Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Bruke tidsbestemt proteinindusert fluorescensforbedring for å identifisere stabile lokale konformasjoner En α-Synuclein Monomer om gangen

Published: May 30, 2021 doi: 10.3791/62655
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Tidsavklart proteinindusert fluorescensforbedring med ett molekyl er en nyttig fluorescensspektroskopisk nærhetssensor som er følsom for lokale strukturelle endringer i proteiner. Her viser vi at den kan brukes til å avdekke stabile lokale konformasjoner i α-Synuclein, som ellers kalles globulært ustrukturert og ustabilt når den måles ved hjelp av FRET-linjalen med lengre rekkevidde.

Abstract

Ved hjelp av spektroskopiske herskere for å spore flere konformasjoner av enkeltbiomolekyler og deres dynamikk har revolusjonert forståelsen av strukturell dynamikk og dens bidrag til biologi. Mens den FRET-baserte linjalen rapporterer om interfargeavstander i 3-10 nm-serien, rapporterer andre spektroskopiske teknikker, for eksempel proteinindusert fluorescensforbedring (PIFE), om nærheten mellom et fargestoff og en proteinoverflate i det kortere 0-3 nm-området. Uavhengig av valgmetoden, henter bruken i å måle fritt diffuserende biomolekyler en om gangen histogrammer av den eksperimentelle parameteren som gir separate sentralt fordelte underpopulasjoner av biomolekyler, hvor hver underpopulasjon representerer enten en enkelt konformasjon som forble uendret innen millisekunder, eller flere konformasjoner som interkonverterer mye raskere enn millisekunder, og dermed en gjennomsnittlig sub-ut underpopulasjon. I enkeltmolekylet FRET, hvor den rapporterte parameteren i histogrammer er den mellomfargede FRET-effektiviteten, ble et iboende uordnet protein, som α-Synuclein monomer i buffer, tidligere rapportert å vise en enkelt gjennomsnittlig underpopulasjon av flere konformasjoner som interkonverterer raskt. Mens disse tidligere funnene avhenger av 3-10 nm-serien til den FRET-baserte linjalen, forsøkte vi å sette dette proteinet på prøve ved hjelp av enkeltmolekyl pife, hvor vi sporer fluorescenslevetiden til stedsspesifikke sCy3-merkede α-Synuclein-proteiner en om gangen. Interessant nok, ved hjelp av denne kortere rekkeviddespektroskopiske nærhetssensoren, viser sCy3-merkede α-Synuclein flere livsunderpopulasjoner med tydelig forskjellige gjennomsnittlige levetider som interkonverterer i 10-100 ms. Disse resultatene viser at selv om α-Synuclein kan være uorden globalt, oppnår det likevel stabile lokale strukturer. Oppsummert fremhever vi i dette arbeidet fordelen ved å bruke forskjellige spektroskopiske nærhetssensorer som sporer lokale eller globale strukturelle endringer en biomolekyl om gangen.

Introduction

I løpet av de siste to tiårene har fluorescensbaserte metoder med ett molekyl blitt et kraftig verktøy for måling av biomolekyler1,2, som undersøker hvordan forskjellige biomolekylære parametere distribueres, samt hvordan de dynamisk interkonverterer mellom forskjellige underpopulasjoner av disse parametrene ved sub-millisekunders oppløsning3,4,5. Parametrene i disse teknikkene inkluderer energioverføringseffektiviteten i FRET-målinger 6,7, fluorescensanisotropi8,9, fluorescens kvanteutbytter og levetider10,11, som en funksjon av forskjellige fluorescens slukke12 eller forbedring13 mekanismer. En av disse mekanismene, bedre kjent som proteinindusert fluorescensforbedring (PIFE)14 introduserer forbedringen av fluorescens kvanteutbytte og levetid som en funksjon av sterisk obstruksjon til fri isomerisering av fluoroforen når den er i spent tilstand, forårsaket av proteinoverflater i nærheten avfargestoffet 14,15,16,17,18,19 . Både FRET og PIFE regnes som spektroskopiske linjaler eller nærhetssensorer siden deres målte parameter er direkte knyttet til et romlig mål innenfor den merkede biomolekylen under måling. Mens FRET-effektiviteten er relatert til avstanden mellom et par fargestoffer innenfor et område på 3-10 nm20, øker PIFE-sporene i fluorescens kvanteutbytter eller levetider relatert til avstanden mellom fargestoffet og en overflate av et nærliggende protein i området 0-3 nm19.

Enkeltmolekyl fret har blitt mye brukt for å gi strukturell innsikt i mange forskjellige proteinsystemer, inkludert iboende uordnede proteiner (IDPs)21, for eksempel α-Synuclein (α-Syn)22. α-Syn kan danne bestilte strukturer etter binding til forskjellige biomolekyler og under forskjellige forhold23,24,25,26,27,28,29,30. Men når den er ubundet, er α-Syn monomer preget av høy konformasjons heterogenitet med raskt mellomkonverterende konformasjoner31,32.

Konformasjonene til α-Syn har blitt studert tidligere ved hjelp av ulike teknikker som hjelper til med å identifisere konformasjonsdynamikk i slike svært heterogene og dynamiske proteinsystemer33,34,35,36,37,38,39. Interessant, enkeltmolekyl FRET (smFRET) målinger av α-Syn i buffer rapporterte en enkelt FRET-populasjon39,40 som er et resultat av tidsgjennomsnitt av konformasjoner dynamisk interkonverterer til tider mye raskere enn den typiske diffusjonstiden til α-Syn gjennom det konfokale stedet (ganger så raskt som få mikrosekunder og enda raskere enn det, i forhold til typiske millisekunder diffusjonstider) ,40 41. Ved hjelp av en FRET spektroskopisk linjal med 3-10 nm avstandsfølsomhet rapporterer imidlertid noen ganger bare om generelle strukturelle endringer i et lite protein som α-Syn. Enkeltmolekylmålinger ved hjelp av spektroskopiske nærhetssensorer med kortere avstandsfølsomhet har potensial til å rapportere om dynamikken i lokale strukturer. Her utfører vi pife-målinger av α-Syn og identifiserer ulike underpopulasjoner av fluorescenslevetider som kartlegger ulike lokale strukturer med overganger mellom dem så sakte som 100 ms. Dette arbeidet oppsummerer tidsavklarte smPIFE-målinger av fritt diffuserende α-Syn-molekyler en om gangen, i buffer og når de er bundet til SDS-baserte membraner som en kortdistanse enkeltmolekylspektroskopisk nærhetssensor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plasmid transformasjon

  1. Tilberedning av 0,5 L SOC-medium
    1. Vei 10 g trypton, 2,5 g gjærekstrakt, 0,25 g natriumklorid (NaCl), 0,1 g kaliumklorid (KCl).
    2. Tilsett dobbelt destillert vann (DDW) til totalt volum på 0,5 L.
    3. Juster til pH 7 ved å tilsette natriumhydroksid (NaOH).
    4. Forbered lager aliquots på 100 ml og autoklav.
    5. Før bruk tilsettes 0,5 ml steril magnesiumklorid (MgCl2) og 1,8 ml steril glukose til 100 ml SOC.
  2. Tine BL21 (DE3) kompetente Escherichia coli-celler på is.
  3. Bland de kompetente cellene forsiktig.
  4. Forbered to 15 ml rør. Merk den ene som transformasjonsreaksjonsrør og den andre som kontrollrøret.
  5. Aliquot 100 μL kompetente celler inn i rørene.
  6. Tilsett 1 μL plasmid i en konsentrasjon på 0,1 ng/μL i transformasjonsreaksjonsrøret.
  7. Varm SOC-mediet i 42 °C vannbad til bruk i trinn 1.8.
  8. Varmpulser de to rørene i 42 °C vannbad i en varighet på 45 sekunder. (Kritisk trinn!)
  9. Tilsett 900 μL oppvarmet SOC-medium til hvert rør.
  10. Inkuber rørene ved 37 °C i en varighet på 45 minutter med risting med en hastighet på 225 o/min.
  11. Spred 200 μL av cellene med den transformerte plasmiden på en LB (Luria-Bertani)-agarplate som inneholder 100 μg/ml ampicillin, ved hjelp av en steril cellespreder.
  12. Spred 200 μL av cellene med den transformerte plasmiden på en LB-agarplate uten ampicillin, ved hjelp av en steril spreder (positiv kontroll).
  13. Spred 200 μL av kontrollcellene (som ikke inneholder en plasmid) på en LB-agarplate som inneholder 100 μg/ml ampicillin, ved hjelp av en steril spreder (negativ kontroll).
  14. Inkuber platene over natten ved 37 °C.

2. Proteinpreparat

  1. Rekombinant α-Synuclein uttrykk og rensing
    1. Velg en enkelt koloni og vokse i 100 ml autoklavert LB (Luria-Bertani) flytende medium som inneholder 100 μg / ml ampicillin ved 37 ° C (starter).
    2. Forbered fire 2 L Erlenmeyer-kolber, som hver inneholder 1 L autoklavert LB-medium og 100 μg/ml ampicillin (stor inokulasjon).
    3. Mål den optiske tettheten (OD ved λ = 600 nm) av celleoppløsningen. Når celletettheten til starteren når en ODλ = 600nm på 0,6-0,7, tilsett 10 ml startløsning per hver 1 L LB-medium tilberedt i forrige trinn.
    4. Dyrk bakteriemediene i en inkubator shaker ved 37 °C og en hastighet på 200 o/min.
    5. Når celletettheten når en ODλ = 600nm på 0,6-0,8, induser proteinuttrykk ved å legge til isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) per hver 1 L vekstmedium til en endelig konsentrasjon på 1 mM.
      MERK: Løs opp 0,96 g IPTG i 4 ml DDW og tilsett 1 ml av den resulterende IPTG-løsningen per hver 1 liter bakterievekst.
    6. Vokse cellene i en varighet på 4 timer og samle dem ved sentrifugering i 50 ml rør med en hastighet på 5,170 x g i en varighet på 8 minutter.
      MERK: Kast supernatanten i hver runde, behold pelletsen og fyll igjen de samme rørene med bakterievekst.
    7. Oppbevar bakteriell pellets i dypfrysingslager (f.eks. -80 °C) for neste dag.
    8. Neste dag, forberede 200 ml lysis buffer: 40% (w / v) sukrose og buffer A, som inkluderer 30 mM Tris-HCl, 2 mM etylendiamintetraacetic acid (EDTA), 2 mM dithiothreitol (DTT) ved pH 8.0.
    9. Tilsett 25 ml lysisbuffer til hvert rør med bakteriell pellets.
    10. Sett på pelletsen igjen (bruk sterile pasteurpipetter i plast) i Lysis buffer (se 2.1.8).
    11. Forbered steril 250 ml Erlenmeyer-kolbe med en røremagnet på is.
    12. Tilsett 5 ml lysisbuffer, og overfør deretter de homogene re-suspenderte cellene til den.
    13. Rør cellene i en varighet på 20 minutter ved 200 rpm ved romtemperatur.
    14. Del løsningen i 50 ml rør og sentrifuge ved 4 °C i en varighet på 30 minutter med en hastighet på 17 400 x g.
    15. Kast supernatanten.
    16. Forbered steril 250 ml Erlenmeyer-kolbe med røremagnet på is.
    17. Tilsett 15 ml oppløsningsbuffer (90 ml avkjølt buffer A og 37 μL MgCl2 oppløst utover løselighetsgrensen og filtrert) i hvert rør. Bruk sterile pasteurpipetter i plast og oppløs pelletsen.
    18. Når en del av løsningen blir homogen, flytt den til en omrørt Erlenmeyer-kolbe på is.
    19. Finn løsningsvolumet i Erlenmeyer.
    20. Tilsett 10 mg streptomycinsulfat per hver 1 ml oppløsning (før tilsett, oppløs streptomycinsulfat i 2 ml buffer A).
      MERK: Dette trinnet utføres for å fjerne DNA og ribosomer bort.
    21. Rør løsningen i en varighet på 10-20 minutter ved romtemperatur.
    22. Del oppløsningen i 50 ml rør og sentrifuger ved 4 °C og med en hastighet på 20 700 x g i en varighet på 30 minutter.
    23. Samle supernatanten og kast pelletsen.
    24. Forbered en steril 250 ml Erlenmeyer-kolbe på is med omrører.
    25. Filtrer supernatanten ved hjelp av 0,22 μm sprøytefilter i den rene Erlenmeyer-kolben.
    26. Bestem løsningsvolumet og vei 0,3 g ammoniumsulfat per hver 1 ml oppløsning.
    27. Tilsett gradvis ammoniumsulfatet til den rørte løsningen.
      MERK: Dette trinnet utføres for å utfelle proteiner. Når ammoniumsulfatet binder proteinene, blir løsningen skjult og uklar, som vises som hvit farge.
