Здесь мы сообщаем о методе 3D-биопечати мышиных кортикальных астроцитов для биофабрикации нервно-подобных тканей для изучения функциональности астроцитов в центральной нервной системе и механизмов с участием глиальных клеток при неврологических заболеваниях и методах лечения.
Астроциты представляют собой глиальные клетки с существенной ролью в центральной нервной системе (ЦНС), включая поддержку и функциональность нейронов. Эти клетки также реагируют на нервные травмы и защищают ткани от дегенеративных событий. Исследования функциональности астроцитов in vitro важны для выяснения механизмов, участвующих в таких событиях, и способствуют разработке методов лечения неврологических расстройств. Этот протокол описывает метод биофабрикатного моделирования невроходной структуры ткани, богатой астроцитами, с помощью 3D-биопечати биоинков, нагруженных астроцитами. В этой работе был использован 3D-биопринтер на основе экструзии, а астроциты были извлечены из коры головного мозга детенышей мышей C57Bl/6. Биомочинку готовили путем смешивания кортикальных астроцитов от пассажа до пассажа 3 с раствором биоматериала, состоящим из желатина, желатино-метанрилоила (GelMA) и фибриногена, дополненного ламинином, который представлял оптимальные условия биопечати. Условия 3D-биопечати минимизировали клеточный стресс, способствуя высокой жизнеспособности астроцитов во время процесса, в котором 74,08% ± 1,33% клеток были жизнеспособными сразу после биопечати. После 1 недели инкубации жизнеспособность астроцитов значительно возросла до 83,54% ± 3,00%, что указывает на то, что 3D-конструкция представляет собой подходящую микросреду для роста клеток. Состав биоматериала позволял прикреплять клетки и стимулировал астроцитарное поведение, при этом клетки экспрессировали специфический маркер астроцитов глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и обладали типичной астроцитарной морфологией. Этот воспроизводимый протокол обеспечивает ценный метод биофабрикатного 3D-невроходобной ткани, богатой астроцитами, которая напоминает нативную микросреду клеток, полезный для исследователей, которые стремятся понять функциональность астроцитов и их связь с механизмами, участвующими в неврологических заболеваниях.
Астроциты являются наиболее распространенным типом клеток в центральной нервной системе (ЦНС) и играют ключевую роль в гомеостазе мозга. В дополнение к устойчивой поддержке нейронов, астроциты отвечают за модуляцию поглощения нейротрансмиттеров, поддержание целостности гематоэнцефалического барьера и регулирование нейронального синаптогенеза1,2. Астроциты также играют существенную роль в воспалении ЦНС, реагируя на травмы головного мозга в процессе, который приводит к астрограционной реактивности или реактивному астроглиозу3,4,образуя глиальный рубец, который препятствует поражению здоровой ткани дегенеративными агентами5. Это событие приводит к изменениям в экспрессии генов астроцитов, морфологии и функции6,7. Поэтому исследования, связанные с функциональностью астроцитов, полезны для разработки методов лечения неврологических расстройств.
Модели in vitro имеют решающее значение для изучения механизмов, связанных с неврологическими травмами, и хотя была установлена успешная изоляция и двумерная (2D) культура корковых астроцитов8,эта модель не может обеспечить реалистичную среду, которая имитирует поведение нативных клеток и воспроизводит сложность мозга9 . В 2D-состоянии плохая механическая и биохимическая поддержка, низкоклеточные и клеточно-матричные взаимодействия и сплющивание клеток, приводящее к отсутствию базально-апикальной полярности, влияют на динамику клеточной сигнализации и экспериментальные результаты, приводящие к изменению морфологии клеток и экспрессии генов, которые ставят под угрозу реакцию на лечение10. Поэтому крайне важно разработать альтернативы, которые обеспечивают более реалистичную нейронную среду, направленную на перевод результатов в клинику.
Трехмерная (3D) клеточная культура представляет собой более продвинутую модель, которая рекапитулирует с повышенной точностью особенности органов и тканей, включая ЦНС11. Что касается глиальной культуры, 3D-модели способствуют поддержанию морфологии астроцитов, базально-апикальной полярности клеток и клеточной сигнализации12,13. Технология 3D-биопечати стала мощным инструментом для контролируемого биофабрикатирования живых тканей 3D с использованием клеток и биоматериалов для воссоздания структуры и свойств нативных тканей. Использование этой технологии привело к существенному улучшению прогнозирования результатов и способствовало регенеративной медицине, применяемой в ЦНС14,15,16.
Протокол, описанный здесь, детализирует выделение и культуру корковых астроцитов. В протоколе также подробно описывается воспроизводимый метод биопечати астроцитов, встроенных в желатин / желатин метанрилоил (GelMA) / фибриноген, дополненный ламинином. В этой работе биопринтер на основе экструзии использовался для печати композиции биоматериала, содержащей корковые астроциты при плотности 1 х 106 клеток/мл. Напряжение сдвига биопечати было сведено к минимуму за счет контроля скорости печати, а астроциты показали высокую жизнеспособность после процесса. Биопечатные конструкции культивировали в течение 1 недели, и астроциты смогли распространяться, прикрепляться и выживать в гидрогеле, сохраняя астроцитарную морфологию и экспрессируя специфический маркер глиального фибриллярного кислого белка (GFAP)4.
Эта процедура совместима с биопринтерами на основе экструзии с поршневым приводом и может быть использована для биопечати астроцитов, полученных из разных источников. Предложенная здесь 3D-биопечатная модель подходит для широкого спектра применений нейронной инженерии, таких как исследования механизмов, участвующих в функциональности астроцитов в здоровых тканях и понимание прогрессирования неврологических патологий и развития лечения.
Технология 3D-биопечати появилась как альтернатива биофабрикации, которая позволяет создавать усовершенствованные конструкции, которые структурно и физиологически напоминают нативныеткани 22,включая мозг23. Биофабрикация нервно-подобных тканей позволяет ?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Исследовательским фондом Сан-Паулу (FAPESP), номера грантов 2018/23039-3 и 2018/12605-8; Национальный совет по научно-техническому развитию (CNPq), номера грантов 465656/2014-5 и 309679/2018-4; и Координация по совершенствованию кадров высшего образования (CAPES), финансовый код 001.
3D Bioprinter | 3D Biotechnology Solutions | Extrusion-based bioprinter | |
Blunt-tip forceps | Integra Miltex | 6–30 | Forceps for brain dissection previously sterilized |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Protease free, fatty acid free, essentially globulin free |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
Cell culture flask | Fisher Scientific | 156340 | Culture flask T25 |
Cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | Cell strainer 40 µm |
Confocal microscope | Leica | Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system | |
Conical tubes | Thermo Scientific | 339651, 339652 | Sterile tubes of 15 mL and 50 mL |
DAPI | Abcam | ab224589 | DAPI staining solution |
DMEM/F12 | Gibco; Life Technologies Corporation | 12500062 | DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
Dyalisis tubing | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14 kDa |
Ethanol | Fisher Scientific | 64-15-5 | Reagent grade |
Fetal Bovine Serum | Gibco; Life Technologies Corporation | 12657011 | Research Grade |
Fibrinogen | Sigma-Aldrich | 9001-32-5 | Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma |
Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | Gelatin powder from porcine skin |
Glycine | Sigma-Aldrich | 56-40-6 | Glycine powder |
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 14175095 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 56-85-9 | L-Glutamine crystalline powder |
Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl |
Live dead kit cell imaging kit | Thermo Scientific | R37601 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 760-93-0 | For GelMA preparation |
Microtubes | Corning Incorporated | MCT-150-C | Microtubes of 1,5 mL |
NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
Needle 22G | Fisher Scientific | NC1362045 | Sterile blunt needle |
Operating scissor | Integra Miltex | 05–02 | Sharp scissor for brain dissection previously sterilized |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde powder |
Penicillin/Streptomycin | Gibco; Life Technologies Corporation | 15070063 | Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin) |
Petri dish | Corning Incorporated | 430591, 430588 | Sterile petri dishes of 35 and 100 mm |
Phalloidin | Abcam | ab176753 | iFluor 488 reagent |
Photoinitiator | Sigma-Aldrich | 106797-53-9 | 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone |
Phosphate buffer saline (PBS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 10010023 | PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000 |
Primary antobody | Abcam | ab4674 | Chicken polyclonal to GFAP |
Secondary antibody | Abcam | ab150176 | Alexa fluor 594 anti-chicken |
Spatula | Miltex | V973-70 | Number 24 cement spatula previously sterilized |
Stereomicroscope | Fisherbrand | 3000038 | Microscope for brain dissection |
Syringe 5 mL | BD | 1222C84 | Sterile syringe |
Syringe filter 2 µm | Fisher Scientific | 09-740-105 | Polypropylene filter for sterilization |
Thrombin | Sigma-Aldrich | 9002–04-4 | Thrombin cristalline powder from bovine plasma |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Laboratory grade |
Trypsin-EDTA | Gibco; Life Technologies Corporation | 15400054 | Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS |
Versene solution | Gibco; Life Technologies Corporation | 15040066 | Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS |
Well plate | Thermo Scientific | 144530 | Sterile 24-well plate |