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Bioengineering

Bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para la ingeniería de tejido neural

Published: July 16, 2021 doi: 10.3791/62691
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo

Summary

Aquí informamos un método de bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para biofabricar tejidos neurales para estudiar la funcionalidad de los astrocitos en el sistema nervioso central y los mecanismos que involucran a las células gliales en enfermedades y tratamientos neurológicos.

Abstract

Los astrocitos son células gliales con un papel esencial en el sistema nervioso central (SNC), incluyendo el soporte neuronal y la funcionalidad. Estas células también responden a las lesiones neuronales y actúan para proteger el tejido de eventos degenerativos. Los estudios in vitro de la funcionalidad de los astrocitos son importantes para dilucidar los mecanismos implicados en tales eventos y contribuir al desarrollo de terapias para tratar trastornos neurológicos. Este protocolo describe un método para biofabricar una estructura de tejido de tipo neural rica en astrocitos mediante bioimpresión 3D de biotinta cargada de astrocitos. En este trabajo se utilizó una bioimpresora 3D basada en extrusión, y se extrajeron astrocitos de las cortezas cerebrales de los cachorros de ratones C57Bl / 6. La biotinta se preparó mezclando astrocitos corticales de hasta el pasaje 3 a una solución de biomaterial compuesta de gelatina, gelatina-metacriloil (GelMA) y fibrinógeno, complementada con laminina, que presentaba condiciones óptimas de bioimpresión. Las condiciones de bioimpresión 3D minimizaron el estrés celular, contribuyendo a la alta viabilidad de los astrocitos durante el proceso, en el que el 74,08% ± el 1,33% de las células eran viables justo después de la bioimpresión. Después de 1 semana de incubación, la viabilidad de los astrocitos aumentó significativamente a 83.54% ± 3.00%, lo que indica que la construcción 3D representa un microambiente adecuado para el crecimiento celular. La composición del biomaterial permitió la unión celular y estimuló el comportamiento astrocítico, con células que expresan el marcador específico de astrocitos glial de proteína ácida fibrilar (GFAP) y poseen la morfología astrocítica típica. Este protocolo reproducible proporciona un método valioso para biofabricar tejido neural 3D rico en astrocitos que se asemeja al microambiente nativo de las células, útil para los investigadores que tienen como objetivo comprender la funcionalidad de los astrocitos y su relación con los mecanismos involucrados en las enfermedades neurológicas.

Introduction

Los astrocitos son el tipo de célula más abundante en el Sistema Nervioso Central (SNC) y juegan un papel clave en la homeostasis cerebral. Además de soportar el apoyo neuronal, los astrocitos son responsables de modular la absorción de neurotransmisores, mantener la integridad de la barrera hematoencefálica y regular la sinaptogénesis neuronal1,2. Los astrocitos también tienen un papel esencial en la inflamación del SNC, respondiendo a lesiones en el cerebro en un proceso que conduce a la reactividad astrociátrica o astrogliosis reactiva3,4,formando una cicatriz glial que impide la exposición del tejido sano a agentes degenerativos5. Este evento resulta en cambios en la expresión génica, morfología y función de los astrocitos6,7. Por lo tanto, los estudios que involucran la funcionalidad de los astrocitos son útiles para el desarrollo de terapias para tratar trastornos neurológicos.

Los modelos in vitro son cruciales para estudiar los mecanismos relacionados con las lesiones neurológicas, y aunque se ha establecido un aislamiento exitoso y un cultivo bidimensional (2D) de astrocitos corticales8,este modelo no proporciona un entorno realista que imite el comportamiento de las células nativas y reproduzca la complejidad del cerebro9 . En condición 2D, el pobre soporte mecánico y bioquímico, las bajas interacciones célula-célula y célula-matriz, y el aplanamiento celular que conduce a la ausencia de polaridad basal-apical, afectan la dinámica de señalización celular y los resultados experimentales que conducen a la alteración de la morfología celular y la expresión génica, que comprometen la respuesta a los tratamientos10. Por lo tanto, es crucial desarrollar alternativas que proporcionen un entorno neuronal más realista, con el objetivo de traducir los resultados a la clínica.

El cultivo celular tridimensional (3D) representa un modelo más avanzado que recapitula con mayor fidelidad las características de órganos y tejidos, incluido el SNC11. En cuanto al cultivo glial, los modelos 3D contribuyen al mantenimiento de la morfología de los astrocitos, la polaridad basal-apical celular y la señalización celular12,13. La tecnología de bioimpresión 3D surgió como una poderosa herramienta para biofabricar tejidos vivos 3D de manera controlada mediante el uso de células y biomateriales para recrear la estructura y las propiedades de los tejidos nativos. El uso de esta tecnología ha supuesto una mejora sustancial de la predicción de resultados y ha contribuido a la medicina regenerativa aplicada al SNC14,15,16.

El protocolo descrito aquí detalla el aislamiento y cultivo de astrocitos corticales. El protocolo también detalla un método reproducible para bioimprimir astrocitos incrustados en gelatina / gelatina metacriloilo (GelMA) / fibrinógeno, complementado con laminina. En este trabajo, se utilizó una bioimpresora basada en extrusión para imprimir la composición del biomaterial que contiene astrocitos corticales a una densidad de 1 x 106 células/ ml. El estrés de cizallamiento de bioimpresión se minimizó mediante el control de la velocidad de impresión, y los astrocitos mostraron una alta viabilidad después del proceso. Los constructos bioimpresos se cultivaron durante 1 semana, y los astrocitos pudieron propagarse, adherirse y sobrevivir dentro del hidrogel, manteniendo la morfología astrocítica y expresando un marcador específico de proteína ácida fibrilar glial (GFAP)4.

Este procedimiento es compatible con bioimpresoras basadas en extrusión accionadas por pistón y se puede utilizar para bioimprimir astrocitos derivados de diferentes fuentes. El modelo bioimpreso en 3D propuesto aquí es adecuado para una amplia gama de aplicaciones de ingeniería neuronal, como los estudios de los mecanismos involucrados en la funcionalidad de los astrocitos en tejidos sanos y la comprensión de la progresión de las patologías neurológicas y el desarrollo de tratamientos.

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Protocol

Todos los procedimientos con animales siguieron las pautas internacionales para el uso de animales en la investigación (http://www.iclas.org) y fueron aprobados por el Comité de Ética en Investigación de la Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019 / 9292090519).

1. Disección cerebral de ratones

  1. Transfiera 10 ml de solución de sal tamponada de Hanks fría (HBSS) a un plato de cultivo de 100 mm y 1 ml a un microtubo de 1,5 ml. Preparar un microtubo por animal.
    NOTA: Tanto el plato de cultivo como el microtubo deben mantenerse en hielo.
  2. Preparar el medio de cultivo de astrocitos utilizando DMEM F12 + 10% fetal bovino (FBS), 2% glutamina y 1% penicilina-estreptomicina (P/S). Esterilizar el medio filtrando con un filtro de 0,2 μm.
  3. Sacrificar a los cachorros de ratones C57Bl / 6 (día postnatal 1) por decapitación con una tijera operativa afilada. Usando forrórceps, tira de la piel y expone el cráneo. Asegúrese de que tanto las tijeras como las pórceps estén esterilizadas con etanol al 70%.
  4. Corte el cráneo desde el foramen magnum hasta la parte superior de la cabeza a lo largo del plano sagital con una tijera de punta curva afilada.
    NOTA: Asegúrese de que el tejido encefálico no esté dañado.
  5. Utilizando una espátula previamente esterilizada con etanol al 70%, levantar el cerebro de la cavidad craneal y colocarlo en la placa de cultivo que contiene 10 ml de HBSS frío.
  6. Coloque el plato de cultivo que contiene el cerebro debajo del estereomiroscopio, y usando dos fórceps de punta roma, retire las meninges del cerebro (Figura 1).
  7. Separe las cortezas del resto del cerebro alejándolas suavemente de la línea mediana del cerebro usando una espátula.
  8. Recoja ambas cortezas y transfiéralas inmediatamente al mismo microtubo que contenga 1 ml de HBSS frío.

2. Aislamiento y cultivo de astrocitos

  1. Bajo el flujo laminar, corte el tejido cortical en trozos pequeños con una micro tijera curva y lávelos con 1 ml de HBSS mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo 3x. Espere a que el tejido se asiente. Retire HBSS y agregue HBSS nuevo, repitiendo el proceso dos veces más.
  2. Retire el HBSS e incube el tejido con 1 ml de tripsina al 0,05% a 37 °C durante 5 min.
    NOTA: Solo la digestión de tripsina es suficiente en este punto.
  3. Disociar mecánicamente el tejido canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo 15x.
    NOTA: La disociación completa del tejido se observa por el aumento de la turbidez de la suspensión y por la ausencia de grandes fragmentos de tejido en la suspensión.
  4. Transfiera la solución a un tubo cónico de 15 ml, neutralice la actividad de la tripsina agregando un volumen igual de FBS y filtre la solución en un filtro colador celular de 0,4 μm para eliminar fragmentos no disociados.
  5. Lavar el filtro con 1 mL de medio de astrocitos, recoger la suspensión celular que pasó por el colador, y centrifugarla durante 5 min a 200 x g y 25 °C. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y suspender el pellet en 1 mL de medio de cultivo de astrocitos.
  6. Transfiera la suspensión celular a un matraz de cultivo T25, consciba el volumen del medio a 3,5 ml e incube las células a 37 °C y 5% de CO2.
  7. Asegúrese de que después de 24 h, las células sean adherentes. Luego, reemplace el medio y cámbielo cada 3 días.
  8. Después de 7 días, elimine la microglía y los oligodendrocitos del cultivo lavando las células con 2 ml de 1x PBS.
  9. Reemplace la solución de PBS con el medio de cultivo de astrocitos y deje el matraz de cultivo en un agitador orbital a 180 rpm durante la noche.
    NOTA: Los astrocitos forman una monocapa confluente en aproximadamente 10-12 días de cultivo.

3. Síntesis de gelatina metacriloil (GelMA)

  1. Pesar 10 g de gelatina obtenida de la piel porcina y disolver en 100 ml de PBS dejando que la solución se revuelva en una placa calefactora a 240 rpm y 50 °C hasta la disolución completa.
  2. Debajo de una capucha, agregue 2 ml de anhídrido metacrílico (MA) para un bajo grado de funcionalización, y deje que la emulsión de gelatina se revuelva a 240 rpm y 50 ° C durante 2 h.
    PRECAUCIÓN: Declaración de peligro MA: H302 + H332 (dañino si se ingiere o inhala), H311 (tóxico en contacto con la piel), 314 (causa quemaduras graves en la piel y daño ocular), 315 (causa irritación de la piel), H317 (puede causar una reacción alérgica en la piel), H318 (causa daño ocular grave), 331 (tóxico si se inhala), H332 (dañino si se inhala), H335 (puede causar irritación respiratoria). Pautas de manejo: P261 (evite respirar polvo / humo / gas / niebla / vapores / aerosol), P305 + P351 + P338 + P310 (SI ESTÁ EN LOS OJOS: Enjuague con precaución con agua durante varios minutos. Quítese las lentes de contacto, si están presentes y son fáciles de hacer. Continúe enjuagando. Llame inmediatamente a un CENTRO DE ENVENENAMIENTO / médico), P301 + P312 + P330 (SI SE TRAGA: Llame a un CENTRO DE ENVENENAMIENTO / médico si se siente mal. Enjuague la boca).
    NOTA: Agregue MA muy lentamente, gota a gota.
  3. Diluir la solución de gelatina-MA en 100 mL de PBS precalentado (50 °C) para obtener 200 mL de volumen final y dejar remover la solución a 240 rpm y 50 °C durante 10 min.
  4. Cortar ~20 cm de membrana de diálisis (corte molecular 12-14 kDa) y remojarla en agua desionizada hasta que esté blanda.
    NOTA: Llene las membranas con agua desionizada para asegurarse de que no haya agujeros o defectos.
  5. Usando un embudo, transfiera la solución de gelatina-MA a las membranas.
    NOTA: Cierre ambos lados dejando espacio adicional en el interior para permitir la mezcla.
  6. Coloque las membranas que contienen la solución de gelatina-MA en un recipiente con 2 L de agua destilada para diálisis, dejándolas remover a 40 °C durante 5 días (500 rpm).
    NOTA: Cubra el recipiente para evitar la evaporación del agua.
  7. Cambie el agua destilada dos veces en un día. Cada vez, voltee las membranas boca abajo para la homogeneización.
  8. En el quinto día, mezcle 200 ml de agua ultrapura precalentada (40 °C) con la gelatina dializada-MA, y déjela remover durante 15 min a 40 °C.
  9. Transfiera la solución de gelatina-MA a tubos cónicos de 50 ml hasta 25 ml y deje que los tubos permanezcan a -80 °C durante 2 días.
    NOTA: Guarde los tubos horizontalmente para facilitar la liofilización.
  10. Liofilizar las soluciones congeladas durante 3-5 días y almacenar el GelMA liofilizado protegido de la humedad.

4. Preparación de biotinta

NOTA: Para obtener 1 mL de biotinta, se recomienda fabricar al menos 3 mL de solución de biomaterial, ya que puede haber pérdidas durante la filtración.

  1. Preparación de la solución de fibrinógeno
    1. Preparar solución salina (NaCl 0,9%) en agua desionizada, y disolver 10 mg de fibrinógeno del plasma bovino en 1 mL de la solución salina para obtener una concentración de 10 mg/mL.
      NOTA: Como el fibrinógeno se adsorbe al vidrio, no use matraces de vidrio para preparar la solución de fibrinógeno.
    2. Dejar la solución bajo agitación a 37 °C hasta la disolución completa del fibrinógeno.
      NOTA: Para la disolución de fibrinógeno, utilice un sistema rotativo colocado dentro de un horno a 37 °C. La agitación magnética (180 rpm) de fibrinógeno en una placa caliente a 37 °C también es adecuada. Bajo esta condición, 10 mg / ml de fibrinógeno tarda aproximadamente 40 minutos en disolverse.
  2. Preparación de la solución de gelatina/GelMA
    1. Pesar 0,12 g de gelatina y añadirla a 1,9 ml de PBS precalentado (40 °C) para obtener una concentración final de gelatina al 4% (p/v). Vórtice para facilitar la disolución.
    2. Mantener la emulsión a 40 °C hasta la disolución completa.
    3. Pesar 0,06 g de GelMA liofilizado y transferir a la solución de gelatina para obtener una concentración final de GelMA al 2% (p/v). Vórtice para facilitar la disolución.
    4. Mantenga la solución a 40 °C hasta la disolución completa.
  3. Preparación de biotinta de gelatina/GelMA/fibrinógeno cargada de astrocitos
    1. Pipetear 0,9 ml de la solución de fibrinógeno de 10 mg/ml y transferir a la solución de gelatina/GelMA para obtener una concentración final de 3 mg/ml de fibrinógeno.
    2. Pesar 0,015 g de fotoiniciador (IP) y transferir a la solución de gelatina/GelMA/fibrinógeno para obtener una concentración final de PI al 0,5% (p/v). Mezcle la solución volteando el tubo hacia arriba y hacia abajo y manténgalo a 40 °C protegido de la luz para evitar la degradación de PI.
      NOTA: Almacene la biotinta a 4 °C durante un máximo de 24 h.
    3. Bajo el flujo laminar, filtre la solución con un filtro de 0,2 μm en un tubo cónico estéril de 15 ml.
      NOTA: La solución de biomaterial debe estar a 37-40 °C para permitir la filtración.
    4. Transfiera 980 μL de la solución de biomaterial a un tubo cónico de 15 ml.
    5. Diluir laminina en solución salina para obtener una solución stock de 100 μg/mL.
    6. Pipetear 20 μL de laminina y transferir al tubo que contiene la biotinta para obtener una concentración final de 2 μg/ml de laminina.
    7. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo, evitando burbujas. Si persiste alguna burbuja, centrífuga el tubo cónico a 200 x g durante 2 min. Mantenga la biotinta a 37 °C hasta que se mezcle con las células.
    8. Tripsinizar astrocitos primarios con tripsina al 0,05% durante 5 min.
      NOTA: Use astrocitos de los pasajes 1 a 3.
    9. Neutralice la actividad de tripsina con FBS en una proporción de 1: 1 y transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugarlo a 200 x g durante 5 min.
    10. Cuente las células y transfiera 1 x 106 células a un tubo cónico diferente. Centrifugarlo a 200 x g durante 5 min.
    11. Retire el sobrenadante dejando un pequeño volumen (~ 200 μL) para suspender el gránulo celular, golpeando suavemente la parte inferior del tubo cónico.
    12. Transferir 1 mL de solución de gelatina/GelMA/fibrinógeno al tubo que contiene las células y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar, obteniendo una concentración final de 1 x 106 células/ml.

5. Preparación de la solución de reticulación

  1. Reconstitución de trombina
    1. Preparar una solución caldo de trombina 100 U/mL en agua desionizada estéril con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,1% (p/v) en un tubo cónico de 15 mL. Stock en microtubos a -20 °C.
      NOTA: Como la trombina se adsorba al vidrio, no use matraces de vidrio para preparar la solución de caldo o almacenar las alícuotas.
  2. Preparación de la solución de trombina-CaCl2
    1. Pipetear 100 μL de solución de trombina y transferir a un tubo cónico de 50 mL que contenga 8,9 mL de agua desionizada estéril para obtener una concentración final de 1 U/mL de trombina.
    2. Preparar una solución de CaCl2 al 10% (p/v) en agua desionizada y esterilizar con un filtro de 0,2 μm.
    3. Transfiera 1,1 ml de la solución de CaCl2 al 10% al tubo cónico que contiene trombina, con el fin de obtener una relación final de 1:9 (CaCl2 a trombina).
      NOTA: Prepare la solución de reticulación en el volumen que se utilizará en el experimento, evitando el almacenamiento.

6. Bioimpresión de biotinta cargada de astrocitos utilizando una bioimpresora basada en extrusión

  1. Diseño del tejido neural
    1. Usando el código G: construir una cuadrícula de 6 x 6 mm (forma cuadrada) con 1 mm de distancia entre cada línea bioimpresa en los ejes X e Y, y 6 capas en el eje Z (0,2 mm entre cada línea); establecer la extrusión (E) a 0,01 mm, aumentando 0,001 mm en cada nueva capa del eje Z; y establecer la velocidad de impresión (F) en 400 mm/min(Información suplementaria).
  2. Configuración de bioimpresora
    1. Exponga la máquina a la luz UV durante 15 minutos y luego límpiela con etanol al 70%.
    2. Encienda la bioimpresora con el interruptor de encendido. Conecte la máquina a la computadora a través de un cable USB. Abra el software de control para conectarlo a la bioimpresora y cargue el diseño del archivo.
  3. Preparación de la jeringa de bioimpresión
    1. Transfiera la biotinta de gelatina/GelMA/fibrinógeno cargada de astrocitos a una jeringa de plástico de 5 ml utilizando una pipeta de 1.000 μL.
      NOTA: Transfiera lentamente para evitar la formación de burbujas.
    2. Conecte una aguja roma estéril de 22 G a la jeringa.
      NOTA: Deje la jeringa a 4 °C durante 2 min.
    3. Conecte la jeringa al cabezal de impresión de la bioimpresora y enjuague manualmente la biotinta para eliminar las burbujas restantes.
  4. Bioimpresión
    NOTA: La bioimpresión se realizó fuera de la campana laminar.
    1. Coloque un plato de cultivo de 35 mm en la mesa de la bioimpresora y coloque la aguja a 0,1 mm de distancia de la superficie del plato de cultivo para permitir el movimiento de la aguja.
      NOTA: Utilice un plato de cultivo de 35 mm para cada bioimpresión.
    2. Pulse el botón Imprimir.
    3. Una vez que termine la bioimpresión, asegúrese de que la jeringa se aleje del plato. Luego, cierre el plato de cultivo y prepárese para el proceso de reticulación.
      NOTA: La bioimpresión de una construcción dura aproximadamente 1 min y 10 s.
  5. Reticulación de la construcción bioimpresa y la cultura
    1. Coloque la placa de cultivo bajo luz UV a 2 mW/cm2 durante 2 x 60 s (arriba y abajo) para la reticulación GelMA.
    2. Bajo el flujo laminar, transfiera la construcción bioimpresa a una placa de 24 pozos utilizando una espátula estéril.
    3. Añadir 500 μL de solución de trombina/CaCl2 y dejar actuar durante 30 min para permitir la reticulación de fibrina.
    4. Retire la solución de reticulación y lave la construcción con 2 ml de PBS 1x. A continuación, sustituir el PBS por 1 mL de medio de cultivo de astrocitos e incubar a 37 °C y 5% de CO2. Cambie el medio cada 3 días.

7. Evaluación de la viabilidad de los astrocitos

  1. Viabilidad de los astrocitos bioimpresos
    1. Transfiera la construcción bioimpresa a un plato de cultivo de 35 mm utilizando una espátula.
    2. Lave la construcción con 1 ml de 1x PBS.
    3. Deposite 100 μL del reactivo Live/Dead sobre la construcción y manténgalo a 37 °C durante 30 min, manteniéndolo protegido de la luz.
    4. Retire el reactivo Live/Dead y lave la construcción con 1 mL de 1x PBS.
    5. Transfiera la muestra a un plato confocal usando una espátula y observe las células dentro de la construcción bajo un microscopio confocal utilizando excitación de 488 y 570 nm para la adquisición de imágenes.
      NOTA: Utilice una ampliación de 10x para una visualización general de las celdas dentro de la construcción.
    6. Asegúrese de que la muestra esté plana. Si es necesario, coloque una cubierta sobre la muestra para aumentar la planitud.
      NOTA: Durante la toma de imágenes, asegúrese de que el plato confocal esté bien sellado para evitar que la muestra se seque.
    7. Calcule el número de viables (verde) y muertos (rojo) utilizando un software computacional.
  2. Viabilidad del cultivo de astrocitos 2D
    1. Sembrar 0,5 x 106 astrocitos (paso 1-3) en una placa confocal de 35 mm, añadir astrocitos de medio, e incubarlos a 37 °C y 5% de CO2.
    2. Cuando las células estén confluentes, retire el medio de cultivo y lávese con 1 ml de 1x PBS.
    3. Deposite 200 μL del reactivo Vivo/Muerto y mantenga el plato a 37 °C durante 30 min, protegido de la luz.
    4. Retire el reactivo Vivo/Muerto y lave las células con 1 ml de 1 PBS.
    5. Lleve el plato a un microscopio confocal junto con una cámara digital y use excitación de 488 y 570 nm para la adquisición de imágenes.
    6. Calcule el número de viables (verde) y muertos (rojo) utilizando un software computacional.

8. Inmunotinción de astrocitos

  1. Tinción de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de astrocitos bioimpresos en 3D
    NOTA: Para investigar la presencia de otros marcadores celulares, cambie el anticuerpo primario en consecuencia.
    1. Retire el medio del pozo y lave la construcción con 1 ml de 3x PBS.
    2. Añadir paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS al pozo hasta que la construcción esté completamente cubierta y dejarlo durante 2 h a 4 °C.
    3. Retire el PFA y lave la construcción con 1 ml de 3x PBS.
      NOTA: Este procedimiento se puede pausar durante varios meses si se almacena a 4 °C en PBS. Asegúrese de que la placa del pozo esté sellada para evitar la evaporación de PBS.
    4. Tratar la muestra con glicina 0,1 mol/L durante 5 min.
    5. Lavar con 1 mL de 1x PBS durante 5 min.
    6. Permeabilizar la muestra con PBS que contenga 0,1% de Tritón X-100 y 10% de FBS durante 1 h a 25 °C bajo agitación orbital.
    7. Incubar el constructo con pollo anti-GFAP (dilución de anticuerpos primarios 1:500) a 4 °C durante la noche.
    8. Aspire el anticuerpo primario y lave la muestra con 1 ml de PBS durante 5 min, 3 veces.
      NOTA: El anticuerpo primario se puede reutilizar varias veces cuando se almacena a 4 °C.
    9. Incubar la muestra con Alexa fluor 488-conjugado anti-pollo (dilución secundaria de anticuerpos 1:500) y 1 μg/mL DAPI durante 1 h a 25 °C bajo agitación orbitaria.
      NOTA: Mantenga la muestra protegida de la luz.
    10. Lave la muestra con 1 ml de PBS durante 5 min, 3 veces.
    11. Transfiera la construcción a un plato confocal de 35 mm.
      NOTA: Asegúrese de que el plato esté bien sellado para evitar que la muestra se seque.
  2. Tinción de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) del cultivo de astrocitos 2D
    1. Sembrar 0,5 x 106 astrocitos (paso 1-3) en una placa confocal de 35 mm, añadir astrocitos de medio, e incubarlos a 37 °C y 5% de CO2.
    2. Cuando las células estén confluentes, retire el medio de cultivo y lávelas con 1 ml de 1x PBS.
    3. Repita los pasos 8.1.2-8.1.10.
  3. Tinción del citoesqueleto de los astrocitos
    1. Repita los pasos 8.1.1-8.1.6.
    2. Añadir 200 μL de 50 μg/mL de solución de faloidina conjugada fluorescente en PBS y 1 μg/mL de DAPI sobre la construcción.
    3. Incubar durante 1 h a 25 °C bajo agitación orbitaria, manteniendo la muestra protegida de la luz.
    4. Lave la muestra con 1 ml de PBS durante 5 min 3 veces y transfiera la construcción a un plato confocal usando una espátula.
      NOTA: Asegúrese de que el plato esté bien sellado para evitar que la muestra se seque.

9. Imágenes confocales

  1. Lleve los platos a un microscopio confocal junto con una cámara digital para obtener imágenes (excitación de 359, 488 y 570 nm).
  2. Utilice un aumento de 10x para una visualización general y de 40 o 63x para imágenes ampliadas de celdas.
    NOTA: Asegúrese de que la muestra esté plana. Si es necesario, coloque una cubierta sobre la muestra para aumentar la planitud.

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Representative Results

Este trabajo tuvo como objetivo desarrollar un tejido similar a un neural utilizando la tecnología de bioimpresión 3D para depositar capa por capa la biotinta cargada de estratocitos primarios / GelMA / fibrinógeno. Los astrocitos fueron extraídos y aislados de la corteza cerebral de cachorros de ratones(Figura 1),añadidos a una composición de biomaterial, permitiendo la biofabricación de una construcción 3D viva.

El diseño asistido por ordenador (CAD) se desarrolló utilizando el código G(archivo suplementario)como un marco interconectado de forma cuadrada (0,6 x 0,6 mm), con poros de 1 mm, con el objetivo de facilitar la difusión de nutrientes y oxígeno. El marco estaba compuesto por 6 capas colocadas una encima de la otra, cambiando en un ángulo de 90° en cada capa (Figura 2A i). La estructura diseñada poseía aproximadamente 5 mm de altura (Figura 2A ii), lo que permite la manipulación del tejido. La composición de la biotinta también permitió la fabricación de construcciones de diferentes formas(Figura 2B).

La preparación de la biotinta compuesta de gelatina, GelMA y fibrinógeno comprendió dos pasos de reticulación. Primero, GelMA se reticuló bajo luz UV, en la que se forman enlaces covalentes inter e intramoleculares, seguidos de reticulación de fibrina. En este paso, la trombina escinde enzimáticamente las cadenas de fibrinógeno, lo que resulta en la formación de fibras defibrina 17,una reacción estabilizada por los iones Ca2+ 18. Luego, las fibras gelMA y fibrina forman una red estable de polímeros interpenetrados (IPN) complementada con laminina, soporte adecuado para la unión celular y la propagación19,20 (Figura 2C).

Antes de la bioimpresión, después de 12 días de aislamiento, los astrocitos se caracterizaron por la presencia de GFAP, un componente proteico de los filamentos intermedios de astrocitos4 (Figura 3A). Luego, los astrocitos tripsinizados se mezclaron con la solución de gelatina / GelMA / fibrinógeno a una densidad de 1 x 106 células / ml, generando una biotinta cargada de astrocitos. La biotinta se transfirió a una jeringa de 5 ml conectada a una aguja roma de 22 G, componiendo el cabezal de impresión de la bioimpresora (Figura 3B i). La aguja permitió la extrusión de biotinta sin obstrucciones y evitando un alto estrés de cizallamiento en las células.

Debido a las propiedades viscoelásticas de la gelatina, que se comporta como un fluido a temperaturas más altas y como un gel a temperaturas más bajas21,el constructo bioimpreso conservó la fidelidad de la forma(Figura 3B ii). Después de la bioimpresión de dos capas consecutivas de biotinta, se observó la formación de una estructura bien definida(Figura 3C),con células atrapadas dentro del biomaterial.

Después de los procesos de bioimpresión y reticulación, el constructo se incubó con medio de astrocitos, y después de 1 día de bioimpresión, la mayoría de las células aún presentaban una morfología redonda(Figura 3D). Los andamios bioimpresos mantuvieron la integridad después de 7 días de incubación, y aunque se observaron algunas células redondas, un gran número de astrocitos se extendieron por todo el constructo, presentando morfología astrocítica e interconexión(Figura 3E).

Debido a que los parámetros de la bioimpresión, como la velocidad, podrían afectar directamente la viabilidad celular, se probaron diferentes velocidades de bioimpresión (400, 600 y 800 mm / min) y se evaluó la supervivencia de los astrocitos utilizando el ensayo Live/Dead con calceína-AM (células vivas, fluorescencia verde) y homodímero de etidio III (EthD-II) (células muertas, fluorescencia roja). El porcentaje de células viables se cuantificó utilizando un software computacional, calculando el número de células vivas y muertas. La viabilidad celular se evaluó en el tiempo 0 (justo después de la bioimpresión), y los resultados mostraron que a la velocidad más baja, 400 mm/min, las células viables representaban el 74,08% ± el 1,33% del total de células, siendo significativamente más altas que las células bioimpresas a 600 y 800 mm/min (60,25% ± 1,93% y 62,94 ± 6,18%, respectivamente)(Figura 4A). Por lo tanto, se utilizó la velocidad de 400 mm / min en este trabajo.

Antes de la bioimpresión, los astrocitos cultivados en 2D se caracterizaban como el porcentaje de células viables, y la viabilidad de los astrocitos bioimpresos se normalizaba a esta condición. Los resultados mostraron que el cultivo 2D presentó el 90,98% ± el 0,94% de las células viables. La viabilidad de los astrocitos bioimpresos (día 7) fue del 83,54% ± 3,00%, representando el 0,92 ± 0,03 del valor 2D, que fue significativamente superior al del día 0 (0,81 ± 0,01)(Figura 4B). Las imágenes de astrocitos teñidos con el reactivo vivo/muerto se presentan en la Figura 4C,y muestran que después de la bioimpresión, las células poseían una morfología redonda(Figura 4C i). Después de 1 semana de incubación, los astrocitos se extendieron por todo el constructo (Figura 4C ii), mostrando una morfología distinta de las células del cultivo 2D ( Figura4C iii).

Los astrocitos bioimpresos se tiñeron para mostrar la densidad celular y la morfología celular dentro del constructo. La Figura 5A muestra una construcción bioimpresa después de 7 días de incubación, con alta densidad de astrocitos teñidos con faloidina, un colorante del citoesqueleto de F-actina. Aunque se observaron pocas células redondas, los astrocitos presentaron principalmente una morfología similar a una estrella. Los astrocitos bioimpresos mostraron ser GFAP positivos cuando se tiñeron después de 7 días de bioimpresión, lo que indica que las células mantuvieron su fenotipo astrocítico(Figura 5B i). Las figuras 5B ii y 5B iii muestran las imágenes apiladas en Z de los astrocitos GFAP+ bioimpresos dentro del constructo. Estos resultados indican que la composición de la biotinta proporcionó un microambiente biocompatible para promover la adhesión, propagación y crecimiento de los astrocitos.

Figure 1
Figura 1: Extracción de la separación cerebral y de la corteza para el cultivo de astrocitos primarios. Los astrocitos primarios se aislaron de la corteza del cerebro de las crías de ratones C57Bl / 6 (postnatal día 1). Después de extraer el cerebro del animal, las meninges se extirparon bajo un microscopio y la corteza se separó seguida de la digestión del tejido y el cultivo de astrocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Ilustración esquemática del proceso de bioimpresión 3D. (A) Archivo CAD diseñado para la bioimpresión 3D de tejido neural que muestra (i) 2 capas, vista superior, y (ii) 6 capas, vista lateral, de la construcción. (B) Imágenes que muestran la capacidad de la biotinta para imprimir estructuras de diferentes formas (i) cuadradas, (ii) capilares, y (iii) estrella. (C) Esquema de reticulación de biomateriales después de la bioimpresión 3D mostrando, donde GelMA se reticula bajo luz UV seguido de reticulación de fibrina en un baño de trombina: Ca2+. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Boprinting 3D de biotinta de gelatina/GelMA/fibrinógeno cargada de astrocitos. (A) Caracterización de astrocitos tras 12 días de aislamiento y cultivo, teñidos para GFAP, verde y DAPI, azul. (B) ( i )Configuracióndel cabezal de impresión y (ii) Construcción bioimpresa en 3D inmediatamente después de la bioimpresión. (B) Construcción de dos capas que muestra el marco bioimpreso. Ampliación de 4x. (C) Imagen de astrocitos bioimpresos 1 día después de la bioimpresión, mostrando células en una morfología redonda. (D) Imagen de astrocitos bioimpresos 7 días después del proceso de bioimpresión, mostrando células con morfología astrocítica con pocas células redondas, indicando su afinidad con el tejido mimético. Ampliación de 10x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Evaluación de la viabilidad de los astrocitos bioimpresos. (A) Viabilidad de astrocitos bioimpresos a diferentes velocidades. (B) Viabilidad de los astrocitos bioimpresos en (i) día 0 (inmediatamente después de la bioimpresión) y (ii) después de 7 días de bioimpresión, normalizada a la viabilidad de los astrocitos en cultivo 2D. Análisis estadístico mediante Anova unidireccional con prueba de Tukey, n = 3, *p < 0,05. (C) Imágenes fluorescentes de astrocitos teñidos con reactivo vivo/muerto. Astrocitos bioimpresos en (i) día 0 (justo después de la bioimpresión), (ii) día 7 y (iii) cultivo 2D de astrocitos. Ampliación de 10x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Caracterización de astrocitos bioimpresos en 3D. Inmunofluorescencia de astrocitos bioimpresos en 3D después de 7 días de incubación teñidos para (A) F-actina (falotina, rojo) y núcleos (DAPI, azul) con aumento de 10x y 40x y para (B) GFAP, verde (i) con aumento de 10x, (ii) Z-apilado que muestra el eje X-Y-Z del constructo bioimpreso, y (iii) imagen que muestra el eje X-Z de los astrocitos GFAP+. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La tecnología de bioimpresión 3D ha surgido como una alternativa de biofabricación que permite la ingeniería de construcciones refinadas que estructural y fisiológicamente se asemejan a tejidos nativos22,incluido el cerebro23. La biofabricación de tejidos neurales permite el modelado de microambientes nativos in vitro, siendo una herramienta importante para comprender los mecanismos celulares y moleculares asociados con el desarrollo y tratamiento de muchas enfermedades que afectan al SNC11. Debido al importante papel de las células gliales en la funcionalidad neural, los astrocitos corticales se han utilizado en muchos estudios, como el desarrollo cerebral24,el transporte de biomoléculas25,el crecimiento de neuritas26y en la biofabricación de tejidos similares al cerebro14.

Los métodos para la ingeniería del cultivo 3D de astrocitos fueron reportados previamente, utilizando diferentes biomateriales y técnicas de andamiaje27,28,29. Del mismo modo, también se informó de un método para bioimprimir en 3D agregados neuronales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs), que mostró la capacidad de estas células bioimpresas para diferenciarse y madurar in vitro30. Sin embargo, no hay informes de métodos para la biofabricación de construcciones de astrocitos brioimpresos en 3D en la literatura. Luego, este protocolo tuvo como objetivo describir un método reproducible para la bioimpresión 3D de astrocitos corticales.

En este protocolo se aislaron astrocitos de las cortezas cerebrales de cachorros de ratones C57Bl/6, un modelo animal muy utilizado en la investigación31,32,que puede ser sustituido por astrocitos derivados de otras fuentes, como hiPSCs y médula espinal. Después del aislamiento, el cultivo y el subcultivo, los astrocitos permanecen en un estado proliferativo hasta el paso 3, que es el número máximo de división recomendado debido a su limitación intrínseca de proliferación8. Se verificó que la proliferación de astrocitos a partir del paso 4 era limitada, siendo difícil alcanzar la cantidad deseada de células para la bioimpresión 3D.

En el método descrito, se utilizó una concentración de 1,0 x 106 células/ml de solución de biomaterial, como prueba de concepto para evaluar la capacidad de las células para sobrevivir al proceso de bioimpresión y mantener su viabilidad y propiedades intrínsecas durante el cultivo dentro del hidrogel. En el trabajo anterior, se biofabricaba un tejido neural bioimpreso en 3D mediante el cocultivo de astrocitos y neuronas, y para aumentar la interacción celular, la concentración de astrocitos fue de 8,0 x 106 células/ml14. Luego, la concentración de células puede optimizarse para estudios específicos.

Una biotinta para bioimpresión 3D está compuesta por células y un biomaterial o una combinación de biomateriales33. En este protocolo, se utilizó una combinación de gelatina/GelMA/fibrinógeno, que demostró ser favorable tanto para la bioimpresión como para el mantenimiento de astrocitos en cultivo. La producción de una biotinta bioimprimible es un desafío cuando se utiliza la técnica de bioimpresión basada en extrusión. La composición del biomaterial debe poseer propiedades viscoelásticas que, al mismo tiempo, permitan la extrusión de la biotinta, conservando la forma 3D después del proceso de impresión34. Además, debe ser capaz de mantener la viabilidad celular durante el proceso, lo que dependiendo de las condiciones de bioimpresión, puede causar estrés de cizallamiento a las células que conduce a la muerte35.

La bioimpresión fue asegurada por la gelatina, un biomaterial que posee propiedades viscoelásticas óptimas debido a su capacidad de transición sol-gel36. Esto permite que las macromoléculas de gelatina se reorganicen y se comporten como un fluido durante la extrusión, y como un gel después de la bioimpresión, manteniendo la estructura 3D. Además, como derivado del colágeno, la gelatina está compuesta por repeticiones de tripletes peptídicos glicina-aminoácido, que aseguran la especificidad celular21. Sin embargo, los enlaces intra e intermoleculares de la gelatina son débiles, y debido a su termoreversibilidad, la gelatina no tiene estabilidad a 37 ° C, siendo liberada de la construcción durante el cultivo celular. Por lo tanto, GelMA se convirtió en una alternativa como hidrogel estable, debido a los enlaces covalentes formados después de la exposición a la luz UV, manteniendo las propiedades de especificidad celular19. Las propiedades físicas de GelMA, como la porosidad, la degradación y el módulo elástico, se pueden ajustar para adaptarse a diferentes aplicaciones de ingeniería de tejidos19. La rigidez de los andamios GelMA se puede controlar variando la sustitución de metacriloilo37,permitiendo lograr una rigidez similar a la del tejido a modelar. Es decir, al disminuir el grado de funcionalización, se puede lograr una menor rigidez37. Por lo tanto, debido a la suavidad del cerebro deratón 38,39 y al efecto directo de la rigidez de la matriz extracelular (ECM) sobre el comportamiento celular40,en este protocolo se propuso un bajo grado de funcionalización de la gelatina. En los trabajos anteriores, se informó de la capacidad de los hidrogeles GelMA para imitar las características físicas del SNC, mostrando una alta idoneidad para el cultivo de astrocitos, neuronas y células madre neurales14,41,42.

Además de GelMA, el fibrinógeno, un biopolímero nativo que forma fibras de fibrina a través de la reacción enzimática, también se ha utilizado ampliamente para biofabricar tejido neural, mostrando una alta especificidad y ofreciendo un microambiente adecuado para que las células neuronales se adhieran y crezcan30,43,44. Otros biomateriales, como el alginato y el quitosano, se han utilizado para bioimprimir tejidos similares a los neurales, mezclados con gelatina, GelMA y / o fibrinógeno, con el objetivo de mejorar la imprimibilidad y las propiedades físicas de los andamios 3D14,30. En el presente método, se logró una bioimpresión óptima, estabilidad física y especificidad celular utilizando gelatina, GelMA y fibrinógeno como componentes de la biotinta. Con el fin de aumentar el reconocimiento de los astrocitos al microambiente, se utilizó laminina, un componente de la ECM cerebral, para complementar la biotinta.

En este protocolo, se utilizó gelatina a una concentración del 4% (p/v), lo que permitió la transición sol-gel de la biotinta a 25 °C en aproximadamente 10 min. Se puede lograr una gelificación más rápida aumentando la concentración de gelatina. Sin embargo, la esterilización por filtración con un filtro de 0,2 μm puede verse comprometida. La filtración de biotinta es un paso crítico, verificando que las concentraciones más altas de gelatina (>5% p/v) pueden prevenir la filtración. Una alternativa para lograr un punto de gelificación más rápido durante la bioimpresión es dejar la jeringa que contiene la biotinta a 4 °C durante 2 minutos antes de conectarla al cabezal de impresión de la bioimpresora. Después de la bioimpresión, es crucial mantener la construcción a 25 ° C para evitar desestabilizar la estructura 3D y mantener una condición gelificada antes de la exposición a los rayos UV. En particular, la construcción debe ser sólida cuando se agrega la solución de reticulación de fibrinógeno a la placa. Para la reticulación gelMA, es importante voltear la muestra (2 x 60 s cada lado) para garantizar la exposición UV durante toda la construcción. Para la reticulación de fibrinógeno, la solución de reticulación debe cubrir la construcción por completo. Por lo tanto, si se usa un plato o plato más grande, se debe ajustar el volumen. Después de la reticulación, el hidrogel debe verse homogéneo bajo microscopía de contraste de fase y las células deben distribuirse homogéneamente a lo largo de la construcción, poseyendo una morfología redonda.

Este protocolo permitió a la biotinta de gelatina/GelMA/fibrinógeno imprimir estructuras de diferentes formas, manteniendo la integridad y la forma 3D de los constructos. Debido a las limitaciones de la temperatura para alcanzar los 25 °C dentro del flujo laminar, la bioimpresión se realizó en la sala de cultivo fuera del flujo laminar. El tiempo de bioimpresión fue de aproximadamente 1 min para cada muestra, y no se observó contaminación durante el cultivo celular.

La integridad celular puede verse afectada por la bioimpresión, debido al esfuerzo de cizallamiento causado en el proceso35. Esto se puede controlar optimizando los parámetros de impresión, como la velocidad de impresión. En este trabajo, se probaron diferentes velocidades de bioimpresión, 400, 600 y 800 mm / min, observando una disminución significativa en la viabilidad celular cuando la velocidad se incrementó de 400 a 600 mm / min. A 400 mm/min, alrededor del 74% de las células permanecieron viables después de la bioimpresión, y este valor aumentó significativamente después de 7 días de incubación (>80%). Por lo tanto, no se utilizaron velocidades más bajas para evitar la exposición excesiva de las células al medio ambiente. El cultivo 2D de astrocitos mostró una mayor viabilidad (~ 90%) en comparación con las células bioimpresas. Sin embargo, como muestran las imágenes fluorescentes, la morfología se ve afectada por el tipo de cultivo. Mientras que las células 2D eran planas, los astrocitos en el entorno 3D poseían una forma de estrella, interconectándose entre sí por procesos celulares.

En particular, el microambiente mimético fue favorable para el cultivo de astrocitos corticales, ya que la viabilidad celular aumentó significativamente después de 1 semana, lo que sugiere proliferación celular dentro del constructo. La laminina, una glicoproteína presente en la ECM cerebral, se añadió a la biotinta con el objetivo de lograr una mayor adherencia de los astrocitos al hidrogel14. La tinción de F-actina del citoesqueleto mostró que los astrocitos bioimpresos estaban en alta densidad dentro del constructo, lo que indica que la concentración celular utilizada en este protocolo permitió la interconexión de los astrocitos. La inmunohistoquímica para la localización de GFAP, un marcador correlacionado con la arborización extensa de los astrocitos y la hipertrofia celular45,corroborada por la tinción de F-actina, mostró que las células presentaban una morfología astrocítica típica, lo que indica que el sistema 3D mimético era favorable para que las células se unen y se comporten como en su entorno nativo.

El protocolo presentado aquí describe un procedimiento eficiente y reproducible para la bioimpresión 3D de astrocitos corticales. Debido a la importancia de los astrocitos en la respuesta de neuroinflamación a la lesión, así como en la regulación de la funcionalidad neuronal, los estudios que involucran a esta célula glial podrían contribuir a muchos aspectos en la comprensión de las enfermedades que afectan al SNC. Por lo tanto, el modelo 3D in vitro que aquí se presenta es útil en futuras aplicaciones que tienen como objetivo estudiar las interacciones astrocito-neurona, la funcionalidad de los astrocitos en patologías cerebrales y el potencial de los astrocitos como dianas terapéuticas.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP), números de subvención 2018/23039-3 y 2018/12605-8; Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq), números de subvención 465656/2014-5 y 309679/2018-4; y Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Educación Superior (CAPES), código financiero 001.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Bioprinter 3D Biotechnology Solutions Extrusion-based bioprinter
Blunt-tip forceps Integra Miltex 6--30 Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4
Cell culture flask Fisher Scientific 156340 Culture flask T25
Cell strainer Corning Incorporated 352340 Cell strainer 40 µm
Confocal microscope Leica Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubes Thermo Scientific 339651, 339652 Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPI Abcam ab224589 DAPI staining solution
DMEM/F12 Gibco; Life Technologies Corporation 12500062 DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubing Sigma-Aldrich D9527 Molecular weight cut-off = 14 kDa
Ethanol Fisher Scientific 64-15-5 Reagent grade
Fetal Bovine Serum Gibco; Life Technologies Corporation 12657011 Research Grade
Fibrinogen Sigma-Aldrich 9001-32-5 Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
Gelatin Sigma-Aldrich 9000-70-8 Gelatin powder from porcine skin
Glycine Sigma-Aldrich 56-40-6 Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco; Life Technologies Corporation 14175095 No calcium, no magnesium, no phenol red
L-Glutamine Sigma-Aldrich 56-85-9 L-Glutamine crystalline powder
Laminin Sigma-Aldrich 114956-81-9 Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kit Thermo Scientific R37601 Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 760-93-0 For GelMA preparation
Microtubes Corning Incorporated MCT-150-C Microtubes of 1,5 mL
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Needle 22G Fisher Scientific NC1362045 Sterile blunt needle
Operating scissor Integra Miltex 05--02 Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Paraformaldehyde powder
Penicillin/Streptomycin Gibco; Life Technologies Corporation 15070063 Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dish Corning Incorporated 430591, 430588 Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
Phalloidin Abcam ab176753 iFluor 488 reagent
Photoinitiator Sigma-Aldrich 106797-53-9 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS) Gibco; Life Technologies Corporation 10010023 PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich 25988-63-0 Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobody Abcam ab4674 Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibody Abcam ab150176 Alexa fluor 594 anti-chicken
Spatula Miltex V973-70 Number 24 cement spatula previously sterilized
Stereomicroscope Fisherbrand 3000038 Microscope for brain dissection
Syringe 5 mL BD 1222C84 Sterile syringe
Syringe filter 2 µm Fisher Scientific 09-740-105 Polypropylene filter for sterilization
Thrombin Sigma-Aldrich 9002--04-4 Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1 Laboratory grade
Trypsin-EDTA Gibco; Life Technologies Corporation 15400054 Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solution Gibco; Life Technologies Corporation 15040066 Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plate Thermo Scientific 144530 Sterile 24-well plate

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References

  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114 (2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
  3. Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
  4. Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
  5. Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
  6. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  7. Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
  8. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079 (2013).
  9. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  10. Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
  11. Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
  12. Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
  13. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
  14. Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
  15. Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
  16. de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414 (2018).
  17. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  18. Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
  19. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  20. de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
  21. Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401 (2017).
  22. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  23. de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
  24. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  25. Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
  26. Liu, R., Wang, Z. h, Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
  27. Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848 (2018).
  28. East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
  29. Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
  30. Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
  31. Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
  32. Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
  33. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001 (2018).
  34. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
  35. Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
  36. Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
  37. Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036 (2016).
  38. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517 (2018).
  39. Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  40. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
  41. Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757 (2020).
  42. Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
  43. Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
  44. Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
  45. Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).

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Bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para la ingeniería de tejido neural
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de Melo, B. A. G., Cruz, E. M.,… More

de Melo, B. A. G., Cruz, E. M., Ribeiro, T. N., Mundim, M. V., Porcionatto, M. A. 3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue. J. Vis. Exp. (173), e62691, doi:10.3791/62691 (2021).

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