    28. Rør i 30 minutter ved romtemperatur.
    29. Del løsningen på 50 ml rør og sentrifuger ved 4 °C og med en hastighet på 20 700 g i en varighet på 30 minutter.
    30. Kast forsiktig supernatanten og hold pelletsen.
    31. Løs opp pelletsen med 20 ml buffer A.
    32. Foren alle løsningene i ett rør, og mål deretter UV-absorpsjonsspekteret til løsningen.
      MERK: Hvis spekteret viser en signatur av aggregering (absorpsjon over en bølgelengde på 300 nm), fortsett til neste trinn. Hvis ikke, hopper du over neste trinn og går til trinn 2.1.34.
      MERK: Aggregasjonsindeksen (A.I.) beregnet fra UV-spektra som ODλ = 350nm/ (ODλ = 280nm - ODλ = 350nm) ×100. 41
    33. Bruk 100 kDa cutoff sentriprep rør og sentrifuge med en hastighet på 3,590 x g ved 4 °C i en varighet på 15 minutter. Samle væsken som passerte gjennom filteret.
    34. Dialyze løsningen ved 4 °C over natten, mot buffer A, ved hjelp av dialyseposer med 3,5 kDa-avskjæring.
    35. Utfør en ny runde med dialyse i en varighet på minst 4 timer.
    36. Last den dialyzed prøven på en 1 ml MonoQ anionbyttekolonne. Bruk 30 mM Tris hydrokloridbuffer (Tris-HCl) ved pH 7,5 som vaskebuffer og 30 mM Tris-HCl buffer pH 7,5 med 500 mM NaCl som elutionbuffer.
    37. Sett inn eksemplet i kolonnen. Vask deretter med 20 kolonnevolumer (CV) på 0% elutionbuffer og 100% vaskebuffer for å fjerne de ubundne proteinene.
    38. Vask med 7 CV-er med 30% elutionbuffer.
    39. Elute α-Syn proteinprøve ved hjelp av en gradient som endres fra 30% til 100% elution buffer for 30 CV-er, med en strømningshastighet på 1,5 ml / min.
      MERK: α-Syn elutes ved 46-66 CV-er med konduktivitet 20-24 mS/cm, som refererer til 38-50% elutionbuffer.
    40. Samle brøkdelene av hovedutløpstoppen. Kontroller tilstedeværelsen av α-Syn ved å kjøre prøver i 15% natrium dodecyl sulfat polyakrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE), etter farging med enten Coomassie Blue eller Fast SeeBand farging løsning. Det forventes et bånd på 15 kDa.
    41. Foren de relevante fraksjonene og dialyze dem over natten, mot buffer A, ved hjelp av dialyse poser med en 3,5 kDa cutoff ved 4 °C.
    42. Forbered aliquots av proteinprøven og lagre dem ved -20 °C.
  2. Cy3-merket α-Synuclein
    1. Reduser tiolen av cysteinrester i α-Syn A56C mutant ved å legge DTT til en endelig konsentrasjon på 2 mM i en varighet på 1 time ved romtemperatur.
    2. Fjern DTT ved å utføre to runder med dialyse ved hjelp av 3,5 kDa cutoff dialyseposer. For første runde, dialyze mot 30 mM Tris-HCl pH 8.0 og 2 mM EDTA. For andre runde, dialyze mot 50 mM HEPES pH 7.2 og 2 mM EDTA.
    3. Reduser cysteinrester ved å tilsette Tris(2-karboksyetyl)fosfinhydroklorid (TCEP) til proteinprøven, til en endelig konsentrasjon på 50 μM i en varighet på 30 minutter ved romtemperatur.
      MERK: TCEP er et ikke-sulhydrylreduserende middel, derfor holder det tiolgruppene redusert uten å reagere med fargestoffet. Vi la til 0,5 μL fra en lagerløsning på 1 M TCEP.
    4. Beregn mengden protein som kreves for det endelige reaksjonsvolumet på 1 ml.
      MERK: Her er et eksempel på beregningen vi brukte:
      20 μM endelig proteinkonsentrasjon × 1 ml sluttvolum = 56 μM innledende proteinkonsentrasjon × V-protein som skal tilsetts
    5. Beregn mengden fargestoff som kreves for endelig reaksjonsvolum på 1 ml. Fargemerking av en enkelt cystein bør utføres med overflødig fargestoff, med et fargestoff: proteinmolarforhold på minst 3: 1.
      MERK: Et eksempel på beregningen vi brukte:
      60 μM endelig fargekonsentrasjon × 1 ml sluttvolum = 370 μM innledende fargekonsentrasjon × V-fargestoff som skal tilsetts
    6. Beregn mengden buffer fra dialysatet som kreves for å justere det totale reaksjonsvolumet til 1 ml.
      MERK: Beregningseksempel: 1 ml - (V beregnet fra trinn 2.2.4 + V beregnet fra trinn 2.2.5)
    7. Forbered reaksjons hetteglass med en magnet på toppen av en røre.
    8. For det første, legg til den beregnede mengden protein og bufferen. Deretter legger du til den beregnede mengden fargestoff (sulfo-Cy3 maleimid).
    9. Hold reaksjonen ved romtemperatur i mørket i en varighet på 3-5 timer.
    10. Avslutt reaksjonen ved å legge til 2 mM DTT og fortsett i en varighet på 1 time.
    11. Utfør tre runder med dialyse mot buffer A, ved hjelp av dialyseposer med en 3,5 kDa-avskjæring for å fjerne overflødig fritt fargestoff fra løsningen.
    12. Last inn prøven på en kolonne for størrelsesekskludering for å skille den merkede α-Syn ytterligere fra det frie fargestoffet.
    13. Bestem konsentrasjonen av ren merket α-Syn ved å måle absorpsjonen av fargestoffet (absorpsjonskoeffisient for sulfo-Cy3 er 162 000 M-1cm-1ved λ = 548 nm).
    14. Konsentrer om nødvendig den rene merkede α-Syn-oppløsningen ved hjelp av en vakuumkonsentrator (f.eks. SpeedVac). Utfør deretter en runde dialyse mot buffer A, bruk dialyseposer med en 3,5 kDa cutoff og igjen bestemme konsentrasjonen av det merkede proteinet.
    15. Forbered aliquots av den merkede proteinprøven og lagre dem ved -20 °C.

3. Målinger

  1. smPIFE eksperimentelt oppsett
    MERK: Bruk følgende konfombaserte oppsett eller lignende.
    1. Bruk en pulserende laserkilde (i vårt tilfelle, λ = 532 nm picosecond pulserende laser med pulsbredde på ~ 100 ps FWHM), som opererer med en passende repetisjonshastighet (20 MHz i vårt tilfelle) og rutet til SYNC av et tidskorrelert enkelt fotontellingskort (TCSPC), som kilden til sulfo-Cy3 (sCy3) eksitasjon.
    2. Bruk et dikroisk speil med høy reflektivitet ved 532 nm, for å skille eksitasjon og spredning fra fluorescens.
    3. Bruk et pinhole med en diameter på 100 μm i fokus for det avgitte lyset, etter at den kollaterte utslippsstrålen var fokusert av en linse, og før utslippsstrålen har blitt re-collimated av en annen linse.
    4. Bruk et båndpassfilter (585/40 nm i vårt tilfelle) for å filtrere sCy3 fluorescens ytterligere fra andre lyskilder.
    5. Oppdag fluorescensen ved hjelp av en detektor (enkeltfoton skreddiode eller hybrid fotomultiplier, i vårt tilfelle) rutet (gjennom en 4-til-1-ruter, i vårt tilfelle) til en TCSPC-modul (Becker &Hickl SPC-150, i vårt tilfelle).
      MERK: I vårt tilfelle utføres datainnsamling via VistaVision-programvaren (ISSTM) i det tidsmerkede tidsavklarte (TTTR) filformatet.
  2. smPIFE prøvepreparering
    1. Forbered 25 pM sCy3-merket α-Syn i målebuffer: 10 mM natriumacetat, 10 mM natriumdihydrogenfosfat, 10 mM glycin pH 8,0, 20 mM NaCl, 10 mM cysteamin og 1 mM 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylchroman-2-karboksylsyre (TROLOX), i et lavproteinbindingsrør.
      MERK: Hvis α-Syn måles i nærvær av SDS-vesicles, tilsett også riktig SDS-mengde.
    2. Skyll en 18-kammers mikroskopi coverlip lysbilde med 100 μL 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) i en varighet på 1 minutt, og fjern deretter BSA.
    3. Legg til 100 μL av den 25 pM sCy3-merkede α-Syn-prøven i et kammer i coverlip-lysbildet.
    4. Utfør smPIFE-måling av prøven ved hjelp av det beskrevne oppsettet, som følger i de neste trinnene.
  3. smPIFE datainnsamling
    1. Bruk en objektiv linse med høy numerisk blenderåpningsvann (i vårt tilfelle Olympus UPLSAPO 60x N.A. 1.2), og legg til en dråpe ultrarent vann på toppen av objektivlinsen.
    2. Fest dekslene i et scenekammer og installer det på toppen av mikroskopstadiet.
    3. Ta objektivlinsen oppover til vanndråpen på toppen av objektivlinsen smøres på bunnen av dekslene.
    4. Åpne laserlukkeren og ta objektivlinsen oppover mens du inspiserer mønsteret på et CMOS-kamera, og samle lys spredt fra prøven. Vær oppmerksom på Luftige ringer mønster: den første representerer fokuset på vannglassgrensesnittet, og deretter representerer den andre fokuset på grensesnittet mellom glasset og prøveløsningen.
    5. Øk høyden på objektivlinsen med ytterligere 75 μm, og få laserfokuset dypt inn i løsningen, for å minimere autofluorescens fra glassoverflaten på dekslene.
    6. Juster lasereffekten på objektivlinsen slik at den er ~100 μW.
    7. Start oppkjøpet av oppdagede fotoner for en forhåndsdefinert tid (2 timer, i våre målinger).
      MERK: Mesteparten av anskaffelsessignalet skal ha en rate (målt i antall per sekund, cps) som ligner på den som er anskaffet ved måling av bare bufferen; de millisekund-binned dataene bør vise knappe foton burst hendelser, med de fleste hyller har en gjennomsnittlig hastighet som er sammenlignbar med den typiske detektor bakgrunnsfrekvensen (<1,000 cps, i vårt tilfelle).

4. smPIFE burst analyse

  1. Konvertering av rådata
    MERK: Dataene lagres vanligvis i en binær fil med et format som ble forhåndsdefinert av selskapet som produserer TCSPC-kortet (.spc-filer i vårt tilfelle).
    1. Konverter rå datafilen til photon-HDF5 universell filformat42, ved hjelp av programvarepakken phconvert (https://github.com/Photon-HDF5/phconvert). Kall rå datafilen som en inngang og konverter til en raw data .hdf5 fil ved hjelp av riktig kode i phconvert suite (Convert ns-ALEX Becker-Hickl filer til Photon-HDF5.ipynb Jupyter notebook, i vårt tilfelle).
      MERK: Konverteringen til en HDF5-fil inkluderer: (1) bestemme de relevante fotonstrømmene i rådataene (dvs. fotonstrømmer av registrerte fotoner av den aktuelle detektor-ID- (2) relevante foton nanotider (fotondeteksjonstidene i forhold til excitation SYNC-tiden); og (3) lagt til metadata.
  2. Burst-søk og -merking ved hjelp av FRETbursts43
    MERK: Alle de foton-HDF5 rå datafilene til smPIFE-målingene, samt koden som oppsummerer analysen av rådataene, lagres i Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4587698). Alle trinnene nedenfor er detaljerte og vises i Jupyter bærbare PC-er, også levert i Zenodo-repositoriumskoblingen.
    1. Åpne Jupyter bærbare PC-er (innenfor Anaconda-rammeverket, i vårt tilfelle).
    2. Åpne den bærbare PCen smPIFE-aSyn 56C(Cy3) 25 pM newBuffer (endelig bærbar PC).ipynb (den finnes i Zenodo-koblingen).
    3. Last inn FRETbursts.
    4. Last inn den foton HDF5 datafilen.
    5. BG-ratevurdering: Ved hjelp av histogrammet for de inter-fotontidene beregner du bakgrunnsratene (BG) for hvert 30 sekunder med datainnsamling i den foton HDF5 datafilen.
      MERK: Følgende trinn beskriver burst-søket ved hjelp av glidevindusalgoritmen44,45,46.
    6. Flytt et tidsvindu med m = 20 påfølgende fotoner, ett foton om gangen.
    7. Samle inn fotondataene bare hvis den øyeblikkelige fotonfrekvensen ( Equation 1 ) er minst F =11 ganger større enn BG-satsen for den perioden av datainnsamlingen.
      MERK: En serie er konstruert av alle de påfølgende fotonene som ble samlet inn ved å skyve vinduet ett foton om gangen (trinn 4.2.6.) og godta fotonhastighetskriteriet (trinn 4.2.7).
    8. Beregn følgende bristeegenskaper:
      Burst størrelse: mengden fotoner i en burst.
      Burst varighet: tidsforskjellen mellom siste og første foton deteksjon ganger i en burst.
      Burst lysstyrke: den største verdien av den øyeblikkelige fotonhastigheten i en burst.
      Burst separasjon: tidsintervallet mellom påfølgende utbrudd.
      MERK: Følgende punkter beskriver den videre sprengningsprosedyren.
    9. Plott histogrammet for burst lysstyrkeverdier (den høyeste øyeblikkelige fotonhastigheten i en burst), med hendelsenes akse i logaritmisk skala.
    10. Definer terskelverdien for burst-lysstyrke som den minimale verdien for burst-lysstyrke som histogrammet viser et forfallende mønster fra.
    11. Velg serie med lysstyrkeverdier som er større enn terskelverdien for burst-lysstyrke.
      MERK: De neste trinnene beskriver burst bety fluorescenslevetid.
    12. Plott histogrammet av foton nanotider for alle fotoner i alle valgte utbrudd med foton teller akse i logaritmisk skala.
    13. Definer nanotidsterskelen som den minimale nanotidsverdien som histogrammet av foton nanotider viser et forfallende mønster fra.
    14. Velg bare fotoner med nanotider som er større enn nanotidsterskelen.
    15. Beregn det algebraiske gjennomsnittet av alle utvalgte foton nanotider.
    16. Trekk nanotidsterskelen fra det foton nanotidsalgebraiske gjennomsnittet. Resultatet er gjennomsnittlig foton nanotid av bristen, som er direkte proporsjonal med gjennomsnittlig fluorescens levetid.
    17. Plott histogrammet av alle briste betyr fluorescens levetider. Sentralt fordelte underpopulasjoner av fluorescenslevetid kan forekomme. Underpopulasjoner med gjennomsnitt av lav verdi representerer molekylarter med sCy3 som ikke var sterisk blokkert, mens underpopulasjoner med gjennomsnitt av høyere verdi representerer molekylarter med sCy3 som var mer sterisk blokkert.
      MERK: De neste trinnene beskriver langsom mellom-burst-dynamikken basert på burst-regelmessighetsanalyse47
    18. Plott histogrammet for briste separasjonstider, med separasjonstidaksen i logaritmisk skala.
      MERK: To underpopulasjoner av briste separasjonstider vises:
      En stor underpopulasjon med separasjonstider på sekunder, som representerer påfølgende utbrudd som stammer fra forskjellige fortløpende målte molekyler.
      En mindre underpopulasjon med separasjonstider ~ <100 ms, som representerer påfølgende brister som begge stammer fra samme molekyl, gjentar seg tilbake gjennom det konfokale volumet.
    19. Merk av for dette alternativet hvis du vil lagre alle par med påfølgende utbrudd som er atskilt med mindre enn en maksimal separasjonstid som definerer underpopulasjonen av samme molekyl (<100 ms, i vårt tilfelle).
    20. Plott et histogram eller et scatter-plott av gjennomsnittlig fluorescenslevetid for første og andre utbrudd for alle par brister som oppstod under en viss separasjonstidsterskel

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som en IDP, når den ikke er bundet til en annen biomolekyl, viser α-Syn strukturell dynamikk mellom flere konformasjoner, med overganger ved få mikroseconds40 og til og med på hundrevis av nanoseconds41. Når α-Syn krysser det konfiske stedet, kan det gjennomgå tusenvis av overganger mellom konformasjoner. Faktisk var dette tilfelle da smFRET ble brukt39,40. Her utfører vi smPIFE-målinger for å undersøke den lokale konformasjonsdynamikken til α-Syn.

Målingen registrerer fluorescensfotoner som slippes ut fra et sulfo-Cy3 (sCy3) fargestoff, festet til tiolgruppen cystein i α-Syn A56C mutant. SCy3 fluorofor kan gjennomgå isomerisering når den er i spent tilstand. Imidlertid avgir sCy3 en foton når den av-begeistrer fra sin trans isomer. Derfor, hvis ingenting sterisk hindrer sCy3 excited-state isomerization, vil det avgi få fotoner i gjennomsnitt, men vil vise et lavt fluorescens kvanteutbytte og kort fluorescens levetid. Men hvis den begeistrede tilstands-isomeriseringen av sCy3 hindres av for eksempel overflaten av et nærliggende protein, vil isomeriseringshastigheten reduseres, noe som igjen vil føre til flere de-excitations fra transisomeren, og dermed flere fotoner, et høyere fluorescens kvanteutbytte og lengre fluorescenslevetider. Dette er bedre kjent som PIFE-effekten.

Ved hjelp av smPIFE målte vi gjennomsnittlig fluorescenslevetid for sCy3-merking α-Syn ved rest 56 en α-Syn om gangen, hvor sCy3-fargestoffet merker proteinmiljøet rundt rester 56. Proteinet ble målt i en konsentrasjon på 25 pM, hvor det hovedsakelig finnes som en monomer. Resultatene av smPIFE-målingene vises som histogrammer av gjennomsnittlig fluorescenslevetid for enkelt α-Syn-molekyler (figur 1). Gjennomsnittlig fluorescenslevetid kan grupperes i to hovedunderpopulasjoner (figur 1A). Den første underpopulasjonen viser korte fluorescenslevetider, med en karakteristisk fluorescenslevetid på 1,6 ns, som representerer α-Syn konformasjonstilstander uten eller få proteinoverflater som finnes i nærheten av rester 56. Den andre underpopulasjonen viser lengre fluorescenslevetid, med en karakteristisk fluorescenslevetid på 3,5 ns, som representerer α-Syn konformasjonstilstander med flere proteinoverflater som finnes i nærheten av rester 56.

Det er kjent at i nærvær av ~ 5-10 mM SDS, N-terminal- og NAC-segmentene til nesten alle α-Syn-molekylene i løsningen vedtar en spiralformet hårnålstruktur ved binding til SDS vesikler40. Siden rester 56 ligger innenfor NAC-segmentet, forventes fluorescens fra sCy3-merkingsrester 56 å føle et ganske ensartet mikromiljø, siden flertallet av nesten alle α-Syn-molekyler skal skaffe seg den vesikkelbundne spiralformede hårnålstrukturen. Derfor utførte vi lignende smPIFE-målinger, men i nærvær av 5 mM SDS som kontroll, og forventet å identifisere en enkelt populasjon av fluorescenslevetider. Faktisk resulterer disse målingene i en enkelt populasjon av fluorescenslevetid med en karakteristisk fluorescenslevetid på 3,1 ns (figur 1B). ~3 ns karakteristisk fluorescens levetid peker på en lokal struktur i nærheten av rester 56, som ikke eksisterer i ~ 1,5 ns levetid underpopulasjon av α-Syn i løsning, understreker strukturering α-Syn gjennomgår når spiralformet hårnål dannes og bindingen til SDS vesicle overflaten har oppstått. Interessant nok har den ene befolkningen en kortere karakteristisk fluorescenslevetid i forhold til ~ 3,5 ns levetidsunderpopulasjon av α-Syn i løsning.

Utseendet til to distinkte sentralt fordelte underpopulasjoner av enkeltmolekylutbrudd er en kjent signatur av molekylær heterogenitet. Siden ingen blanding av separate merkede molekyler er involvert, representerer begge livstidsunderpopulasjoner to separate arter av sCy3-merkingsrester 56 i α-Syn (Figur 1A). Resultatene rapporterer derfor dynamisk heterogenitet. Dette er fordi parameteren som rapporteres i histogrammet, beregnes ved hjelp av alle fotonene i en serie gjennom hele ms-varigheten til den diffuserende α-Syn inne i det konfokale volumet. Derfor krysset sCy3-merkede α-Syn-molekyler det konfokale volumet enten når de viste en kort eller lang gjennomsnittlig levetid. Overgangene mellom disse artene må skje langsommere enn de karakteristiske diffusjonstidene gjennom det konfokale stedet, og dermed langsommere enn noen få millisekunder. For å vurdere denne dynamiske oppførselen utførte vi burst-recurrence analyse47. Kort sagt, siden vi søker å vurdere dynamikken som til tider oppstår lenger enn varigheten av et enkeltmolekylutbrudd, testet vi muligheten for at et enkelt α-Syn-molekyl viser en endring i sCy3 betyr fluorescenslevetid mellom påfølgende kryssinger av det konfokale stedet. For å gjøre dette skiller vi først mellom to typer påfølgende utbrudd: i) påfølgende utbrudd av forskjellige α-Syn-molekyler med briste separasjonstider som fordeler seg i sekunder, og ii) påfølgende utbrudd av samme α-Syn-molekyl som gjentar seg i det konfokale volumet etter en briste separasjonstid, til tider så sakte som ~ 100 ms (Figur 2A). Etter de to gjennomsnittlige livsunderpopulasjonene valgte vi å inspisere par med påfølgende utbrudd som er separert med maksimalt 100 ms (figur 2A), der den første av de to utbruddene viste gjennomsnittlig fluorescenslevetid innenfor den korte levetiden underpopulasjonen (0-2 ns) eller innenfor den lange levetiden underpopulasjonen (>3,5 ns; Figur 2B, fargede nyanser). Inspeksjonen tester hvilke av utbruddene av tilbakevendende brister, representert ved den andre bristen i par påfølgende utbrudd, viser fluorescenslevetid i livstidsunderpopulasjonen motsatt den i den første bristen. Man kan observere at en brøkdel av molekyler som starter som en utbrudd i den korte levetiden sub-populasjonen gjentar seg som en briste utenfor dette området og selv innenfor lang levetid subpopulation (Figur 2C), og at en brøkdel av molekyler som starter som en briste i lang levetid sub-populasjonen gjentas som en briste utenfor dette området og selv innenfor kort levetid subpopulation (Figur 2D), alt innen 10-100 ms.

