Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

3D Bioprinting af Murine Kortikale Astrocytter til Engineering Neural-lignende Væv

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo

Summary

Her rapporterer vi en metode til 3D bioprinting murine kortikale astrocytter til biofabricating neural-lignende væv til at studere funktionaliteten af astrocytter i centralnervesystemet og de mekanismer, der involverer gliaceller i neurologiske sygdomme og behandlinger.

Abstract

Astrocytter er gliaceller med en væsentlig rolle i centralnervesystemet (CNS), herunder neuronal støtte og funktionalitet. Disse celler reagerer også på neurale skader og virker for at beskytte vævet mod degenerative hændelser. In vitro-undersøgelser af astrocytters funktionalitet er vigtige for at belyse de mekanismer, der er involveret i sådanne hændelser, og bidrage til at udvikle behandlinger til behandling af neurologiske lidelser. Denne protokol beskriver en metode til biofabricate en neural-lignende væv struktur rig på astrocytter ved 3D bioprinting astrocytter-laden bioink. En ekstruderingsbaseret 3D-bioprinter blev brugt i dette arbejde, og astrocytter blev udvundet fra C57Bl/6 mus hvalpe hjerne cortices. Bioinken blev fremstillet ved at blande kortikale astrocytter fra op til passage 3 til en biomaterialeopløsning bestående af gelatine, gelatine-methacryloyl (GelMA) og fibrinogen, suppleret med laminin, som præsenterede optimale bioprinting betingelser. 3D-bioprintforholdene minimerede cellestress og bidrog til astrocytternes høje levedygtighed under processen, hvor 74,08% ± 1,33% af cellerne var levedygtige lige efter bioprinting. Efter 1 uges inkubation steg astrocytternes levedygtighed betydeligt til 83,54% ± 3,00%, hvilket indikerer, at 3D-konstruktionen repræsenterer et passende mikromiljø til cellevækst. Den biomateriale sammensætning tilladt celle vedhæftet fil og stimuleret astrocytisk adfærd, med celler, der udtrykker de specifikke astrocytter markør glial fibrillary surt protein (GFAP) og besidder typisk astrocytisk morfologi. Denne reproducerbare protokol giver en værdifuld metode til biofabricate 3D neural-lignende væv rig på astrocytter, der ligner cellernes indfødte mikromiljø, nyttigt for forskere, der har til formål at forstå astrocytter funktionalitet og deres forhold til de mekanismer, der er involveret i neurologiske sygdomme.

Introduction

Astrocytter er den mest rigelige celletype i centralnervesystemet (CNS) og spiller en central rolle i hjernen homøostase. Ud over vedvarende neuronal støtte, astrocytter er ansvarlige for modulerende neurotransmittere optagelse, opretholde blod - hjerne barriere integritet, og regulere neuronal synaptogenese1,2. Astrocytter har også en væsentlig rolle i CNS-inflammation, der reagerer på skader på hjernen i en proces, der fører til astrocitær reaktivitet eller reaktiv astrogliose3,4, danner et glimt ar, der forhindrer sund vævsudposition til degenerative stoffer5. Denne hændelse resulterer i ændringer i astrocytters genekspression, morfologi og funktion6,7. Derfor er undersøgelser, der involverer astrocytter funktionalitet, nyttige til udvikling af behandlinger til behandling af neurologiske lidelser.

In vitro-modeller er afgørende for at studere mekanismer relateret til neurologiske skader, og selvom vellykket isolation og todimensionel (2D) kultur af kortikale astrocytter er blevet etableret8, giver denne model ikke et realistisk miljø, der efterligner indfødte celleadfærd og reproducerer kompleksiteten af hjernen9 . I 2D-tilstand påvirker den dårlige mekaniske og biokemiske støtte, lav cellecelle- og cellematrixinteraktioner og celleudfladning, der fører til fravær af basal-apikal polaritet, cellesignaldynamik og eksperimentelle resultater, der fører til ændret cellemorfologi og genekspression, hvilket kompromitterer reaktionen på behandlinger10. Derfor er det afgørende at udvikle alternativer, der giver et mere realistisk neuralt miljø, der sigter mod at oversætte resultaterne til klinikken.

Tredimensionel (3D) cellekultur repræsenterer en mere avanceret model, der opsummerer med øgede troskabsfunktioner i organer og væv, herunder CNS11. Med hensyn til glialkultur bidrager 3D-modeller til vedligeholdelse af astrocyttermorfologi, celle basal-apikal polaritet og cellesignalering12,13. 3D bioprinting-teknologien opstod som et kraftfuldt værktøj til at biofabricate 3D levende væv på en kontrolleret måde ved at bruge celler og biomaterialer til at genskabe strukturen og egenskaberne af indfødte væv. Brugen af denne teknologi har ført til en betydelig forbedring af resultaterne forudsigelse og har bidraget til regenerativ medicin anvendes til CNS14,15,16.

Protokollen beskrevet her beskriver isolation og kultur kortikale astrocytter. Protokollen beskriver også en reproducerbar metode til bioprint astrocytter indlejret i gelatine / gelatine methacryloyl (GelMA) / fibrinogen, suppleret med laminin. I dette værk blev en ekstruderingsbaseret bioprinter brugt til at udskrive biomaterialesammensætningen, der indeholder kortikale astrocytter med en massefylde på 1 x 106 celler/mL. Bioprinting forskydningsstress blev minimeret ved at kontrollere udskrivningshastigheden, og astrocytter viste høj levedygtighed efter processen. Bioprintede konstruktioner blev kultiveret i 1 uge, og astrocytter var i stand til at sprede, vedhæfte og overleve inden for hydrogelen, opretholde den astrocytiske morfologi og udtrykke en bestemt markør glial fibrillary surt protein (GFAP)4.

Denne procedure er kompatibel med stempeldrevne ekstruderingsbaserede bioprintere og kan bruges til bioprint astrocytter afledt af forskellige kilder. Den 3D bioprintede model, der foreslås her, er velegnet til en bred vifte af neurale tekniske applikationer, såsom undersøgelser af de mekanismer, der er involveret i astrocytterfunktionalitet i sundt væv og forståelse af udviklingen af neurologiske patologier og behandlingsudvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer vedrørende dyr fulgte internationale retningslinjer for dyrebrug i forskning (http://www.iclas.org) og blev godkendt af Udvalget for Etik i Forskning i Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019 / 9292090519).

1. Mus hjerne dissektion

  1. Overfør 10 mL kold Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) til en 100 mm kulturskål og 1 mL til en 1,5 mL microtube. Forbered en mikrotube pr. Dyr.
    BEMÆRK: Både kulturskålen og mikrotuben skal opbevares på is.
  2. Forbered astrocytter kulturmedium ved hjælp af DMEM F12 + 10% Føtalt Kvæg Serum (FBS), 2% glutamin, og 1% Penicillin-Streptomycin (P / S). Sterilisere mediet ved at filtrere ved hjælp af et 0,2 μm filter.
  3. Aflive C57Bl/6 mus hvalpe (postnatal dag 1) ved halshugning ved hjælp af en skarp driftssak. Brug sammenkive, træk huden og udsætte kraniet. Sørg for, at både saks og sammenk tvinger steriliseres med 70% ethanol.
  4. Skær kraniet fra foramen magnum til toppen af hovedet langs sagittal plan ved hjælp af en skarp buet spids saks.
    BEMÆRK: Sørg for, at det encefaliske væv ikke er beskadiget.
  5. Brug en spatel, der tidligere var steriliseret med ethanol 70%, løft hjernen fra kraniehulen og læg den i kulturskålen, der indeholder 10 mL kold HBSS.
  6. Placer kulturskålen, der indeholder hjernen under stereomikroskopet, og fjern meningerne fra hjernen ved hjælp af to stumpspids-sammenkrøkker (Figur 1).
  7. Adskil cortices fra resten af hjernen ved forsigtigt at rulle dem væk fra medianlinjen i hjernen ved hjælp af en spatel.
  8. Saml begge cortices og straks overføre dem til den samme microtube, der indeholder 1 mL kold HBSS.

2. Astrocytter isolation og kultur

  1. Under laminar flow, skære kortikale væv i små stykker ved hjælp af en buet mikro saks, og vask dem med 1 mL AF HBSS ved pipetter op og ned 3x. Vent på, at vævet falder til ro. Fjern HBSS, og tilføj frisk HBSS, og gentag processen to gange mere.
  2. Fjern HBSS og inkuber vævet med 1 minut 0,05% trypsin ved 37 °C i 5 min.
    BEMÆRK: Kun trypsin fordøjelse er tilstrækkelig på dette tidspunkt.
  3. Afsykning af vævet ved forsigtigt at pipetter op og ned 15x.
    BEMÆRK: Den fuldstændige dissociation af vævet observeres ved stigningen i suspensionen uklarhed og ved fraværet af store fragmenter af væv i suspensionen.
  4. Opløsningen overføres til et 15 mL konisk rør, neutralisere trypsinaktiviteten ved at tilføje et tilsvarende volumen FBS, og filtrer opløsningen i et cellesienfilter på 0,4 μm for at fjerne ikke-adskilte fragmenter.
  5. Filteret vaskes med 1 mL astrocytter med et medium, celleaffjedringen, der passerede gennem sien, og centrifugere det i 5 min ved 200 x g og 25 °C. Efter centrifugering skal supernatanten kasseres og suspendere pelleten i 1 mL astrocytter kulturmedium.
  6. Celleaffjedringen overføres til en T25-kulturkolbe, med et mediumfang udgør 3,5 mL, og cellerne inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2.
  7. Sørg for, at cellerne efter 24 timer er klæbende. Derefter udskiftes mediet og ændrer det hver 3. dag.
  8. Efter 7 dage fjernes mikroglia og oligodendrocytter fra kulturen ved at vaske cellerne med 2 mL 1x PBS.
  9. Udskift PBS-opløsningen med astrocytterkulturmediet, og lad kulturkolben stå i en orbital shaker ved 180 omdr./min natten over.
    BEMÆRK: Astrocytter danner et sammenflydende monolag i ca. 10-12 dages kultur.

3. Syntese af gelatine methacryloyl (GelMA)

  1. 10 g gelatine fremstillet af svineskind og opløses i 100 ml PBS ved at lade opløsningen røre på en varmeplade ved 240 omdr./min. og 50 °C, indtil opløsningen er fuldstændig opløst.
  2. Under en hætte tilsættes 2 ml methacrylic anhydrid (MA) for en lav grad af funktionalisering, og lad gelatinemulsion røre ved 240 rpm og 50 °C i 2 timer.
    FORSIGTIG: MA-faresætning: H302 + H332 (skadelig, hvis den sluges eller indåndes), H311 (giftig i kontakt med huden), 314 (forårsager alvorlige hudforbrændinger og øjenskader), 315 (forårsager hudirritation), H317 (kan forårsage en allergisk hudreaktion), H318 (forårsager alvorlig øjenskade), 331 (giftig, hvis de indåndes), H332 (skadelig, hvis den indåndes), H335 (kan forårsage åndedrætsirritation). Retningslinjer for håndtering: P261 (undgå indånding af støv/røg/gas/tåge/dampe/spray), P305 + P351 + P338 + P310 (HVIS I ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern kontaktlinser, hvis de er til stede og nemme at gøre. Ring straks til et POISON CENTER/doctor), P301 + P312 + P330 (HVIS DU SLUGES: Ring til et POISON CENTER/læge, hvis du føler dig utilpas. Skyl munden).
    BEMÆRK: Tilføj MA meget langsomt, dråbe for dråbe.
  3. Gelatine-MA-opløsningen fortyndes i 100 ml forvarmet PBS (50 °C) for at opnå 200 ml slutvolumen og lad opløsningen røre ved 240 omdrejninger og 50 °C i 10 min.
  4. Skær ~ 20 cm dialysemembran (molekylær cutoff 12-14 kDa) og blød den i deioniseret vand, indtil den er blød.
    BEMÆRK: Fyld membranerne med deioniseret vand for at sikre, at der ikke er huller eller defekter.
  5. Ved hjælp af en tragt overføres gelatine-MA-opløsningen til membranerne.
    BEMÆRK: Luk begge sider, så der er ekstra plads indeni for at tillade blanding.
  6. Anbring membranerne, der indeholder gelatine-MA-opløsningen, i en beholder med 2 L destilleret vand til dialyse, så de kan røres ved 40 °C i 5 dage (500 omdrejninger).
    BEMÆRK: Dæk beholderen til for at undgå vandfordampning.
  7. Skift det destillerede vand to gange om dagen. Hver gang vendes membranerne på hovedet for homogenisering.
  8. På den femte dag blandes 200 ml forvarmet ultrapurt vand (40 °C) til den dialyzed gelatine-MA, og lad det røre i 15 min ved 40 °C.
  9. Gelatine-MA-opløsningen overføres til 50 ml koniske rør på op til 25 ml og lad rørene forblive ved -80 °C i 2 dage.
    BEMÆRK: Opbevar rørene vandret for at lette lyfiliseringen.
  10. Lyophilize de frosne opløsninger i 3-5 dage og gemme den lyophilized GelMA beskyttet mod fugtighed.

