JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للخلايا الفلكية القشرية لمورين للأنسجة الهندسية الشبيهة بالعصبية

Published: July 16, 2021
doi:
10.3791/62691
, , , ,
1Department of Biochemistry, Escola Paulista de Medicina,Universidade Federal de São Paulo

Summary

هنا نحن تقرير طريقة الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد الخلايا الفلكية القشرية مورين للأنسجة الحيوية مثل العصبية لدراسة وظائف الخلايا الفلكية في الجهاز العصبي المركزي والآليات التي تنطوي على الخلايا الدبقية في الأمراض العصبية والعلاجات.

Abstract

الخلايا الفلكية هي خلايا جلبقية لها دور أساسي في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، بما في ذلك دعم الخلايا العصبية ووظائفها. هذه الخلايا تستجيب أيضا للإصابات العصبية وتعمل على حماية الأنسجة من الأحداث التنكسية. الدراسات المختبرية من وظائف الخلايا الفلكية مهمة لتوضيح الآليات المشاركة في مثل هذه الأحداث والمساهمة في تطوير العلاجات لعلاج الاضطرابات العصبية. يصف هذا البروتوكول طريقة لتصنيع بنية أنسجة تشبه العصبية غنية بالخلايا الفلكية عن طريق الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للخلايا الفلكية المحملة بالفينك الحيوي. تم استخدام طابعة بيولوجية ثلاثية الأبعاد تعتمد على البثق في هذا العمل ، وتم استخراج الخلايا الفلكية من قشريات الدماغ C57Bl/6 الفئران. تم إعداد bioink عن طريق خلط الخلايا الفلكية القشرية من ما يصل إلى الممر 3 إلى محلول المواد الحيوية المكون من الجيلاتين والجيلاتين الميثاكريلويل (GelMA) والفيبرينوجين ، المكمل باللامينين ، والذي قدم ظروف الطباعة الحيوية المثلى. قللت ظروف الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد من إجهاد الخلايا ، مما ساهم في البقاء العالي للخلايا الفلكية أثناء العملية ، حيث كان 74.08٪ ± 1.33٪ من الخلايا قابلة للحياة مباشرة بعد الطباعة الحيوية. بعد أسبوع واحد من الحضانة ، زادت صلاحية الخلايا الفلكية بشكل كبير إلى 83.54٪ ± 3.00٪، مما يشير إلى أن البناء ثلاثي الأبعاد يمثل بيئة دقيقة مناسبة لنمو الخلايا. سمح تكوين المادة الحيوية بتعلق الخلية وحفز السلوك الفلكي ، مع الخلايا التي تعبر عن الخلايا الفلكية المحددة علامة البروتين الحمضي الرجفانى الدبقية (GFAP) وامتلاك مورفولوجيا فلكية نموذجية. يوفر هذا البروتوكول القابل للاستنساخ طريقة قيمة لتصنيع الأنسجة ثلاثية الأبعاد الشبيهة بالخلايا العصبية الغنية بالخلايا الفلكية التي تشبه البيئة الدقيقة الأصلية للخلايا ، مفيدة للباحثين الذين يهدفون إلى فهم وظائف الخلايا الفلكية وعلاقتها بالآليات المشاركة في الأمراض العصبية.

Introduction

الخلايا الفلكية هي نوع الخلية الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتلعب دورا رئيسيا في التوازن الدماغي. بالإضافة إلى دعم الخلايا العصبية دائمة, الخلايا الفلكية هي المسؤولة عن تحوير امتصاص الناقلات العصبية, الحفاظ على سلامة حاجز الدم في الدماغ, وتنظيم تولد الخلايا العصبية1,2. الخلايا الفلكية أيضا دورا أساسيا في التهاب الجهاز العصبي المركزي, الاستجابة لإصابات الدماغ في عملية تؤدي إلى التفاعل الفلكي أو astrogliosisالتفاعلية 3,4, تشكيل ندبة الدبقية التي تمنع معرض الأنسجة السليمة للعوامل التنكسية5. ينتج عن هذا الحدث تغييرات في التعبير الجيني للخلايا الفلكية، ومورفولوجيا، ووظيفة6،7. لذلك، تساعد الدراسات التي تنطوي على وظائف الخلايا الفلكية في تطوير العلاجات لعلاج الاضطرابات العصبية.

في المختبر نماذج حاسمة لدراسة الآليات المتعلقة بالإصابات العصبية، وعلى الرغم من العزلة الناجحة والثقافة ثنائية الأبعاد (2D) من الخلايا الفلكية القشرية قد أنشئت8،وهذا النموذج يفشل في توفير بيئة واقعية تحاكي سلوك الخلايا الأصلية وإعادة إنتاج تعقيد الدماغ9 . في حالة 2D، وضعف الدعم الميكانيكية والبيوكيميائية، وانخفاض الخلايا الخلية والتفاعلات مصفوفة الخلية، وتسطيح الخلايا مما يؤدي إلى عدم وجود قطبية القاعدية apical، تؤثر على ديناميات إشارات الخلايا والنتائج التجريبية مما يؤدي إلى تغيير مورفولوجيا الخلايا والتعبير الجيني، والتي تعرض للخطر الاستجابة للعلاجات10. لذلك، من المهم تطوير بدائل توفر بيئة عصبية أكثر واقعية، تهدف إلى ترجمة النتائج إلى العيادة.

ثلاثي الأبعاد (3D) ثقافة الخلية يمثل نموذجا أكثر تقدما أن يلخص مع زيادة ميزات الدقة من الأجهزة والأنسجة, بما في ذلك CNS11. وفيما يتعلق بالثقافة الدبقية، تساهم النماذج ثلاثية الأبعاد في الحفاظ على مورفولوجيا الخلايا الفلكية، والقطبية القاعدية القاعدية للخلايا، وإشارة الخلية12،13. ظهرت تقنية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد كأداة قوية لتصنيع الأنسجة الحية ثلاثية الأبعاد بطريقة خاضعة للرقابة باستخدام الخلايا والمواد الحيوية لإعادة إنشاء بنية وخصائص الأنسجة الأصلية. وقد أدى استخدام هذه التكنولوجيا إلى تحسن كبير في التنبؤ بالنتائج وساهم في الطب التجديدي المطبق على CNS14،15،16.

البروتوكول الموصوف هنا تفاصيل العزلة والثقافة من الخلايا الفلكية القشرية. البروتوكول تفاصيل أيضا طريقة استنساخها للخلايا الفلكية bioprint جزءا لا يتجزأ من الجيلاتين / الجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA) / الفيبرينوجين، تكملها لامينين. في هذا العمل، تم استخدام طابعة بيولوجية تعتمد على البثق لطباعة تكوين المادة الحيوية التي تحتوي على الخلايا الفلكية القشرية بكثافة 1 × 106 خلايا / مل. تم تقليل إجهاد القص الطباعة الحيوية عن طريق التحكم في سرعة الطباعة ، وأظهرت الخلايا الفلكية قابلية عالية للحياة بعد العملية. تم استزراع البنى المطبوعة بيولوجيا لمدة أسبوع واحد ، وتمكنت الخلايا الفلكية من الانتشار والإرفاق والبقاء على قيد الحياة داخل الهيدروجيل ، والحفاظ على مورفولوجيا الفلكية والتعبير عن بروتين حمضي الرجفان الرجفي الرجفي المحدد (GFAP)4.

يتوافق هذا الإجراء مع الطابعات الحيوية القائمة على البثق القائم على المكبس ويمكن استخدامه للطباعة الحيوية للخلايا الفلكية المشتقة من مصادر مختلفة. النموذج المطبوع بيولوجيا ثلاثي الأبعاد المقترح هنا مناسب لمجموعة واسعة من تطبيقات الهندسة العصبية ، مثل دراسات الآليات المشاركة في وظائف الخلايا الفلكية في الأنسجة السليمة وفهم تطور الأمراض العصبية وتطوير العلاج.

Protocol

اتبعت جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات المبادئ التوجيهية الدولية لاستخدام الحيوانات في الأبحاث (http://www.iclas.org) ووافقت عليها لجنة الأخلاقيات في أبحاث جامعة ساو باولو الاتحادية (CEUA 2019 / 9292090519). 1. الفئران تشريح الدماغ نقل 10 مل من محلول الملح البارد هانكس المخزنة (HBSS) إلى ط…

Representative Results

يهدف هذا العمل إلى تطوير نسيج يشبه العصبية باستخدام تقنية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد لإيداع الجيلاتين /GelMA/fibrinogen bioink الأولي المشحون بالخلايا الفلكية طبقة بطبقة. تم استخراج الخلايا الفلكية وعزلها عن قشرة الدماغ من جراء الفئران (الشكل 1) ، إضافة إلى تكوين المواد الحيوية …

Discussion

ظهرت تقنية الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد كبديل ل الصنع الحيوي يسمح بهندسة البنى المكررة التي تشبه هيكليا وفسيولوجيا الأنسجة الأصلية22، بما في ذلك الدماغ23. يسمح التصنيع الحيوي للأنسجة الشبيهة بالعصبية بنمذجة البيئة الدقيقة الأصلية في المختبر ، كونها أداة ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ساو باولو للبحوث (FAPESP)، وأرقام المنح 2018/23039-3 و2018/12605-8؛ المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجية ،أرقام المنح 465656/2014-5 و 309679/2018-4 وتنسيق تحسين موظفي التعليم العالي (CAPES)، القانون المالي 001.

Materials

3D Bioprinter 3D Biotechnology Solutions Extrusion-based bioprinter
Blunt-tip forceps Integra Miltex 6–30 Forceps for brain dissection previously sterilized
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Protease free, fatty acid free, essentially globulin free
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4
Cell culture flask Fisher Scientific 156340 Culture flask T25
Cell strainer Corning Incorporated 352340 Cell strainer 40 µm
Confocal microscope Leica Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system
Conical tubes Thermo Scientific 339651, 339652 Sterile tubes of 15 mL and 50 mL
DAPI Abcam ab224589 DAPI staining solution
DMEM/F12 Gibco; Life Technologies Corporation 12500062 DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine
Dyalisis tubing Sigma-Aldrich D9527 Molecular weight cut-off = 14 kDa
Ethanol Fisher Scientific 64-15-5 Reagent grade
Fetal Bovine Serum Gibco; Life Technologies Corporation 12657011 Research Grade
Fibrinogen Sigma-Aldrich 9001-32-5 Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma
Gelatin Sigma-Aldrich 9000-70-8 Gelatin powder from porcine skin
Glycine Sigma-Aldrich 56-40-6 Glycine powder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco; Life Technologies Corporation 14175095 No calcium, no magnesium, no phenol red
L-Glutamine Sigma-Aldrich 56-85-9 L-Glutamine crystalline powder
Laminin Sigma-Aldrich 114956-81-9 Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kit Thermo Scientific R37601 Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydride Sigma-Aldrich 760-93-0 For GelMA preparation
Microtubes Corning Incorporated MCT-150-C Microtubes of 1,5 mL
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5
Needle 22G Fisher Scientific NC1362045 Sterile blunt needle
Operating scissor Integra Miltex 05–02 Sharp scissor for brain dissection previously sterilized
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Paraformaldehyde powder
Penicillin/Streptomycin Gibco; Life Technologies Corporation 15070063 Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin)
Petri dish Corning Incorporated 430591, 430588 Sterile petri dishes of 35 and 100 mm
Phalloidin Abcam ab176753 iFluor 488 reagent
Photoinitiator Sigma-Aldrich 106797-53-9 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone
Phosphate buffer saline (PBS) Gibco; Life Technologies Corporation 10010023 PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich 25988-63-0 Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000
Primary antobody Abcam ab4674 Chicken polyclonal to GFAP
Secondary antibody Abcam ab150176 Alexa fluor 594 anti-chicken
Spatula Miltex V973-70 Number 24 cement spatula previously sterilized
Stereomicroscope Fisherbrand 3000038 Microscope for brain dissection
Syringe 5 mL BD 1222C84 Sterile syringe
Syringe filter 2 µm Fisher Scientific 09-740-105 Polypropylene filter for sterilization
Thrombin Sigma-Aldrich 9002–04-4 Thrombin cristalline powder from bovine plasma
Triton X-100 Sigma-Aldrich 9002-93-1 Laboratory grade
Trypsin-EDTA Gibco; Life Technologies Corporation 15400054 Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS
Versene solution Gibco; Life Technologies Corporation 15040066 Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS
Well plate Thermo Scientific 144530 Sterile 24-well plate
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114 (2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
  3. Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
  4. Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
  5. Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
  6. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  7. Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
  8. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079 (2013).
  9. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  10. Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
  11. Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
  12. Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
  13. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
  14. Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
  15. Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
  16. de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414 (2018).
  17. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  18. Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
  19. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  20. de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
  21. Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401 (2017).
  22. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  23. de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
  24. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  25. Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
  26. Liu, R., Wang, Z. h., Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
  27. Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848 (2018).
  28. East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
  29. Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
  30. Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
  31. Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
  32. Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
  33. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001 (2018).
  34. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
  35. Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
  36. Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
  37. Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036 (2016).
  38. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517 (2018).
  39. Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
  40. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
  41. Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757 (2020).
  42. Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
  43. Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
  44. Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
  45. Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).

Tags

3D BioprintingAstrocytesIn Vitro ModelsNeurological DiseaseBiomaterialsExtracellular MatrixFibrinogenGelatinPhoto-initiatorLaminin

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
de Melo, B. A. G., Cruz, E. M., Ribeiro, T. N., Mundim, M. V., Porcionatto, M. A. 3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue. J. Vis. Exp. (173), e62691, doi:10.3791/62691 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image