Figure 1
Figur 1: Gjennomsnittlig fluorescenslevetid for sCy3-merkingsrester 56 i α-Syn A56C. gjennomsnittlig fluorescenslevetid histogrammer av fritt diffuserende sCy3-merket α-Syn A56C (ved 25 pM) i fravær (A) og tilstedeværelse (B) på 5 mM SDS. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: PIFE burst recurrence analyse viser individuelle molekyler gjennomgå overganger mellom ulike gjennomsnittlige levetidsverdier innen 100 ms. Fra topp til bunn: (A) histogrammet av separasjonstider mellom påfølgende enkeltmolekylutbrudd. Den oransje skyggen representerer separasjonstider mellom påfølgende utbrudd av tilbakevendende molekyler, hvor den første og andre brister oppstår fra samme molekyl. (B) Gjennomsnittlig fluorescens levetid histogram av alle enkeltmolekylutbrudd. De gule og grønne nyansene representerer området med gjennomsnittlige levetidsverdier som er valgt for å representere verdier i henholdsvis korte og lange gjennomsnittlige levetidsunderpopulasjoner. (C) eller (D). Den gjennomsnittlige fluorescenslevetiden histogrammer av brister som ble skilt fra en tidligere utbrudd med en tid innenfor den oransje-skyggelagte tidsskalaen (i A), og hvor den forrige bristen hadde en gjennomsnittlig levetid innenfor området representert av henholdsvis de gule eller grønne nyanser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Omfattende biokjemiske og biofysiske studier ble utført for å studere de strukturelle egenskapene til α-Syn og dens uordnede natur33,34,35,36,37,38. Flere arbeider har allerede brukt fritt diffuserende smFRET for å undersøke den intramolekylære dynamikken i α-Syn monomer fri for binding. Disse verkene rapporterte den høye dynamiske heterogeniteten til α-Syn, noe som fører til gjennomsnitt av flere forskjellige strukturelle arter innenfor de typiske diffusjonstidene gjennom det konfokale stedet, noe som fører til utseendet til en enkelt FRET-befolkning39,40. Man må imidlertid huske at smFRET-målinger rapporterer om endringer i mellomfargede avstander som forekommer innen 3-10 nm, en skala som karakteriserer generelle strukturelle endringer i et lite protein som α-Syn.

Vi var nysgjerrige på hvilke resultater vi kunne finne når vi brukte en annen fluorescensbasert sensor av romlige endringer i et protein som er følsomt for lokal strukturdynamikk, og som også har blitt brukt på enkeltmolekylnivå. smPIFE kan spore lokale romlige endringer i nærheten sCy3 merking en bestemt aminosyre rester i 0-3 nm området.

I denne studien benyttet vi smPIFE for å undersøke dynamikken i lokale strukturer innen α-Syn og mer spesifikt lokale strukturendringer i nærheten av NAC-rester 56. Resultatene tyder på at regionen i nærheten av rester 56 i α-Syn viser noen distinkte strukturelle underpopulasjoner som er stabile nok termodynamisk til å interkonvertere i så sakte som 100 ms, og kanskje enda langsommere. Disse underpopulasjonene identifiseres gjennom inspeksjon av gjennomsnittlig fluorescenslevetid for målte sCy3-merkede enkelt- α-Syn-molekyler. I disse underpopulasjonene, jo lengre den karakteristiske fluorescenslevetiden til underpopulasjonen er, jo mer nærliggende en proteinoverflate hindrer den begeistrede tilstanden isomerisering av sCy3, og dermed jo nærmere proteinoverflaten er til den sCy3-merkede rester.

I likhet med andre sprøytebrukere har α-Syn blitt rapportert å ha interaksjoner med andre biomolekyler, samt selvforening, der disse bindingshendelsene i mange tilfeller innebærer stabilisering av en bestemt struktur innenfor α-Syn-underenheten56,57,58,59. Noen proteiner får en bestemt struktur ved binding, via en indusert passformmekanisme. Imidlertid mellom andre proteiner spontant mellom flere distinkte konformasjoner, og bindingshendelsen til en bestemt biomolekyl stabiliserer bare en av de eksisterende konformasjonene. For sistnevnte tilfelle er et av kravene at konformasjonen som skal stabiliseres, vil overleve lenge nok til å imøtekomme den første bindingen. Derfor, jo lenger en strukturell region i et protein overlever, jo høyere vil bindingseffektiviteten være. Vi foreslår at de observerte millisekunder stabile underpopulasjonene representerer eksistensen av forskjellige arter av lokal struktur i nærheten av rester 56. Disse peker på forskjellige lokale strukturarter i nærheten av midten av NAC- og NTD-segmentene. I et nylig arbeid rapporterer vi dette og andre sCy3-merkede rester i disse segmentene viser også slike underpopulasjoner60. Dette resultatet kommer til å vise at den strukturelle dynamikken i den frie α-Syn monomer best kan beskrives som rask (få mikrosekunder på det meste40) samlet proteindynamikk, som bærer lokale strukturelle segmenter som holder seg stabile i millisekunder. Andre sprøytebrukere som Tau og amyloid-β var kjent for å dele lignende egenskaper ved å bære en lokal strukturert region48,49,50.

smPIFE har hovedsakelig blitt brukt til å studere interaksjonene mellom separate biomolekyler. Her bruker vi smPIFE for å undersøke PIFE innen segmenter av samme protein. Det er viktig å nevne at flertallet av tidligere smPIFE-eksperimenter ble utført ved å spore relative endringer i fluorescensintensiteter av enkelt immobiliserte sCy3-merkedemolekyler 13,14,15,16,17,18,19,51,52,53 . Selv om den er nyttig for immobiliserte molekyler, er denne prosedyren mindre informativ når du måler fritt diffuserende enkeltmolekyler. Hwang et al. har vist hvordan man måler PIFE-effekten også ved å spore endringer i fluorescenslevetider, som rapporterer direkte om endringen i isomeriseringsdynamikken til sCy319. Her undersøker vi PIFE-effekten av enkelt diffuserende α-Syn via sCy3 betyr fluorescenslevetid, i stedet for å spore relative endringer i fluorescensintensiteter. Ved å gjøre det var vi i stand til å skaffe PIFE-relaterte underpopulasjoner til tross for den korte oppholdstiden til hvert enkelt α-Syn-molekylet på det konfiskere stedet. Faktisk viste gjennomsnittlig fluorescenslevetid ikke bare å være nyttig for å definere PIFE-relaterte underpopulasjoner, men også i å vurdere langsom PIFE-relatert dynamikk ved hjelp av burst recurrence analysis framework47. Det kreves imidlertid mer arbeid i å utvikle prosedyrer som gjør det mulig å vurdere raskere PIFE-dynamikk på riktig måte. Det er mange eksisterende fotonstatistikkverktøy, som brukes til å vurdere rask FRET-dynamikk i fritt diffuserende smFRET-eksperimenter, som vi har tenkt å gjenbruke som skal brukes i smPIFE54,55.

For å oppsummere, i dette arbeidet brukte vi den relativt nye kombinasjonen av PIFE-målinger av fritt diffuserende enkeltmolekyler for å identifisere ms-stabile underpopulasjoner av lokale strukturer i α-Syn, som ikke ble gjenvunnet av smFRET. Vi brukte smPIFE-målinger for å studere α-Syn som modell IDP, og resultatene våre strekker seg utover tidligere funn av at α-Syn er globalt uorden. Funnene tyder på at α-Syn kan ha ms-stabile bestilte lokale strukturer, og vi hypoteser om at disse lokale strukturene kan tjene en rolle i bindende anerkjennelse.

Så langt ble smPIFE brukt som middel til å studere interaksjoner mellom sCy3-merkede nukleinsyrer med deres umerkede protein kolleger51. Ved det ble smPIFE brukt som et kraftig verktøy for å føle biomolekylære interaksjoner, og dermed ville det naturlige neste trinnet i den retningen være å bruke det for å føle proteinproteininteraksjoner og deres dynamikk, ett kompleks om gangen.

Kraften ved å bruke en kortdistanse nærhetssensor som smPIFE kan bidra til å identifisere stabil lokal strukturering i andre proteinsystemer som anses som uorden og strukturelt ustabile. Imidlertid stopper ikke kraften ved å bruke en enkeltmolekyls fluorescensbasert kort nærhetssensor der. Det er mange biomolekylære systemer som viser kortvarig konformasjonsdynamikk for å lette deres funksjon, for eksempel mange ionkanaler. Vi tror smPIFE kan fungere som et verktøy komplementært til enkeltmolekylet FRET, i slike tilfeller der det dynamiske området av nærhetsendringene i proteinsystemet ikke samsvarer med det dynamiske avstandsområdet FRET kan oppdage og løse. Oppsummert fremmer vi bruken av smPIFE som en nærhetssensor komplementær til enkeltmolekylerte FRET-målinger, for å dekke en bredere skala av biomolekylære proxyer, og kanskje observere klare millisekunder-gjennomsnittlige underpopulasjoner av de målte parametrene som rapporterer om stabile strukturer som enten er lokale eller generelle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere deler ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

PT-t7 plasmidkodingen A56C α-Syn mutant ble gitt til oss som en gave fra Dr. Asaf Grupi, Dr. Dan Amir og Dr. Elisha Haas. Denne artikkelen ble støttet av National Institutes of Health (NIH, gi R01 GM130942 til E.L. som en subaward), Israel Science Foundation (tilskudd 3565/20 i KillCorona - Curbing Coronavirus Research Program), Milner Fund og Det hebraiske universitetet i Jerusalem (oppstartsmidler).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merc C7715 cutoff: 100 kDa
ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
BSA Sigma-Aldrich A9647
cysteamine Sigma-Aldrich 30070
dialysis bags - MEGA GeBaFlex-tube Gene Bio-Application MEGA320
dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Fast SeeBand staining solution Gene Bio-Application SB050
Glycine Sigma-Aldrich 50046
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES Sigma-Aldrich 54457
HiTrap Desalting 5 mL Sigma-Aldrich GE17-1408
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX) Sigma-Aldrich 238813
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
LB broth Sigma-Aldrich L3152
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63068
MonoQ column Sigma-Aldrich 54807
protein LoBind tube Sigma-Aldrich EP0030108094 0.5 mL
Rinse a µ-slide 18 Ibidi 81816
SDS Sigma-Aldrich 75746
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich 71507
Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas mini-plast 815-004-05-001
streptomycin sulfate Sigma-Aldrich S9137
sulfo-Cy3 maleimide abcam ab146493
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich 75259
Tris-HCl Sigma-Aldrich 93363
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gust, A., et al. A starting point for fluorescence-based single-molecule measurements in biomolecular research. Molecules. 19 (10), 15824-15865 (2014).
  2. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  3. Haran, G. Single-molecule fluorescence spectroscopy of biomolecular folding. Journal of Physics Condensed Matter. 15 (32), R1291 (2003).
  4. Schuler, B., Lipman, E. A., Eaton, W. A. Probing the free-energy surface for protein folding with single-molecule fluorescence spectroscopy. Nature. 419 (6908), 743-747 (2002).
  5. Michalet, X., Weiss, S., Jäger, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chemical Reviews. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  6. Ha, T., Enderle, T., Ogletree, D. F., Chemla, D. S., Selvin, P. R., Weiss, S. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
  7. Deniz, A. A., et al. Single-molecule protein folding: Diffusion fluorescence resonance energy transfer studies of the denaturation of chymotrypsin inhibitor 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5179-5184 (2000).
  8. Bialik, C. N., Wolf, B., Rachofsky, E. L., Ross, J. B. A., Laws, W. R. Dynamics of biomolecules: Assignment of local motions by fluorescence anisotropy decay. Biophysical Journal. 75 (5), 2564-2573 (1998).
  9. Jameson, D. M., Sawyer, W. H. Fluorescence anisotropy applied to biomolecular interactions. Methods in Enzymology. 246, 283-300 (1995).
  10. Kempe, D., Schöne, A., Fitter, J., Gabba, M. Accurate Fluorescence Quantum Yield Determination by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Journal of Physical Chemistry B. 119 (13), 4668-4672 (2015).
  11. Callis, P. R., Liu, T. Quantitative Prediction of Fluorescence Quantum Yields for Tryptophan in Proteins. Journal of Physical Chemistry B. 108, 4248-4259 (2004).
  12. Lehrer, S. S. Solute Perturbation of Protein Fluorescence. The Quenching of the Tryptophyl Fluorescence of Model Compounds and of Lysozyme by Iodide Ion. Biochemistry. 10 (17), 3254-3263 (1971).
  13. Xie, K. X., Liu, Q., Jia, S. S., Xiao, X. X. Fluorescence enhancement by hollow plasmonic assembly and its biosensing application. Analytica Chimica Acta. 1144, 96-101 (2021).
  14. Stennett, E. M. S., Ciuba, M. A., Lin, S., Levitus, M. Demystifying PIFE: The Photophysics behind the Protein-Induced Fluorescence Enhancement Phenomenon in Cy3. Journal of Physical Chemistry Letters. 6 (10), 1819-1823 (2015).
  15. Nguyen, B., Ciuba, M. A., Kozlov, A. G., Levitus, M., Lohman, T. M. Protein Environment and DNA Orientation Affect Protein-Induced Cy3 Fluorescence Enhancement. Biophysical Journal. 117 (1), 66-73 (2019).
  16. Song, D., Graham, T. G. W., Loparo, J. J. A general approach to visualize protein binding and DNA conformation without protein labelling. Nature Communications. 7, 10976 (2016).
  17. Ploetz, E., et al. Förster resonance energy transfer and protein-induced fluorescence enhancement as synergetic multi-scale molecular rulers. Scientific Reports. 6, 33257 (2016).
  18. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
  19. Hwang, H., Kim, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement as a single molecule assay with short distance sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7414-7418 (2011).
  20. Ray, P. C., Fan, Z., Crouch, R. A., Sinha, S. S., Pramanik, A. Nanoscopic optical rulers beyond the FRET distance limit: Fundamentals and applications. Chemical Society Reviews. 43, 6370-6404 (2014).
  21. Chen, H., Rhoades, E. Fluorescence characterization of denatured proteins. Current Opinion in Structural Biology. 18 (4), 516-524 (2008).
  22. Alderson, T. R., Markley, J. L. Biophysical characterization of α-synuclein and its controversial structure. Intrinsically Disordered Proteins. 1 (1), 18-39 (2013).
  23. Mane, J. Y., Stepanova, M. Understanding the dynamics of monomeric, dimeric, and tetrameric α-synuclein structures in water. FEBS Open Bio. 6 (7), 666-686 (2016).
  24. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  25. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  26. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  27. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  28. Trexler, A. J., Rhoades, E. α-Synuclein binds large unilamellar vesicles as an extended helix. Biochemistry. 48 (11), 2304-2306 (2009).
  29. Stephens, A. D., Zacharopoulou, M., Kaminski Schierle, G. S. The Cellular Environment Affects Monomeric α-Synuclein Structure. Trends in Biochemical Sciences. 44 (5), 453-466 (2019).
  30. Illes-Toth, E., Dalton, C. F., Smith, D. P. Binding of dopamine to alpha-synuclein is mediated by specific conformational states. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (9), 1346-1354 (2013).
  31. Frimpong, A. K., Abzalimov, R. R., Uversky, V. N., Kaltashov, I. A. Characterization of intrinsically disordered proteins with electrospray inization mass spectrometry: Conformationl heterogeneity of α-synuciein. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics. 78 (3), 714-722 (2010).
  32. Sandal, M., et al. Conformational equilibria in monomeric α-synuclein at the single-molecule level. PLoS Biology. 6 (1), e6 (2008).
  33. Brodie, N. I., Popov, K. I., Petrotchenko, E. V., Dokholyan, N. V., Borchers, C. H. Conformational ensemble of native α-synuclein in solution as determined by short-distance crosslinking constraint-guided discrete molecular dynamics simulations. PLoS Computational Biology. 15 (3), e1006859 (2019).
  34. Ullman, O., Fisher, C. K., Stultz, C. M. Explaining the structural plasticity of α-synuclein. Journal of the American Chemical Society. 133 (48), 19536-19546 (2011).
  35. Binolfi, A., Theillet, F. X., Selenko, P. Bacterial in-cell NMR of human α-synuclein: A disordered monomer by nature? Biochemical Society Transactions. 40 (5), 950-954 (2012).
  36. Waudby, C. A., et al. In-Cell NMR Characterization of the Secondary Structure Populations of a Disordered Conformation of α-Synuclein within E. coli Cells. PLoS ONE. 8 (8), e72286 (2013).
  37. Yu, J., Malkova, S., Lyubchenko, Y. L. α-Synuclein Misfolding: Single Molecule AFM Force Spectroscopy Study. Journal of Molecular Biology. 384 (4), 992-1001 (2008).
  38. Guerrero-Ferreira, R., Kovacik, L., Ni, D., Stahlberg, H. New insights on the structure of alpha-synuclein fibrils using cryo-electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 61, 89-95 (2020).
  39. Trexler, A. J., Rhoades, E. Single molecule characterization of α-synuclein in aggregation-prone states. Biophysical Journal. 99 (9), 3048-3055 (2010).
  40. Ferreon, A. C. M., Gambin, Y., Lemke, E. A., Deniz, A. A. Interplay of α-synuclein binding and conformational switching probed by single-molecule fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5645-5650 (2009).
  41. Rezaei-Ghaleh, N., et al. Local and Global Dynamics in Intrinsically Disordered Synuclein. Angewandte Chemie - International Edition. 57 (46), 15262-15266 (2018).
  42. Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. Photon-HDF5: An Open File Format for Timestamp-Based Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).
  43. Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S. Y., Weiss, S., Michalet, X. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing Single-molecule FRET. PLoS ONE. 11 (8), e0160716 (2016).
  44. Ingargiola, A., et al. Multispot single-molecule FRET: Highthroughput analysis of freely diffusing molecules. PLoS ONE. 12 (4), e0175766 (2017).
  45. Eggeling, C., Fries, J. R., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. A. M. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  46. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. Journal of Physical Chemistry A. 102, 6601-6613 (1998).
  47. Hoffmann, A., et al. Quantifying heterogeneity and conformational dynamics from single molecule FRET of diffusing molecules: Recurrence analysis of single particles (RASP). Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (5), 1857-1871 (2011).
  48. Eakin, C. M., Berman, A. J., Miranker, A. D. A native to amyloidogenic transition regulated by a backbone trigger. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 202-208 (2006).
  49. Jahn, T. R., Parker, M. J., Homans, S. W., Radford, S. E. Amyloid formation under physiological conditions proceeds via a native-like folding intermediate. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 195-201 (2006).
  50. Chen, D., et al. Tau local structure shields an amyloid-forming motif and controls aggregation propensity. Nature Communications. 10 (1), 2493 (2019).
  51. Lerner, E., Ploetz, E., Hohlbein, J., Cordes, T., Weiss, S. A Quantitative Theoretical Framework for Protein-Induced Fluorescence Enhancement-Förster-Type Resonance Energy Transfer (PIFE-FRET). Journal of Physical Chemistry. B. 120 (26), 6401-6410 (2016).
  52. Valuchova, S., Fulnecek, J., Petrov, A. P., Tripsianes, K., Riha, K. A rapid method for detecting protein-nucleic acid interactions by protein induced fluorescence enhancement. Scientific Reports. 6, 39653 (2016).
  53. Qiu, Y., Myong, S. Single-Molecule Imaging With One Color Fluorescence. Methods in Enzymology. 581, 33-51 (2016).
  54. Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), eaan1133 (2018).
  55. Lerner, E., et al. FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices. Elife. 10, e60416 (2021).
  56. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  57. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  58. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  59. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  60. Chen, J., et al. The structural heterogeneity of α-synuclein is governed by several distinct subpopulations with interconversion times slower than milliseconds. Structure. 29 (9), (2021).

Tags

Biokjemi Utgave 171 Enkeltmolekyl proteinindusert fluorescensforbedring fluorescenslevetid α-Synuclein konformasjoner dynamikk iboende uordnet protein
Bruke tidsbestemt proteinindusert fluorescensforbedring for å identifisere stabile lokale konformasjoner En α-Synuclein Monomer om gangen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zaer, S., Lerner, E. Utilizing… More

Zaer, S., Lerner, E. Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One α-Synuclein Monomer at a Time. J. Vis. Exp. (171), e62655, doi:10.3791/62655 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter