Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للخلايا الفلكية القشرية لمورين للأنسجة الهندسية الشبيهة بالعصبية

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo

Summary

هنا نحن تقرير طريقة الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد الخلايا الفلكية القشرية مورين للأنسجة الحيوية مثل العصبية لدراسة وظائف الخلايا الفلكية في الجهاز العصبي المركزي والآليات التي تنطوي على الخلايا الدبقية في الأمراض العصبية والعلاجات.

Abstract

الخلايا الفلكية هي خلايا جلبقية لها دور أساسي في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، بما في ذلك دعم الخلايا العصبية ووظائفها. هذه الخلايا تستجيب أيضا للإصابات العصبية وتعمل على حماية الأنسجة من الأحداث التنكسية. الدراسات المختبرية من وظائف الخلايا الفلكية مهمة لتوضيح الآليات المشاركة في مثل هذه الأحداث والمساهمة في تطوير العلاجات لعلاج الاضطرابات العصبية. يصف هذا البروتوكول طريقة لتصنيع بنية أنسجة تشبه العصبية غنية بالخلايا الفلكية عن طريق الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للخلايا الفلكية المحملة بالفينك الحيوي. تم استخدام طابعة بيولوجية ثلاثية الأبعاد تعتمد على البثق في هذا العمل ، وتم استخراج الخلايا الفلكية من قشريات الدماغ C57Bl/6 الفئران. تم إعداد bioink عن طريق خلط الخلايا الفلكية القشرية من ما يصل إلى الممر 3 إلى محلول المواد الحيوية المكون من الجيلاتين والجيلاتين الميثاكريلويل (GelMA) والفيبرينوجين ، المكمل باللامينين ، والذي قدم ظروف الطباعة الحيوية المثلى. قللت ظروف الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد من إجهاد الخلايا ، مما ساهم في البقاء العالي للخلايا الفلكية أثناء العملية ، حيث كان 74.08٪ ± 1.33٪ من الخلايا قابلة للحياة مباشرة بعد الطباعة الحيوية. بعد أسبوع واحد من الحضانة ، زادت صلاحية الخلايا الفلكية بشكل كبير إلى 83.54٪ ± 3.00٪، مما يشير إلى أن البناء ثلاثي الأبعاد يمثل بيئة دقيقة مناسبة لنمو الخلايا. سمح تكوين المادة الحيوية بتعلق الخلية وحفز السلوك الفلكي ، مع الخلايا التي تعبر عن الخلايا الفلكية المحددة علامة البروتين الحمضي الرجفانى الدبقية (GFAP) وامتلاك مورفولوجيا فلكية نموذجية. يوفر هذا البروتوكول القابل للاستنساخ طريقة قيمة لتصنيع الأنسجة ثلاثية الأبعاد الشبيهة بالخلايا العصبية الغنية بالخلايا الفلكية التي تشبه البيئة الدقيقة الأصلية للخلايا ، مفيدة للباحثين الذين يهدفون إلى فهم وظائف الخلايا الفلكية وعلاقتها بالآليات المشاركة في الأمراض العصبية.

Introduction

الخلايا الفلكية هي نوع الخلية الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتلعب دورا رئيسيا في التوازن الدماغي. بالإضافة إلى دعم الخلايا العصبية دائمة, الخلايا الفلكية هي المسؤولة عن تحوير امتصاص الناقلات العصبية, الحفاظ على سلامة حاجز الدم في الدماغ, وتنظيم تولد الخلايا العصبية1,2. الخلايا الفلكية أيضا دورا أساسيا في التهاب الجهاز العصبي المركزي, الاستجابة لإصابات الدماغ في عملية تؤدي إلى التفاعل الفلكي أو astrogliosisالتفاعلية 3,4, تشكيل ندبة الدبقية التي تمنع معرض الأنسجة السليمة للعوامل التنكسية5. ينتج عن هذا الحدث تغييرات في التعبير الجيني للخلايا الفلكية، ومورفولوجيا، ووظيفة6،7. لذلك، تساعد الدراسات التي تنطوي على وظائف الخلايا الفلكية في تطوير العلاجات لعلاج الاضطرابات العصبية.

في المختبر نماذج حاسمة لدراسة الآليات المتعلقة بالإصابات العصبية، وعلى الرغم من العزلة الناجحة والثقافة ثنائية الأبعاد (2D) من الخلايا الفلكية القشرية قد أنشئت8،وهذا النموذج يفشل في توفير بيئة واقعية تحاكي سلوك الخلايا الأصلية وإعادة إنتاج تعقيد الدماغ9 . في حالة 2D، وضعف الدعم الميكانيكية والبيوكيميائية، وانخفاض الخلايا الخلية والتفاعلات مصفوفة الخلية، وتسطيح الخلايا مما يؤدي إلى عدم وجود قطبية القاعدية apical، تؤثر على ديناميات إشارات الخلايا والنتائج التجريبية مما يؤدي إلى تغيير مورفولوجيا الخلايا والتعبير الجيني، والتي تعرض للخطر الاستجابة للعلاجات10. لذلك، من المهم تطوير بدائل توفر بيئة عصبية أكثر واقعية، تهدف إلى ترجمة النتائج إلى العيادة.

ثلاثي الأبعاد (3D) ثقافة الخلية يمثل نموذجا أكثر تقدما أن يلخص مع زيادة ميزات الدقة من الأجهزة والأنسجة, بما في ذلك CNS11. وفيما يتعلق بالثقافة الدبقية، تساهم النماذج ثلاثية الأبعاد في الحفاظ على مورفولوجيا الخلايا الفلكية، والقطبية القاعدية القاعدية للخلايا، وإشارة الخلية12،13. ظهرت تقنية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد كأداة قوية لتصنيع الأنسجة الحية ثلاثية الأبعاد بطريقة خاضعة للرقابة باستخدام الخلايا والمواد الحيوية لإعادة إنشاء بنية وخصائص الأنسجة الأصلية. وقد أدى استخدام هذه التكنولوجيا إلى تحسن كبير في التنبؤ بالنتائج وساهم في الطب التجديدي المطبق على CNS14،15،16.

البروتوكول الموصوف هنا تفاصيل العزلة والثقافة من الخلايا الفلكية القشرية. البروتوكول تفاصيل أيضا طريقة استنساخها للخلايا الفلكية bioprint جزءا لا يتجزأ من الجيلاتين / الجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA) / الفيبرينوجين، تكملها لامينين. في هذا العمل، تم استخدام طابعة بيولوجية تعتمد على البثق لطباعة تكوين المادة الحيوية التي تحتوي على الخلايا الفلكية القشرية بكثافة 1 × 106 خلايا / مل. تم تقليل إجهاد القص الطباعة الحيوية عن طريق التحكم في سرعة الطباعة ، وأظهرت الخلايا الفلكية قابلية عالية للحياة بعد العملية. تم استزراع البنى المطبوعة بيولوجيا لمدة أسبوع واحد ، وتمكنت الخلايا الفلكية من الانتشار والإرفاق والبقاء على قيد الحياة داخل الهيدروجيل ، والحفاظ على مورفولوجيا الفلكية والتعبير عن بروتين حمضي الرجفان الرجفي الرجفي المحدد (GFAP)4.

يتوافق هذا الإجراء مع الطابعات الحيوية القائمة على البثق القائم على المكبس ويمكن استخدامه للطباعة الحيوية للخلايا الفلكية المشتقة من مصادر مختلفة. النموذج المطبوع بيولوجيا ثلاثي الأبعاد المقترح هنا مناسب لمجموعة واسعة من تطبيقات الهندسة العصبية ، مثل دراسات الآليات المشاركة في وظائف الخلايا الفلكية في الأنسجة السليمة وفهم تطور الأمراض العصبية وتطوير العلاج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

اتبعت جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات المبادئ التوجيهية الدولية لاستخدام الحيوانات في الأبحاث (http://www.iclas.org) ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات في أبحاث جامعة ساو باولو الاتحادية (CEUA 2019 / 9292090519).

1. الفئران تشريح الدماغ

  1. نقل 10 مل من محلول الملح البارد هانكس المخزنة (HBSS) إلى طبق ثقافة 100 ملم و 1 مل إلى 1.5 مل ميكروب. إعداد واحد الأنابيب الدقيقة لكل.
    ملاحظة: يجب الاحتفاظ بكل من طبق الثقافة والميكروبيوب على الجليد.
  2. إعداد الخلايا الفلكية ثقافة المتوسطة باستخدام DMEM F12 + 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 2٪ الجلوتامين، و 1٪ البنسلين-ستريبتوميسين (P/S). قم بتعقيم الوسط عن طريق التصفية باستخدام فلتر 0.2 ميكرومتر.
  3. القتل الرحيم C57Bl/6 الفئران الجراء (بعد الولادة اليوم 1) عن طريق قطع الرأس باستخدام مقص التشغيل حادة. باستخدام ملقط، سحب الجلد وفضح الجمجمة. تأكد من تعقيم كل من المقص والمملقط بالإيثانول بنسبة 70٪.
  4. قطع الجمجمة من ماغنوم foramen إلى أعلى الرأس على طول الطائرة القوس باستخدام مقص تلميح منحني حاد.
    ملاحظة: تأكد من عدم تلف النسيج الدماغي.
  5. باستخدام ملعقة تعقيمها سابقا مع الإيثانول 70٪، ورفع الدماغ من تجويف الجمجمة ووضعه في طبق الثقافة التي تحتوي على 10 مل من HBSS الباردة.
  6. وضع طبق الثقافة التي تحتوي على الدماغ تحت مجسم، وباستخدام اثنين من ملقط طرف حاد، وإزالة السحاي من الدماغ(الشكل 1).
  7. فصل القشريات من بقية الدماغ عن طريق المتداول بلطف لهم بعيدا عن الخط المتوسط للدماغ باستخدام ملعقة.
  8. جمع كل من القشريات ونقلها على الفور إلى نفس microtube تحتوي على 1 مل من HBSS الباردة.

2. العزلة الفلكية والثقافة

  1. تحت تدفق صفح، وقطع الأنسجة القشرية إلى قطع صغيرة باستخدام مقص صغير منحني، وغسلها مع 1 مل من HBSS عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 3x. انتظر حتى يستقر النسيج. إزالة HBSS وإضافة HBSS جديدة، وتكرار العملية مرتين أخريين.
  2. إزالة HBSS واحتضان الأنسجة مع 1 مل من 0.05٪ تريبسين في 37 °C لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: هضم التريبسين فقط كافية عند هذه النقطة.
  3. ينفصم ميكانيكيا الأنسجة عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا 15x.
    ملاحظة: يلاحظ التفكك الكامل للأنسجة من خلال زيادة عكر التعليق وعدم وجود شظايا كبيرة من الأنسجة في التعليق.
  4. نقل الحل إلى أنبوب مخروطي 15 مل، تحييد نشاط التربسين بإضافة حجم متساو من FBS، وتصفية الحل في مرشح مصفاة الخلية من 0.4 ميكرومتر لإزالة شظايا غير مفككة.
  5. غسل مرشح مع 1 مل من الخلايا الفلكية المتوسطة، وجمع تعليق الخلية التي مرت من خلال مصفاة، والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز و 25 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي، والتخلص من supernatant وتعليق بيليه في 1 مل من الخلايا الفلكية ثقافة المتوسطة.
  6. نقل تعليق الخلية إلى قارورة الثقافة T25، تشكل حجم المتوسط إلى 3.5 مل، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  7. تأكد من أن بعد 24 ساعة، والخلايا هي المنضمة. ثم، استبدال المتوسط وتغييره كل 3 أيام.
  8. بعد 7 أيام، وإزالة microglia وoligodendrocytes من الثقافة عن طريق غسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1x.
  9. استبدال حل برنامج تلفزيوني مع الخلايا الفلكية ثقافة المتوسطة وترك قارورة الثقافة في شاكر المدارية في 180 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: تشكل الخلايا الفلكية طبقة أحادية التقاء في حوالي 10-12 يوما من الثقافة.

3. توليف الجيلاتين ميثاكريلويل (جيلما)

  1. وزن 10 غرام من الجيلاتين التي تم الحصول عليها من الجلد porcine وتذوب في 100 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق السماح للحل يحرك على لوحة التدفئة في 240 دورة في الدقيقة و 50 درجة مئوية حتى حل كامل.
  2. تحت غطاء محرك السيارة، إضافة 2 مل من أنهيدريد الميثاكرليك (MA) للحصول على درجة منخفضة من الوظيفية، والسماح للمستحلب الجيلاتين اثارة في 240 دورة في الدقيقة و 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    تحذير: بيان مخاطر MA: H302 + H332 (ضار إذا تم ابتلاعه أو استنشاقه)، H311 (سام في ملامسة الجلد)، 314 (يسبب حروق الجلد الشديدة وتلف العين)، 315 (يسبب تهيج الجلد), H317 (قد يسبب رد فعل تحسسي الجلد), H318 (يسبب تلف العين خطيرة), 331 (السامة إذا استنشق), H332 (ضارة إذا استنشق), H335 (قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي). إرشادات المناولة: P261 (تجنب تنفس الغبار / الدخان / الغاز / الضباب / الأبخرة / الرش) ، P305 + P351 + P338 + P310 (IF IN EYES: اشطف بحذر بالماء لعدة دقائق. إزالة العدسات اللاصقة، إذا كانت موجودة وسهلة للقيام. اتصل فورا بمركز السموم / الطبيب)، P301 + P312 + P330 (إذا ابتلع: اتصل بمركز السموم / الطبيب إذا كنت تشعر بتوعك. شطف الفم).
    ملاحظة: إضافة MA ببطء شديد، إسقاط بالإفلات.
  3. تمييع الحل الجيلاتين MA في 100 مل من برنامج تلفزيوني مسخن (50 درجة مئوية) للحصول على 200 مل من الحجم النهائي والسماح للحل يحرك في 240 دورة في الدقيقة و 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. قطع ~ 20 سم من غشاء غسيل الكلى (قطع الجزيئية 12-14 كيلودا) ونقع في الماء deionized حتى يصبح لينة.
    ملاحظة: ملء الأغشية مع الماء deionized للتأكد من عدم وجود ثقوب أو عيوب.
  5. باستخدام قمع، نقل الحل الجيلاتين MA إلى الأغشية.
    ملاحظة: أغلق كلا الجانبين تاركا مساحة إضافية في الداخل للسماح بالخليط.
  6. ضع الأغشية التي تحتوي على محلول الجيلاتين-MA في وعاء يحتوي على 2 لتر من الماء المقطر لغسيل الكلى، مما يسمح لها بالإثارة عند 40 درجة مئوية لمدة 5 أيام (500 دورة في الدقيقة).
    ملاحظة: قم بتغطية الحاوية لتجنب تبخر الماء.
  7. تغيير الماء المقطر مرتين في اليوم. في كل مرة، والوجه الأغشية رأسا على عقب لتحقيق التجانس.
  8. في اليوم الخامس، اخلطي 200 مل من المياه فائقة التسخين (40 درجة مئوية) إلى الجيلاتين-MA الممسخن، واتركيه يحرك لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
  9. نقل الحل الجيلاتين MA إلى أنابيب مخروطية 50 مل تصل إلى 25 مل والسماح للأنابيب تبقى في -80 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
    ملاحظة: تخزين الأنابيب أفقيا لتسهيل lyophilization.
  10. Lyophilize الحلول المجمدة لمدة 3-5 أيام وتخزين GelMA lyophilized المحمية من الرطوبة.

4. إعداد بيوينك

ملاحظة: من أجل الحصول على 1 مل من bioink، فمن المستحسن لتصنيع ما لا يقل عن 3 مل من محلول المواد الحيوية، كما قد يكون هناك خسائر أثناء الترشيح.

  1. إعداد محلول الفيبرينوجين
    1. إعداد محلول ملحي (NaCl 0.9٪) في الماء deionized، وتذوب 10 ملغ من الفيبرينوجين من البلازما البقرية في 1 مل من محلول ملحي للحصول على تركيز 10 ملغم / مل.
      ملاحظة: كما الامتزازات الفيبرينوجين إلى الزجاج، لا تستخدم قوارير الزجاج لإعداد محلول الفيبرينوجين.
    2. اترك الحل تحت الهياج عند 37 درجة مئوية حتى الانحلال الكامل للفيبرينوجين.
      ملاحظة: لحل الفيبرينوجين، استخدم نظام دوار يوضع داخل الفرن عند 37 درجة مئوية. الهياج المغناطيسي (180 دورة في الدقيقة) من الفيبرينوجين على طبق ساخن عند 37 درجة مئوية هو أيضا مناسبة. تحت هذه الحالة، 10 ملغم/مل الفيبرينوجين يستغرق حوالي 40 دقيقة لتذوب.
  2. إعداد الجيلاتين / جيلما الحل
    1. وزن 0.12 غرام من الجيلاتين وإضافته إلى 1.9 مل من برنامج تلفزيوني مسخن (40 درجة مئوية) للحصول على تركيز نهائي من 4٪ (ث / الخامس) الجيلاتين. دوامة لتسهيل حل.
    2. الحفاظ على مستحلب في 40 درجة مئوية حتى حل كامل.
    3. وزن 0.06 غرام من هلام الليوفيلي ونقلها إلى محلول الجيلاتين للحصول على تركيز نهائي من 2٪ (ث / v) GelMA. دوامة لتسهيل حل.
    4. احتفظ بالحل عند 40 درجة مئوية حتى ينحل بالكامل.
  3. إعداد الجيلاتين المحملة بالخلايا الفلكية / GelMA / الفيبرينوجين bioink
    1. ماصة 0.9 مل من محلول الفيبرينوجين 10 ملغم/مل ونقلها إلى محلول الجيلاتين/جيلما للحصول على تركيز نهائي من 3 ملغم/مل من الفيبرينوجين.
    2. وزن 0.015 غرام من الضوئي (PI) ونقلها إلى حل الجيلاتين / GelMA / الفيبرينوجين للحصول على تركيز نهائي من 0.5 ٪ (ث / الخامس) PI. امزج المحلول عن طريق قلب الأنبوب صعودا وهبوطا وإبقائه عند درجة حرارة 40 درجة مئوية محميا من الضوء لتجنب تدهور PI.
      ملاحظة: قم بتخزين المنك الحيوي عند 4 درجات مئوية لمدة أقصاها 24 ساعة.
    3. تحت تدفق صفح، فلتر الحل باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر في أنبوب مخروطي معقم 15 مل.
      ملاحظة: يجب أن يكون محلول المواد الحيوية عند 37-40 درجة مئوية للسماح بالترشيح.
    4. نقل 980 ميكرولتر من محلول المواد الحيوية إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
    5. تمييع صفمين في محلول ملحي للحصول على محلول مخزون من 100 ميكروغرام / مل.
    6. ماصة 20 ميكرولتر من اللامينين ونقلها إلى أنبوب يحتوي على bioink للحصول على تركيز نهائي من 2 ميكروغرام / مل صفمين.
    7. مزيج بلطف عن طريق pipetting صعودا وهبوطا، وتجنب فقاعات. إذا استمرت أي فقاعات، طرد مركزي أنبوب مخروطي في 200 × ز لمدة 2 دقيقة. حافظ على نسبة 37 درجة مئوية حتى يتم خلطها مع الخلايا.
    8. جرب الخلايا الفلكية الأولية مع 0.05٪ تريبسين لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: استخدام الخلايا الفلكية من المقاطع 1 إلى 3.
    9. تحييد نشاط التريبسين مع FBS بنسبة 1:1 ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
    10. عد الخلايا ونقل 1 × 106 خلايا إلى أنبوب مخروطي مختلف. الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
    11. إزالة supernatant ترك حجم صغير (~ 200 ميكرولتر) لتعليق بيليه الخلية، عن طريق التنصت بلطف الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي.
    12. نقل 1 مل من الجيلاتين / GelMA / الفيبرينوجين حل للأنبوب الذي يحتوي على الخلايا وماصة بلطف صعودا وهبوطا لتجانس، والحصول على تركيز النهائي من 1 × 106 خلايا / مل.

5. إعداد الحل عبر الوصلات

  1. إعادة تشكيل ثروبين
    1. إعداد محلول الأسهم من thrombin 100 U/mL في الماء deionized العقيمة مع 0.1٪ (ث / v) ألبوم مصل البقر (BSA) في أنبوب مخروطي 15 مل. المخزون في الأنابيب الصغيرة عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: كما الموازات thrombin إلى الزجاج، لا تستخدم قوارير الزجاج لإعداد حل الأسهم أو تخزين aliquots.
  2. إعداد حل ثروبين-كاكل2
    1. ماصة 100 ميكرولتر من محلول مخزون الثرومبين ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل يحتوي على 8.9 مل من الماء deionized العقيمة للحصول على تركيز نهائي من 1 U / مل thrombin.
    2. إعداد محلول CaCl2 بنسبة 10٪ (ث/v) في الماء الم ديونيز وتعقيم باستخدام فلتر 0.2 ميكرومتر.
    3. نقل 1.1 مل من محلول CaCl2 10٪ إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على الثرومبين ، من أجل الحصول على نسبة نهائية من 1:9 (CaCl2 إلى thrombin).
      ملاحظة: تحضير الحل crosslinker في وحدة التخزين لاستخدامها في التجربة، تجنب التخزين.

6. Bioprinting الخلايا الفلكية محملة bioink باستخدام الطابعة الحيوية القائمة على البثق

  1. تصميم الأنسجة العصبية
    1. باستخدام G-code: إنشاء شبكة من 6 × 6 مم (شكل مربع) مع 1 مم من المسافة بين كل خط مطبوع بيولوجيا على المحورين X و Y، و 6 طبقات على المحور Z (0.2 مم بين كل خط)؛ تعيين البثق (E) إلى 0.01 مم، وزيادة 0.001 مم في كل طبقة جديدة من المحور Z؛ وتعيين سرعة الطباعة (F) إلى 400 ملم / دقيقة (معلومات تكميلية).
  2. إعداد الطابعة الحيوية
    1. تعريض الجهاز للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة، ومن ثم مسح عليه مع الإيثانول 70٪.
    2. قم بتشغيل الطابعة الحيوية باستخدام مفتاح الطاقة. قم بتوصيل الجهاز بالكمبيوتر من خلال كابل USB. افتح برنامج التحكم لتوصيله بالطباعة الحيوية وتحميل تصميم الملف.
  3. إعداد حقنة الطباعة الحيوية
    1. نقل الجيلاتين المحملة الخلايا الفلكية / GelMA / الفيبرينوجين bioink إلى حقنة بلاستيكية 5 مل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
      ملاحظة: نقل ببطء لتجنب تشكيل فقاعة.
    2. قم بتوصيل إبرة معقمة 22 G حادة إلى الحقنة.
      ملاحظة: اترك الحقنة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة دقيقتين.
    3. قم بتوصيل المحقنة برأس الطباعة البيولوجية وامسح يدويا المنك الحيوي لإزالة الفقاعات المتبقية.
  4. الطباعة الحيوية
    ملاحظة: تم إجراء الطباعة الحيوية خارج غطاء محرك السيارة.
    1. ضع طبق ثقافة 35 مم على طاولة الطابعة الحيوية وضع الإبرة 0.1 مم بعيدا عن سطح طبق الثقافة للسماح حركة الإبرة.
      ملاحظة: استخدم طبق ثقافة واحد مقاس 35 مم لكل بصمة بيولوجية.
    2. اضغط على الزر طباعة.
    3. بمجرد الطباعة الحيوية ، تأكد من أن الحقنة تبتعد عن الطبق. ثم أغلق طبق الثقافة واستعد لعملية الربط المتبادل.
      ملاحظة: الطباعة الحيوية لبناء واحد يستغرق حوالي 1 دقيقة و 10 ق.
  5. الربط بين البناء والثقافة المطبوعة بيولوجيا
    1. ضع طبق الثقافة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية على 2 كيلوواط / سم2 ل2 × 60 ثانية (صعودا وهبوطا) لGelMA crosslinking.
    2. تحت تدفق الصفيحة ، قم بنقل البناء المطبوع بيولوجيا إلى لوحة من 24 بئرا باستخدام ملعقة معقمة.
    3. إضافة 500 ميكرولتر من حل thrombin / CaCl2 وترك لمدة 30 دقيقة للسماح للربط المتبادل الفيبرين.
    4. إزالة الحل crosslinking وغسل بناء مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1x. ثم، استبدال برنامج تلفزيوني مع 1 مل من الخلايا الفلكية ثقافة المتوسطة واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. تغيير المتوسطة كل 3 أيام.

7. تقييم قابلية الخلايا الفلكية للحياة

  1. صلاحية الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا
    1. نقل البناء المطبوع بيولوجيا إلى طبق ثقافة 35 ملم باستخدام ملعقة.
    2. غسل بناء مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x.
    3. إيداع 100 ميكرولتر من الكاشف الحي / الميت على البناء وإبقائه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، مما يبقيه محميا من الضوء.
    4. إزالة كاشف لايف / الميت وغسل بناء مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x.
    5. نقل العينة إلى طبق confocal باستخدام ملعقة، ومراقبة الخلايا داخل بناء تحت المجهر confocal باستخدام 488 و 570 نانومتر الإثارة للحصول على الصور.
      ملاحظة: استخدام تكبير 10x لتصور الكلي للخلايا داخل البناء.
    6. تأكد من أن العينة مسطحة. إذا لزم الأمر، ضع غطاء فوق العينة لزيادة التسطيح.
      ملاحظة: أثناء التصوير، تأكد من أن طبق الكونفوجكال مغلق جيدا لمنع العينة من الجفاف.
    7. حساب عدد قابلة للحياة (الأخضر) والميت (الأحمر) باستخدام برنامج حسابي.
  2. صلاحية ثقافة الخلايا الفلكية 2D
    1. البذور 0.5 × 106 الخلايا الفلكية (مرور 1-3) في طبق confocal 35 ملم، إضافة الخلايا الفلكية المتوسطة، واحتضانها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    2. عندما تكون الخلايا التقاء، وإزالة المتوسطة الثقافة ويغسل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x.
    3. إيداع 200 ميكرولتر من الكاشف الحي / الميت، والحفاظ على الطبق في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، محمية من الضوء.
    4. إزالة كاشف لايف / الميت وغسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x.
    5. خذ الطبق إلى مجهر كونفوجال إلى جانب كاميرا رقمية ، واستخدم 488 و 570 نانومتر من الإثارة للحصول على الصورة.
    6. حساب عدد قابلة للحياة (الأخضر) والميت (الأحمر) باستخدام برنامج حسابي.

8. الاحتواء المناعي للخلايا الفلكية

  1. بروتين حمضي الرجفان الدبقية (GFAP) تلطيخ الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد
    ملاحظة: للتحقيق في وجود علامات الخلية الأخرى تغيير الأجسام المضادة الأساسية وفقا لذلك.
    1. إزالة المتوسطة من البئر وغسل بناء مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 3x.
    2. إضافة 4٪ paraformaldehyde (PFA) في برنامج تلفزيوني إلى البئر حتى يتم تغطية البناء بالكامل وتركه لمدة 2 ساعة في 4 درجة مئوية.
    3. إزالة PFA وغسل بناء مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 3x.
      ملاحظة: يمكن إيقاف هذا الإجراء مؤقتا لعدة أشهر إذا تم تخزينه عند 4 درجات مئوية في PBS. تأكد من أن لوحة البئر مختومة لتجنب تبخر PBS.
    4. علاج العينة مع الجليسين 0.1 مول / لتر لمدة 5 دقائق.
    5. غسل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x لمدة 5 دقائق.
    6. Permeabilize العينة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 و 10٪ FBS لمدة 1 ساعة في 25 درجة مئوية تحت التحريض المداري.
    7. احتضان بناء مع الدجاج المضادة GFAP (تخفيف الأجسام المضادة الأولية 1:500) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    8. يستنشق الأجسام المضادة الأساسية ويغسل العينة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، 3 مرات.
      ملاحظة: يمكن إعادة استخدام الأجسام المضادة الأساسية لعدة مرات عند تخزينها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    9. احتضان العينة مع اليكسا فلور 488-اقتران المضادة للدجاج (تخفيف الأجسام المضادة الثانوية 1:500) و 1 ميكروغرام / مل DAPI لمدة 1 ساعة في 25 درجة مئوية تحت التحريض المداري.
      ملاحظة: الاحتفاظ العينة محمية من الضوء.
    10. غسل العينة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، 3 مرات.
    11. نقل البناء إلى طبق confocal 35 ملم.
      ملاحظة: تأكد من أن الطبق مغلق جيدا لمنع العينة من الجفاف.
  2. بروتين حمضي الرجفان الدبقية (GFAP) تلطيخ ثقافة الخلايا الفلكية 2D
    1. البذور 0.5 × 106 الخلايا الفلكية (مرور 1-3) في طبق confocal 35 ملم، إضافة الخلايا الفلكية المتوسطة، واحتضانها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    2. عندما تكون الخلايا التقاء، وإزالة المتوسطة الثقافة وغسلها مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1x.
    3. كرر الخطوات 8.1.2-8.1.10.
  3. هيكل الخلايا الفلكية تلطيخ
    1. كرر الخطوات 8.1.1-8.1.6.
    2. إضافة 200 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل من محلول phalloidin الفلورسنت المترافق في برنامج تلفزيوني و 1 ميكروغرام / مل من DAPI على البناء.
    3. احتضان لمدة ساعة واحدة في 25 درجة مئوية تحت الهياج المداري، والحفاظ على العينة محمية من الضوء.
    4. غسل العينة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق 3 مرات، ونقل بناء إلى طبق confocal باستخدام ملعقة.
      ملاحظة: تأكد من أن الطبق مغلق جيدا لمنع العينة من الجفاف.

9. التصوير الكونفوجال

  1. خذ الأطباق إلى مجهر كونفوجال إلى جانب كاميرا رقمية للتصوير (359 و 488 و 570 نانومتر من الإثارة).
  2. استخدم تكبير 10x للتصور الكلي و40 أو 63x للصور التكبير من الخلايا.
    ملاحظة: تأكد من أن العينة يجلس مسطح. إذا لزم الأمر، ضع غطاء فوق العينة لزيادة التسطيح.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يهدف هذا العمل إلى تطوير نسيج يشبه العصبية باستخدام تقنية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لإيداع الجيلاتين /GelMA/fibrinogen bioink الأولي المشحون بالخلايا الفلكية طبقة بطبقة. تم استخراج الخلايا الفلكية وعزلها عن قشرة الدماغ من جراء الفئران (الشكل 1) ، إضافة إلى تكوين المواد الحيوية ، مما يسمح با الصنع الحيوي لبناء 3D حية.

تم تطوير التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) باستخدام G-code(ملف تكميلي)ك إطار مترابط من الشكل المربع (0.6 × 0.6 مم) ، مع مسام 1 مم ، تهدف إلى تسهيل نشر العناصر الغذائية والأوكسجين. كان الإطار يتكون من 6 طبقات وضعت فوق بعضها البعض، وتغيير بزاوية 90 درجة في كل طبقة(الشكل 2A i). يمتلك الهيكل المصمم حوالي 5 مم من الارتفاع(الشكل 2A II)، مما يسمح بمعالجة الأنسجة. كما سمح تكوين bioink تصنيع البنى من أشكال مختلفة (الشكل 2B).

إعداد bioink تتألف من الجيلاتين، جيلما، وفيبرينوجين تتألف خطوتين عبر الوصلات. أولا، تم ربط GelMA تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية، حيث تتشكل الروابط التساهمية بين و وداخل الجزيئية، تليها الربط المتبادل الفيبرين. في هذه الخطوة، thrombin انزيميا يشق سلاسل الفيبرينوجين، مما أدى إلى تشكيل ألياف الفيبرين17،رد فعل استقرت من قبل Ca2 + الأيونات18. ثم، ألياف غيلما وفيبرين تشكل شبكة البوليمر المتشابكة مستقرة (IPN) تستكمل مع صفمين، ودعم مناسب لمرفق الخلية وانتشار19،20 (الشكل 2C).

قبل الطباعة الحيوية ، وبعد 12 يوما من العزلة ، تميزت الخلايا الفلكية بوجود GFAP ، وهو مكون بروتيني من خيوط الخلايا الفلكية الوسيطة4 (الشكل 3A). ثم، تم خلط الخلايا الفلكية المتجربة مع محلول الجيلاتين/جيلما/الفيبرينوجين بكثافة 1 × 106 خلايا/مل، مما أدى إلى توليد دينك حيوي محمل بالخلايا الفلكية. تم نقل bioink إلى حقنة 5 مل متصلة بإبرة حادة 22 G ، تتألف من رأس الطباعة الحيوية(الشكل 3B i). سمحت الإبرة للقذف bioink دون انسداد ومنع الإجهاد القص عالية للخلايا.

نظرا لخصائص viscoelastic من الجيلاتين، الذي يتصرف كسائل في درجات حرارة أعلى وهلام في درجات حرارة أقل21،وبناء مطبوع بيولوجيا الاحتفاظ الإخلاص الشكل(الشكل 3B ii). بعد الطباعة البيولوجية لطبقتين متتاليتين من البيوينك ، لوحظ تشكيل بنية محددة جيدا(الشكل 3C)، مع وجود خلايا عالقة داخل المادة الحيوية.

بعد الطباعة الحيوية وعمليات الربط المتبادل ، تم احتضان البناء مع وسيطة الخلايا الفلكية ، وبعد يوم واحد من الطباعة الحيوية ، لا تزال معظم الخلايا تقدم مورفولوجيا مستديرة(الشكل 3D). حافظت السقالات المطبوعة بيولوجيا على سلامتها بعد 7 أيام من الحضانة ، وعلى الرغم من ملاحظة بعض الخلايا المستديرة ، انتشر عدد كبير من الخلايا الفلكية في جميع أنحاء البناء ، مما يعرض مورفولوجيا الخلايا الفلكية والترابط(الشكل 3E).

لأن معلمات الطباعة الحيوية، مثل السرعة، يمكن أن تؤثر بشكل مباشر على صلاحية الخلية، تم اختبار سرعات الطباعة الحيوية المختلفة (400 و 600 و 800 مم / دقيقة) وتقييم بقاء الخلايا الفلكية باستخدام المقايسة الحية / الميتة مع calcein-AM (الخلايا الحية، الفلورية الخضراء) وethidium homodimer-III (EthD-II) (الخلايا الميتة، الفلورية الحمراء). تم قياس النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة باستخدام برنامج حسابي، عن طريق حساب عدد الخلايا الحية والميتة. تم تقييم صلاحية الخلية في الوقت 0 (مباشرة بعد الطباعة الحيوية) ، وأظهرت النتائج أنه في سرعة أقل ، 400 ملم/دقيقة، مثلت الخلايا القابلة للحياة 74.08٪ ± 1.33٪ من إجمالي الخلايا، كونها أعلى بكثير من الخلايا المطبوعة بيولوجيا عند 600 و800 ملم/دقيقة (60.25٪ ± 1.93٪ و62.94 ± 6.18٪، على التوالي)(الشكل 4A). لذلك، تم استخدام سرعة 400 ملم / دقيقة في هذا العمل.

قبل الطباعة الحيوية ، كانت الخلايا الفلكية المستزرعة 2D توصف بأنها النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة ، وتم تطبيع صلاحية الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا إلى هذه الحالة. وأظهرت النتائج أن الثقافة 2D قدمت 90.98٪ ± 0.94٪ من الخلايا القابلة للحياة. وكانت صلاحية الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا (اليوم السابع) 83.54٪ ± 3.00٪، وهو ما يمثل 0.92 ± 0.03 من القيمة 2D، والتي كانت أعلى بكثير من تلك التي كانت في اليوم 0 (0.81 ± 0.01)(الشكل 4B). يتم عرض صور الخلايا الفلكية الملطخة بالكاشف الحي / الميت في الشكل 4C، وتظهر أنه بعد الطباعة الحيوية ، تمتلك الخلايا مورفولوجيا مستديرة(الشكل 4C i). بعد أسبوع واحد من الحضانة ، انتشرت الخلايا الفلكية في جميع أنحاء البناء(الشكل 4C ii)، مما يدل على مورفولوجيا متميزة للخلايا من الثقافة 2D (الشكل 4C iii).

كانت الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا ملطخة لإظهار كثافة الخلايا ومورفولوجيا الخلايا داخل البناء. الشكل 5أ يظهر بناء مطبوع بيولوجيا بعد 7 أيام من الحضانة، مع كثافة عالية من الخلايا الفلكية ملطخة phalloidin، صبغة الهيكل الخلوي F-actin. على الرغم من ملاحظة عدد قليل من الخلايا المستديرة ، قدمت الخلايا الفلكية بشكل رئيسي مورفولوجيا تشبه النجوم. وأظهرت الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا أن تكون إيجابية GFAP عندما ملطخة بعد 7 أيام من الطباعة الحيوية، مما يدل على أن الخلايا حافظت على النمط الظاهري الفلكية(الشكل 5B i). الشكل 5B الثاني و 5B الثالث تظهر الصور Z مكدسة من الخلايا الفلكية GFAP + مطبوعة بيولوجيا داخل البناء. وتشير هذه النتائج إلى أن تكوين دينك الحيوي وفر بيئة دقيقة متوافقة بيولوجيا لتعزيز التصاق الخلايا الفلكية وانتشارها ونموها.

Figure 1
الشكل 1: استخراج فصل الدماغ والقشرة لثقافة الخلايا الفلكية الأولية. تم عزل الخلايا الفلكية الأولية من قشرة الجراء الفئران C57Bl/6 '(بعد الولادة اليوم 1) الدماغ. بعد استخراج الدماغ من الحيوان ، تمت إزالة السحاي تحت المجهر ، وفصل القشرة تليها هضم الأنسجة وثقافة الخلايا الفلكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2:رسم تخطيطي لعملية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد. (أ) ملف كندي مصممة للطباعة الحيوية 3D من الأنسجة العصبية تظهر (1) 2 طبقات، عرض أعلى، و (2) 6 طبقات، عرض الجانب، من بناء. (ب) صور تظهر قدرة البيوينك على طباعة هياكل مختلفة الأشكال (i) مربع ، (ii) شعري ، و (iii) نجمة. (ج)مخطط المواد الحيوية عبرالربط بعد 3D الطباعة الحيوية تظهر، حيث يتم ربط GelMA تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية تليها الربط المتبادل الفيبرين في thrombin:Ca2 + حمام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: 3D boprinting من الجيلاتين المحملة الخلايا الفلكية / GelMA / الفيبرينوجين bioink. (أ) توصيف الخلايا الفلكية بعد 12 يوما من العزلة والثقافة، ملطخة لGFAP، الأخضر وDAPI، الأزرق. (ب) (i) إعداد رأس الطباعة و (ii) 3D بناء مطبوعة بيولوجيا مباشرة بعد الطباعة الحيوية. (ب) بناء من طبقتين يظهر الإطار المطبوع بيولوجيا. تكبير 4x. (C) صورة للخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا بعد يوم واحد من الطباعة الحيوية ، والتي تظهر الخلايا في مورفولوجيا مستديرة. (د) صورة للخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا بعد 7 أيام من عملية الطباعة الحيوية ، والتي تظهر الخلايا ذات المورفولوجيا الفلكية مع عدد قليل من الخلايا المستديرة ، مما يشير إلى تقاربها مع الأنسجة المحاكاة. تكبير 10x. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4:تقييم صلاحية الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا. (أ) صلاحية الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا بسرعات مختلفة. (ب)صلاحية الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا في(1)اليوم 0 (مباشرة بعد الطباعة الحيوية) و(2)بعد 7 أيام من الطباعة الحيوية ، تطبيعها إلى صلاحية الخلايا الفلكية في الثقافة ثنائية الأبعاد. التحليل الإحصائي عن طريق أنوفا اتجاه واحد مع اختبار Tukey، ن = 3، *ص < 0.05. (ج) صور الفلورسنت من الخلايا الفلكية ملطخة لايف / الميت كاشف. الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا في (1) اليوم 0 (مباشرة بعد الطباعة الحيوية)،(2)اليوم 7، و (3) ثقافة 2D من الخلايا الفلكية. تكبير 10x. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5:توصيف الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا ثلاثية الأبعاد. immunofluorescence من الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا 3D بعد 7 أيام من الحضانة ملطخة ل (أ) F-actin (phalloidin, الأحمر) والنوى (DAPI، الأزرق) مع تكبير 10x و 40x و ل (B) GFAP، الأخضر (i) مع تكبير 10x، (ii) Z مكدسة تظهر محور X-Y-Z للبناء المطبوع بيولوجيا، و (3) صورة تظهر محور X-Z من GFAP + astrocytes. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف تكميلي. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ظهرت تقنية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد كبديل ل الصنع الحيوي يسمح بهندسة البنى المكررة التي تشبه هيكليا وفسيولوجيا الأنسجة الأصلية22، بما في ذلك الدماغ23. يسمح التصنيع الحيوي للأنسجة الشبيهة بالعصبية بنمذجة البيئة الدقيقة الأصلية في المختبر ، كونها أداة مهمة لفهم الآليات الخلوية والجزيئية المرتبطة بتطوير وعلاج العديد من الأمراض التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي11. نظرا للدور الهام للخلايا الدبقية في الوظائف العصبية ، تم استخدام الخلايا الفلكية القشرية في العديد من الدراسات ، مثل نمو الدماغ24، الجزيئات الحيوية تنقل25، نمو نيوريت26، وفي التصنيع الحيوي للأنسجة الشبيهة بالدماغ14.

تم الإبلاغ عن طرق هندسة الثقافة ثلاثية الأبعاد للخلايا الفلكية سابقا ، باستخدام المواد الحيوية وتقنيات السقالات المختلفة27و28و29. وبالمثل، تم الإبلاغ أيضا عن طريقة للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة للإنسان (hiPSCs) المشتقة من المجاميع العصبية، وأظهرت قدرة هذه الخلايا المطبوعة بيولوجيا على التفريق والنضج في المختبر30. ومع ذلك ، لا توجد تقارير عن طرق ل الصنع الحيوي للخلايا الفلكية ثلاثية الأبعاد البريوبرينت في الأدبيات. ثم، يهدف هذا البروتوكول إلى وصف طريقة قابلة للاستنساخ للخلايا الفلكية القشرية ثلاثية الأبعاد.

في هذا البروتوكول ، تم عزل الخلايا الفلكية من القشريات الدماغية لجراء الفئران C57Bl /6 ، وهو نموذج حيواني يستخدم على نطاق واسع في البحث31،32، والذي يمكن استبداله بالخلايا الفلكية المستمدة من مصادر أخرى ، مثل hiPSCs والحبل الشوكي. بعد العزلة والثقافة والثقافة الفرعية ، تبقى الخلايا الفلكية في حالة انتشار حتى الممر 3 ، وهو العدد الأقصى من التقسيم الموصى به بسبب قيودها الجوهرية على الانتشار8. تم التحقق من أن انتشار الخلايا الفلكية من الممر 4 كان محدودا ، حيث يصعب تحقيق الكمية المطلوبة من الخلايا للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد.

وفي الطريقة الموصوفة، استخدم تركيز قدره 1.0 × 106 خلايا/مل من محلول المواد الحيوية، كدليل على المفهوم لتقييم قدرة الخلايا على البقاء على قيد الحياة في عملية الطباعة البيولوجية والحفاظ على قدرتها على البقاء وخصائصها الجوهرية أثناء الثقافة داخل الهيدروجيل. في العمل السابق ، تم تصنيع نسيج ثلاثي الأبعاد يشبه العصبية المطبوعة بيولوجيا عن طريق زراعة الخلايا الفلكية والخلايا العصبية ، ولزيادة التفاعل الخلوي ، كان تركيز الخلايا الفلكية 8.0 × 106 خلايا / مل14. ثم، قد يكون الأمثل تركيز الخلايا لدراسات محددة.

ويتكون bioink للطباعة الحيوية 3D من الخلايا والمواد الحيوية أو مزيج من المواد الحيوية33. في هذا البروتوكول، تم استخدام مزيج من الجيلاتين / GelMA / الفيبرينوجين، والتي أظهرت أن تكون مواتية للطباعة الحيوية والحفاظ على كل من الخلايا الفلكية في الثقافة. إن إنتاج دينك حيوي قابل للطباعة الحيوية يمثل تحديا عند استخدام تقنية الطباعة الحيوية القائمة على البثق. يجب أن يمتلك تكوين المادة الحيوية خصائص لزجة تسمح ، في الوقت نفسه ، بقذف البيوينك ، مع الاحتفاظ بالشكل ثلاثي الأبعاد بعد عملية الطباعة34. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تكون قادرة على الحفاظ على صلاحية الخلية خلال هذه العملية، والتي اعتمادا على ظروف الطباعة الحيوية، يمكن أن يسبب إجهاد القص للخلايا مما يؤدي إلى وفاة35.

تم ضمان الطباعة الحيوية من قبل الجيلاتين ، وهي مادة بيولوجية تمتلك خصائص لزجة مثالية بسبب قدرتها الانتقالية سول جل36. وهذا يسمح الجزيئات الكلية الجيلاتين لإعادة ترتيب وتتصرف كسائل أثناء البثق، وهلام بعد الطباعة الحيوية، والحفاظ على هيكل 3D. وبالإضافة إلى ذلك، باعتبارها مشتق الكولاجين، ويتكون الجيلاتين من الجليسين الأمينية الببتيد ثلاثي التكرار، والتي تضمن خصوصية الخلية21. ومع ذلك ، فإن الروابط داخل و بين الجزيئيات من الجيلاتين ضعيفة ، وبسبب قابليتها للحرارة ، فإن الجيلاتين ليس لديه استقرار عند 37 درجة مئوية ، يتم إطلاقه من البناء أثناء زراعة الخلايا. لذلك ، أصبح GelMA بديلا كماء مستقر ، نظرا للروابط التساهمية التي تشكلت بعد معرض ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، والحفاظ على خصائص خصوصية الخلية19. يمكن ضبط الخصائص الفيزيائية ل GelMA ، مثل المسامية والتدهور ومعامل مرن لتناسب تطبيقات هندسة الأنسجة المختلفة19. يمكن التحكم في صلابة سقالات GelMA عن طريق تغيير استبدال الميثاكريلويل37، مما يسمح بتحقيق تصلب مماثل لتلك الموجودة في الأنسجة التي سيتم تصميمها على غرار. وهذا هو، من خلال خفض درجة الوظيفية، ويمكن تحقيق صلابة أقل37. لذلك ، نظرا لنعومة دماغ الماوس38،39 والتأثير المباشر لتيبس المصفوفة خارج الخلية (ECM) على سلوك الخلية40، في هذا البروتوكول تم اقتراح درجة منخفضة من وظيفية الجيلاتين. في الأعمال السابقة، تم الإبلاغ عن قدرة الجيلما هيدروجيلس على تقليد الميزات الفيزيائية CNS، مما يدل على ملاءمة عالية لزراعة الخلايا الفلكية والخلايا العصبية والخلايا الجذعية العصبية14،41،42.

وإلى جانب GelMA، الفيبرينوجين، وهو البوليمر الحيوي الأصلي الذي يشكل ألياف الفيبرين من خلال رد الفعل الأنزيمي، كما تم استخدامها على نطاق واسع لتصنيع الأنسجة العصبية مثل الحيوية، مما يدل على خصوصية عالية وتقديم بيئة دقيقة مناسبة للخلايا العصبية لإرفاق وتنمو30،43،44. وقد استخدمت المواد الحيوية الأخرى، مثل الألجينات والشيتوزان لطباعة الأنسجة العصبية مثل بيولوجيا، مختلطة إلى الجيلاتين، جيلما، و / أو الفيبرينوجين، تهدف إلى تحسين قابلية الطباعة والخصائص الفيزيائية للسقالات 3D14،30. في الطريقة الحالية، تم تحقيق الطباعة الحيوية المثلى، والاستقرار المادي، وخصوصية الخلية باستخدام الجيلاتين، جيلما، وفيبرينوجين كمكونات للبيوينك. من أجل زيادة التعرف على الخلايا الفلكية إلى البيئة الدقيقة، تم استخدام اللامينين-أحد مكونات ECM الدماغ-لتكملة bioink.

في هذا البروتوكول، تم استخدام الجيلاتين بتركيز 4٪ (ث / v)، مما سمح بانتقال سول جل من bioink في 25 درجة مئوية في غضون 10 دقيقة تقريبا. ويمكن تحقيق الجيلاتين أسرع عن طريق زيادة تركيز الجيلاتين. ومع ذلك، يمكن اختراق التعقيم عن طريق الترشيح باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر. الترشيح bioink هو خطوة حاسمة، والتحقق من أن تركيزات أعلى من الجيلاتين (>5٪ ث / الخامس) قد تمنع الترشيح. البديل لتحقيق أسرع نقطة هلام أثناء الطباعة الحيوية هو ترك المحقنة التي تحتوي على bioink في 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة قبل ربطه في printhead الطباعة الحيوية. بعد الطباعة الحيوية ، من المهم الحفاظ على البناء عند 25 درجة مئوية لتجنب زعزعة استقرار الهيكل ثلاثي الأبعاد والحفاظ على حالة هلامية قبل معرض الأشعة فوق البنفسجية. وتجدر الإشارة إلى أن البناء يجب أن يكون صلبا عند إضافة محلول اللينك المتقاطع الفيبرينوجين إلى اللوحة. بالنسبة إلى الربط المتبادل من GelMA ، من المهم قلب العينة (2 × 60 ق لكل جانب) لضمان عرض الأشعة فوق البنفسجية في جميع أنحاء البناء. بالنسبة للربط العرضي للفيبرينوجين ، يجب أن يغطي حل الوصلة المتقاطعة البناء تماما. لذلك، إذا كنت تستخدم طبق أو طبق أكبر، يجب تعديل مستوى الصوت. بعد الربط المتبادل ، يجب أن تبدو الهيدروجيل متجانسة تحت المجهر التباين المرحلة وينبغي توزيع الخلايا بشكل متجانس في جميع أنحاء البناء ، وامتلاك مورفولوجيا مستديرة.

سمح هذا البروتوكول للجيلاماتين / GelMA / الفيبرينوجين bioink لطباعة هياكل من أشكال مختلفة ، والحفاظ على سلامة وشكل 3D من البنى. نظرا للقيود المفروضة على درجة الحرارة لتصل إلى 25 درجة مئوية داخل تدفق صفح، تم إجراء الطباعة الحيوية في غرفة الثقافة خارج تدفق صفح. وكان وقت الطباعة البيولوجية حوالي دقيقة واحدة لكل عينة، ولم يلاحظ أي تلوث أثناء زراعة الخلايا.

يمكن أن تتأثر سلامة الخلية عن طريق الطباعة الحيوية ، وذلك بسبب إجهاد القص الناجم في العملية35. ويمكن التحكم في ذلك من خلال تحسين معلمات الطباعة، مثل سرعة الطباعة. في هذا العمل، تم اختبار سرعات طباعة بيولوجية مختلفة، 400 و600 و800 مم/دقيقة، مما لوحظ انخفاضا كبيرا في صلاحية الخلية عندما زادت السرعة من 400 إلى 600 ملم/دقيقة. في 400 ملم / دقيقة، حوالي 74٪ من الخلايا ظلت قابلة للحياة بعد الطباعة الحيوية، وهذه القيمة زادت بشكل كبير بعد 7 أيام من الحضانة (>80٪). لذلك ، لم يتم استخدام سرعات أقل من أجل تجنب العرض المفرط للخلايا على البيئة. أظهرت الثقافة 2D من الخلايا الفلكية أعلى قابلية للحياة (~ 90٪) بالمقارنة مع الخلايا المطبوعة بيولوجيا. ومع ذلك ، كما هو مبين في الصور الفلورية ، يتأثر مورفولوجيا بنوع الثقافة. في حين أن الخلايا 2D كانت مسطحة ، تمتلك الخلايا الفلكية في بيئة ثلاثية الأبعاد شكلا يشبه النجوم ، وتتواصل مع بعضها البعض من خلال العمليات الخلوية.

وتجدر الإشارة إلى أن البيئة الدقيقة المحاكاة كانت مواتية لثقافة الخلايا الفلكية القشرية ، حيث زادت صلاحية الخلية بشكل كبير بعد أسبوع واحد ، مما يشير إلى انتشار الخلايا داخل البناء. تمت إضافة لامينين ، وهو بروتين جليكوبروتين موجود في الدماغ ECM ، إلى bioink بهدف تحقيق التزام أعلى من الخلايا الفلكية إلى هيدروجيل14. وأظهرت تلطيخ الهيكل الخلوي F-actin أن الخلايا الفلكية المطبوعة بيولوجيا كانت في كثافة عالية داخل البناء، مما يشير إلى أن تركيز الخلية المستخدمة في هذا البروتوكول يسمح الترابط الخلايا الفلكية. أظهرت الكيمياء المناعية لتوطين GFAP ، وهي علامة مرتبطة بالتشجير الواسع النطاق للخلايا الفلكية وتضخم الخلايا45، الذي تؤكده تلطيخ F-actin ، أن الخلايا تقدم مورفولوجيا فلكية نموذجية ، مما يشير إلى أن نظام 3D المحاكاة كان مواتيا للخلايا لإرفاقها والتصرف كما هو الحال في بيئتها الأصلية.

يصف البروتوكول المعروض هنا إجراء فعالا وقابلا للاستنساخ للخلايا الفلكية القشرية ثلاثية الأبعاد. نظرا لأهمية الخلايا الفلكية في الاستجابة للاشتعال العصبي للإصابة ، وكذلك في تنظيم وظائف الخلايا العصبية ، يمكن أن تساهم الدراسات التي تنطوي على هذه الخلية الدبقية في العديد من الجوانب في فهم الأمراض التي تؤثر على الجهاز العصبي المركزي. لذلك ، فإن نموذج المختبر ثلاثي الأبعاد المعروض هنا مفيد في التطبيقات المستقبلية التي تهدف إلى دراسة التفاعلات بين الخلايا الفلكية والخلايا العصبية ، ووظائف الخلايا الفلكية في أمراض الدماغ ، وإمكانات الخلايا الفلكية ك أهدافا علاجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ أي تضارب في الكشف عن المعلومات.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ساو باولو للبحوث (FAPESP)، وأرقام المنح 2018/23039-3 و2018/12605-8؛ المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية ،أرقام المنح 465656/2014-5 و 309679/2018-4 وتنسيق تحسين موظفي التعليم العالي (CAPES)، القانون المالي 001.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Bioprinter 3D Biotechnology Solutions Extrusion-based bioprinter
Blunt-tip forceps Integra Miltex 6--30 Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4
Cell culture flask Fisher Scientific 156340 Culture flask T25
Cell strainer Corning Incorporated 352340 Cell strainer 40 µm
Confocal microscope Leica Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubes Thermo Scientific 339651, 339652 Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPI Abcam ab224589 DAPI staining solution
DMEM/F12 Gibco; Life Technologies Corporation 12500062 DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubing Sigma-Aldrich D9527 Molecular weight cut-off = 14 kDa
Ethanol Fisher Scientific 64-15-5 Reagent grade
Fetal Bovine Serum Gibco; Life Technologies Corporation 12657011 Research Grade
Fibrinogen Sigma-Aldrich 9001-32-5 Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
Gelatin Sigma-Aldrich 9000-70-8 Gelatin powder from porcine skin
Glycine Sigma-Aldrich 56-40-6 Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco; Life Technologies Corporation 14175095 No calcium, no magnesium, no phenol red
L-Glutamine Sigma-Aldrich 56-85-9 L-Glutamine crystalline powder
Laminin Sigma-Aldrich 114956-81-9 Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kit Thermo Scientific R37601 Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 760-93-0 For GelMA preparation
Microtubes Corning Incorporated MCT-150-C Microtubes of 1,5 mL
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Needle 22G Fisher Scientific NC1362045 Sterile blunt needle
Operating scissor Integra Miltex 05--02 Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Paraformaldehyde powder
Penicillin/Streptomycin Gibco; Life Technologies Corporation 15070063 Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dish Corning Incorporated 430591, 430588 Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
Phalloidin Abcam ab176753 iFluor 488 reagent
Photoinitiator Sigma-Aldrich 106797-53-9 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS) Gibco; Life Technologies Corporation 10010023 PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich 25988-63-0 Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobody Abcam ab4674 Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibody Abcam ab150176 Alexa fluor 594 anti-chicken
Spatula Miltex V973-70 Number 24 cement spatula previously sterilized
Stereomicroscope Fisherbrand 3000038 Microscope for brain dissection
Syringe 5 mL BD 1222C84 Sterile syringe
Syringe filter 2 µm Fisher Scientific 09-740-105 Polypropylene filter for sterilization
Thrombin Sigma-Aldrich 9002--04-4 Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1 Laboratory grade
Trypsin-EDTA Gibco; Life Technologies Corporation 15400054 Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solution Gibco; Life Technologies Corporation 15040066 Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plate Thermo Scientific 144530 Sterile 24-well plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114 (2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
  3. Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
  4. Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
  5. Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
  6. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  7. Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
  8. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079 (2013).
  9. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  10. Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
  11. Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
  12. Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
  13. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
  14. Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
  15. Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
  16. de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414 (2018).
  17. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  18. Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
  19. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  20. de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
  21. Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401 (2017).
  22. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  23. de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
  24. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  25. Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
  26. Liu, R., Wang, Z. h, Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
  27. Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848 (2018).
  28. East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
  29. Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
  30. Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
  31. Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
  32. Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
  33. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001 (2018).
  34. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
  35. Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
  36. Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
  37. Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036 (2016).
  38. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517 (2018).
  39. Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  40. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
  41. Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757 (2020).
  42. Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
  43. Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
  44. Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
  45. Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 173، الخلايا الفلكية، الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد، التصنيع الحيوي، هندسة الأنسجة، الأنسجة العصبية، الجهاز العصبي المركزي
الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للخلايا الفلكية القشرية لمورين للأنسجة الهندسية الشبيهة بالعصبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Melo, B. A. G., Cruz, E. M.,… More

de Melo, B. A. G., Cruz, E. M., Ribeiro, T. N., Mundim, M. V., Porcionatto, M. A. 3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue. J. Vis. Exp. (173), e62691, doi:10.3791/62691 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter