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Bioengineering

Fiberoptic Confocal लेजर माइक्रोएंडोस्कोपी का उपयोग कर ओकुलर ड्रग डिलीवरी सिस्टम के विवो इमेजिंग में Spatio-टेम्पोरल

Published: September 27, 2021 doi: 10.3791/62685
Automatic Translation
1,2, 3,4, 2,5, 1
1Laboratory for Translational and Molecular Imaging, Cancer and Stem Cell Biology Programme, Duke-NUS Medical School, 2School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 3Singapore National Eye Centre, 4Singapore Eye Research Institute, 5Material Science & Engineering, National University of Singapore

Summary

हम फाइबरऑप्टिक कॉन्फोकल लेजर माइक्रोएंडोस्कोपी (सीएलएम) के उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ताकि उप-संयुग्मन इंजेक्शन के बाद आंखों में लिपोसोम के स्पैटो-टेम्पोरल वितरण का गैर-आक्रामक रूप से अध्ययन किया जा सके।

Abstract

Subconjunctival इंजेक्शन आसान ट्रांस-स्क्लरल एक्सेस के कारण ओकुलर दवाओं को प्रशासित करने के लिए एक आकर्षक मार्ग है जो पूर्वकाल ओकुलर बाधाओं को बायपास करता है, जैसे कि कॉर्निया और कंजंक्टिवा। जबकि कुछ अध्ययनों में subconjunctival इंजेक्शन पर दवाओं के चिकित्सीय प्रभाव और फार्माकोकाइनेटिक्स का वर्णन किया गया है, बहुत कम दवाओं या दवा वितरण प्रणालियों (डीडीएस) के ओकुलर वितरण का आकलन करते हैं। उत्तरार्द्ध इंट्राओकुलर डीडीएस डिजाइन और दवा जैव उपलब्धता के अनुकूलन के लिए वांछित ओकुलर स्थानीयकरण और कार्रवाई की अवधि (जैसे, तीव्र बनाम लंबे समय तक) को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह अध्ययन फाइबरऑप्टिक कॉन्फोकल लेजर माइक्रोएंडोस्कोपी (सीएलएम) के उपयोग को स्थापित करता है ताकि उप-कंजंक्टिवल इंजेक्शन के बाद जीवित चूहों में वास्तविक समय में फ्लोरोसेंट लिपोसोम के ओकुलर वितरण का गुणात्मक रूप से अध्ययन किया जा सके। माइक्रोस्कोपिक स्तर पर ऊतकों के विवो दृश्य निरीक्षण के लिए डिज़ाइन किया जा रहा है, यह सीएलएम इमेजिंग विधि का पहला पूर्ण विवरण भी है जो सबकंजंक्टिव इंजेक्शन के बाद आंखों में इंजेक्टेबल्स के स्पैटियो-टेम्पोरल वितरण का अध्ययन करता है।

Introduction

रक्त निकासी, ऊतक वितरण, और जीवित प्रणालियों में दवाओं के लक्ष्य अधिभोग विवो दवा स्वभाव में समझने के लिए स्तंभ हैं। प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल में, इन मापदंडों का मूल्यांकन आमतौर पर दवा प्रशासन के बाद विशेष समय बिंदुओं पर लगातार रक्त और ऊतक नमूने द्वारा किया जाता है। हालांकि, ये प्रक्रियाएं आम तौर पर आक्रामक होती हैं, अक्सर गैर-उत्तरजीविता माप शामिल होती हैं, और सांख्यिकीय शक्ति के लिए बड़े पशु समूहों की आवश्यकता होती है। जानवरों के अत्यधिक उपयोग के लिए नैतिक चिंताओं के साथ-साथ अतिरिक्त लागत और समय खर्च हो सकता है। नतीजतन, गैर-इनवेसिव इमेजिंग तेजी से बायोडिस्ट्रिब्यूशन अध्ययन में एक अभिन्न कदम बन रहा है। Confocal लेजर माइक्रोएंडोस्कोपी (CLM1,2) अच्छी तरह से ओकुलर अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है गैर-invasively उच्च संवेदनशीलता और उच्च संकल्प के साथ जीवित जानवरों की आंखों में चिकित्सीय के spatio-अस्थायी वितरण छवि 1,3,4.

सीएलएम में डीडीएस और दवा जैव उपलब्धता के व्यापक परिमाणीकरण से पहले ओकुलर ड्रग डिलीवरी सिस्टम (डीडीएस) की मजबूत स्क्रीनिंग की सुविधा प्रदान करने की क्षमता है, जैसे कि लिपोसोम। Liposomes अपने भौतिक-रासायनिक और biophysical गुणों को ट्यूनिंग में उनके लचीलेपन के लिए आकर्षक हैं5,6,7,8,9,10,11 चिकित्सीय कार्गो की एक बड़ी विविधता encapsulate और दवा रिलीज और कार्रवाई की अवधि के ऊतक साइट को नियंत्रित करने के लिए। लिपोसोम का उपयोग बड़े अणुओं के वितरण के लिए ओकुलर अनुप्रयोगों में किया गया है, जैसे कि मोनोक्लोनल एंटीबॉडी बेवासिज़ुमेब 12, और साइक्लोस्पोरिन 13 और गैंसिक्लोविर 14 जैसे छोटे अणु। दवा से भरी हुई लिपोसोम में गैर-लिपोसोमल "मुफ्त दवा" योगों की तुलना में लंबे समय तक जैविक आधे जीवन और लंबे समय तक चिकित्सीय प्रभाव होते हैं। हालांकि, ओकुलर ऊतक में दवा वितरण आमतौर पर आंख के तरल घटकों में दवा की सांद्रता से extrapolated है (यानी, रक्त, जलीय हास्य, और vitreous humor15,16,17)। लोड किए गए ड्रग कार्गो के विवो भाग्य में प्रारंभिक के रूप में नैनोकैरियर के गुणों द्वारा परिभाषित किया गया है, फ्लोरोसेंट लिपोसोम की सीएलएम इमेजिंग ऊतक लक्ष्यीकरण और सीटू ऊतक निवास समय में प्रकट करने के लिए दवा के लिए एक सरोगेट के रूप में काम कर सकती है। इसके अलावा, सीएलएम के साथ वितरण के दृश्य साक्ष्य डीडीएस को फिर से डिजाइन कर सकते हैं, दवा के चिकित्सीय लाभों का मूल्यांकन कर सकते हैं, और शायद प्रतिकूल जैविक घटनाओं की भविष्यवाणी भी कर सकते हैं (उदाहरण के लिए, समय की लंबी अवधि के लिए डीडीएस के अवांछनीय स्थानीयकरण के कारण ऊतक विषाक्तता)।

यहां, एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया एक दोहरे बैंड सीएलएम सिस्टम के साथ लाइव चूहों में लिपोसोम के ओकुलर बायोडिस्ट्रिब्यूशन का अध्ययन करने के तरीके पर विस्तृत है। यह विशिष्ट सीएलएम प्रणाली वास्तविक समय में दो-रंग प्रतिदीप्ति (488 एनएम और 660 एनएम पर हरे और लाल उत्तेजना लेजर के साथ) का पता लगा सकती है, जिसमें 8 फ्रेम / एस की आवृत्ति होती है। शारीरिक रूप से आंख पर पता लगाने की जांच रखकर, प्रोटोकॉल 2% इवांस ब्लू (ईबी) डाई के साथ चूहों में पूर्व-इंजेक्ट किए गए अंतःशिरा (IV) में subconjunctival प्रशासन पर छवि अधिग्रहण और ग्रीन-फ्लोरोसेंट लिपोसोम के विश्लेषण को प्रदर्शित करता है। ईबी डाई लाल प्रतिदीप्ति चैनल में संवहनी संरचनाओं की कल्पना करने में मदद करता है। हम फॉस्फोलिपिड पीओपीसी (यानी, 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) से बने 100 एनएम तटस्थ लिपोसोम का आकलन करने वाले एक अध्ययन से प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं और फ्लोरोसीन-टैग किए गए फॉस्फोलिपिड Fl-DHPE (यानी, N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine के अनुपात में 1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine के साथ डोप किया गया है। ). CLM EB-सना हुआ ओकुलर ऊतक सीमाओं के चित्रण द्वारा 15 μm अक्षीय और 3.30 μm पार्श्व संकल्प पर हरे रंग के फ्लोरोसीन-टैग किए गए लिपोसोम पर कब्जा करने में सक्षम है।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को सिंगहेल्थ (सिंगापुर) में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है। मादा C57BL / 6 जे चूहों (6- 8 सप्ताह पुराने; 18-20 ग्राम) InVivos, सिंगापुर से प्राप्त किए गए थे, और ड्यूक-एनयूएस मेडिकल स्कूल, सिंगापुर के तापमान और प्रकाश-नियंत्रित vivarium में रखे गए थे। नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए एसोसिएशन फॉर रिसर्च इन विजन एंड ओप्थाल्मोलॉजी (एआरवीओ) के बयान के दिशानिर्देशों के अनुसार जानवरों का इलाज किया गया था।

नोट:: मुख्य कार्यविधियों को हाइलाइट करने वाला एक प्रवाह चार्ट चित्र 2 में दिखाया गया है।

1. इसके विपरीत एजेंटों की तैयारी: इवांस ब्लू (ईबी) और liposomes

  1. 2% ईबी डाई समाधान के लिए, बाँझ खारा के 50 मिलीलीटर में ईबी के 1 ग्राम को भंग करें। 1.5 mL बाँझ ट्यूबों में 0.22 μm फ़िल्टर का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें और बाद में उपयोग के लिए उन्हें कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  2. ग्रीन-फ्लोरोसेंट लिपोसोम के लिए, POPC / Fl-DHPE (95: 5), क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल (2: 1) को 100 एमएल राउंड बॉटम फ्लास्क में जोड़ें। 1 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर 150 आरपीएम पर एक रोटरी बाष्पीकरणकर्ता का उपयोग करें, एक पतली लिपिड फिल्म बनाने के लिए 0 mbar1 पर बनाए रखा वैक्यूम के साथ।
    नोट: वितरण पर लिपोसोमल गुणों (जैसे, आकार, चार्ज, लिपिड संतृप्ति, लिपिड श्रृंखला लंबाई) के प्रभावों की तुलना करते समय, यह पुष्टि करने के लिए Fl-DHPE या अन्य फ्लोरोसेंट लिपिड का एक निश्चित प्रतिशत बनाए रखें कि देखे गए परिणाम परीक्षण किए गए गुणों के प्रभाव के कारण हैं, न कि बड़े हाइड्रोफोबिक रंजक के चर भार के लिए।
  3. मल्टी-लैमेलर पुटिकाओं (एमएलवी) बनाने के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (फ्लोरोसेंट लिपोसोम के 26.3 एमएम प्राप्त करने के लिए) के साथ लिपिड फिल्म को हाइड्रेट करें। मैनुअल बाहर निकालना के लिए एक ग्लास सिरिंज में एमएलवी लोड (30 बार एक 0.08 μm रंध्र आकार polycarbonate फिल्टर का उपयोग कर) 100 एनएम के वांछित आकार को प्राप्त करने के लिए.
    नोट: जलयोजन के लिए तापमान लिपिड के संक्रमण तापमान से अधिक होना चाहिए।
  4. एक 0.22 μm बाँझ सिरिंज फिल्टर के माध्यम से उन्हें पारित करके liposomes फ़िल्टर। एक गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन प्रणाली का उपयोग कर liposomes के हाइड्रोडायनामिक व्यास (DH) की पुष्टि करें।

2. जीवित चूहों में ईबी और liposomes के प्रशासन

  1. पूंछ शिरा (2.5 मिलीग्राम / किग्रा) के माध्यम से ईबी IV (अंतःशिरा) के साथ माउस इंजेक्ट करें, सबकंजक्टिवल इंजेक्शन से 2 घंटे पहले।
  2. Subconjunctival इंजेक्शन के लिए, सबसे पहले, संज्ञाहरण के एक पर्याप्त विमान को प्राप्त करने के लिए एक प्रेरण कक्ष में साँस लेने के माध्यम से 5% isoflurane का उपयोग कर माउस sedate। माउस को एक नाक शंकु में स्थानांतरित करें और पूरी प्रक्रिया के दौरान हीटिंग पैड पर रहते हुए आइसोफ्लुरेन के 2% -2.5% पर बेहोश करने की क्रिया बनाए रखें।
  3. इंजेक्ट किए जाने के लिए आंख के पास व्हिस्कर को ट्रिम करें और सीधे आंखों पर सामयिक संवेदनाहारी 0.5% प्रॉक्सीमेटाकेन हाइड्रोक्लोराइड समाधान की एक बूंद डालें।
  4. फ्लोरोसेंट लिपोसोम (Fl-DHPE: 0.78 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ एक 10 μL ग्लास सिरिंज (32 जी सुई के साथ) लोड करें और इंजेक्शन से पहले सिरिंज में सभी हवा के बुलबुले को दूर करें।
    नोट: इंजेक्टेट के 20 μL तक को mice18,19 के subconjunctival स्थान में समायोजित किया जा सकता है।
  5. एक चिमटी का उपयोग करते हुए, कंजाक्तिवा को थोड़ा ऊपर उठाएं और धीरे-धीरे subconjunctival अंतरिक्ष में इंजेक्ट करें (चित्रा 1A)। Backflow को रोकने के लिए सुई को धीरे-धीरे वापस लें। सुनिश्चित करें कि फ्लोरोसेंट लिपोसोम से भरा एक दृश्यमान ब्लेब का गठन किया जाता है (चित्रा 1 सी)।
  6. इंजेक्शन के बाद आंख पर एंटीबायोटिक 1% फ्यूसिडिक एसिड की एक बूंद का प्रशासन करें और माउस की निगरानी करें जब तक कि यह चेतना प्राप्त न कर ले।

3. CLM सेट-अप

  1. CLM सिस्टम पर स्विच करें और सुनिश्चित करें कि कनेक्टर और स्कैनिंग जांच के डिस्टल टिप दोनों साफ हैं।
  2. निर्माता के निर्देशों का पालन करके ऑप्टिकल कनेक्टर क्लीनर का उपयोग करके स्कैनिंग जांच के कनेक्टर को साफ करें।
    1. एक सफाई रिबन प्रकट करने के लिए ऑप्टिकल कनेक्टर क्लीनर के rachet (अक्सर रंगीन) दबाएँ।
    2. कनेक्टर को सफाई रिबन के संपर्क में रखें और संपर्क बनाए रखते समय कनेक्टर को रिबन के साथ स्लाइड करें।
  3. जांच के डिस्टल टिप (जिसे स्कैनिंग टिप के रूप में भी जाना जाता है) को सफाई समाधान में डुबोकर साफ करें, इसके बाद निर्माता द्वारा प्रदान किए गए रिंसिंग समाधान। एक कपास टिप applicator भी अधिक पूरी तरह से सफाई के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अगर टिप बहुत गंदा है.
  4. CLM सिस्टम के लिए प्रोब कनेक्ट करें। इस बिंदु पर अधिग्रहण फ़ाइलों के लिए दृश्य का फ़ील्ड (FOV) और स्थान चुनें.
    नोट:: Fl-DHPE के लिए प्रतिदीप्ति का पता लगाने रैखिक श्रेणी में है यह सुनिश्चित करने के लिए इस चरण में लेजर तीव्रता समायोजित करें। लेजर तीव्रता को विभिन्न समय बिंदुओं पर ली गई छवियों के बीच तुलना के लिए सुसंगत रखा जाना है।
  5. निर्देश के रूप में सिस्टम को 15 मिनट के लिए गर्म करने की अनुमति दें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार सिस्टम को कैलिब्रेट करने के लिए अंशांकन किट का उपयोग करें।
    नोट: अंशांकन किट में, निम्नलिखित समाधानों वाले प्रत्येक लेजर के लिए तीन शीशियां हैं: सफाई समाधान, कुल्ला समाधान, और आंतरिक अंशांकन के लिए फ्लोरोफोर 488/660 एनएम समाधान। अंशांकन चरणों को सिस्टम द्वारा संकेत दिया जाता है और तदनुसार पालन किया जाना है।
    1. टिप को सफाई की शीशी में विसर्जित करें, जिसके बाद रिंसिंग शीशी (प्रत्येक शीशी में 5 एस)। दोनों चैनलों के लिए पृष्ठभूमि रिकॉर्डिंग के लिए इसे हवा में छोड़ दें।
      नोट: यह चरण बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि यह जांच के विभिन्न तंतुओं से पृष्ठभूमि मानों को सामान्य करता है और छवि एकरूपता सुनिश्चित करता है।
    2. टिप को सफाई की शीशी में विसर्जित करें, जिसके बाद रिंसिंग शीशी (प्रत्येक शीशी में 5 एस)। जांच में विभिन्न तंतुओं से सिग्नल मूल्यों को सामान्य करने के लिए 5 सेकंड के लिए फ्लोरोफोर 488 एनएम शीशी में टिप को विसर्जित करें।
    3. टिप को सफाई की शीशी में विसर्जित करें, जिसके बाद रिंसिंग शीशी (प्रत्येक शीशी में 5 एस)। 3.5.2 में दर्ज प्रतिदीप्ति संकेत तक rinsing शीशी में टिप विसर्जित करें। गायब हो जाता। जांच में विभिन्न तंतुओं से संकेत मूल्यों को सामान्य करने के लिए fluorophore 660 एनएम शीशी में टिप विसर्जित करें।
      नोट:: उचित अंशांकन और इष्टतम छवि गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए सभी अंशांकन चरणों का पालन करें।
  6. जांच को कैलिब्रेट करने के बाद, यह सुनिश्चित करने के लिए जांचें कि जांच के लिए पृष्ठभूमि मान यथासंभव कम हैं। उपयोग किए गए CLM सिस्टम के लिए, पृष्ठभूमि मानों को 100 से नीचे रखें. यदि मान 100/परिभाषित उपयोगकर्ता मान से ऊपर हैं या यदि जांच गंदी प्रतीत होती है, तो कपास टिप applicator और अंशांकन के साथ जांच की बार-बार सफाई करें। यह सुनिश्चित करने के लिए है कि पृष्ठभूमि शोर एक ही मूल्य के आसपास रखा जाता है।
    नोट:: यह सुनिश्चित करने के लिए कि जांच की स्थिति समान हैं, अधिकतम पृष्ठभूमि मान (उदाहरण के लिए, 100 के रूप में चरण 3.6 में कहा गया है) को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह विभिन्न समय बिंदुओं पर ली गई छवियों के बीच उचित मात्रात्मक तुलना की अनुमति देगा। मान विभिन्न प्रणालियों और जांच स्थितियों में भिन्न हो सकता है।
  7. पशु तापमान नियंत्रक (ATC) पर स्विच करें। एटीसी को 37 डिग्री सेल्सियस पर समायोजित करें। एक सर्जिकल ड्रेप के साथ हीटिंग पैड को कवर करें और हीटिंग पैड पर नाक शंकु को ठीक करें।
    नोट: एक संलग्न हीटिंग पैड के साथ एटीसी यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है कि जानवर को इमेजिंग अवधि के दौरान गर्म रखा जाता है।
  8. इसे सुरक्षित करने के लिए टेबलटॉप पर विच्छेदन माइक्रोस्कोप के स्टैंड को क्लैंप करें। घुमाएं और माइक्रोस्कोप के आईपीस को समायोजित करने के लिए माउस आंखों को आईपीस के माध्यम से एर्गोनॉमिक रूप से देखने के लिए जब उपयोगकर्ता बैठा होता है (जानवर को रखने के बाद समायोजन करें)।
  9. एक प्रेरण कक्ष में 5% isoflurane का उपयोग कर माउस sedate. एक बार जब जानवर गैर-उत्तरदायी होता है तो माउस को नाक शंकु में स्थानांतरित करें और पूरी प्रक्रिया के दौरान हीटिंग पैड पर रहते हुए 2% -2.5% आइसोफ्लुरेन पर बेहोश करने की क्रिया बनाए रखें।
  10. माउस के व्हिस्कर को ट्रिम करें और आंख पर एनेस्थेटिक 0.5% प्रॉक्सीमेटाकेन हाइड्रोक्लोराइड समाधान की एक बूंद डालें।
  11. यह सुनिश्चित करने के लिए कि आंखें साफ हैं, ओकुलर सतह को धोने के लिए खारा की कुछ बूंदें छोड़ दें।
  12. माइक्रोस्कोप को समायोजित करें ताकि माउस आंख 0.67x आवर्धन पर सीधे फोकस में हो।
    नोट: खारा के साथ आंखों को चिकनाई देना सुनिश्चित करें। यदि आंखों को इमेजिंग सत्र के दौरान चिकना नहीं किया जाता है, तो वे सूख सकते हैं, जिससे लेंस क्रिस्टलीकृत हो सकता है। नतीजतन, सीएलएम इमेजिंग के दौरान, लेंस पृष्ठभूमि लाल प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन कर सकता है।

4. सीएलएम और अधिग्रहण के साथ माउस आंखों की लाइव इमेजिंग

  1. लेजर को चालू करें, आंख पर जांच रखें और चित्रा 3 में आंखों के नक्शे पर इंगित क्षेत्रों में आंख में प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करने के लिए अधिग्रहण की रिकॉर्डिंग शुरू करें।
    नोट: जांच के दूरस्थ अंत के साथ एक पेन की तरह जांच पकड़ो सीधे क्षेत्र पर छवि की जा करने के लिए।
  2. जब सभी क्षेत्रों को ध्वजांकित और लेबल किया गया हो तो रिकॉर्डिंग रोकें. अधिग्रहण फ़ाइलें चरण 3.4 में चुने गए फ़ाइल स्थान में स्वचालित रूप से सहेजी जाएंगी.
    नोट:: फ़ाइल को एक वीडियो फ़ाइल के रूप में सहेजा जाएगा जिसे अलग-अलग छवियों में निर्यात किया जा सकता है। सटीक फ्रेम रिकॉर्डिंग किया गया था पर जांच के स्थान को जानने के लिए आंखों के नक्शे के अनुसार ध्वज को लेबल करें।

5. छवि विश्लेषण

  1. एक ही CLM अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए, आगे के विश्लेषण के लिए छवि अधिग्रहण फ़ाइलों को निर्यात करें। File | पर क्लिक करें निर्यात करें और निर्यात किए जाने वाले प्रारूप का चयन करें. Mkt प्रारूप फ़ाइलें देखो तालिका (LUT) के समायोजन की अनुमति देगा और आगे CLM व्यूअर सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर छवि फ़ाइल स्वरूपों के लिए निर्यात करता है।
  2. प्रतिदीप्ति तीव्रता की सटीक तुलना के लिए, सभी छवि फ़ाइलों को निर्यात करते समय प्रत्येक चैनल के लिए समायोजित एक ही LUT का उपयोग करें।
    नोट: पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति रीडिंग को कम करने के लिए नियंत्रण माउस के उन लोगों के संबंध में न्यूनतम और अधिकतम LUT थ्रेशोल्ड चुनें (कोई liposomes इंजेक्शन के साथ) के साथ।
  3. एक उपयुक्त छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर / फ्रीवेयर प्रोग्राम (जैसे, ImageJ) में छवि खोलें। ब्याज के क्षेत्र (ROI) को आकर्षित करें।
    नोट: ROI यहाँ प्रसंस्करण कार्यक्रम में रुचि के क्षेत्र को संदर्भित करता है। ज्यादातर मामलों में, ROI पूरी छवि स्कैन किया जाएगा। हालांकि, लिम्बस की इमेजिंग के मामले में, जांच सिर्फ लिम्बस की छवि को अलग से प्राप्त नहीं कर सकती है। इसलिए, एक ROI को लिम्बस क्षेत्र में प्रतिदीप्ति को 'परिमाणित' करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए, जैसा कि चित्र 4 में खींचा गया है। ROI सुसंगत रखने के लिए, सभी छवियों में एक ही ROI का उपयोग करें।
  4. मापने और हरे प्रतिदीप्ति के लिए ROI मूल्यों को रिकॉर्ड करें। किसी स्प्रेडशीट में मान दर्ज करें. ROI के औसत और प्रतिदीप्ति तीव्रता (a.u.) मानों को सारणीबद्ध करें.

6. हिस्टोलॉजी मूल्यांकन

  1. स्थानीय IACUC द्वारा अनुमोदित विधि का उपयोग करके माउस को Euthanize करें।
  2. आंख को न्यूक्लिएट करें और रात भर में 4% फॉर्मेल्डिहाइड या 10% फॉर्मेलिन समाधान के 1 मिलीलीटर में आंख को ठीक करें।
  3. अतिरिक्त वसा ट्रिम करें और इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) यौगिक में आंख को एम्बेड करें और इसे कम से कम एक दिन के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में जमे हुए रखें।
  4. 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा तापमान काटने के साथ क्रायोस्टेट में 5 μm मोटाई के वर्गों में कटौती। अनुभाग को पॉली-एल-लाइसिन-लेपित माइक्रोस्कोप स्लाइड में स्थानांतरित करें।
    नोट: हिस्टोलॉजी डीडीएस के वितरण के अतिरिक्त सत्यापन के रूप में काम कर सकती है। हालांकि, इसके लिए अतिरिक्त अनुकूलन, तकनीकी विशेषज्ञता और जानवरों के बलिदान की आवश्यकता होती है, जिसका अध्ययन सीएलएम का उपयोग करके कम करना है।

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Representative Results

प्रोटोकॉल CLM की उपयोगिता को प्रदर्शित करता है ताकि subconjunctival इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित हरे फ्लोरोसेंट liposomes के spatio-temporal ocular वितरण का आकलन किया जा सके। सीएलएम प्रणाली की दोहरी रंग क्षमता (488 एनएम और 660 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य) का उपयोग करने के लिए, इंजेक्ट किए जाने वाले 100 एनएम तटस्थ पीओपीसी लिपोसोम को 5% Fl-DHPE (संरचना और लक्षण वर्णन डेटा चित्रा 1 बी में दिखाया गया है) के साथ डोप किया गया था, और ईबी को आंखों में स्थलों की पहचान करने के लिए IV इंजेक्ट किया गया था। एपिस्क्लेरा की एक पतली परत और कंजंक्टिवा की उपस्थिति, जो दोनों अत्यधिक संवहनी हैं, स्क्लेरा क्षेत्र को ईबी (चित्रा 4 ए, एस के रूप में लेबल) के साथ लाल रंग की अनुमति देता है, जबकि कॉर्निया जिसमें कोई वास्कुलचर नहीं होता है (चित्रा 4 ए, सी के रूप में लेबल किया जाता है), दाग नहीं मिलता है और काला दिखाई देता है। यह प्रतिदीप्ति इमेजिंग के दौरान दोनों क्षेत्रों के बीच एक अलग अंतर को सक्षम बनाता है।

प्रतिनिधि परिणाम 7 दिनों (एन = 4 चूहों) में फैले एक वितरण अध्ययन से हैं। चूंकि दिन 1 और दिन 3 के लिए छवियों में प्रतिदीप्ति तीव्रता अधिक थी (चित्रा 5 बी), बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए पिक्सेल तीव्रता को कम कर दिया गया था। प्रतिदीप्ति तीव्रता के वास्तविक मान रेखांकन (चित्र6) में परिलक्षित होते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि छवियों से टिप्पणियां लिपोसोम से प्रतिदीप्ति के कारण थीं और मुक्त डाई नहीं थीं, जो लिपोसोम से अलग हो सकती थीं, फ्लोरोसीन (एफएल) डाई के साथ इंजेक्ट किए गए नियंत्रण चूहों को शामिल किया गया था (चित्रा 5 ए)।

लिपोसोम में कमी (हरे फ्लोरोसेंट सिग्नल में कमी के प्रॉक्सी द्वारा) समय के साथ लिम्बस और स्क्लेरा दोनों क्षेत्रों में देखी गई थी। जैसा कि लिपोसोम को अस्थायी से उप-संयुग्मन स्थान (चित्रा 3) के बेहतर क्षेत्र में इंजेक्ट किया गया था, उन्हें स्वाभाविक रूप से अस्थायी और बेहतर स्क्लेरा (चित्रा 4 बी) के शीर्ष पर रखा गया था, जो कि उप-संयुग्मन अंतरिक्ष के अन्य क्षेत्रों तक पहुंचने से पहले था। दिन 1 पोस्ट-इंजेक्शन पर, स्क्लेरा में पाया गया प्रतिदीप्ति अस्थायी और बेहतर दोनों क्षेत्रों के लिए लिम्बस की तुलना में 6 गुना अधिक था (चित्रा 6)। दिन 3 और दिन 7 तक, स्क्लेरा में लिपोसोम की एक महत्वपूर्ण कमी देखी गई थी (दिन 1 से दिन 3 तक 60% (दिन 1→3) और दिन 3 से दिन 7 (दिन 3→7)) तक 88%) लौकिक क्षेत्र में, 66% और दिन 1→3 और दिन 3→7 के लिए 93 % की कमी के साथ, बेहतर क्षेत्रों में दिन 1→3 और दिन 3→7 के लिए, क्रमशः, पी < 0.001) (चित्रा 6)। इस कमी को नेत्रश्लेष्मला और एपिस्क्लेरा में पाए जाने वाले रक्त और / या लसीका वाहिकाओं के माध्यम से ओकुलर निकासी तंत्र के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था। लिपोसोम भी स्क्लेरा के माध्यम से फैल सकता है और कोरॉइड द्वारा साफ किया जा सकता है, जो अत्यधिक संवहनी भी है।

लिपोसोम को लिम्बस में धीमी तरीके से साफ किया गया पाया गया था। अस्थायी लिम्बस और बेहतर लिम्बस के लिए, दिन 1 से दिन 3 पोस्ट-इंजेक्शन तक प्रतिदीप्ति संकेतों में परिवर्तन महत्वपूर्ण नहीं थे, यह दर्शाता है कि तटस्थ लिपोसोम में लिम्बस क्षेत्र, विशेष रूप से कॉर्नियल परिधि (चित्रा 5 बी) को प्राथमिकता दी जाती है। लिम्बस क्षेत्र में लिपोसोम ने दिन 3 (d3→7: अस्थायी (पी < 0.01) के लिए -89% और बेहतर के लिए -53% (पी < 0.05)) से साफ करना शुरू कर दिया। दिन 7 तक, 90% से अधिक लिपोसोम को सभी लिम्बस क्षेत्रों (पी < 0.05) से साफ कर दिया गया था, सिवाय बेहतर लिम्बस 1 एस के, जहां 50% लिपोसोम का अभी भी पता लगाया जा सकता है (पी > 0.05)। यह एक संकेत है कि तटस्थ लिपोसोम के लिए निवास का समय अन्य क्षेत्रों की तुलना में बेहतर लिम्बस / कॉर्निया परिधि (चित्रा 5 और चित्रा 6) पर बहुत अधिक है। इंजेक्शन साइट से उनकी दूरी के कारण सभी समय बिंदुओं पर नाक और अवर क्षेत्रों में प्रतिदीप्ति की सबसे कम मात्रा का पता लगाया गया था (चित्रा 6 ए, बी)।

पहले से रिपोर्ट की गई आंखों में लिपोसोम की निकासी के अधिक व्यापक अध्ययनों में, हमने कुछ मार्गों पर चर्चा की है जिसमें लिपोसोम को उप-संयुग्मन इंजेक्शन के बाद ओकुलर ऊतकों से साफ किया जा सकता है। जबकि लिपोसोम को प्रणालीगत परिसंचरण और लसीका निकासी द्वारा कंजंक्टिवा, एपिस्क्लेरा और कोरॉइड के माध्यम से साफ किया जा सकता है, जो अत्यधिक संवहनी होते हैं, वे स्क्लेरा के माध्यम से निष्क्रिय प्रसार द्वारा गहरे इंट्राओकुलर ऊतकों तक भी पहुंच सकते हैं। द्रव प्रवाह भी trabecular meshwork या uveosclera बहिर्वाह है, जो liposomes वापस sclera करने के लिए ला सकते हैं के माध्यम से liposomes परिवहन सकता है. आँसू के माध्यम से उन्मूलन भी संभव है, और इंजेक्शन साइट में मामूली रिसाव निष्क्रिय प्रसार के माध्यम से कॉर्नियल प्रवेश की अनुमति दे सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: आंख में लिपोसोम का उप-संयुग्मन इंजेक्शन। (ए) ग्रीन-फ्लोरोसेंट लिपोसोम और सबकंजंक्टिवल इंजेक्शन का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। (बी) ओकुलर सीएलएम इमेजिंग के लिए एफएल-डीएचपीई डोप्ड लिपोसोमल फॉर्मूलेशन की संरचना और गुण। (सी) ग्रीन-फ्लोरोसेंट लिपोसोम सबकंजंक्टिवल इंजेक्शन पर एक ब्लेब बनाते हैं। इस आंकड़े को चाव एसवाई एट अल.1 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: ओकुलर CLM प्रक्रिया की समयरेखा. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सीएलएम स्कैन के लिए आंखों का नक्शा। क्षेत्र 1 लिम्बस क्षेत्र को संदर्भित करता है, जबकि क्षेत्र 2 स्क्लेरा क्षेत्र को संदर्भित करता है। वीडियो और छवियों को 1T से एक एंटी-क्लॉकवाइज दिशा में लिया गया था, इसके बाद 2T एक समान एंटी-क्लॉकवाइज दिशा में। जैसा कि सुई को 2T से 2S की ओर इंजेक्शन के लिए डाला गया था, ब्याज के क्षेत्र मुख्य रूप से 1T, 1S, 2T और 2S हैं। सम्मिलित करें माउस आंख के सापेक्ष जांच के आकार को दर्शाता है। इस आंकड़े को चाव एसवाई एट अल.1 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: छवि विश्लेषण(ए) फ्लोरोसेंट-टैग किए गए लिपोसोम का इमेजजे विश्लेषण लिम्बस (एल) और स्क्लेरा (एस) (बी) ओकुलर क्षेत्रों के लिए परिभाषित ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) का उपयोग करके किया गया था, जो लिपोसोम उपस्थिति के लिए लिम्बस क्षेत्र में परिमाणित होते हैं। लिम्बस में पाए गए लिपोसोम के संभावित स्थान 1) कॉर्नियल परिधि, 2) लिम्बस या 3) स्क्लेरा परिधि हैं। इस आंकड़े को चाव एसवाई एट अल.1 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: लिम्बस और स्क्लेरा पर कंट्रास्ट वितरण। लिम्बस (1S: सुपीरियर, 1N: Nasal, 1I: Inferior, 1T: Temporal) और sclera (2S: Superior, 2N: Nasal, 2I: Inferior, 2T: Temporal) क्षेत्रों में एक प्रतिनिधि माउस के प्रत्येक कोहोर्ट (n = 4) से एक प्रतिनिधि माउस के क्षेत्रों में (A) Fluorescein (Fl) नियंत्रण के लिए 7 दिनों में, (B) 100 nm neutral liposomes (POPC-100)। लाल रंग ईबी धुंधला इंगित करता है। स्केल बार = 50 μm. (C) ली गई छवियों को बेहतर समझ के लिए आंखों के नक्शे पर इकट्ठा किया जाता है। इस आंकड़े को चाव एसवाई एट अल.1 से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: 100 एनएम तटस्थ POPC liposomes की निकासी कैनेटीक्स 7 दिनों में स्क्लेरा (ए) और लिम्बस (बी) क्षेत्रों में 7 दिनों में (एन = 4 चूहों प्रति समूह)। माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना पिछले समय बिंदु के संबंध में कई तुलनाओं के साथ 2-तरफ़ा एनोवा द्वारा की गई थी; d1→3 और d3→7; * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: माउस आंख के अनुप्रस्थ वर्गों (5 μm) के प्रतिनिधि histology छवियों Fl-DHPE liposomes के एक दिन बाद इंजेक्शन के बाद. बिंदीदार रेखाएं इंगित करती हैं कि लिपोसोम को कहां देखा जा सकता है, जो हरे रंग द्वारा इंगित किया जाता है। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

जैसा कि परिणामों से दिखाया गया है, सीएलएम आंखों में लिपोसोम के ओकुलर वितरण की छवि के लिए एक सरल और व्यवहार्य विधि प्रदान करता है। हमने पहले सीएलएम के उपयोग का प्रदर्शन किया ताकि समय 1 पर माउस आंख के भीतर विभिन्न लिपोसोमल योगों के स्थानीयकरण को चिह्नित किया जा सके। गैर-इनवेसिव अनुप्रयोगों के लिए, सीएलएम पूर्वकाल ओकुलर सतह के वास्तविक समय इमेजिंग की अनुमति देता है ताकि अंतर्दृष्टि के लिए कि एक ही जानवर से आंखों में लिपोसोम कैसे वितरित किए जाते हैं। यह सीएलएम को अधिक व्यापक परिमाणीकरण से पहले प्री-स्क्रीन नैनोकैरियर / डीडीएस के लिए उपयुक्त बनाता है। विविध डीडीएस के अद्वितीय फिजियोकेमिकल गुणों को देखते हुए, पारंपरिक हिस्टोलॉजी द्वारा इसके उप-कम्पार्टमेंट वितरण को चिह्नित करना चुनौतीपूर्ण है। उत्तरार्द्ध को डीडीएस निकासी की समग्र भावना के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पूरी आंख और व्यक्तिगत इमेजिंग वर्गों के संपूर्ण सेक्शनिंग की आवश्यकता होगी।

सीएलएम छवियों (चित्रा 5 बी, सी) के साथ समझौते में, हम कॉर्निया, लिम्बस और आंख के स्क्लेरा क्षेत्रों में हिस्टोलॉजी द्वारा हरे फ्लोरोसेंट संकेतों का निरीक्षण कर सकते हैं, जो लिपोसोम के इंजेक्शन के बाद 1 दिन में एकत्र किए जाते हैं (चित्रा 7)। विशेष रूप से, सीएलएम ने फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी की तुलना में बेहतर संवेदनशीलता दिखाई - स्क्लेरा में लिपोसोम को सीएलएम (चित्रा 5) का उपयोग करके स्पष्ट रूप से पता लगाया जा सकता है, लेकिन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (चित्रा 7) द्वारा मुश्किल से पता लगाया जा सकता है। सिग्नल हानि धोने और सेक्शनिंग प्रक्रियाओं के कारण हो सकती है जो ऊतक वर्गों में लिपोसोम के प्रतिधारण को प्रभावित करती है। यद्यपि सीएलएम सटीक ऊतक परत को इंगित करने में सीमित है जिसमें लिपोसोम जमा होते हैं, यह निश्चित रूप से वास्तविक समय में उम्मीदवार ओकुलर थेरेप्यूटिक्स को गैर-आक्रामक रूप से स्क्रीन और मूल्यांकन करने के लिए एक व्यवहार्य और अपेक्षाकृत सरल तरीका है।

जबकि विवो इमेजिंग सिस्टम और फ्लोरोमीटर जैसे अन्य इमेजिंग सिस्टम भी आंखों में प्रतिदीप्ति के लाइव इमेजिंग या लाइव परिमाणीकरण को सक्षम करते हैं, वे इस अध्ययन के उद्देश्य के लिए उपयुक्त नहीं हैं। विवो इमेजिंग सिस्टम में यह परिभाषित करने के लिए आवश्यक स्थानिक रिज़ॉल्यूशन की पेशकश नहीं करते हैं कि ओकुलर स्पेस में चिकित्सीय कहां हैं। कोई केवल इस बात का विचार प्राप्त कर सकता है कि विवो इमेजिंग सिस्टम 20 में उपयोग करते समय चिकित्सीय अभी भी ओकुलर स्पेस और उनके बायोडिस्ट्रिब्यूशन में मौजूद हैं या नहीं। एक फ्लोरोमीटर आंख के ऑप्टिकल अक्ष के साथ प्रतिदीप्ति के माप की अनुमति देता है और व्यापक रूप से आंख में शारीरिक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। चूंकि हर समय बिंदु पर सटीक एक ही ऑप्टिकल अक्ष को स्कैन करने में कठिनाई होती है, इसलिए एक सुसंगत इमेजिंग स्पॉट बनाए नहीं रखा जा सकता है। यह बहुत महत्वपूर्ण है, खासकर जब दवा वितरण प्रणालियों के वितरण का अध्ययन किया जाता है जिसमें इंजेक्शन साइट से उनके निवास समय और निकासी दर पूरी तरह से अज्ञात हैं। इसके अलावा, इंजेक्शन साइट और subconjunctival इंजेक्शन के लिए अपेक्षित वितरण भी ऑप्टिकल अक्ष की सीमा के भीतर नहीं हैं।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में चित्रा 3 में दिखाए गए आंखों के नक्शे के समान इमेजिंग मानचित्र का सख्ती से पालन करना और स्थानों को सटीक रूप से लेबल करना शामिल है। इमेजिंग स्थान से मिस-लेबलिंग या विचलन के परिणामस्वरूप परिणामों की असंगतता होगी। चूंकि प्रत्येक स्कैन के लिए लेजर तीव्रता को समायोजित किया जा सकता है, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि तीव्रता विभिन्न समय बिंदुओं के परिमाणीकरण के लिए तुलनीय होने के लिए सुसंगत है। यह भी महत्वपूर्ण है कि इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान जांच को मलबे से मुक्त रखा जाए। जैसा कि इमेजिंग करते समय आंखों के बलगम को जांच पर पकड़ा जा सकता है, खारा में जांच को धोने की सिफारिश की जाती है यदि पृष्ठभूमि मान उपयोगकर्ता-परिभाषित मूल्य से ऊपर उठते हैं।

Subconjunctival इंजेक्शन के अलावा, इस CLM प्रणाली में अन्य ओकुलर डिलीवरी मार्गों जैसे कि आंखों की बूंद प्रशासन और इंट्राविट्रल इंजेक्शन (IVT) का अध्ययन करने के लिए भी उपयोग किए जाने की क्षमता है। हालांकि, इमेजिंग गहराई में सीमा के कारण, यह आईवीटी के लिए उतना उपयोगी नहीं हो सकता है यदि इंजेक्शन साइट और गहरे ओकुलर ऊतक ब्याज के मुख्य क्षेत्र हैं। सीएलएम का उपयोग अन्य अंगों या ऊतकों में डीडीएस के वितरण का अध्ययन करने के लिए इंट्रावाइटल इमेजिंग के एक रूप के रूप में भी किया जा सकता है। यद्यपि यह शायद ही कभी डीडीएस वितरण का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया गया है, एंडोस्कोपिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग पीरियडोंटाइटिस 21 के कारण होने वाली सूजन को प्रतिबिंबित करने के लिए किया गया है, फुफ्फुसीय सूजन और संक्रमण 22,23 की निगरानी और ट्यूमर 24 में एंजियोजेनेसिस पर दवाओं के प्रभाव की निगरानी करता है, जो इस सीएलएम प्रणाली के लिए अन्य संभावित अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला का संकेत देता है।

कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल यह पता लगाने के लिए एक स्क्रीनिंग चरण के रूप में काम कर सकता है कि डीडीएस योगों में संशोधन कैसे प्रभावित करते हैं जहां वे रहते हैं या जमा होते हैं, जो डीडीएस के डिजाइन में महत्वपूर्ण हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था (SV को) और सिंगापुर नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ग्रांट AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2 और सिंगापुर के स्वास्थ्य और जैव चिकित्सा विज्ञान (HBMS) उद्योग संरेखण निधि प्री-पोजिशनिंग (IAF-PP) अनुदान H18/01/a0/018 द्वारा भाग में विज्ञान, प्रौद्योगिकी और अनुसंधान एजेंसी द्वारा प्रशासित (A*STAR) (A* STAR) के लिए एजेंसी द्वारा प्रशासित किया गया था। ट्रांसलेशनल और आणविक इमेजिंग (LTMI) के लिए ड्यूक-NUS प्रयोगशाला के सदस्यों को रसद और उपकरणों पर अध्ययन और प्रशिक्षण के निष्पादन की सुविधा के लिए धन्यवाद। सुश्री विस्ना नोवेरा को उनके संपादकीय सहायता के लिए विशेष धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.08 µm polycarbonate filter Whatman, USA 110604
0.22 µm syringe filter Fisherbrand, Ireland 09-720-3
0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution Alcon, Singapore
10 µL Glass Syringe Hamilton, USA 65460-06
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti, USA 850457
32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) Hamilton, USA 7803-04
Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) WPI, USA ATC 2000 & 61800
Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) Mauna Kea Technologies, France Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm
Chloroform Sigma Aldrich, USA 472476
Dumont Tweezers #5, Dumostar WPI, USA 500233 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips
Evans Blue Sigma Aldrich, USA E2129
Fusidic acid eye drop LEO Pharma, Denmark
ImageJ National Institutes of Health, USA https://imagej.nih.gov/ij/
Isoflurane Piramal, USA
Malvern Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical, UK
Methanol Sigma Aldrich, USA 179337
Mini Extruder Avanti, USA 610020
N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) Invitrogen, USA F362
Phosphate Buffered Saline Gibco, USA 10010023
Stereomicroscope System with table clamp stand Olympus, Tokyo, Japan SZ51 & SZ2-STU3

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References

  1. Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
  2. Kuo, J. C. -H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
  3. Wu, Y. -F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
  4. Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
  5. Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
  6. Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
  7. Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
  8. Metselaar, J. M., Storm, G. Liposomes in the treatment of inflammatory disorders. Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).
  9. Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
  10. Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
  11. Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
  12. Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
  13. Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
  14. Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
  15. Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
  16. Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
  17. Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
  18. Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
  19. Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
  20. Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
  21. Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
  22. Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
  23. Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
  24. Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).

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