4. Bioink forberedelse

BEMÆRK: For at opnå 1 mL bioink anbefales det at fremstille mindst 3 mL biomaterialeopløsning, da der kan være tab under filtrering.

  1. Fremstilling af fibrinogenopløsning
    1. Saltvandsopløsning (NaCl 0,9%) i deioniseret vand og opløs 10 mg fibrinogen fra kvægplasma i 1 mL af saltvandsopløsningen for at opnå en koncentration på 10 mg/mL.
      BEMÆRK: Som fibrinogen adsorber til glas, må du ikke bruge glasflasker til at forberede fibrinogen opløsning.
    2. Opløsningen efterlades under omrøring ved 37 °C, indtil fibrinogen opløses fuldstændigt.
      BEMÆRK: Ved fibrinogenopløsning skal du bruge et roterende system, der er anbragt inde i en ovn ved 37 °C. Magnetisk omrøring (180 rpm) af fibrinogen på en kogeplade ved 37 °C er også velegnet. Under denne betingelse tager 10 mg/mL fibrinogen ca. 40 min at opløse.
  2. Fremstilling af gelatine/GelMA-opløsning
    1. 0,12 g gelatine og tilsæt den til 1,9 ml forvarmet PBS (40 °C) for at opnå en endelig koncentration på 4% (w/v) gelatine. Vortex for at lette opløsningen.
    2. Emulsionen holdes ved 40 °C, indtil den er fuldstændig opløst.
    3. Afvej 0,06 g lyophilized GelMA og overførsel til gelatineopløsningen for at opnå en endelig koncentration på 2% (w/v) GelMA. Vortex for at lette opløsningen.
    4. Hold opløsningen ved 40 °C, indtil opløsningen er fuldstændig opløst.
  3. Fremstilling af astrocytterbelastet gelatine/GelMA/fibrinogen bioink
    1. Pipette 0,9 ml af 10 mg/ml fibrinogenopløsningen og overføres til gelatine/GelMA-opløsningen for at opnå en endelig koncentration på 3 mg/ml fibrinogen.
    2. Veje 0,015 g fotoinitiator (PI) og overførsel til gelatine /GelMA/fibrinogen opløsning for at opnå en endelig koncentration på 0,5% (w /v) PI. Bland opløsningen ved at vende røret op og ned og holde det ved 40 °C beskyttet mod lys for at undgå PI-nedbrydning.
      BEMÆRK: Biobanen fyldes ved 4 °C i højst 24 timer.
    3. Under laminarstrømmen filtreres opløsningen ved hjælp af et 0,2 μm filter i et sterilt 15 mL konisk rør.
      BEMÆRK: Biomaterialeopløsningen skal være ved 37-40 °C for at muliggøre filtrering.
    4. 980 μL af biomaterialeopløsningen overføres til et 15 mL konisk rør.
    5. Fortynd laminin i saltvandsopløsning for at opnå en lageropløsning på 100 μg/mL.
    6. Pipette 20 μL laminin og overføres til røret, der indeholder bioinken, for at opnå en endelig koncentration på 2 μg/mL laminin.
    7. Bland forsigtigt ved pipetter op og ned, undgå bobler. Hvis der er bobler, centrifugere det koniske rør ved 200 x g i 2 min. Hold biobanen ved 37 °C, indtil den blandes med cellerne.
    8. Trypsinize primære astrocytter med 0,05% trypsin i 5 min.
      BEMÆRK: Brug astrocytter fra passager 1 til 3.
    9. Neutralisere trypsinaktiviteten med FBS i et forhold på 1:1 og overfør cellerne til et 15 mL konisk rør. Centrifuge det på 200 x g i 5 min.
    10. Tæl cellerne og overfør 1 x 106 celler til et andet konisk rør. Centrifuge det på 200 x g i 5 min.
    11. Fjern supernatanten, der efterlader et lille volumen (~ 200 μL) for at suspendere cellepillen ved forsigtigt at trykke på bunden af det koniske rør.
    12. 1 ml gelatine/GelMA/fibrinogenopløsning overføres til røret, der indeholder cellerne, og pipettes forsigtigt op og ned for at homogenisere og opnå en endelig koncentration på 1 x 106 celler/ml.

5. Forberedelse af crosslinkeropløsningen

  1. Trombin rekonstitution
    1. Der fremstilles en lageropløsning på thrombin 100 U/mL i sterilt deioniseret vand med 0,1% (w/v) kvægserum albumin (BSA) i et 15 mL konisk rør. Lager i mikrorør ved -20 °C.
      BEMÆRK: Som thrombin adsorbs til glas, må du ikke bruge glasflasker til at forberede lageropløsningen eller opbevare aliquots.
  2. Forberedelse af thrombin-CaCl2 opløsning
    1. Pipette 100 μL trombinlageropløsning og overførsel til et 50 mL konisk rør, der indeholder 8,9 mL sterilt deioniseret vand for at opnå en endelig koncentration på 1 U/mL thrombin.
    2. Der fremstilles en 10% (w/v) CaCl2-opløsning i deioniseret vand, og steriliseres ved hjælp af et 0,2 μm filter.
    3. Overfør 1,1 mL af 10% CaCl2-opløsningen til det koniske rør, der indeholder thrombin, for at opnå et endeligt forhold på 1:9 (CaCl2 til thrombin).
      BEMÆRK: Forbered crosslinker-løsningen på den diskenhed, der skal bruges i eksperimentet, så du undgår opbevaring.

6. Bioprinting astrocytter-laden bioink ved hjælp af en ekstrudering-baseret bioprinter

  1. Design af neurale væv
    1. Brug af G-koden: Konstruere et gitter på 6 x 6 mm (kvadreret form) med 1 mm afstand mellem hver bioprintet linje på X- og Y-aksen og 6 lag på Z-aksen (0,2 mm mellem hver linje); indstille ekstrudering (E) til 0,01 mm, hvilket øges 0,001 mm ved hvert nyt lag af Z-aksen og indstil udskrivningshastigheden (F) til 400 mm/min (Supplerende oplysninger).
  2. Opsætning af bioprinter
    1. Udsæt maskinen for UV-lys i 15 min, og tør den derefter af med ethanol 70%.
    2. Tænd for bioprinteren ved hjælp af afbryderen. Tilslut maskinen til computeren via et USB-kabel. Åbn den styrende software for at forbinde den til bioprinteren, og indlæs fildesignet.
  3. Forberedelse af sprøjten til bioprint
    1. Overfør den astrocytterbelastede gelatine/GelMA/fibrinogen bioink til en 5 ml plastsprøjte med en 1.000 μL pipette.
      BEMÆRK: Overfør langsomt for at undgå bobledannelse.
    2. Tilslut en steril 22 G stump nål til sprøjten.
      BEMÆRK: Lad sprøjten stå ved 4 °C i 2 min.
    3. Tilslut sprøjten til bioprinter printhovedet og skyl manuelt bioinken for at fjerne de resterende bobler.
  4. Bioprint
    BEMÆRK: Bioprintningen blev udført uden for laminarhætten.
    1. Placer en 35 mm kulturskål på bioprinterbordet, og anbring nålen 0,1 mm væk fra kulturskålens overflade for at tillade kanylens bevægelse.
      BEMÆRK: Brug en 35 mm kulturfad til hver bioprinting.
    2. Tryk på knappen Udskriv.
    3. Når bioprintet er overstået, skal du sørge for, at sprøjten bevæger sig væk fra fadet. Luk derefter kulturskålen og forbered dig på crosslinking-processen.
      BEMÆRK: Bioprinting af en konstruktion tager ca. 1 min og 10 s.
  5. Krydskædning af den bioprintede konstruktion og kultur
    1. Placer kulturskålen under UV-lys ved 2 mW/cm2 for 2 x 60 s (op og ned) til GelMA crosslinking.
    2. Under laminar flow, overføre bioprintet konstruktion til en 24-brønd plade ved hjælp af en steril spatel.
    3. Tilsæt 500 μL thrombin/CaCl2 opløsning og lad i 30 min at tillade fibrin crosslinking.
    4. Fjern crosslinkløsningen, og vask konstruktionen med 2 mL PBS 1x. Derefter udskiftes PBS med 1 mL astrocytter kulturmedium og inkuberes ved 37 °C og 5% CO2. Skift medium hver 3. dag.

7. Vurdering af astrocytter levedygtighed

  1. Levedygtigheden af bioprintede astrocytter
    1. Overfør den bioprintede konstruktion til en 35 mm kulturskål ved hjælp af en spatel.
    2. Vask konstruktionen med 1 mL 1x PBS.
    3. Sæt 100 μL af det levende/døde reagens over konstruktionen og hold det ved 37 °C i 30 min, så det holdes beskyttet mod lys.
    4. Fjern Live/Dead reagenset og vask konstruktionen med 1 mL 1x PBS.
    5. Prøven overføres til en konfokal skål ved hjælp af en spatel, og observere cellerne i konstruktionen under et konfokalt mikroskop ved hjælp af 488 og 570 nm excitation for billeder erhvervelse.
      BEMÆRK: Brug en forstørrelse på 10x til en samlet visualisering af cellerne i konstruktionen.
    6. Sørg for, at prøven sidder fladt. Hvis det er nødvendigt, skal du placere en coverlip over prøven for at øge fladheden.
      BEMÆRK: Sørg for, at konfokalfadet er godt forseglet for at forhindre, at prøven tørrer ud.
    7. Beregn antallet af levedygtige (grønne) og døde (røde) ved hjælp af en beregningssoftware.
  2. Levedygtigheden af 2D astrocytter kultur
    1. Frø 0,5 x 106 astrocytter (passage 1-3) i en 35 mm konfokal skål, tilsæt astrocytter medium, og inkuberes ved 37 °C og 5% CO2.
    2. Når cellerne er sammenflyttede, skal du fjerne kulturmediet og vaskes med 1 mL 1x PBS.
    3. Sæt 200 μL af det levende/døde reagens, og opbevar fadet ved 37 °C i 30 min, beskyttet mod lys.
    4. Fjern Live/Dead reagenset og vask cellerne med 1 mL 1x PBS.
    5. Tag fadet til et konfokalt mikroskop kombineret med et digitalt kamera, og brug 488 og 570 nm excitation til billederhvervelse.
    6. Beregn antallet af levedygtige (grønne) og døde (røde) ved hjælp af en beregningssoftware.

8. Immunstaining af astrocytter

  1. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) farvning af 3D bioprintede astrocytter
    BEMÆRK: For at undersøge tilstedeværelsen af andre cellemarkører skal du ændre det primære antistof i overensstemmelse hermed.
    1. Fjern mediet fra brønden og vask konstruktionen med 1 mL 3x PBS.
    2. Der tilsættes 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS til brønden, indtil konstruktionen er helt dækket, og lad den stå i 2 timer ved 4 °C.
    3. Fjern PFA og vask konstruktionen med 1 mL 3x PBS.
      BEMÆRK: Denne procedure kan sættes på pause i flere måneder, hvis den opbevares ved 4 °C i PBS. Sørg for, at brøndpladen er forseglet for at undgå PBS fordampning.
    4. Prøven behandles med glycin 0,1 mol/L i 5 min.
    5. Vask med 1 mL 1x PBS i 5 min.
    6. Permeabilisere prøven med PBS indeholdende 0,1% Triton X-100 og 10% FBS i 1 time ved 25 °C under orbital agitation.
    7. Inkuberes konstruktionen med kylling anti-GFAP (primær antistoffortynding 1:500) ved 4 °C natten over.
    8. Aspirere det primære antistof og vaske prøven med 1 mL PBS i 5 min, 3 gange.
      BEMÆRK: Primært antistof kan genbruges flere gange, når det opbevares ved 4 °C.
    9. Inkuberes prøven med Alexa fluor 488-konjugeret anti-kylling (sekundær antistoffortynding 1:500) og 1 μg/mL DAPI i 1 time ved 25 °C under orbital agitation.
      BEMÆRK: Hold prøven beskyttet mod lys.
    10. Prøven vaskes med 1 minut PBS i 5 min. 3 gange.
    11. Overfør konstruktionen til en 35 mm konfokal skål.
      BEMÆRK: Sørg for, at fadet er godt forseglet for at forhindre, at prøven tørrer ud.
  2. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) farvning af 2D astrocytter kultur
    1. Frø 0,5 x 106 astrocytter (passage 1-3) i en 35 mm konfokal skål, tilsæt astrocytter medium, og inkuberes ved 37 °C og 5% CO2.
    2. Når cellerne er sammenflyttede, skal du fjerne kulturmediet og vaske dem med 1 mL 1x PBS.
    3. Gentag trin 8.1.2-8.1.10.
  3. Astrocytter cytoskeleton farvning
    1. Gentag trin 8.1.1-8.1.6.
    2. Der tilsættes 200 μL 50 μg/mL fluorescerende konjugeret phalloidinopløsning i PBS og 1 μg/mL DAPI over konstruktionen.
    3. Inkuberes i 1 time ved 25 °C under orbital agitation, så prøven beskyttes mod lys.
    4. Prøven vaskes med 1 mL PBS i 5 min 3 gange , og overfør konstruktionen til en konfokal skål ved hjælp af en spatel.
      BEMÆRK: Sørg for, at fadet er godt forseglet for at forhindre, at prøven tørrer ud.

9. Konfokal billeddannelse

  1. Tag opvasken til et konfokalt mikroskop kombineret med et digitalt kamera til billedbehandling (359, 488 og 570 nm excitation).
  2. Brug forstørrelse på 10x til en samlet visualisering og 40 eller 63x til zoomede billeder af celler.
    BEMÆRK: Sørg for, at prøven sidder fladt. Hvis det er nødvendigt, skal du placere en coverlip over prøven for at øge fladheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette arbejde havde til formål at udvikle en neural-lignende væv ved hjælp af 3D bioprinting teknologi til at deponere lag-for-lag primære astrocytter-laden gelatine / GelMA / fibrinogen bioink. Astrocytter blev ekstraheret og isoleret fra hjernebarken hos mus hvalpe (Figur 1), føjet til en biomateriale sammensætning, så biofabrikation af en levende 3D-konstruktion.

Det computerstøttede design (CAD) blev udviklet ved hjælp af G-koden (supplerende fil) som en sammenkoblet ramme af firkantet form (0,6 x 0,6 mm) med porer på 1 mm, der har til formål at lette spredningen af næringsstoffer og ilt. Rammen bestod af 6 lag placeret oven på hinanden, skiftende i en vinkel på 90 ° i hvert lag (Figur 2A i). Den konstruerede struktur var i besiddelse af ca. 5 mm høj (Figur 2A ii), hvilket gjorde det muligt at manipulere med væv. Bioinksammensætningen gjorde det også muligt at fremstille konstruktioner af forskellige former (figur 2B).

Forberedelsen af bioinken bestående af gelatine, GelMA og fibrinogen bestod af to krydslinktrin. For det første blev GelMA krydslinket under UV-lys, hvor inter- og intramolekulære kovalente bindinger dannes, efterfulgt af fibrin crosslinking. I dette trin, thrombin enzymatisk kløver fibrinogen kæder, hvilket resulterer i dannelsen af fibrin fibre17, en reaktion stabiliseret af Ca2 + ioner18. Derefter danner GelMA- og fibrinfibre et stabilt interpenetreret polymernetværk (IPN) suppleret med laminin, passende støtte til celletilbehør og spredes19,20 (Figur 2C).

Før bioprinting var astrocytter efter 12 dages isolation karakteriseret ved tilstedeværelsen af GFAP, en proteinkomponent af astrocyt mellemliggende filamenter4 (Figur 3A). Derefter blev trypsiniserede astrocytter blandet med gelatine / GelMA / fibrinogenopløsning ved en tæthed på 1 x 106 celler / ml, hvilket genererer en astrocytterbelastet bioink. Bioinken blev overført til en 5 mL sprøjte, der var tilsluttet en 22 G stump nål, og som komponerede bioprinterprinthovedet (Figur 3B i). Nålen tillod bioink ekstrudering uden tilstopning og forebyggelse af høj forskydning stress til cellerne.

På grund af gelatinens viskoelastiske egenskaber, der opfører sig som en væske ved højere temperaturer og som en gel ved lavere temperaturer21, bevarede den bioprintede konstruktion formegenskaber (Figur 3B ii). Efter bioprinting af to på hinanden følgende lag bioink blev dannelsen af en veldefineret struktur observeret (Figur 3C), med celler fanget i biomaterialet.

Efter bioprinting og crosslinking processer blev konstruktionen inkuberet med astrocyt medium, og efter 1 dag med bioprinting præsenterede de fleste celler stadig en rund morfologi (Figur 3D). Bioprintede stilladser opretholdt integriteten efter 7 dages inkubation, og selv om nogle runde celler blev observeret, spredte et stort antal astrocytter sig over hele konstruktionen og præsenterede astrocytisk morfologi og sammenkobling (figur 3E).

Fordi parametrene for bioprinting, såsom hastighed, direkte kunne påvirke celle levedygtighed, forskellige bioprinting hastigheder (400, 600 og 800 mm / min) blev testet og astrocytter overlevelse evalueret ved hjælp af Live / Dead assay med calcein-AM (levende celler, grøn fluorescens) og etium homodimer-III (EthD-II) (døde celler, rød fluorescens). Procentdelen af levedygtige celler blev kvantificeret ved hjælp af en beregningssoftware ved at beregne antallet af levende og døde celler. Celle levedygtighed blev evalueret på tid 0 (lige efter bioprint), og resultaterne viste, at ved den lavere hastighed, 400 mm / min, levedygtige celler repræsenterede 74,08% ± 1,33% af de samlede celler, er betydeligt højere end celler bioprintet ved 600 og 800 mm / min (60,25% ± 1,93% og 62,94 ± 6,18%, henholdsvis) (Figur 4A). Derfor blev hastigheden på 400 mm/min brugt i dette arbejde.

Før bioprinting blev 2D-dyrkede astrocytter karakteriseret som procentdelen af levedygtige celler, og levedygtigheden af bioprintede astrocytter blev normaliseret til denne tilstand. Resultaterne viste, at 2D-kultur præsenterede 90,98% ± 0,94% af levedygtige celler. Levedygtigheden af bioprintede astrocytter (dag 7) var 83,54% ± 3,00%, svarende til 0,92 ± 0,03 af 2D-værdien, hvilket var betydeligt højere end dag 0 (0,81 ± 0,01) (Figur 4B). Billeder af astrocytter, der er farvet med det levende/døde reagens, præsenteres i figur 4Cog viser, at celler efter bioprinting havde en rund morfologi (Figur 4C i). Efter 1 uges inkubation spredes astrocytter over hele konstruktionen (figur 4C ii), der viser en særskilt morfologi af celler fra 2D-kultur ( figur4C iii).

Bioprintede astrocytter blev plettet for at vise celletæthed og cellemorfologi i konstruktionen. Figur 5A viser en bioprintet konstruktion efter 7 dages inkubation, med høj densitet af astrocytter farvet med phalloidin, en F-actin cytoskeleton farvestof. Selvom få runde celler blev observeret, præsenterede astrocytter hovedsageligt en stjernelignende morfologi. Bioprintede astrocytter viste sig at være GFAP-positive, når de blev farvet efter 7 dages bioprint, hvilket indikerer, at cellerne opretholdt deres astrocytiske fænotype (Figur 5B i). Figur 5B ii og 5B iii viser Z-stablede billeder af de bioprintede GFAP+ astrocytter i konstruktionen. Disse resultater tyder på, at bioink sammensætning forudsat en biokompatierbar mikromiljø til at fremme astrocytter 'vedhæftning, spredning, og vækst.

Figure 1
Figur 1: Udvinding af hjerne- og cortexadskillelse for primær astrocytterkultur. Primære astrocytter blev isoleret fra cortex af C57Bl/6 mus hvalpe (post-natal dag 1) hjerne. Efter at have udvundet hjernen fra dyret blev meningerne fjernet under et mikroskop, og cortex adskilt efterfulgt af væv fordøjelse og astrocytter kultur. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk illustration af 3D-bioprintningsproces. (A) CAD fil designet til 3D bioprinting af neurale væv viser (i) 2 lag, top view, og (ii) 6 lag, side view, af konstruktionen. (B) Billeder, der viser bioinkens evne til at trykke strukturer af forskellige former (i) firkantet, (ii) kapillær og (iii) stjerne. (C) Ordning af biomaterialer krydslinking efter 3D bioprint viser, hvor GelMA er crosslinked under UV-lys efterfulgt af fibrin crosslinking i en thrombin:Ca2 + bad. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: 3D boprinting af astrocytter-laden gelatine/GelMA/fibrinogen bioink. (A) Karakterisering af astrocytter efter 12 dages isolation og kultur, farves til GFAP, grøn og DAPI, blå. (B) (i) Opsætning af printhead og (ii) 3D bioprintet konstruktion lige efter bioprint. (B) Tolagskonstruktion, der viser den bioprintede ramme. Forstørrelse af 4x. (C) Billede af bioprintede astrocytter 1 dag efter bioprinting, der viser celler i en rund morfologi. (D) Billede af bioprintede astrocytter 7 dage efter bioprintprocessen, der viser celler med astrocytisk morfologi med få runde celler, hvilket angiver deres affinitet med det mimetiske væv. Forstørrelse af 10x. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Vurdering af bioprintede astrocytters levedygtighed. (A) A) Astrocytters levedygtighed bioprintet ved forskellige hastigheder. (B) Bioprintede astrocytters levedygtighed på (i) dag 0 (lige efter bioprint) og (ii) efter 7 dages bioprint, normaliseret til astrocytters levedygtighed i 2D-kulturen. Statistisk analyse ved hjælp af One-Way Anova med Tukeys test, n = 3, *p < 0,05. (C) Fluorescerende billeder af astrocytter farves med Live / Dead reagens. Bioprintede astrocytter på (i) dag 0 (lige efter bioprinting), (ii) dag 7 og (iii) 2D-kultur af astrocytter. Forstørrelse af 10x. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Karakterisering af 3D bioprintede astrocytter. Immunofluorescence af 3D bioprintede astrocytter efter 7 dages inkubation farves for (A) F-actin (phalloidin, rød) og kerner (DAPI, blå) med forstørrelse på 10x og 40x og for (B) GFAP, grøn (i) med forstørrelse af 10x,( ii) Z-stablet viser X-Y-Z aksen af bioprintet konstruktion, og (iii) billede, der viser X-Z aksen af GFAP + astrocytter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende fil. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

3D bioprinting-teknologien har vist sig som et biofabricationalternativ, der gør det muligt at konstruere raffinerede konstruktioner, der strukturelt og fysiologisk ligner indfødte væv22, herunder hjernen23. Biofabrication af neurale-lignende væv giver mulighed for in vitro native mikromiljø modellering, er et vigtigt redskab til at forstå de cellulære og molekylære mekanismer forbundet med udvikling og behandling af mange sygdomme, der påvirker CNS11. På grund af den vigtige rolle, som glialceller i neural funktionalitet, kortikale astrocytter er blevet brugt i mange undersøgelser, såsom hjernens udvikling24, biomolekyler transport25, neurite udvækst26, og i hjerne-lignende væv biofabrikation14.

Metoder til ingeniørarbejde 3D-kultur af astrocytter blev rapporteret tidligere ved hjælp af forskellige biomaterialer og stilladsteknikker27,28,29. Tilsvarende blev der også rapporteret en metode til 3D-bioprinting human induceret pluripotente stamceller (hiPSCs)-afledte neurale aggregater og viste disse bioprintede cellers evne til at differentiere og modne in vitro30. Der er dog ingen rapporter om metoder til biofabrikation af 3D brioprintede astrocytter konstruktioner i litteraturen. Derefter havde denne protokol til formål at beskrive en reproducerbar metode til 3D bioprinting kortikale astrocytter.

I denne protokol blev astrocytter isoleret fra cerebrale cortices af C57Bl/6 mus hvalpe, en dyremodel, der i vid udstrækning anvendes i forskning31,32, som kan erstattes af astrocytter afledt af andre kilder, såsom hiPSCs og rygmarv. Efter isolation, kultur og subkultur forbliver astrocytter i en proliferativ tilstand op til passage 3, hvilket er det maksimale antal opdelinger, der anbefales på grund af deres iboende begrænsning af spredning8. Det blev verificeret, at spredningen af astrocytter fra passage 4 var begrænset, idet det var vanskeligt at opnå den ønskede mængde celler til 3D-bioprinting.

I den beskrevne metode blev der anvendt en koncentration på 1,0 x 106 celler/ml biomaterialeopløsning som et proof of concept til at evaluere cellernes evne til at overleve bioprintprocessen og til at opretholde deres levedygtighed og iboende egenskaber under kulturen i hydrogelen. I det foregående arbejde blev et 3D bioprintet neuralt-lignende væv biofabricated af co-culturing astrocytter og neuroner, og for at øge cellulær interaktion var astrocytterkoncentrationen 8,0 x 106 celler / mL14. Derefter kan koncentrationen af celler optimeres til specifikke undersøgelser.

En bioink til 3D bioprinting består af celler og et biomateriale eller en kombination af biomaterialer33. I denne protokol blev der anvendt en kombination af gelatine/GelMA/fibrinogen, som viste sig at være gunstig for både bioprint og opretholdelse af astrocytter i kulturen. Produktionen af en bioprintbar bioink er udfordrende, når du bruger ekstruderingsbaseret bioprinting-teknik. Biomaterialesammensætningen skal have viskoelastiske egenskaber, der samtidig tillader ekstrudering af bioinken, samtidig med at 3D-formen bevares efter trykprocessen34. Derudover bør det være i stand til at opretholde celle levedygtighed under processen, som afhængigt af bioprinting betingelser, kan forårsage forskydning stress til cellerne, der fører til døden35.

Bioprintbarhed blev sikret ved gelatine, et biomateriale, der besidder optimale viskoelastiske egenskaber på grund af sin sol-gel overgangskapacitet36. Dette gør det muligt gelatine makromolekyler at omarrangere og opføre sig som en væske under ekstrudering, og som en gel efter bioprinting, opretholde 3D-struktur. Hertil kommer, som en kollagen derivat, gelatine består af glycin-aminosyre peptid triplet gentagelser, som sikrer celle-specificitet21. Intra- og intermolekylær bindinger af gelatine er imidlertid svage, og på grund af dens termoreversibilitet har gelatine ingen stabilitet ved 37 °C, der frigives fra konstruktionen under cellekulturen. Derfor blev GelMA et alternativ som en stabil hydrogel på grund af de kovalente bindinger, der blev dannet efter UV-lysudstilling, og opretholdt cellespecifikitetsegenskaber19. GelMA's fysiske egenskaber, såsom porøsitet, nedbrydning og elastisk modulus, kan indstilles, så de passer til forskellige vævstekniske applikationer19. Stivheden af GelMA stilladser kan styres ved at variere methacryloyl substitution37, gør det muligt at opnå en stivhed svarende til det væv, der skal modelleres. Det vil sige, ved at reducere graden af funktionalisering, kan en lavere stivhed opnås37. Derfor blev der på grund af blødheden i musehjernen38,39 og den direkte effekt af ekstracellulær matrix (ECM) stivhed på celleadfærd40, i denne protokol foreslået en lav grad af gelatinefunktionalisering. I de tidligere værker, evnen af GelMA hydrogels til at efterligne CNS fysiske funktioner, viser høj egnethed til dyrkning astrocytter, neuroner, og neurale stamceller14,41,42 blev rapporteret.

Udover GelMA, fibrinogen, en indfødt biopolymer, der danner fibrin fibre gennem enzymatisk reaktion, har også været meget udbredt til biofabricate neurale-lignende væv, der viser høj specificitet og tilbyder en passende mikromiljø for neurale celler til at vedhæfte og vokse30,43,44. Andre biomaterialer, såsom alginat og chitosan er blevet brugt til bioprint neurale-lignende væv, blandet til gelatine, GelMA, og / eller fibrinogen, der har til formål at forbedre printbarhed og fysiske egenskaber af 3D stilladser14,30. I den nuværende metode blev der opnået en optimal bioprintbarhed, fysisk stabilitet og cellespecifikitet ved hjælp af gelatine, GelMA og fibrinogen som komponenter i bioinken. For at øge astrocytternes anerkendelse af mikromiljøet blev laminin-en komponent i hjernen ECM-brugt til at supplere bioinken.

I denne protokol blev gelatine anvendt i en koncentration på 4% (w/v), hvilket gjorde det muligt at skifte sol-gel af bioinken ved 25 °C inden for ca. 10 min. En hurtigere gelering kan opnås ved at øge koncentrationen af gelatine. Sterilisering ved filtrering ved hjælp af 0,2 μm filter kan dog kompromitteres. Bioinkfiltrering er et kritisk skridt, der kontrollerer, at højere koncentrationer af gelatine (>5% w /v) kan forhindre filtrering. Et alternativ til at opnå et hurtigere gelationspunkt under bioprinting er at lade sprøjten indeholde bioinken stå ved 4 °C i 2 min, før den tilsluttes ved bioprinterprinthovedet. Efter bioprint er det afgørende at opretholde konstruktionen ved 25 °C for at undgå at destabilisere 3D-strukturen og opretholde en geleret tilstand før UV-redegørelse. Især skal konstruktionen være solid, når fibrinogen crosslinkeropløsningen tilsættes til pladen. For GelMA crosslinking er det vigtigt at vende prøven (2 x 60 s hver side) for at sikre UV-redegørelse i hele konstruktionen. For fibrinogen crosslinking skal crosslinkeropløsningen dække konstruktionen helt. Derfor skal lydstyrken justeres, hvis du bruger en større skål eller plade. Efter krydsning skal hydrogelen se homogen ud under fasekontrastmikroskopi, og cellerne skal være homogent fordelt i hele konstruktionen og have en rund morfologi.

Denne protokol gjorde det muligt for gelatine / GelMA / fibrinogen bioink at udskrive strukturer af forskellige former, opretholde integriteten og 3D-formen af konstruktionerne. På grund af temperaturbegrænsningerne til at nå 25 °C inde i laminarstrømmen blev bioprintningen udført i kulturrummet uden for laminarstrømmen. Bioprinttiden var ca. 1 min for hver prøve, og der blev ikke observeret nogen forurening under cellekulturen.

Celleintegritet kan påvirkes af bioprinting på grund af forskydningsstress forårsaget i processen35. Dette kan styres ved at optimere udskrivningsparametre, f.eks. I dette arbejde blev forskellige bioprinthastigheder testet, 400, 600 og 800 mm / min, hvilket observerede et betydeligt fald i celle levedygtigheden, når hastigheden blev øget fra 400 til 600 mm / min. Ved 400 mm/min forblev ca. 74 % af cellerne levedygtige efter bioprint, og denne værdi steg betydeligt efter 7 dages inkubation (>80 %). Derfor blev lavere hastigheder ikke brugt for at undgå overdreven udstilling af celler til miljøet. 2D-kulturen af astrocytter viste højere levedygtighed (~ 90%) sammenlignet med de bioprintede celler. Men som det fremgår af fluorescerende billeder, er morfologi påvirket af den type kultur. Mens 2D-celler var flade, havde astrocytter i 3D-miljø en stjernelignende form, der forbinder med hinanden ved cellulære processer.

Især var det mimetiske mikromiljø gunstigt for kortikale astrocytterkultur, da celle levedygtigheden steg betydeligt efter 1 uge, hvilket tyder på cellespredning inden for konstruktionen. Laminin, et glycoprotein til stede i hjernen ECM, blev tilføjet til bioink sigter mod at opnå en højere tilslutning af astrocytter til hydrogel14. Cytoskeleton F-actin farvning viste, at bioprintede astrocytter var i høj densitet i konstruktionen, hvilket indikerer, at cellekoncentrationen, der anvendes i denne protokol, tillod astrocytter sammenkobling. Immunohistochemistry for GFAP lokalisering, en markør korreleret med astrocytter 'omfattende arborization og celle hypertrofi45, bekræftet af F-actin farvning, viste, at celler præsenteret typisk astrocytisk morfologi, hvilket indikerer, at mimetiske 3D-system var gunstigt for celler til at vedhæfte og opføre sig som i deres oprindelige miljø.

Protokollen, der præsenteres her, beskriver en effektiv og reproducerbar procedure for 3D bioprintende kortikale astrocytter. På grund af betydningen af astrocytter i neuroinflammation reaktion på skade, samt i reguleringen af neuronal funktionalitet, undersøgelser, der involverer denne glia celle kunne bidrage til mange aspekter i forståelsen af sygdomme, der påvirker CNS. Derfor er den 3D in vitro-model, der præsenteres her, nyttig i fremtidige applikationer, der har til formål at studere astrocyt-neuroninteraktioner, astrocytters funktionalitet i hjernens patologier og potentialet i astrocytter som terapeutiske mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af The São Paulo Research Foundation (FAPESP), bevillingsnumrene 2018/23039-3 og 2018/12605-8; Det Nationale Råd for Videnskabelig og Teknologisk Udvikling (CNPq), tilskudsnumre 465656/2014-5 og 309679/2018-4; koordinering til forbedring af personale på de videregående uddannelser (CAPES), finansiel kode 001.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Bioprinter 3D Biotechnology Solutions Extrusion-based bioprinter
Blunt-tip forceps Integra Miltex 6--30 Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4
Cell culture flask Fisher Scientific 156340 Culture flask T25
Cell strainer Corning Incorporated 352340 Cell strainer 40 µm
Confocal microscope Leica Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubes Thermo Scientific 339651, 339652 Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPI Abcam ab224589 DAPI staining solution
DMEM/F12 Gibco; Life Technologies Corporation 12500062 DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubing Sigma-Aldrich D9527 Molecular weight cut-off = 14 kDa
Ethanol Fisher Scientific 64-15-5 Reagent grade
Fetal Bovine Serum Gibco; Life Technologies Corporation 12657011 Research Grade
Fibrinogen Sigma-Aldrich 9001-32-5 Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
Gelatin Sigma-Aldrich 9000-70-8 Gelatin powder from porcine skin
Glycine Sigma-Aldrich 56-40-6 Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco; Life Technologies Corporation 14175095 No calcium, no magnesium, no phenol red
L-Glutamine Sigma-Aldrich 56-85-9 L-Glutamine crystalline powder
Laminin Sigma-Aldrich 114956-81-9 Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kit Thermo Scientific R37601 Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 760-93-0 For GelMA preparation
Microtubes Corning Incorporated MCT-150-C Microtubes of 1,5 mL
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Needle 22G Fisher Scientific NC1362045 Sterile blunt needle
Operating scissor Integra Miltex 05--02 Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Paraformaldehyde powder
Penicillin/Streptomycin Gibco; Life Technologies Corporation 15070063 Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dish Corning Incorporated 430591, 430588 Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
Phalloidin Abcam ab176753 iFluor 488 reagent
Photoinitiator Sigma-Aldrich 106797-53-9 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS) Gibco; Life Technologies Corporation 10010023 PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich 25988-63-0 Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobody Abcam ab4674 Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibody Abcam ab150176 Alexa fluor 594 anti-chicken
Spatula Miltex V973-70 Number 24 cement spatula previously sterilized
Stereomicroscope Fisherbrand 3000038 Microscope for brain dissection
Syringe 5 mL BD 1222C84 Sterile syringe
Syringe filter 2 µm Fisher Scientific 09-740-105 Polypropylene filter for sterilization
Thrombin Sigma-Aldrich 9002--04-4 Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1 Laboratory grade
Trypsin-EDTA Gibco; Life Technologies Corporation 15400054 Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solution Gibco; Life Technologies Corporation 15040066 Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plate Thermo Scientific 144530 Sterile 24-well plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114 (2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
  3. Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
  4. Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
  5. Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
  6. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  7. Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
  8. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079 (2013).
  9. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  10. Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
  11. Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
  12. Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
  13. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
  14. Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
  15. Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
  16. de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414 (2018).
  17. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  18. Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
  19. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  20. de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
  21. Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401 (2017).
  22. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  23. de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
  24. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  25. Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
  26. Liu, R., Wang, Z. h, Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
  27. Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848 (2018).
  28. East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
  29. Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
  30. Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
  31. Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
  32. Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
  33. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001 (2018).
  34. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
  35. Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
  36. Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
  37. Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036 (2016).
  38. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517 (2018).
  39. Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  40. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
  41. Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757 (2020).
  42. Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
  43. Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
  44. Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
  45. Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).

Tags

Bioengineering Udgave 173 astrocytter 3D bioprinting biofabrication vævsteknik neuralt væv centralnervesystemet
3D Bioprinting af Murine Kortikale Astrocytter til Engineering Neural-lignende Væv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Melo, B. A. G., Cruz, E. M.,… More

de Melo, B. A. G., Cruz, E. M., Ribeiro, T. N., Mundim, M. V., Porcionatto, M. A. 3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue. J. Vis. Exp. (173), e62691, doi:10.3791/62691 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter