única utilizando sensores de proximidade espectroscópicos com sensibilidades de distância mais curta têm o potencial de relatar a dinâmica das estruturas locais. Aqui realizamos medições pife de molécula única de α-Syn e identificamos diferentes subsu populações de vida fluorescência mapeando para diferentes estruturas locais com transições entre elas tão lentas quanto 100 ms. Este trabalho resume as medidas smPIFE resolvidas pelo tempo de moléculas α-Syn livremente difundidas uma de cada vez, em buffer e quando ligadas a membranas baseadas em SDS como um sensor de proximidade espectroscópico de molécula única de curto alcance.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Transformação plasmida

  1. Preparação de 0,5 L de meio SOC
    1. Pesar 10 g de triptona, 2,5 g de extrato de levedura, 0,25 g de cloreto de sódio (NaCl), 0,1 g de cloreto de potássio (CTI).
    2. Adicione água duplamente destilada (DDW) até o volume total de 0,5 L.
    3. Ajuste ao pH 7 adicionando hidróxido de sódio (NaOH).
    4. Prepare alíquotas de estoque de 100 mL e autoclave.
    5. Antes de usar, adicione 0,5 mL de cloreto de magnésio estéril (TM2) e 1,8 mL de glicose estéril a 100 mL de SOC.
  2. Descongelar células Escherichia coli competentes no gelo.
  3. Misture as células competentes suavemente.
  4. Prepare dois tubos de 15 mL. Rotule um como tubo de reação de transformação e o outro como o tubo de controle.
  5. Alíquota de 100 μL de células competentes nos tubos.
  6. Adicione 1 μL de plasmídeo a uma concentração de 0,1 ng/μL no tubo de reação de transformação.
  7. Aqueça o meio SOC em banho-maria de 42 °C para uso na etapa 1.8.
  8. Pulso de calor os dois tubos em banho-maria de 42 °C por uma duração de 45 segundos. (Passo crítico!)
  9. Adicione 900 μL de soc aquecido médio a cada tubo.
  10. Incubar os tubos a 37 °C por uma duração de 45 minutos com agitação a uma velocidade de 225 rpm.
  11. Espalhe 200 μL das células com o plasmídeo transformado em uma placa de ágar LB (Luria-Bertani)-ágar contendo 100 μg/mL ampicillin, usando um espalhador de células estéril.
  12. Espalhe 200 μL das células com o plasmídeo transformado em uma placa LB-ágar sem ampicilina, utilizando um espalhador estéril (controle positivo).
  13. Espalhe 200 μL das células de controle (não contendo um plasmídeo) em uma placa LB-ágar contendo 100 μg/mL ampicillin, utilizando um espalhador estéril(controle negativo).
  14. Incubar as placas durante a noite a 37 °C.

2. Preparação de proteínas

  1. Expressão e purificação de α-sinucleína recombinante
    1. Escolha uma única colônia e cresça em 100 mL de meio líquido LB autoclaved (Luria-Bertani) contendo 100 μg/mL ampicillin a 37 °C (entrada).
    2. Prepare quatro frascos 2 L Erlenmeyer, cada um contendo 1 L de meio LB autoclavado e 100 μg/mL ampicillin (grande inoculação).
    3. Meça a densidade óptica (OD a λ = 600 nm) da solução celular. Quando a densidade celular da partida atingir um ODλ=600nm de 0,6-0,7, adicione 10 mL de solução inicial por cada 1 L de meio LB preparado na etapa anterior.
    4. Cresça os meios bacterianos em um agitador de incubadora a 37 °C e uma velocidade de 200 rpm.
    5. Quando a densidade celular atingir um ODλ=600nm de 0,6-0,8, induza a expressão proteica adicionando isopropílico β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) por cada 1 L de meio de crescimento a uma concentração final de 1 mM.
      NOTA: Dissolva 0,96 g de IPTG em 4 mL de DDW e adicione 1 mL da solução IPTG resultante por cada 1 L de crescimento bacteriano.
    6. Cresça as células por uma duração de 4 horas e colete-as por centrifugação em tubos de 50 mL a uma velocidade de 5.170 x g por uma duração de 8 minutos.
      NOTA: Em cada rodada, descarte o supernasal, mantenha a pelota e encha novamente os mesmos tubos com crescimento bacteriano.
    7. Armazene a pelota bacteriana no armazenamento de congelamento profundo (por exemplo, -80 °C) para o dia seguinte.
    8. No dia seguinte, prepare 200 mL de tampão de lise: 40% (w/v) sacarose e tampão A, que inclui 30 mM Tris-HCl, 2 mM de ácido trienediaminetetraacético de 2 mM (EDTA), dithiothreitol (DTT) em pH 8.0.
    9. Adicione 25 mL de tampão de lise a cada tubo com pelota bacteriana.
    10. Suspenda-a dem boleira (use pipetas pasteur de plástico estérei) no tampão de Lysis (ver 2.1.8).
    11. Prepare o frasco estéril de 250 mL Erlenmeyer com um ímã de agitação no gelo.
    12. Adicione 5 mL de tampão de lise e, em seguida, transfira as células homogêneas re-suspensas para ele.
    13. Mexa as células por uma duração de 20 minutos a 200 rpm a temperatura ambiente.
    14. Divida a solução em tubos de 50 mL e centrífuga a 4 °C por uma duração de 30 minutos a uma velocidade de 17.400 x g.
    15. Descarte o supernatante.
    16. Prepare o frasco estéril de 250 mL Erlenmeyer com ímã de agitação no gelo.
    17. Adicione 15 mL de tampão de dissolução (90 mL tampão resfriado A e 37 μL de MgCl2 dissolvido além do limite de solubilidade e filtrado) em cada tubo. Use pipetas pasteur de plástico estéreis e dissolva a pelota.
    18. Quando parte da solução se tornar homogênea, mova-a para um frasco de Erlenmeyer agitado no gelo.
    19. Determine o volume da solução no Erlenmeyer.
    20. Adicione 10 mg de sulfato de estreptomicina por cada 1 mL de solução (antes de adicionar, dissolva sulfato de estreptomicina em 2 mL de tampão A).
      NOTA: Este passo é realizado a fim de remover o DNA e ribossomos afastados.
    21. Mexa a solução por uma duração de 10-20 minutos em temperatura ambiente.
    22. Divida a solução em tubos de 50 mL e centrífuga a 4 °C e a uma velocidade de 20.700 x g por uma duração de 30 minutos.
    23. Pegue o supernatante e descarte a pelota.
    24. Prepare um frasco estéril de 250 mL Erlenmeyer no gelo com um agitador.
    25. Filtre o supernatante usando filtro de seringa de 0,22 μm no frasco erlenmeyer limpo.
    26. Determine o volume da solução e pese 0,3 g de sulfato de amônio por cada 1 mL de solução.
    27. Aos poucos, adicione o sulfato de amônio à solução agitada.
      NOTA: Este passo é realizado para precipitar proteínas. Quando o sulfato de amônio liga as proteínas, a solução fica obscurecida e embaçada, que aparece como cor branca.
    28. Mexa por 30 minutos em temperatura ambiente.
    29. Divida a solução em tubos de 50 mL e centrífuga a 4 °C e a uma velocidade de 20.700 g por uma duração de 30 minutos.
    30. Descarte cuidadosamente o supernatante e mantenha a pelota.
    31. Dissolva a pelota com 20 mL de Buffer A.
    32. Unifique todas as soluções em um tubo e, em seguida, meça o espectro de absorção UV da solução.
      NOTA: Se o espectro mostrar uma assinatura de agregação (absorção acima de um comprimento de onda de 300 nm), continue para o próximo passo. Se não, pule o próximo passo e passe para a etapa 2.1.34.
      NOTA: O índice de agregação (A.I.) calculado a partir do espectro UV como ODλ=350nm/ (ODλ=280nm - ODλ=350nm) ×100. 41
    33. Use tubos centriprep de corte de 100 kDa e centrífuga a uma velocidade de 3.590 x g a 4 °C por uma duração de 15 minutos. Recolhe o líquido que passou pelo filtro.
    34. Dilisar a solução a 4 °C durante a noite, contra buffer A, usando sacos de diálise com um corte de 3,5 kDa.
    35. Realize outra rodada de diálise por uma duração de pelo menos 4 horas.
    36. Carregue a amostra dialisada em uma coluna de troca de 1 mL MonoQ. Use tampão de hidrocloreto Tris (Tris-HCl) de 30 mM no pH 7.5 como tampão de lavagem e 30 mM Tris-HCl tampão pH 7.5 com 500 mM NaCl como um tampão de eluição.
    37. Injete a amostra na coluna. Em seguida, lave com 20 volumes de coluna (CVs) de 0% tampão de eluição e tampão de lavagem de 100% para remover as proteínas não ligadas.
    38. Lave com 7 CVs de 30% de tampão de eluição.
    39. Elute a amostra de proteína α-Syn usando um gradiente que muda de 30% para 100% tampão de elução para 30 CVs, a uma taxa de fluxo de 1,5 mL/min.
      NOTA: α-Syn elutes em 46-66 CVs na condutividade 20-24 mS/cm, que se refere a 38-50% de tampão de elução.
    40. Colete as frações do pico de eluição principal. Verifique a presença de α-Syn executando amostras em eletroforese de gel de poliacrilamida de sulfato de sódio de sódio de 15% de sódio (SDS-PAGE), seguindo a coloração com a solução de coloração Coomassie Blue ou Fast SeeBand. Uma banda a 15 kDa é esperada.
    41. Unifique as frações relevantes e diálise-as durante a noite, contra o tampão A, usando sacos de diálise com um corte de 3,5 kDa a 4 °C.
    42. Prepare as alíquotas da amostra de proteína e armazene-as a -20 °C.
  2. Α-Synucleína com rótulo Cy3
    1. Reduza o thiol do resíduo de cisteína no mutante α-Syn A56C adicionando DTT a uma concentração final de 2 mM por uma duração de 1 hora à temperatura ambiente.
    2. Remova o DTT realizando duas rodadas de diálise usando sacos de diálise de corte de 3,5 kDa. Para a primeira rodada, dialyze contra 30 mM Tris-HCl pH 8.0 e 2 mM EDTA. Para a segunda rodada, dilímita contra 50 mM HEPES pH 7.2 e 2 mM EDTA.
    3. Reduza os resíduos de cisteína adicionando tris (2 carboxyethyl)hidrocloreto de fosfina (TCEP) à amostra de proteína, a uma concentração final de 50 μM por uma duração de 30 minutos à temperatura ambiente.
      NOTA: O TCEP é um agente redutor de não-sulfhydryl, portanto mantém os grupos de tiol reduzidos sem reagir com o corante. Adicionamos 0,5 μL de uma solução de estoque de 1 M TCEP.
    4. Calcule as quantidades de proteína necessárias para o volume final de reação de 1 mL.
      NOTA: Aqui está um exemplo para o cálculo que usamos:
      20 μM concentração final de proteína × volume final de 1 mL = 56 μM concentração inicial de proteína × v proteína a ser adicionada
    5. Calcule a quantidade de corante necessária para o volume final de reação de 1 mL. A rotulagem de tingimento de uma única cisteína deve ser realizada com excesso de corante, em uma razão de molar de corante:proteína de pelo menos 3:1.
      NOTA: Um exemplo para o cálculo que usamos:
      60 μM concentração final de corante × volume final de 1 mL = 370 μM concentração inicial de corante × V corante a ser adicionado
    6. Calcule a quantidade de tampão do dialise necessário para ajustar o volume total de reação para 1 mL.
      NOTA: Exemplo de cálculo: 1 mL - (V calculado a partir da etapa 2.2.4 + V calculado a partir da etapa 2.2.5)
    7. Prepare o frasco de reação com um ímã em cima de um agitador.
    8. Em primeiro lugar, adicione a quantidade calculada da proteína e do tampão. Posteriormente, adicione a quantidade calculada do corante (sulfo-cy3 maleimida).
    9. Mantenha a reação à temperatura ambiente no escuro por uma duração de 3-5 horas.
    10. Termine a reação adicionando 2 mM DTT e continue por uma duração de 1 hora.
    11. Realize três rodadas de diálise contra buffer A, usando sacos de diálise com um corte de 3,5 kDa para remover o corante livre de excesso da solução.
    12. Carregue a amostra em uma coluna de exclusão de tamanho para separar ainda mais o α-Syn rotulado do corante livre.
    13. Determine a concentração de α-Syn puramente rotulado medindo a absorção do corante (o coeficiente de absorção para sulfo-Cy3 é de 162.000 M-1cm-1em λ=548 nm).
    14. Se necessário, concentre a solução α-Syn puramente rotulada usando um concentrador de vácuo (por exemplo, SpeedVac). Em seguida, realize uma rodada de diálise contra o tampão A, usando sacos de diálise com um corte de 3,5 kDa e determine novamente a concentração da proteína rotulada.
    15. Prepare as alíquotas da amostra de proteína rotulada e armazene-as a -20 °C.

3. Medições

  1. configuração experimental smPIFE
    NOTA: Use a seguinte configuração baseada em confocal ou similar.
    1. Use uma fonte de laser pulsada (no nosso caso, λ= 532 nm picosegundo laser pulsado com largura de pulso de ~100 ps FWHM), operando a uma taxa de repetição adequada (20 MHz em nosso caso) e encaminhado para o SYNC de uma placa de contagem de fótons único correlacionada por tempo (TCSPC), como a fonte de excitação sulfo-Cy3 (sCy3).
    2. Use um espelhodicróico com alta reflexividade a 532 nm, para separar a excitação e a dispersão da fluorescência.
    3. Use um pinhole de 100 μm de diâmetro no foco da luz emitida, depois que o feixe de emissão colidido foi focado por uma lente, e antes que o feixe de emissão tenha sido re-colidido por outra lente.
    4. Use um filtro de passe de banda (585/40 nm em nosso caso) para filtrar ainda mais a fluorescência sCy3 de outras fontes de luz.
    5. Detecte a fluorescência usando um detector (diodo de avalanche de fótons ou fotomultiplier híbrido, no nosso caso) encaminhado (através de um roteador 4-para-1, no nosso caso) para um módulo TCSPC (Becker & Hickl SPC-150, no nosso caso).
      NOTA: No nosso caso, a aquisição de dados é realizada através do software VistaVision (ISSTM)no formato de arquivo TTTR (Time-Tagged-Time- Resolved).
  2. preparação da amostra smPIFE
    1. Prepare 25 pM sCy3-labeled α-Syn em tampão de medição: 10 mM acetato de sódio, Fosfato de dihidrogênio de sódio de 10 mM, 10 mM de glicina pH 8,0, 20 mM NaCl, 10 mM de cisteamina e 1 mM 6-hidroxi-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxílico ácido TROLOX, em um tubo de ligação de proteína baixa.
      NOTA: Se α-Syn for medido na presença de vesículas SDS, adicione também a quantidade SDS apropriada.
    2. Enxágüe um slide de deslizamento de microscopia de 18 câmaras com 100 μL de 1 mg/mL de albumina de soro bovino (BSA) por uma duração de 1 minuto e, em seguida, remova o BSA.
    3. Adicione 100 μL da amostra de α-Syn de 25 pM rotulada por SCy3 a uma câmara no slide de deslizamento de tampa.
    4. Realize a medição smPIFE da amostra usando a configuração descrita, conforme segue nos próximos passos.
  3. aquisição de dados smPIFE
    1. Use uma lente objetiva de imersão de água de alta abertura numérica (no nosso caso, Olympus UPLSAPO 60x N.A. 1.2), e adicione uma gota de água ultra-pura em cima da lente objetiva.
    2. Corrija o slide do deslizamento de tampas em uma câmara de palco e instale-o em cima do estágio do microscópio.
    3. Leve a lente objetiva para cima, até que a gota d'água em cima da lente objetiva manche na parte inferior do slide da tampa.
    4. Abra o obturador a laser e leve a lente objetiva para cima, enquanto inspeciona o padrão em uma câmera CMOS, coletando luz espalhada da amostra. Observe o padrão dos anéis arejados: o primeiro representa o foco na interface água-vidro e, em seguida, o segundo representa o foco na interface entre o vidro e a solução de amostra.
    5. Aumente a altura da lente objetiva em mais 75 μm, trazendo o foco do laser profundamente para dentro da solução, para minimizar a auto-fluorescência da superfície de vidro do deslizamento de tampas.
    6. Sintonize a potência do laser na lente objetiva para ser ~100 μW.
    7. Inicie a aquisição de fótons detectados por um tempo predefinido (2 horas, em nossas medições).
      NOTA: A maioria do sinal de aquisição deve ter uma taxa (medida em contagens por segundo, cps) semelhante à adquirida ao medir apenas o buffer; os dados de milissegundos binned devem mostrar eventos escassos de explosão de fótons, com a maioria das lixeiras tendo uma taxa média comparável à taxa de fundo típica do detector (<1.000 cps, no nosso caso).

4. análise de estouro smPIFE

  1. Conversão de dados brutos
    NOTA: Os dados geralmente são armazenados em um arquivo binário com um formato que foi predefinido pela empresa que fabrica o cartão TCSPC (.arquivos spc em nosso caso).
    1. Converta o arquivo de dados brutos para o formato de arquivo universal fóton-HDF542, usando o phconvert do pacote de software (https://github.com/Photon-HDF5/phconvert). Chame o arquivo de dados brutos como uma entrada e converta em um arquivo de dados brutos .hdf5 usando o código apropriado no conjunto phconvert (os arquivos Convert ns-ALEX Becker-Hickl para o notebook Photon-HDF5.ipynb Jupyter, no nosso caso).
      NOTA: A conversão em um arquivo .hdf5 inclui: (1) determinar os fluxos de fótons relevantes nos dados brutos (ou seja, fluxos de fótons de fótons registrados do ID do detector relevante); (2) os nanotimes de fótons relevantes (os tempos de detecção de fótons relativos ao tempo de sincronização da excitação); e (3) adicionados metadados.
  2. Pesquisa e seleção de estouro usando FRETbursts43
    NOTA: Todos os arquivos de dados brutos fóton-HDF5 das medições smPIFE, bem como o código que resume a análise dos dados brutos, são armazenados no Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4587698). Todas as etapas abaixo são detalhadas e mostradas dentro dos notebooks Jupyter, também fornecidos no link do repositório Zenodo.
    1. Abra os Cadernos jupyter (dentro do quadro Anaconda, no nosso caso).
    2. Abra o notebook smPIFE-aSyn 56C(Cy3) 25 pM newBuffer (notebook final).ipynb (ele pode ser encontrado no link Zenodo).
    3. Carregar fretburs.
    4. Carregue o arquivo de dados HDF5 do fóton.
    5. Avaliação da taxa BG: usando o histograma dos tempos interfótons, calcule as taxas de fundo (BG) para cada 30 segundos de aquisição de dados no arquivo de dados HDF5 do fóton.
      NOTA: As seguintes etapas descrevem a pesquisa de estouro usando o algoritmo da janela deslizante44,45,46.
    6. Mova uma janela de tempo de m=20 fótons consecutivos, um fóton de cada vez.
    7. Coletar os dados de fótons somente se a taxa de fótons instantâneos, ( Equation 1 ), for pelo menos F=11 vezes maior do que a taxa BG para esse período da aquisição de dados.
      NOTA: Uma explosão é construída a partir de todos os fótons consecutivos que foram coletados deslizando o fóton da janela de cada vez (passo 4.2.6.) e concordando com o critério de taxa de fótons (etapa 4.2.7).
    8. Calcule as seguintes características de estouro:
      Tamanho da explosão: a quantidade de fótons em uma explosão.
      Duração do estouro: a diferença de tempo entre o último e o primeiro tempo de detecção de fótons em uma explosão.
      Brilho de explosão: o maior valor da taxa de fótons instantâneos em uma explosão.
      Separação de explosão: o intervalo de tempo entre rajadas consecutivas.
      NOTA: Os seguintes pontos descrevem o novo procedimento de seleção de estouro.
    9. Plote o histograma dos valores de brilho de explosão (a maior taxa de fótons instantâneos em uma explosão), com o eixo dos eventos em escala logarítmica.
    10. Defina o limiar de brilho da explosão como o valor mínimo de brilho da explosão a partir do qual o histograma exibe um padrão em decomposição.
    11. Selecione rajadas com valores de brilho maiores do que o limiar de brilho da explosão.
      NOTA: Os próximos passos descrevem a explosão significa vida útil da fluorescência.
    12. Plote o histograma de nanovezess de fótons para todos os fótons em todas as rajadas selecionadas com o eixo de contagem de fótons em escala logarítmica.
    13. Defina o limiar de nanotime como o valor mínimo de nanotime a partir do qual o histograma de nanovezes fótons exibe um padrão decadente.
    14. Selecione apenas fótons com nanovezes maiores que o limiar de nanotime.
    15. Calcule a média algébrica de todos os nanovezes de fótons selecionados.
    16. Subtraia o limiar de nanotime da média algébrica de nanovezes do fóton. O resultado é o nanotime de fótons da explosão, que é diretamente proporcional à vida de fluorescência média.
    17. Traçar o histograma de todas as vidas de fluorescência. Sub-populações distribuídas centralmente de vida fluorescência podem aparecer. Sub-populações com médias de baixo valor representam espécies de moléculas com sCy3 que não foi esticamente obstruída, enquanto sub-populações com médias de valor mais altas representam espécies de moléculas com sCy3 que foi mais obstruída esticamente.
      NOTA: Os próximos passos descrevem dinâmica lenta entre rajadas com base na análise de recorrênciade rajadas 47
    18. Plote o histograma dos tempos de separação de rajadas, com o eixo do tempo de separação em escala logarítmica.
      NOTA: Duas subsumes de tempos de separação de rajadas aparecerão:
      Uma sub-população importante com tempos de separação de segundos, representando explosões consecutivas originárias de diferentes moléculas consecutivas.
      Uma subsu população menor com tempos de separação ~<100 ms, representando rajadas consecutivas ambas originárias da mesma molécula, recorrentes de volta através do volume confocal.
    19. Selecione para salvar todos os pares de rajadas consecutivas que são separados por menos de um tempo máximo de separação que define a subsu população da mesma molécula (<100 ms, no nosso caso).
    20. Traçar um histograma ou um gráfico de dispersão das vidas médias de fluorescência da primeira e segunda rajadas para todos os pares de rajadas que se repetiram abaixo de um certo limiar de tempo de separação

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Como IDP, quando não está vinculado a outra biomolécula, α-Syn exibe dinâmicas estruturais entre múltiplas conformações, com transições em poucos microssegundos40 e até mesmo em centenas de nanossegundos41. Quando α-Syn cruza o ponto confocal, ele pode passar por milhares de transições entre as conformações. De fato, este foi o caso quando o smFRET foi usado39,40. Aqui realizamos medições smPIFE para sondar a dinâmica conformacional local de α-Syn.

A medição registra fótons de fluorescência emitidos de um corante sulfo-cy3 (sCy3), anexado ao grupo de tidool de cisteína no mutante α-Syn A56C. O fluoróforo sCy3 pode sofrer isomerização quando em estado animado. No entanto, o sCy3 emite um fóton quando se desanima de seu isômero trans. Portanto, se nada obstruir estriamente a isomerização de estado animado sCy3, emitirá poucos fótons em média, mas exibirá um baixo rendimento quântico de fluorescência e uma curta vida fluorescência. No entanto, se a isomerização de estado animado do sCy3 é obstruída por, por exemplo, a superfície de uma proteína próxima, a taxa de isomerização diminuirá, o que por sua vez levará a mais des excitações do isômero trans, e, portanto, mais fótons, um rendimento quântico de fluorescência mais elevado e vida útil de fluorescência mais longa. Isso é mais conhecido como efeito PIFE.

Usando smPIFE medimos a vida média de fluorescência da rotulagem sCy3 α-Syn no resíduo 56 um α-Syn de cada vez, onde o corante sCy3 sente o ambiente proteico em torno do resíduo 56. A proteína foi medida em uma concentração de 25 pM, na qual é encontrada principalmente como um monômero. Os resultados das medições do smPIFE são mostrados como histogramas de vida de fluorescência média de moléculas de α-Syn únicos(Figura 1). As vidas médias de fluorescência podem ser agrupadas em duas subsu populações principais(Figura 1A). A primeira subsu população apresenta curtas fluorescências ao longo da vida, com uma vida de fluorescência característica de 1,6 ns, representando estados conformais α-Syn sem ou poucas superfícies proteicas encontradas nas proximidades do resíduo 56. A segunda subsu populacional apresenta maior tempo de fluorescência, com uma vida de fluorescência característica de 3,5 ns, representando estados conformais α-Syn com mais superfícies proteicas encontradas nas proximidades do resíduo 56.

Sabe-se que na presença de ~5-10 mM SDS, os segmentos N-terminal e NAC de quase todas as moléculas α-Syn em solução adotam uma estrutura helicoidal de grampos ao ligar-se às vesículas SDS40. Uma vez que o resíduo 56 está localizado dentro do segmento NAC, espera-se que a fluorescência do resíduo de rotulagem sCy3 56 sinta um microambiente bastante uniforme, uma vez que a maioria de quase todas as moléculas α-Syn devem adquirir a estrutura helicoidal ligada à vesícula. Portanto, realizamos medições semelhantes de smPIFE, mas na presença de 5 mM SDS como controle, esperando identificar uma única população de vida fluorescência. De fato, essas medidas resultam em uma única população de vida fluorescência com uma vida de fluorescência característica de 3,1 ns(Figura 1B). A vida útil característica da fluorescência de ~3 ns aponta para uma estrutura local nas proximidades do resíduo 56, que não existe na subsupersidade de ~1,5 ns de α-Syn em solução, enfatizando a estruturação α-Syn sofre quando o grampo helicoidal é formado e a ligação à superfície vesícula do SDS ocorreu. Curiosamente, essa população única tem uma vida de fluorescência característica mais curta em relação à sub-população de ~3,5 ns de vida de α-Syn em solução.

O aparecimento de duas subsélidas distintas distribuídas centralmente de explosões de moléculas únicas é uma assinatura bem conhecida de heterogeneidade molecular. Como não há mistura de moléculas rotuladas separadas, ambas as subsu populações vitalícias representam duas espécies separadas de resíduo de rotulagem sCy3 56 em α-Syn (Figura 1A). Portanto, os resultados relatam heterogeneidade dinâmica. Isso ocorre porque o parâmetro relatado no histograma é calculado usando todos os fótons em uma rajada ao longo da duração de poucos ms da difusão α-Syn dentro do volume confocal. Portanto, as moléculas α-Syn rotuladas por SCy3 cruzaram o volume confocal, seja ao exibir uma curta ou longa vida média. As transições entre essas espécies devem ocorrer mais lentamente do que os tempos característicos de difusão através do ponto confocal, portanto mais lento do que alguns milissegundos. Para avaliar esse comportamento dinâmico, realizamos a análise de recorrência derajadas 47. Em suma, uma vez que buscamos avaliar dinâmicas que ocorrem em momentos às vezes mais longos do que a duração de uma explosão de uma única molécula, testamos a possibilidade de que uma única molécula α-Syn exibe uma mudança na vida de fluorescência média sCy3 entre cruzamentos consecutivos do ponto confocal. Para isso, primeiro distinguemos entre dois tipos de rajadas consecutivas: i) rajadas consecutivas de diferentes moléculas α-Syn com tempos de separação de rajadas que distribuem em segundos, e ii) rajadas consecutivas da mesma molécula α-Syn que se repete no volume confocal após um tempo de separação de estouro, às vezes tão lento quanto ~100 ms(Figura 2A). Seguindo as duas subsu populações médias de vida, optamos por inspecionar pares de rajadas consecutivas que são separadas por no máximo 100 ms(Figura 2A),onde a primeira fora do par de rajadas exibiu vida média de fluorescência dentro da curta subsumência de vida (0-2 ns) ou dentro da longa sub-população de vida (>3,5 ns; Figura 2B, tons coloridos). Os testes de inspeção que das explosões de rajadas recorrentes, representados pela segunda explosão no par de rajadas consecutivas, exibem a vida de fluorescência ao longo da vida sub-população oposta à da primeira explosão. Pode-se observar que uma fração de moléculas que começam como uma explosão na curta vida subpopulação se repete como uma explosão fora desse intervalo e até mesmo dentro da longa subpopulação de vida(Figura 2C), e que uma fração de moléculas que começam como uma explosão na longa vida subpopulação se repete como uma explosão fora desse intervalo e até mesmo dentro da curta subpopulação de vida(Figura 2D), tudo dentro de 10-100 ms.

Figure 1
Figura 1: Subsu populações médias de fluorescência vitalícia de resíduo de rotulagem sCy3 56 em α-Syn A56C. histogramas de fluorescência médias de sCy3 livremente difundindo α-Syn A56C (a 25 pM) na ausência (A) e presença (B) de 5 mM SDS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: A análise derecorrência de rajadas de PIFE mostra que moléculas individuais passam por transições entre diferentes valores médios de vida dentro de 100 ms. De cima para baixo:(A) o histograma dos tempos de separação entre rajadas consecutivas de molécula única. A tonalidade laranja representa tempos de separação entre rajadas consecutivas de moléculas recorrentes, onde as primeiras e segunda rajadas surgem da mesma molécula. (B) O histograma médio de fluorescência ao longo de todas as rajadas de molécula única. As tonalidades amarela e verde representam a faixa de valores médios de vida escolhidos para representar valores dentro de subsu populações de curta e longa duração, respectivamente. (C) ou (D). Os histogramas médios de fluorescência ao longo da vida de explosões que foram separados de uma explosão anterior por um tempo dentro da escala de tempo de laranja -sombreada (em A), e onde a explosão anterior tinha uma vida média dentro da faixa representada pelas tonalidades amarela ou verde, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Foram realizados extensos estudos bioquímicos e biofísicos para o estudo das características estruturais de α-Syn e sua natureza desordenada33,34,35,36,37,38. Vários trabalhos já utilizaram o smFRET de difusão livre para investigar a dinâmica intra-molecular do monômero α-Syn livre de vinculação. Esses trabalhos relataram a alta heterogeneidade dinâmica do α-Syn, o que leva à média de múltiplas espécies estruturais diferentes dentro dos tempos típicos de difusão através do ponto confocal, levando ao aparecimento de uma única população de FRET39,40. No entanto, deve-se lembrar que as medidas smFRET relatam alterações nas distâncias intertinguadas que ocorrem dentro de 3-10 nm, uma escala que caracteriza mudanças estruturais globais em uma pequena proteína como α-Syn.

Estávamos curiosos para que resultados poderíamos encontrar ao usar um sensor diferente baseado em fluorescência de mudanças espaciais dentro de uma proteína que é sensível à dinâmica estrutural local e que tem sido utilizada também no nível de molécula única. smPIFE pode rastrear alterações espaciais locais nas proximidades do sCy3 rotulando um resíduo específico de aminoácido na faixa de 0-3 nm.

Neste estudo, utilizamos o SPIFE para investigar a dinâmica das estruturas locais dentro do α-Syn e, mais especificamente, as mudanças de estrutura local nas proximidades do resíduo NAC 56. Os resultados sugerem que a região nas proximidades do resíduo 56 em α-Syn exibe algumas subpopuções estruturais distintas que são estáveis o suficiente para interconversar em tão lento quanto 100 ms, e talvez até mais lento. Essas sub populações são identificadas através da inspeção das vidas médias de fluorescência de moléculas de α-Syn denominadas sCy3. Nessas subsu populações, quanto mais tempo a vida característica da fluorescência da subsumência é, mais próxima uma superfície proteica obstrui a isomerização de estado animado do sCy3, e, portanto, mais perto essa superfície proteica está daquele resíduo rotulado por SCy3.

Como outros IDPs, α-Syn tem sido relatado ter interações com outras biomoléculas, bem como auto-associação, onde em muitos casos esses eventos vinculantes envolvem estabilização de uma estrutura específica dentro da subunidade α-Syn56,57,58,59. Algumas proteínas adquirem uma estrutura específica na ligação, através de um mecanismo de ajuste induzido. No entanto, outras proteínas se entrelaçam espontaneamente entre várias conformações distintas, e o evento de vinculação a uma biomolécula específica apenas estabiliza uma das conformações pré-existentes. Para este último caso, um dos requisitos é que a conformação a ser estabilizada sobreviva tempo suficiente para acomodar a vinculação inicial. Portanto, quanto mais tempo uma região estrutural em uma proteína sobreviver, maior será a eficiência de ligação. Sugerimos que as subsélidas de milissegundos-estáveis observadas representem a existência de espécies distintas de estrutura local nas proximidades do resíduo 56. Estes apontam para diferentes espécies de estrutura local próximas ao meio dos segmentos NAC e NTD. Em um trabalho recente, relatamos que este e outros resíduos rotulados pelo SCy3 nesses segmentos também exibem tais subsu populações60. Este resultado vem para mostrar que a dinâmica estrutural do monômero livre α-Syn pode ser melhor descrita como rápida (poucos microsegundos no máximo40) dinâmica global de proteínas, carregando segmentos estruturais locais que permanecem estáveis por milissegundos. Outros IDPs como Tau e amilóide-β eram conhecidos por compartilhar características semelhantes de transportar uma região estruturada local48,49,50.

o smPIFE tem sido usado principalmente para estudar as interações entre biomoléculas separadas. Aqui, empregamos o SMPIFE para investigar o PIFE dentro de segmentos da mesma proteína. É importante mencionar que a maioria dos experimentos smPIFE anteriores foram realizados por meio do rastreamento de alterações relativas nas intensidades de fluorescência de moléculas de sCy3 de tamanho único13,14,15,16,17,18,19,51,52,53 . Embora útil para moléculas imobilizadas, este procedimento é menos informativo ao medir livremente a difusão de moléculas únicas. Hwang et al. mostraram como medir o efeito PIFE também rastreando mudanças nas vidas de fluorescência, que relatam diretamente sobre a mudança na dinâmica de isomerização de estado animado do sCy319. Aqui sondamos o efeito PIFE de difusão única α-Syn através da vida de fluorescência média sCy3, em vez de rastrear mudanças relativas nas intensidades de fluorescência. Fazendo isso, conseguimos adquirir sub-populações relacionadas ao PIFE, apesar do curto tempo de residência de cada molécula α-Syn no local confocal. De fato, as vidas médias de fluorescência mostraram-se úteis não apenas na definição de subséperas relacionadas ao PIFE, mas também na avaliação de dinâmicas lentas relacionadas ao PIFE usando o quadro de análise de recorrência derajadas 47. No entanto, é necessário mais trabalho no desenvolvimento de procedimentos que permitam avaliar adequadamente a dinâmica mais rápida do PIFE. Existem muitas ferramentas de estatísticas de fótons existentes, utilizadas para avaliar a dinâmica rápida do FRET na difusão livre de experimentos smFRET, que pretendemos reutilizar para serem usados em smPIFE54,55.

Resumindo, neste trabalho utilizamos a combinação relativamente nova de medições de PIFE de moléculas únicas de difusão livre para identificar subséfluãs ms-estáveis de estruturas locais em α-Syn, que não foram recuperadas pelo smFRET. Utilizamos medições smPIFE para estudar α-Syn como um IDP modelo e nossos resultados vão além dos resultados passados de α-Syn sendo globalmente desordenado. Os achados sugerem que α-Syn pode transportar estruturas locais ordenadas em ms-estáveis e nós hipóteses que essas estruturas locais possam servir de um papel no reconhecimento vinculativo.

Até agora, o smPIFE foi utilizado como meio para estudar interações de ácidos nucleicos rotulados por SCy3 com suas contrapartes proteicas não rotuladas51. Com isso, o smPIFE foi utilizado como uma poderosa ferramenta para sentir interações biomoleculares e, portanto, o próximo passo natural nessa direção seria usá-lo para sentir interações proteína-proteína e sua dinâmica, um complexo de cada vez.

O poder de usar um sensor de proximidade de curto alcance, como o SMPIFE, pode auxiliar na identificação de estruturação local estável dentro de outros sistemas proteicos considerados desordenados e estruturalmente instáveis. No entanto, o poder de usar um sensor de proximidade curta baseado em fluorescência de molécula única não para por aí. Existem muitos sistemas biomoleculares que exibem dinâmicas conformais em curto prazo para facilitar sua função, como muitos canais de íons. Acreditamos que o smPIFE pode servir como uma ferramenta complementar ao FRET de molécula única, nesses casos em que o alcance dinâmico das mudanças de proximidade dentro do sistema proteico não corresponde à gama dinâmica de distâncias que o FRET pode detectar e resolver. Em resumo, promovemos o uso de smPIFE como um sensor de proximidade complementar às medidas de FRET de molécula única, a fim de cobrir uma escala mais ampla de proximidades biomoleculares, e talvez observar subsédias médias de milissegundos claras dos parâmetros medidos relatando estruturas estáveis que são locais ou globais.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Todos os autores não compartilham conflito de interesses.

Acknowledgments

O pT-t7 codificando o mutante A56C α-Syn foi dado a nós como presente do Dr. Asaf Grupi, Dr. Dan Amir e Dr. Elisha Haas. Este artigo foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH, conceder R01 GM130942 à E.L. como subaward), pela Israel Science Foundation (conceder 3565/20 dentro do KillCorona - Curbing Coronavirus Research Program), o Milner Fund e a Universidade Hebraica de Jerusalém (fundos de startup).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merc C7715 cutoff: 100 kDa
ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
BSA Sigma-Aldrich A9647
cysteamine Sigma-Aldrich 30070
dialysis bags - MEGA GeBaFlex-tube Gene Bio-Application MEGA320
dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Fast SeeBand staining solution Gene Bio-Application SB050
Glycine Sigma-Aldrich 50046
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES Sigma-Aldrich 54457
HiTrap Desalting 5 mL Sigma-Aldrich GE17-1408
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX) Sigma-Aldrich 238813
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
LB broth Sigma-Aldrich L3152
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63068
MonoQ column Sigma-Aldrich 54807
protein LoBind tube Sigma-Aldrich EP0030108094 0.5 mL
Rinse a µ-slide 18 Ibidi 81816
SDS Sigma-Aldrich 75746
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich 71507
Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas mini-plast 815-004-05-001
streptomycin sulfate Sigma-Aldrich S9137
sulfo-Cy3 maleimide abcam ab146493
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich 75259
Tris-HCl Sigma-Aldrich 93363
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gust, A., et al. A starting point for fluorescence-based single-molecule measurements in biomolecular research. Molecules. 19 (10), 15824-15865 (2014).
  2. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  3. Haran, G. Single-molecule fluorescence spectroscopy of biomolecular folding. Journal of Physics Condensed Matter. 15 (32), R1291 (2003).
  4. Schuler, B., Lipman, E. A., Eaton, W. A. Probing the free-energy surface for protein folding with single-molecule fluorescence spectroscopy. Nature. 419 (6908), 743-747 (2002).
  5. Michalet, X., Weiss, S., Jäger, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chemical Reviews. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  6. Ha, T., Enderle, T., Ogletree, D. F., Chemla, D. S., Selvin, P. R., Weiss, S. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
  7. Deniz, A. A., et al. Single-molecule protein folding: Diffusion fluorescence resonance energy transfer studies of the denaturation of chymotrypsin inhibitor 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5179-5184 (2000).
  8. Bialik, C. N., Wolf, B., Rachofsky, E. L., Ross, J. B. A., Laws, W. R. Dynamics of biomolecules: Assignment of local motions by fluorescence anisotropy decay. Biophysical Journal. 75 (5), 2564-2573 (1998).
  9. Jameson, D. M., Sawyer, W. H. Fluorescence anisotropy applied to biomolecular interactions. Methods in Enzymology. 246, 283-300 (1995).
  10. Kempe, D., Schöne, A., Fitter, J., Gabba, M. Accurate Fluorescence Quantum Yield Determination by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Journal of Physical Chemistry B. 119 (13), 4668-4672 (2015).
  11. Callis, P. R., Liu, T. Quantitative Prediction of Fluorescence Quantum Yields for Tryptophan in Proteins. Journal of Physical Chemistry B. 108, 4248-4259 (2004).
  12. Lehrer, S. S. Solute Perturbation of Protein Fluorescence. The Quenching of the Tryptophyl Fluorescence of Model Compounds and of Lysozyme by Iodide Ion. Biochemistry. 10 (17), 3254-3263 (1971).
  13. Xie, K. X., Liu, Q., Jia, S. S., Xiao, X. X. Fluorescence enhancement by hollow plasmonic assembly and its biosensing application. Analytica Chimica Acta. 1144, 96-101 (2021).
  14. Stennett, E. M. S., Ciuba, M. A., Lin, S., Levitus, M. Demystifying PIFE: The Photophysics behind the Protein-Induced Fluorescence Enhancement Phenomenon in Cy3. Journal of Physical Chemistry Letters. 6 (10), 1819-1823 (2015).
  15. Nguyen, B., Ciuba, M. A., Kozlov, A. G., Levitus, M., Lohman, T. M. Protein Environment and DNA Orientation Affect Protein-Induced Cy3 Fluorescence Enhancement. Biophysical Journal. 117 (1), 66-73 (2019).
  16. Song, D., Graham, T. G. W., Loparo, J. J. A general approach to visualize protein binding and DNA conformation without protein labelling. Nature Communications. 7, 10976 (2016).
  17. Ploetz, E., et al. Förster resonance energy transfer and protein-induced fluorescence enhancement as synergetic multi-scale molecular rulers. Scientific Reports. 6, 33257 (2016).
  18. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
  19. Hwang, H., Kim, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement as a single molecule assay with short distance sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7414-7418 (2011).
  20. Ray, P. C., Fan, Z., Crouch, R. A., Sinha, S. S., Pramanik, A. Nanoscopic optical rulers beyond the FRET distance limit: Fundamentals and applications. Chemical Society Reviews. 43, 6370-6404 (2014).
  21. Chen, H., Rhoades, E. Fluorescence characterization of denatured proteins. Current Opinion in Structural Biology. 18 (4), 516-524 (2008).
  22. Alderson, T. R., Markley, J. L. Biophysical characterization of α-synuclein and its controversial structure. Intrinsically Disordered Proteins. 1 (1), 18-39 (2013).
  23. Mane, J. Y., Stepanova, M. Understanding the dynamics of monomeric, dimeric, and tetrameric α-synuclein structures in water. FEBS Open Bio. 6 (7), 666-686 (2016).
  24. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  25. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  26. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  27. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  28. Trexler, A. J., Rhoades, E. α-Synuclein binds large unilamellar vesicles as an extended helix. Biochemistry. 48 (11), 2304-2306 (2009).
  29. Stephens, A. D., Zacharopoulou, M., Kaminski Schierle, G. S. The Cellular Environment Affects Monomeric α-Synuclein Structure. Trends in Biochemical Sciences. 44 (5), 453-466 (2019).
  30. Illes-Toth, E., Dalton, C. F., Smith, D. P. Binding of dopamine to alpha-synuclein is mediated by specific conformational states. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (9), 1346-1354 (2013).
  31. Frimpong, A. K., Abzalimov, R. R., Uversky, V. N., Kaltashov, I. A. Characterization of intrinsically disordered proteins with electrospray inization mass spectrometry: Conformationl heterogeneity of α-synuciein. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics. 78 (3), 714-722 (2010).
  32. Sandal, M., et al. Conformational equilibria in monomeric α-synuclein at the single-molecule level. PLoS Biology. 6 (1), e6 (2008).
  33. Brodie, N. I., Popov, K. I., Petrotchenko, E. V., Dokholyan, N. V., Borchers, C. H. Conformational ensemble of native α-synuclein in solution as determined by short-distance crosslinking constraint-guided discrete molecular dynamics simulations. PLoS Computational Biology. 15 (3), e1006859 (2019).
  34. Ullman, O., Fisher, C. K., Stultz, C. M. Explaining the structural plasticity of α-synuclein. Journal of the American Chemical Society. 133 (48), 19536-19546 (2011).
  35. Binolfi, A., Theillet, F. X., Selenko, P. Bacterial in-cell NMR of human α-synuclein: A disordered monomer by nature? Biochemical Society Transactions. 40 (5), 950-954 (2012).
  36. Waudby, C. A., et al. In-Cell NMR Characterization of the Secondary Structure Populations of a Disordered Conformation of α-Synuclein within E. coli Cells. PLoS ONE. 8 (8), e72286 (2013).
  37. Yu, J., Malkova, S., Lyubchenko, Y. L. α-Synuclein Misfolding: Single Molecule AFM Force Spectroscopy Study. Journal of Molecular Biology. 384 (4), 992-1001 (2008).
  38. Guerrero-Ferreira, R., Kovacik, L., Ni, D., Stahlberg, H. New insights on the structure of alpha-synuclein fibrils using cryo-electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 61, 89-95 (2020).
  39. Trexler, A. J., Rhoades, E. Single molecule characterization of α-synuclein in aggregation-prone states. Biophysical Journal. 99 (9), 3048-3055 (2010).
  40. Ferreon, A. C. M., Gambin, Y., Lemke, E. A., Deniz, A. A. Interplay of α-synuclein binding and conformational switching probed by single-molecule fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5645-5650 (2009).
  41. Rezaei-Ghaleh, N., et al. Local and Global Dynamics in Intrinsically Disordered Synuclein. Angewandte Chemie - International Edition. 57 (46), 15262-15266 (2018).
  42. Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. Photon-HDF5: An Open File Format for Timestamp-Based Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).
  43. Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S. Y., Weiss, S., Michalet, X. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing Single-molecule FRET. PLoS ONE. 11 (8), e0160716 (2016).
  44. Ingargiola, A., et al. Multispot single-molecule FRET: Highthroughput analysis of freely diffusing molecules. PLoS ONE. 12 (4), e0175766 (2017).
  45. Eggeling, C., Fries, J. R., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. A. M. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  46. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. Journal of Physical Chemistry A. 102, 6601-6613 (1998).
  47. Hoffmann, A., et al. Quantifying heterogeneity and conformational dynamics from single molecule FRET of diffusing molecules: Recurrence analysis of single particles (RASP). Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (5), 1857-1871 (2011).
  48. Eakin, C. M., Berman, A. J., Miranker, A. D. A native to amyloidogenic transition regulated by a backbone trigger. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 202-208 (2006).
  49. Jahn, T. R., Parker, M. J., Homans, S. W., Radford, S. E. Amyloid formation under physiological conditions proceeds via a native-like folding intermediate. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 195-201 (2006).
  50. Chen, D., et al. Tau local structure shields an amyloid-forming motif and controls aggregation propensity. Nature Communications. 10 (1), 2493 (2019).
  51. Lerner, E., Ploetz, E., Hohlbein, J., Cordes, T., Weiss, S. A Quantitative Theoretical Framework for Protein-Induced Fluorescence Enhancement-Förster-Type Resonance Energy Transfer (PIFE-FRET). Journal of Physical Chemistry. B. 120 (26), 6401-6410 (2016).
  52. Valuchova, S., Fulnecek, J., Petrov, A. P., Tripsianes, K., Riha, K. A rapid method for detecting protein-nucleic acid interactions by protein induced fluorescence enhancement. Scientific Reports. 6, 39653 (2016).
  53. Qiu, Y., Myong, S. Single-Molecule Imaging With One Color Fluorescence. Methods in Enzymology. 581, 33-51 (2016).
  54. Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), eaan1133 (2018).
  55. Lerner, E., et al. FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices. Elife. 10, e60416 (2021).
  56. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  57. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  58. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  59. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  60. Chen, J., et al. The structural heterogeneity of α-synuclein is governed by several distinct subpopulations with interconversion times slower than milliseconds. Structure. 29 (9), (2021).

Tags

Bioquímica Questão 171 Mono molécula aumento da fluorescência induzida por proteínas vida útil da fluorescência α-Sinucleína conformações dinâmicas proteína intrinsecamente desordenada
Utilizando o aprimoramento da fluorescência induzida por proteínas resolvidas pelo tempo para identificar conformações locais estáveis Um monômero α-sinucleína de cada vez
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zaer, S., Lerner, E. Utilizing… More

Zaer, S., Lerner, E. Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One α-Synuclein Monomer at a Time. J. Vis. Exp. (171), e62655, doi:10.3791/62655 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter