Summary
在这里，我们报道了一种3D生物打印小鼠皮质星形胶质细胞的方法，用于生物制造神经样组织，以研究星形胶质细胞在中枢神经系统中的功能以及涉及神经胶质细胞在神经系统疾病和治疗中的机制。
Abstract
星形胶质细胞是神经胶质细胞，在中枢神经系统（CNS）中起着至关重要的作用，包括神经元的支持和功能。这些细胞也对神经损伤有反应，并保护组织免受退行性事件的影响。星形胶质细胞功能的 体外 研究对于阐明此类事件所涉及的机制并有助于开发治疗神经系统疾病的疗法非常重要。该协议描述了一种通过3D生物打印含有星形胶质细胞的生物墨水生物制造富含星形胶质细胞的神经样组织结构的方法。在这项工作中使用了基于挤出的3D生物打印机，并从C57Bl / 6小鼠幼崽的脑皮质层中提取星形胶质细胞。通过将皮质星形胶质细胞从第3代混合到由明胶，明胶 - 甲基丙烯酰（GelMA）和纤维蛋白原组成的生物材料溶液中，并补充层粘连蛋白来制备生物墨水，其提供了最佳的生物打印条件。3D生物打印条件最大限度地减少了细胞应激，有助于星形胶质细胞在此过程中的高活力，其中74.08%±1.33%的细胞在生物打印后立即存活。孵育1周后，星形胶质细胞的活力显着增加到83.54%±3.00%，表明3D构建体代表了适合细胞生长的微环境。生物材料组成允许细胞附着并刺激星形细胞行为，细胞表达特定的星形胶质细胞标志物神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）并具有典型的星形细胞形态。这种可重复的方案提供了一种有价值的方法来生物制造富含星形胶质细胞的3D神经样组织，类似于细胞的天然微环境，对于旨在了解星形胶质细胞的功能及其与神经系统疾病中涉及的机制的关系的研究人员很有用。
Introduction
星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最丰富的细胞类型，在大脑稳态中起着关键作用。除了持久的神经元支持外，星形胶质细胞还负责调节神经递质摄取，维持血脑屏障完整性，并调节神经元突触发生1，2。星形胶质细胞在中枢神经系统炎症中也具有重要作用，在导致星体反应性或反应性星形胶质细胞增多症3，4的过程中对大脑损伤作出反应，形成神经胶质疤痕，阻止健康组织暴露于退行性因子5。该事件导致星形胶质细胞的基因表达，形态和功能的变化6，7。因此，涉及星形胶质细胞功能的研究有助于开发治疗神经系统疾病的疗法。
体外 模型对于研究与神经损伤相关的机制至关重要，尽管已经建立了成功的皮质星形胶质细胞的分离和二维（2D）培养8，但该模型未能提供模拟天然细胞行为的现实环境并重现大脑的复杂性9.在2D条件下，较差的机械和生化支持，低细胞 - 细胞和细胞 - 基质相互作用以及细胞扁平化导致基底 - 顶端极性缺失，影响细胞信号传导动力学和实验结果，导致细胞形态和基因表达改变，从而损害对治疗的反应10。因此，开发提供更逼真的神经环境的替代方案至关重要，旨在将结果转化为临床。
三维（3D）细胞培养代表了一种更先进的模型，该模型概括了器官和组织（包括CNS11）的保真度增加的特征。关于神经胶质培养，3D模型有助于维持星形胶质细胞形态，细胞基底 - 顶端极性和细胞信号传导12，13。3D生物打印技术成为一种强大的工具，通过使用细胞和生物材料重建天然组织的结构和性质，以受控的方式生物制造3D活组织。该技术的使用导致了结果预测的实质性改进，并有助于再生医学应用于CNS14，15，16。
这里描述的方案详细介绍了皮质星形胶质细胞的分离和培养。该协议还详细介绍了一种可重复的方法，用于生物打印嵌入明胶/明胶甲基丙烯酰（GelMA）/纤维蛋白原中的星形胶质细胞，并补充层粘连蛋白。在这项工作中，使用基于挤出的生物打印机以1×106个细胞/ mL的密度打印含有皮质星形胶质细胞的生物材料组合物。通过控制打印速度将生物打印剪切应力降至最低，并且星形胶质细胞在该过程后显示出高活力。生物打印构建体培养1周，星形胶质细胞能够在水凝胶内扩散，附着和存活，维持星形细胞形态并表达特异性标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）4 。
该程序与活塞驱动的基于挤出的生物打印机兼容，可用于生物打印来自不同来源的星形胶质细胞。这里提出的3D生物打印模型适用于广泛的神经工程应用，例如研究健康组织中星形胶质细胞功能所涉及的机制以及了解神经病理学的进展和治疗发展。
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Protocol
所有涉及动物的程序都遵循国际动物在研究中使用的指导方针（http://www.iclas.org），并得到圣保罗联邦大学研究伦理委员会（CEUA 2019 / 9292090519）的批准。
1. 小鼠脑部解剖
- 将 10 mL 冷汉克斯缓冲盐溶液 （HBSS） 转移到 100 mm 培养皿中，将 1 mL 转移到 1.5 mL 微管中。每只动物准备一个微管。
注意：培养皿和微管都需要保持在冰上。 - 使用DMEM F12 + 10%胎牛血清（FBS），2%谷氨酰胺和1%青霉素 - 链霉素（P / S）制备星形胶质细胞培养基。通过使用0.2μm过滤器过滤对培养基进行灭菌。
- 使用锋利的手术剪刀斩首C57Bl / 6小鼠幼崽（出生后第1天）实施安乐死。使用镊子，拉扯皮肤并暴露头骨。确保剪刀和镊子都用70%乙醇灭菌。
- 使用锋利的弯曲尖端剪刀沿着矢状平面将头骨从大孔切到头顶。
注意：确保脑组织没有受损。 - 使用先前用乙醇灭菌的刮刀70%，将大脑从颅腔中取出并将其放入含有10mL冷HBSS的培养皿中。
- 将含有大脑的培养皿置于立体显微镜下，并使用两个钝尖镊子，从大脑中取出脑膜（图1）。
- 通过使用刮刀轻轻地将它们从大脑的正中线滚动开来，将皮质层与大脑的其余部分分开。
- 收集两个皮质，并立即将它们转移到含有1 mL冷HBSS的同一微管中。
2. 星形胶质细胞分离和培养
- 在层流下，使用弯曲的微型剪刀将皮质组织切成小块，并通过上下移液3次用1 mL HBSS洗涤它们。等待纸巾安定下来。删除 HBSS 并添加新的 HBSS，再重复该过程两次。
- 除去HBSS，用1mL0.05%胰蛋白酶在37°C下孵育组织5分钟。
注意：此时只有胰蛋白酶消化就足够了。 - 通过轻轻地上下移液15倍来机械地解离组织。
注意：通过悬浮液浊度的增加和悬浮液中没有大块组织碎片来观察组织的完全解离。 - 将溶液转移到15mL锥形管中，通过加入等体积的FBS中和胰蛋白酶活性，并在0.4μm的细胞过滤器过滤器中过滤溶液以除去未解离的片段。
- 用1mL星形胶质细胞培养基洗涤过滤器，收集通过过滤器的细胞悬浮液，并在200×g和25°C下离心5分钟。 离心后，弃去上清液并将沉淀悬浮在1mL星形胶质细胞培养基中。
- 将细胞悬浮液转移到T25培养瓶中，将培养基的体积组成为3.5mL，并将细胞在37°C和5%CO2下孵育。
- 确保24小时后，细胞贴壁。然后，更换培养基并每3天更换一次。
- 7天后，通过用2mL 1x PBS洗涤细胞，从培养物中除去小胶质细胞和少突胶质细胞。
- 用星形胶质细胞培养基代替PBS溶液，并将培养瓶以180rpm的转速留在轨道振荡器中过夜。
注意：星形胶质细胞在大约10-12天的培养中形成汇合的单层。
3. 明胶甲基丙烯酰（GelMA）的合成
- 称取从猪皮获得的10克明胶，并通过让溶液在加热板上以240rpm和50°C搅拌直至完全溶解来溶解在100mL PBS中。
- 在罩下，加入2mL甲基丙烯酸酐（MA）以获得低程度的功能化，并让明胶乳液在240rpm和50°C下搅拌2小时。
注意：MA危险说明：H302 + H332（吞咽或吸入有害），H311（与皮肤接触有毒），314（引起严重的皮肤灼伤和眼睛损伤），315（引起皮肤刺激），H317（可能引起过敏性皮肤反应），H318（引起严重眼损伤），331（吸入有毒），H332（吸入有害），H335（可能引起呼吸道刺激）。处理指南：P261（避免吸入灰尘/烟雾/气体/烟雾/蒸气/喷雾），P305 + P351 + P338 + P310（如果眼睛进入：用水小心冲洗几分钟。取下隐形眼镜（如果存在且易于操作）。继续冲洗。立即呼叫毒物中心/医生），P301 + P312 + P330（如果吞咽：如果您感到不适，请致电解毒中心/医生。漱口）。
注意：添加 MA 非常缓慢，一滴一滴。 - 将明胶-MA溶液稀释在100mL预热的PBS（50°C）中，以获得200mL的最终体积，并让溶液在240rpm和50°C下搅拌10分钟。
- 切下约20厘米的透析膜（分子截止12-14 kDa），并将其浸泡在去离子水中直至变软。
注意：用去离子水填充膜，以确保没有孔或缺陷。 - 使用漏斗将明胶-MA溶液转移到膜上。
注意：关闭两侧，在内部留出额外的空间以允许混合。 - 将含有明胶-MA溶液的膜放入装有2L蒸馏水进行透析的容器中，让它们在40°C下搅拌5天（500rpm）。
注意：盖上容器，避免水分蒸发。 - 每天更换两次蒸馏水。每次，将膜倒置以进行均质化。
- 在第五天，将200mL预热的超纯水（40°C）混合到透析的明胶-MA中，并在40°C下搅拌15分钟。
- 将明胶-MA溶液转移到50 mL锥形管中，最高可达25 mL，并让管在-80°C下保持2天。
注意：水平存放试管，以利于冻干。 - 冻干冷冻溶液3-5天，并储存冻干凝胶MA免受潮湿。
4. 生物墨水制备
注意：为了获得1 mL的生物墨水，建议制造至少3 mL的生物材料溶液，因为在过滤过程中可能会有损失。
- 纤维蛋白原溶液的制备
- 在去离子水中制备盐水溶液（NaCl 0.9%），并将牛血浆中的10mg纤维蛋白原溶解在1mL盐水溶液中，以获得10mg / mL的浓度。
注意：由于纤维蛋白原吸附到玻璃上，请勿使用玻璃烧瓶制备纤维蛋白原溶液。 - 将溶液在37°C搅拌下放置，直到纤维蛋白原完全溶解。
注意：对于纤维蛋白原溶解，使用放置在37°C烘箱内的旋转系统。 在37°C的热板上磁性搅拌（180rpm）纤维蛋白原也是合适的。在这种情况下，10 mg / mL纤维蛋白原需要大约40分钟才能溶解。
- 在去离子水中制备盐水溶液（NaCl 0.9%），并将牛血浆中的10mg纤维蛋白原溶解在1mL盐水溶液中，以获得10mg / mL的浓度。
- 明胶/凝胶MA溶液的制备
- 称取0.12克明胶，加入1.9毫升预热的PBS（40°C）中，得到终浓度为4%（w / v）的明胶。涡流有利于溶解。
- 将乳液保持在40°C直至完全溶解。
- 称取0.06g冻干凝胶MA并转移到明胶溶液中，以获得终浓度为2%（w / v）的GelMA。涡流有利于溶解。
- 将溶液保持在40°C直至完全溶解。
- 含有星形胶质细胞的明胶/GelMA/纤维蛋白原生物墨水的制备
- 移取0.9mL的10mg / mL纤维蛋白原溶液，并转移到明胶/ GelMA溶液中，以获得终浓度为3mg / mL的纤维蛋白原。
- 称取0.015g光引发剂（PI）并转移到明胶/GelMA/纤维蛋白原溶液中，以获得终浓度为0.5%（w / v）PI。通过上下翻转管子来混合溶液，并将其保持在40°C，避免光照，以避免PI降解。
注意：将生物墨水在4°C下储存最多24小时。 - 在层流下，使用0.2μm过滤器过滤溶液到无菌的15mL锥形管中。
注意：生物材料溶液应在37-40°C下进行过滤。 - 将980μL生物材料溶液转移到15mL锥形管中。
- 将层粘连蛋白稀释在盐水中，以获得100μg/ mL的储备溶液。
- 移取20μL层粘连蛋白并转移到含有生物墨水的管中，以获得最终浓度为2μg/ mL层粘连蛋白。
- 通过上下移液轻轻混合，避免气泡。如果任何气泡持续存在，则以200×g离心锥形管2分钟。 将生物墨水保持在37°C，直到与细胞混合。
- 胰蛋白酶用0.05%胰蛋白酶对原代星形胶质细胞进行5分钟。
注意：使用第1至3段的星形胶质细胞。 - 用FBS以1：1的比例中和胰蛋白酶活性，并将细胞转移到15mL锥形管中。以200×g离心5分钟。
- 计数细胞并将1 x 106个细胞转移到不同的锥形管中。以200×g离心5分钟。
- 通过轻轻敲击锥形管的底部，除去留下小体积（〜200μL）的上清液以悬浮细胞沉淀。
- 将1mL明胶/ GelMA /纤维蛋白原溶液转移到含有细胞的管中，并轻轻地上下移液以匀浆，获得1 x 106 个细胞/ mL的最终浓度。
5. 交联剂溶液的制备
- 凝血酶重建
- 在15 mL锥形管中制备凝血酶100 U / mL的储备溶液，在无菌去离子水中加入0.1%（w / v）牛血清白蛋白（BSA）。在-20°C的微管中储存。
注意：由于凝血酶吸附到玻璃上，请勿使用玻璃烧瓶制备储备溶液或储存等分试样。
- 在15 mL锥形管中制备凝血酶100 U / mL的储备溶液，在无菌去离子水中加入0.1%（w / v）牛血清白蛋白（BSA）。在-20°C的微管中储存。
- 凝血酶-CaCl2 溶液的制备
- 移取100μL凝血酶储备溶液，并转移到含有8.9mL无菌去离子水的50mL锥形管中，以获得1 U / mL凝血酶的终浓度。
- 在去离子水中制备10%（w / v）CaCl2 溶液，并使用0.2μm过滤器灭菌。
- 将1.1mL的10%CaCl2 溶液转移到含有凝血酶的锥形管中，以获得1：9的最终比例（CaCl2 与凝血酶）。
注意：以实验中使用的体积准备交联剂溶液，避免储存。
6. 使用基于挤出的生物打印机对含有星形胶质细胞的生物墨水进行生物打印
- 神经组织的设计
- 使用G代码：构建一个6 x 6 mm（方形）的网格，X轴和Y轴上的每条生物打印线之间的距离为1 mm，Z轴上的6层（每行之间为0.2 mm）;将挤出（E）设置为0.01毫米，在Z轴的每一个新层处增加0.001毫米;并将打印速度（F）设置为400毫米/分钟（补充信息）。
- 生物打印机设置
- 将机器暴露在紫外线下15分钟，然后用70%乙醇擦拭。
- 使用电源开关打开生物打印机。通过 USB 电缆将机器连接到计算机。打开控制软件将其连接到生物打印机并加载文件设计。
- 生物打印注射器的制备
- 使用1，000μL移液管将含有星形胶质细胞的明胶/GelMA/纤维蛋白原生物墨水转移到5 mL塑料注射器中。
注意：缓慢转移以避免气泡形成。 - 将无菌的22 G钝针连接到注射器。
注意：将注射器在4°C下放置2分钟。 - 将注射器连接到生物打印机打印头，然后手动冲洗生物墨水以除去剩余的气泡。
- 使用1，000μL移液管将含有星形胶质细胞的明胶/GelMA/纤维蛋白原生物墨水转移到5 mL塑料注射器中。
- 生物打印
注：生物打印是在层流罩外进行的。- 将35mm培养皿放在生物打印机台上，并将针头放置在距离培养皿表面0.1mm的位置，以允许针头移动。
注意：每次生物打印使用一个35毫米培养皿。 - 按 打印 按钮。
- 生物打印结束后，确保注射器远离培养皿。然后，关闭培养皿并准备交联过程。
注意：一个结构的生物打印大约需要1分钟和10秒。
- 将35mm培养皿放在生物打印机台上，并将针头放置在距离培养皿表面0.1mm的位置，以允许针头移动。
- 交联生物打印结构和培养物
- 将培养皿置于2 mW /cm 2的紫外线下，持续2 x 60秒（上下）以进行GelMA交联。
- 在层流下，使用无菌刮刀将生物打印的结构转移到24孔板中。
- 加入500μL凝血酶/ CaCl2 溶液，放置30分钟以允许纤维蛋白交联。
- 取出交联溶液，用2 mL PBS 1x清洗结构。然后，用1mL星形胶质细胞培养基代替PBS，并在37°C和5%CO2下孵育。每3天更换一次培养基。
7. 星形胶质细胞活力评估
- 生物打印星形胶质细胞的活力
- 使用刮刀将生物打印的结构转移到35mm培养皿中。
- 用 1 mL 1x PBS 清洗结构。
- 将100μL活/死试剂沉积在构建物上，并将其保持在37°C下30分钟，使其免受光照。
- 取出活/死试剂，并用1 mL 1x PBS洗涤构建体。
- 使用刮刀将样品转移到共聚焦培养皿中，并使用488和570nm激发在共聚焦显微镜下观察构建体内的细胞以获取图像。
注意：使用 10 倍的放大倍率对构造中的单元格进行整体可视化。 - 确保样品平放。如有必要，在样品上放置盖玻片以增加平坦度。
注：在成像过程中，请确保共聚焦皿密封良好，以防止样品变干。 - 使用计算软件计算可行（绿色）和死亡（红色）的数量。
- 二维星形胶质细胞培养的活力
- 在35mm共聚焦皿中播种0.5×106 个星形胶质细胞（传代1-3），加入星形胶质细胞培养基，并在37°C和5%CO2下孵育它们。
- 当细胞汇合时，取出培养基并用1mL 1x PBS洗涤。
- 沉积200μL活/死试剂，并将培养皿在37°C下保持30分钟，避光。
- 取出活/死试剂，并用1 mL 1x PBS洗涤细胞。
- 将培养皿与数码相机一起放入共聚焦显微镜，并使用488和570 nm激发进行图像采集。
- 使用计算软件计算可行（绿色）和死亡（红色）的数量。
8. 星形胶质细胞的免疫染色
- 3D生物打印星形胶质胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色
注意：要研究其他细胞标志物的存在，请相应地改变一抗。- 从孔中取出培养基，并用1 mL 3x PBS洗涤结构。
- 将PBS中的4%多聚甲醛（PFA）添加到井中，直到结构完全覆盖，并在4°C下放置2小时。
- 取出PFA，用1 mL 3x PBS清洗结构。
注意：如果在PBS中储存在4°C下，此过程可以暂停数月。确保孔板密封，以避免PBS蒸发。 - 用甘氨酸0.1摩尔/升处理样品5分钟。
- 用 1 mL 1x PBS 洗涤 5 分钟。
- 在轨道搅拌下，用含有0.1%Triton X-100和10%FBS的PBS在25°C下透化样品1小时。
- 将构建体与鸡肉抗GFAP（一抗稀释1：500）在4°C下孵育过夜。
- 吸出一抗并用1mL PBS洗涤样品5分钟，3次。
注意：一抗在4°C下储存时可重复使用多次。 - 在轨道搅拌下，用Alexa fluor 488偶联抗鸡（二抗稀释1：500）和1μg/ mL DAPI孵育样品1小时，在25°C下。
注：请保持样品避光。 - 用1 mL PBS洗涤样品5分钟，3次。
- 将结构转移到35 mm共聚焦皿中。
注意：确保培养皿密封良好，以防止样品变干。
- 2D星形胶质细胞培养的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色
- 在35mm共聚焦皿中播种0.5×106 个星形胶质细胞（传代1-3），加入星形胶质细胞培养基，并在37°C和5%CO2下孵育它们。
- 当细胞汇合时，取出培养基并用1mL 1x PBS洗涤它们。
- 重复步骤 8.1.2-8.1.10。
- 星形胶质细胞细胞骨架染色
- 重复步骤 8.1.1-8.1.6。
- 在PBS中加入200μL50μg/ mL荧光偶联的鬼臼素溶液，并在构建体上加入1μg/ mL的DAPI。
- 在轨道搅拌下在25°C下孵育1小时，使样品免受光照。
- 用1 mL PBS洗涤样品5分钟3次，然后用刮刀将结构转移到共聚焦皿中。
注意：确保培养皿密封良好，以防止样品变干。
9. 共聚焦成像
- 将培养皿带到共聚焦显微镜和数码相机上进行成像（359，488和570nm激发）。
- 使用 10 倍的放大倍率进行整体可视化，使用 40 倍或 63 倍的放大倍率进行细胞的缩放图像。
注意：确保样品平放。如有必要，在样品上放置盖玻片以增加平坦度。
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Representative Results
这项工作旨在使用3D生物打印技术开发一种神经样组织，以逐层沉积含有原代星形胶质细胞的明胶/ GelMA / 纤维蛋白原生物墨水。从小鼠幼崽的大脑皮层中提取和分离星形胶质细胞（图1），添加到生物材料组合物中，允许生物制造活的3D构建体。
计算机辅助设计（CAD）是使用G代码（补充文件）作为方形（0.6 x 0.6毫米）的互连框架开发的，孔隙为1毫米，旨在促进营养物质和氧气的扩散。框架由彼此叠加的6层组成，每层以90°的角度变化（图2A i）。设计的结构具有大约5毫米高（图2A ii），允许组织操作。生物墨水组合物还允许制造不同形状的结构（图2B）。
由明胶，GelMA和纤维蛋白原组成的生物墨水的制备包括两个交联步骤。首先，GelMA在紫外光下交联，其中形成分子间和分子内共价键，然后纤维蛋白交联。在该步骤中，凝血酶切割纤维蛋白原链，导致纤维蛋白纤维17的形成，反应由Ca2+离子18稳定。然后，GelMA和纤维蛋白纤维形成稳定的互渗透聚合物网络（IPN），并辅以层粘连蛋白，为细胞附着和扩散提供合适的支持19，20（图2C）。
在生物打印之前，经过12天的分离，星形胶质细胞的特征在于GFAP的存在，GFAP是星形胶质细胞中间丝4 的蛋白质成分（图3A）。然后，将胰蛋白酶化的星形胶质细胞与明胶/ GelMA / 纤维蛋白原溶液以1×106 个细胞/ mL的密度混合，产生含有星形胶质细胞的生物墨水。将生物墨水转移到连接到22 G钝针的5 mL注射器中，组成生物打印机打印头（图3B i）。针头允许生物墨水挤出而不会堵塞并防止对细胞的高剪切应力。
由于明胶的粘弹性特性，明胶在较高温度下表现为流体，在较低温度下表现为凝胶21，生物打印结构保留了形状保真度（图3B ii）。在连续两层生物墨水的生物打印后，观察到一个明确定义的结构的形成（图3C），细胞被困在生物材料内。
经过生物打印和交联过程后，将构建体与星形胶质细胞培养基孵育，经过1天的生物打印后，大多数细胞仍然呈现圆形形态（图3D）。生物打印的支架在孵育7天后保持完整性，尽管观察到一些圆形细胞，但大量星形胶质细胞在整个构建体中扩散，呈现星形细胞形态和互连（图3E）。
由于生物打印的参数（如速度）可能直接影响细胞活力，因此测试了不同的生物打印速度（400，600和800 mm / min），并使用具有钙黄素-AM（活细胞，绿色荧光）和乙锭同源二聚体-III（EthD-II）（死细胞，红色荧光）的活/死测定法评估星形胶质细胞存活率。使用计算软件通过计算活细胞和死细胞的数量来量化活细胞的百分比。在时间0（生物打印后）评估细胞活力，结果表明，在较低的速度（400 mm / min）下，活细胞占总细胞的74.08%±1.33%，显着高于生物打印的细胞600和800 mm / min（60.25%±分别为1.93%和62.94±6.18%）（图4A）。因此，在这项工作中使用了400毫米/分钟的速度。
在生物打印之前，2D培养的星形胶质细胞被表征为活细胞的百分比，并且生物打印的星形胶质细胞的活力被归一化为这种情况。结果显示，2D培养呈现90.98%±0.94%的活细胞。生物打印星形胶质细胞（第7天）的活力为83.54%±3.00%，占2D值的0.92±0.03，明显高于第0天（0.81±0.01）（图4B）。用活/死试剂染色的星形胶质细胞的图像如图4C所示，并显示生物打印后，细胞具有圆形形态（图4C i）。孵育1周后，星形胶质细胞扩散到整个构建体（图4C ii），显示出来自2D培养物的细胞的独特形态（图4C iii）。
对生物打印的星形胶质细胞进行染色，以显示构建体内的细胞密度和细胞形态。图5A显示了孵育7天后的生物打印构建体，其中高密度的星形胶质细胞用F-actin细胞骨架染料phalloidin染色。虽然观察到的圆形细胞很少，但星形胶质细胞主要呈现星状形态。生物打印的星形胶质细胞在生物打印7天后染色时显示GFAP阳性，表明细胞保持其星形细胞表型（图5B i）。图5B ii和5B iii显示了构建体内生物打印的GFAP +星形胶质细胞的Z堆叠图像。这些结果表明，生物墨水组合物提供了一种生物相容的微环境，以促进星形胶质细胞的粘附，扩散和生长。
图1：提取脑和皮层分离用于原代星形胶质细胞培养。 从C57Bl / 6小鼠幼崽（产后第1天）大脑的皮层中分离出原代星形胶质细胞。从动物身上提取大脑后，在显微镜下取出脑膜，皮层分离，然后进行组织消化和星形胶质细胞培养。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：3D生物打印工艺示意图。（A）CAD文件设计用于神经组织的3D生物打印，显示（i）2层，顶视图，和（ii）6层，侧视图，结构。（B） 图像显示生物墨水打印不同形状的结构（i）正方形，（ii） 毛细管和（iii）星形结构。（C） 3D生物打印后生物材料的交联方案显示，其中GelMA在紫外光下交联，然后在凝血酶：Ca2 +浴中交联纤维蛋白。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：含有星形胶质细胞的明胶/GelMA/纤维蛋白原生物墨水的3D波纹打印（A）在分离和培养12天后对星形胶质细胞进行表征，染色为GFAP，绿色和DAPI，蓝色。（B） （i） 在生物打印后立即设置打印头和（ii） 3D 生物打印结构。（B） 显示生物打印框架的双层结构。放大4倍（C）生物打印星形胶质细胞的图像在生物打印后1天，显示圆形形态的细胞。（D）生物打印过程后7天的生物打印星形胶质细胞的图像，显示具有星形细胞形态的细胞，具有很少的圆形细胞，表明它们与模拟组织的亲和力。放大倍数为 10 倍。请单击此处查看此图的放大版本。
图4：生物打印星形胶质细胞活力的评估。（A） 星形胶质细胞以不同速度生物打印的活力。（B） 生物打印星形胶质细胞在（i）第0天（生物打印后）和（ii）在生物打印7天后的活力，在2D培养中归一化为星形胶质细胞的活力。通过图基检验的单向方差分析，n = 3，*p < 0.05。（C） 用活/死试剂染色的星形胶质细胞的荧光图像。生物打印星形胶质细胞在（i）天0（生物打印后），（ii）第7天和（iii）星形胶质细胞的2D培养。放大倍数为 10 倍。 请单击此处查看此图的放大版本。
图5：3D生物打印星形胶质细胞的表征。3D 生物打印星形胶质细胞在孵育 7 天后对（ A ） F -肌动蛋白（样蛋白，红色）和细胞核（ DAPI ，蓝色）进行免疫荧光，放大倍率为 10 倍和 40 倍，对于（ B ） GFAP ，绿色（ i ）放大倍率为 10 倍，（ ii ） Z堆叠显示生物打印构建体的 X - Y - Z 轴，以及（ iii ）图像显示 GFAP + 星形胶质细胞的 X - Z 轴。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
3D生物打印技术已经成为一种生物制造替代方案，可以设计出在结构和生理上类似于天然组织22的精制结构，包括大脑23。神经样组织的生物制造允许在体外进行天然微环境建模，是了解与影响CNS11的许多疾病的发展和治疗相关的细胞和分子机制的重要工具。由于神经胶质细胞在神经功能中的重要作用，皮质星形胶质细胞已被用于许多研究，如大脑发育24，生物分子运输25，神经突起生长26，以及脑样组织生物制造14。
星形胶质细胞3D培养的工程方法已有报道，使用不同的生物材料和支架技术27，28，29。同样，还报道了一种用于3D生物打印人类诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生的神经聚集体的方法，并显示了这些生物打印细胞在体外分化和成熟的能力30。然而，文献中没有关于3D浮印星形胶质细胞构建体生物制造方法的报道。然后，该协议旨在描述一种用于3D生物打印皮质星形胶质细胞的可重复方法。
在该协议中，从C57Bl / 6小鼠幼崽的大脑皮层中分离出星形胶质细胞，这是一种广泛用于研究31，32的动物模型，其可以被来自其他来源的星形胶质细胞取代，例如hiPSCs和脊髓。在分离，培养和亚培养后，星形胶质细胞在通过3之前一直处于增殖状态，这是由于其增殖的内在局限性而建议的最大分裂次数8。验证了来自第4代的星形胶质细胞增殖是有限的，难以达到3D生物打印所需的细胞量。
在所描述的方法中，使用浓度为1.0×106 个细胞/ mL的生物材料溶液，作为概念证明，以评估细胞在生物打印过程中存活的能力，并在水凝胶内培养期间保持其活力和内在特性。在之前的工作中，通过共培养星形胶质细胞和神经元对3D生物打印的神经样组织进行生物制造，并且为了增加细胞相互作用，星形胶质细胞浓度为8.0×106 个细胞/mL14。然后，可以针对特定研究优化细胞浓度。
用于3D生物打印的生物墨水由细胞和生物材料或生物材料的组合组成33。在该协议中，使用明胶/ GelMA / 纤维蛋白原的组合，这显示有利于培养物中星形胶质细胞的生物打印和维持。当使用基于挤出的生物打印技术时，生物打印生物墨水的生产具有挑战性。生物材料组合物必须具有粘弹性，同时允许生物墨水的挤出，同时在打印过程34后保持3D形状。此外，它应该能够在此过程中保持细胞活力，这取决于生物打印条件，可以对细胞造成剪切应激，导致死亡35。
明胶确保了生物打印性，明胶是一种生物材料，由于其溶胶 - 凝胶过渡能力36而具有最佳的粘弹性。这允许明胶大分子在挤出过程中重新排列并表现为流体，并在生物打印后作为凝胶，从而保持3D结构。此外，作为胶原衍生物，明胶由甘氨酸 - 氨基酸肽三联重复组成，可确保细胞特异性21。然而，明胶的分子内键和分子间键较弱，并且由于其热可逆性，明胶在37°C下没有稳定性，在细胞培养过程中从构建体中释放出来。因此，GelMA成为稳定水凝胶的替代品，由于紫外光暴露后形成的共价键，保持细胞特异性19。GelMA的物理性质，如孔隙率、降解和弹性模量，可以进行调整，以适应不同的组织工程应用19.GelMA支架的刚度可以通过改变甲基丙烯酰取代37来控制，从而实现与待建模组织的刚度相似的刚度。也就是说，通过降低功能化程度，可以实现较低的刚度37。因此，由于小鼠大脑38、39的柔软度以及细胞外基质（ECM）刚度对细胞行为40的直接影响，在该协议中提出了低程度的明胶功能化。在以前的工作中，报道了GelMA水凝胶模拟CNS物理特征的能力，显示出对培养星形胶质细胞，神经元和神经干细胞14，41，42的高度适用性。
除GelMA外，纤维蛋白原是一种通过酶促反应形成纤维蛋白纤维的天然生物聚合物，也已被广泛用于生物制造神经样组织，显示出高特异性，并为神经细胞附着和生长提供了合适的微环境30，43，44。其他生物材料，如海藻酸盐和壳聚糖已被用于生物打印神经样组织，与明胶，GelMA和/或纤维蛋白原混合，旨在提高3D支架的可印刷性和物理性质14，30。在本方法中，使用明胶，GelMA和纤维蛋白原作为生物墨水的组分实现了最佳的生物可打印性，物理稳定性和细胞特异性。为了增加星形胶质细胞对微环境的识别，使用层粘连蛋白- 大脑ECM的一种成分 - 来补充生物墨水。
在该协议中，明胶以4%（w / v）的浓度使用，这使得生物墨水在25°C下在大约10分钟内的溶胶 - 凝胶转变。通过增加明胶的浓度可以实现更快的凝胶化。但是，使用0.2μm过滤器过滤灭菌可能会受到影响。生物墨水过滤是一个关键步骤，验证较高浓度的明胶（>5%w / v）可能会阻止过滤。在生物打印过程中实现更快凝胶点的替代方法是将含有生物墨水的注射器在4°C下放置2分钟，然后将其连接到生物打印机打印头。生物打印后，将结构保持在25°C至关重要，以避免破坏3D结构的稳定性，并在紫外线暴露之前保持凝胶状态。值得注意的是，当将纤维蛋白原交联剂溶液添加到板中时，结构应该是固体的。对于 GelMA 交联，重要的是翻转样品（每侧 2 x 60 s），以确保整个结构中的紫外线暴露。对于纤维蛋白原交联，交联剂溶液应完全覆盖结构。因此，如果使用较大的盘子或盘子，则应调整体积。交联后，水凝胶在相差显微镜下应看起来均匀，细胞应均匀分布在整个构建体中，具有圆形形态。
该协议允许明胶/ GelMA / 纤维蛋白原生物墨水打印不同形状的结构，保持结构的完整性和3D形状。由于层流内部温度达到25°C的限制，在层流外的培养室中进行生物打印。每个样品的生物打印时间约为1分钟，并且在细胞培养过程中未观察到污染。
细胞完整性会受到生物打印的影响，由于在过程中引起的剪切应力35。这可以通过优化打印参数（例如打印速度）来控制。在这项工作中，测试了不同的生物打印速度，400，600和800 mm / min，观察到当速度从400增加到600 mm / min时细胞活力显着降低。在400 mm / min时，约74%的细胞在生物打印后保持活力，并且在孵育7天后该值显着增加（>80%）。因此，没有使用较低的速度，以避免细胞对环境的过度暴露。与生物打印细胞相比，星形胶质细胞的2D培养显示出更高的活力（〜90%）。然而，如荧光图像所示，形态受培养类型的影响。虽然2D细胞是平坦的，但3D环境中的星形胶质细胞具有类似恒星的形状，通过细胞过程相互连接。
值得注意的是，模拟微环境有利于皮质星形胶质细胞培养，因为细胞活力在1周后显着增加，表明构建体内的细胞增殖。层粘连蛋白是存在于大脑ECM中的一种糖蛋白，被添加到生物墨水中，旨在实现星形胶质细胞对水凝胶14的更高粘附性 。细胞骨架F-肌动蛋白染色表明，生物打印的星形胶质细胞在构建体内密度很高，表明该协议中使用的细胞浓度允许星形胶质细胞互连。GFAP定位的免疫组织化学，一种与星形胶质细胞广泛树化和细胞肥大45相关的标志物，通过F-肌动蛋白染色证实，表明细胞呈现典型的星形细胞形态，表明模拟3D系统有利于细胞附着和表现为天然环境。
这里介绍的协议描述了3D生物打印皮质星形胶质细胞的有效且可重复的程序。由于星形胶质细胞在损伤的神经炎症反应中的重要性，以及在调节神经元功能方面的重要性，涉及这种神经胶质细胞的研究可能有助于理解影响CNS的疾病的许多方面。因此，这里提出的3D 体外 模型在未来旨在研究星形胶质细胞 - 神经元相互作用，星形胶质细胞在脑病理学中的功能以及星形胶质细胞作为治疗靶点的潜力的应用中是有用的。
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Disclosures
作者没有冲突要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了圣保罗研究基金会（FAPESP）的支持，资助号为2018/23039-3和2018/12605-8;国家科学技术发展委员会（CNPq），批准号465656/2014-5和309679/2018-4;和高等教育人员改进协调（CAPES），财务代码001。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Bioprinter | 3D Biotechnology Solutions | Extrusion-based bioprinter | |
| Blunt-tip forceps | Integra Miltex | 6--30 | Forceps for brain dissection previously sterilized |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Protease free, fatty acid free, essentially globulin free |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Cell culture flask | Fisher Scientific | 156340 | Culture flask T25 |
| Cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | Cell strainer 40 µm |
| Confocal microscope | Leica | Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system | |
| Conical tubes | Thermo Scientific | 339651, 339652 | Sterile tubes of 15 mL and 50 mL |
| DAPI | Abcam | ab224589 | DAPI staining solution |
| DMEM/F12 | Gibco; Life Technologies Corporation | 12500062 | DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Dyalisis tubing | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14 kDa |
| Ethanol | Fisher Scientific | 64-15-5 | Reagent grade |
| Fetal Bovine Serum | Gibco; Life Technologies Corporation | 12657011 | Research Grade |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | 9001-32-5 | Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | Gelatin powder from porcine skin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 56-40-6 | Glycine powder |
| Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 14175095 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 56-85-9 | L-Glutamine crystalline powder |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl |
| Live dead kit cell imaging kit | Thermo Scientific | R37601 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 760-93-0 | For GelMA preparation |
| Microtubes | Corning Incorporated | MCT-150-C | Microtubes of 1,5 mL |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Needle 22G | Fisher Scientific | NC1362045 | Sterile blunt needle |
| Operating scissor | Integra Miltex | 05--02 | Sharp scissor for brain dissection previously sterilized |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde powder |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco; Life Technologies Corporation | 15070063 | Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin) |
| Petri dish | Corning Incorporated | 430591, 430588 | Sterile petri dishes of 35 and 100 mm |
| Phalloidin | Abcam | ab176753 | iFluor 488 reagent |
| Photoinitiator | Sigma-Aldrich | 106797-53-9 | 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 10010023 | PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000 |
| Primary antobody | Abcam | ab4674 | Chicken polyclonal to GFAP |
| Secondary antibody | Abcam | ab150176 | Alexa fluor 594 anti-chicken |
| Spatula | Miltex | V973-70 | Number 24 cement spatula previously sterilized |
| Stereomicroscope | Fisherbrand | 3000038 | Microscope for brain dissection |
| Syringe 5 mL | BD | 1222C84 | Sterile syringe |
| Syringe filter 2 µm | Fisher Scientific | 09-740-105 | Polypropylene filter for sterilization |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | 9002--04-4 | Thrombin cristalline powder from bovine plasma |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Laboratory grade |
| Trypsin-EDTA | Gibco; Life Technologies Corporation | 15400054 | Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS |
| Versene solution | Gibco; Life Technologies Corporation | 15040066 | Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS |
| Well plate | Thermo Scientific | 144530 | Sterile 24-well plate |
References
- Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114 (2019).
- Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
- Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
- Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
- Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
- Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
- Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079 (2013).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
- Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
- Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
- Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
- Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
- Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
- de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414 (2018).
- Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
- Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
- Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
- de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
- Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401 (2017).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
- de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
- Liu, R., Wang, Z. h, Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
- Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848 (2018).
- East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
- Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
- Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
- Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
- Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
- Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001 (2018).
- Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
- Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
- Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
- Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036 (2016).
- Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517 (2018).
- Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
- Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
- Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757 (2020).
- Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
- Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
- Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
- Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).
